JP5112941B2 - 酵母からのグリコーゲン調製方法 - Google Patents

Description

本発明は、食用酵母から、グリコーゲン含有組成物を調製する方法に関する。

α−グルカンの一種であるグリコーゲンは、天然由来の調味料として需要が高まりつつある酵母エキスに豊富に存在することが知られており、食品産業において、総合的旨味を向上させる成分であることが知られている（非特許文献１）。

また、調味料としての機能だけでなく、体力維持や体力回復に有効な生理機能を有することも報告されており、グリコーゲン含有の健康食品が市場に出ている（非特許文献２）。

酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、グリコーゲンは、直径約４０ｎｍの球状小体（β粒子）よりなる集塊（α粒子）として細胞内に存在することが知られている（非特許文献３）。

従来の酵母エキスの製造方法は、一般的には、酵母の酵素処理液又は物理的破砕液を遠心分離で固液分離することを基礎としており、この場合、グリコーゲンの殆どは液側（酵母エキス）に移行していたため、グリコーゲンを高濃度に分離回収することがなかった。

一方、特許文献１、２及び非特許文献４は、酵母エキスを平均膜孔径０．１μｍの精密濾過により精製する方法を記載している。しかし、これらの文献は、酵母エキスの製造を目的とした技術であり、グリコーゲンについての記載はなく、ましてや精密濾過後の濾過残渣を遠心分離して上清を回収することについては全く開示していない。

特開平９−３１３１３０号 特開２００４−２２９５４０号 「食品機能 機能性食品創製の基盤」藤巻正生監修 学会出版センター １９８８年３月２０日発行 １１５頁 体力科学 第１４１巻２号２８０頁（１９９２） 「酵母の解剖」１９８１年５月１０日発行 柳島直彦、大嶋泰治、大隈正子編 講談社サイエンティフィック ６６〜６７頁 月刊フードケミカル第６巻９９頁（１９９０）

現在までに、食用酵母からグリコーゲンを高濃縮する効率的かつ簡便な方法は報告されていない。

そこで、本発明は、食用酵母から、効率的かつ簡便にグリコーゲン含有組成物を調製する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、食用酵母の酵素分解物を精密濾過することによって得られる濾過残渣の遠心分離上清画分（以下、「ＹＣＡ」とも称する）中にグリコーゲンが高濃縮されていることを見出した。

また、酵素処理に担子菌産生酵素類を使用することにより、担子菌以外の微生物等の一般的な酵母細胞壁溶解酵素及びプロテアーゼの組合せを使用するよりも、酵素反応液中の総グリコーゲン量が増加することを見出した。

本発明は、上記知見を基礎とするものであり、以下の特徴（１）から（４）を包含する。
（１）以下の工程（a）〜（ｄ）を含む、食用酵母からグリコーゲン含有組成物を調製する方法。
（a）食用酵母を、担子菌産生酵素類による酵素処理に供する工程；
（b）工程(a)で生じた酵素処理液を精密濾過して濾過残渣を回収する工程；
（c）濾過残渣を遠心分離し、グリコーゲンを含む上清を回収する工程；及び
（d）前記上清からグリコーゲン含有組成物を得る工程。
（２）担子菌産生酵素類は、ヒイロタケ（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ）の培養物又は培養抽出物であることを特徴とする、上記（１）に記載の方法。
（３）上記工程(b)の精密濾過に使用する精密濾過膜は０．０５〜０．２２μmの平均孔径を有することを特徴とする、上記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）グリコーゲン含有組成物は、固形分当たり３５重量％以上のグリコーゲンを含むことを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。

本発明によれば、食用酵母からグリコーゲンを簡便かつ効率的に高濃縮することができるため、グリコーゲンを高濃度で含むグリコーゲン含有組成物を調製することができる。

また、本発明は、酵母エキス製造時に副成する精密濾過残渣画分を利用することから、通常は廃棄される産業廃棄物を有効活用できるという点で優れた技術と言える。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、食用酵母から、グリコーゲン含有組成物を調製する方法に関する。
本発明の方法は、食用酵母を、担子菌産生酵素類による酵素処理に供する工程；酵素処理液を精密濾過して濾過残渣を回収する工程；及び濾過残渣を遠心分離して、グリコーゲンを含む上清を回収する工程、を含むことを特徴とする。

本発明において、出発物質となる食用酵母は、分類学上酵母に属し、可食性の酵母であれば特に制限はなく、例えばビール醸造工程の副生成物であるビール酵母の他、ワイン酵母、パン酵母、トルラ酵母、アルコール酵母、清酒用酵母などを使用することができる。より具体的には、本発明に用いる酵母として、これに限定されるものではないが、ビール酵母、パン酵母の属するサッカロマイセス属のサッカロマイセス・セレビッシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、サッカロマイセス・ルーキシ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）、サッカロマイセス・カールスバーゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）又はサッカロマイセス・ポンベ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）等を挙げることができる。本発明においては、上記酵母の1種、又は複数種の組合せであることができる。

上記食用酵母は、様々な製造業者から市販されており、本発明においてこれら市販の食用酵母を出発物質とすることもできる。また酵母を培養し、その培養菌体を出発物質とすることもできる。酵母の培養方法としては、その酵母に適した公知の手段を適宜用いてよい。

また、上記の食用酵母は、乾燥酵母であっても、水や緩衝液等の溶媒に懸濁された液状又は泥状酵母であっても、更には死滅酵母であっても生酵母であってもよく、その形態は問わない。

本発明の方法において、出発物質として、前処理を施した食用酵母を使用してもよい。ここで、前処理とは、水、酸又はアルカリ溶液、低級アルコールなどによる洗浄、食用酵母のホモジナイズ処理などを含む。前記ホモジナイズ処理は、例えば６０Ｐａ〜１５００Ｐａの高圧ホモジナイザー処理とすることができる。上記のような前処理により、酵素処理速度及び効率の向上、精密濾過時の濾過効率の向上等の効果が期待できる。

本発明の方法においては、まず、出発物質である食用酵母を、担子菌産生酵素類による酵素処理に供する。本発明において、「担子菌産生酵素類」とは、プロテアーゼ（アスパラギン酸プロテイナーゼ、セリンカルボキシペプチターゼ等）を主体とし、その他にβ−グルカナーゼ（β−１，３、β−１，６等）を含む粗精製の複合酵素を指し、例えばヒイロタケ（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ）などの担子菌を公知の手法（特開２００４−２２９５４０）で培養することにより、その培養物から得ることができる。ここで培養物とは、前記担子菌の培養菌体、培養濾液及び菌体破砕物を含み、これらを担子菌産生酵素類としてそのまま使用してもよいし、或いは、これらの培養物から得た培養抽出物又はその処理物（例えば凍結乾燥物など）を、粗精製酵素として使用してもよい。

本発明で使用する上記酵素は、腐敗防止のための冷凍保存特性、添加量の低減、計量の簡便さ等の観点から、工業的生産に適した乾燥酵素、特に、酵素力価を落とさずに粉末化した酵素であることが好ましい。このような乾燥粉末化酵素の製造に使用する乾燥方法は、酵素を失活させない乾燥方法であれば特に制限されず、恒温乾燥、減圧（真空）乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥等のいずれの方法を用いてもよい。特に凍結乾燥又は噴霧乾燥を使用することが好ましい。

本発明で使用することができる担子菌産生酵素類の製造方法の一例を示す。
担子菌（好ましくは、ヒイロタケ）の胞子懸濁液（例えば１０^７個／ｍｌ以上）を、種培地（例えば、塩化カルシウム１ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム１ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／ｍｌ、リン酸一カリウム２ｇ／ｌ、ショ糖５０ｇ／ｌ、コーン・スティープ・リカー３０ｇ／ｌ、ｐＨ７．０）に接種し、攪拌もしくは振とう下、適温にて1〜２日間培養し、種培養終了液を得る。得られた種培養終了液の一部を、主培地（例えば、塩化カルシウム１ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム１ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／ｌ、リン酸一カリウム２ｇ／ｌ、ショ糖８０ｇ／ｌ、脱脂大豆粉３５ｇ／ｌ、ｐＨ６．０）に移植し、上記と同様の温度にて攪拌もしくは振とう下で約４日間培養し、主培養終了液を得る。主培養終了液を濾過し、得られた酵素液を真空乾燥して担子菌産生酵素類の乾燥粉末を得る。

本発明において、酵素処理は、使用する酵素以外に特別な手法を用いる必要はなく、当業者に公知の手法に従って行うことができる。すなわち、食用酵母を適当な濃度、例えば５〜３０重量％となるように水性媒体中に懸濁することによって反応液を調製し、ｐＨを担子菌産生酵素類の至適ｐＨ近位の値（３．５〜５．５）になるように調整し、担子菌産生酵素類を添加して、担子菌産生酵素類の至適温度近位の温度（４５℃〜６０℃）で
８〜１６時間、緩やかに攪拌して反応させればよい。なお、ｐＨの調整は、定法に従い、必要に応じて酸（例えば塩酸）又はアルカリ（例えば水酸化ナトリウム等）を用いて行うことができる。

当該酵素処理で使用されるべき担子菌産生酵素の量は、食用酵母の量、添加する酵素の形態、他の併用酵素の有無、酵素の力価等に応じて変化する場合があり、当業者は、上記要素に従って適宜適切な量を選択することができる。例えば、担子菌産生酵素を乾燥形態で使用する場合には、通常、酵母に対して０．２５〜３．０重量％、好ましくは０．５〜１．０重量％、例えば、０．６重量％程度で使用する。

上記酵素処理において、担子菌産生酵素類は他の酵素と組合せて使用することもできる。

担子菌産生酵素類と併用することができる酵素としては、例えば、５’−リン酸生成型ヌクレアーゼ、デアミナーゼ、担子菌以外の微生物由来のプロテアーゼ、酵母細胞壁溶解酵素等を挙げることができる。但し、これらの酵素に、α−グルカナーゼが実質的に混在していないことが望ましい。α−グルカナーゼにより、酵母中のグリコーゲンが分解し、グリコーゲンの収量が低減する虞があるからである。これらの酵素は市販のものであってもよく、またこれらの酵素を産生する菌株を培養し、その培養物又は培養物抽出液等を使用することもできる。

担子菌産生酵素類と併用することができる酵素の一例として、放線菌産生酵素類を挙げることができる。放線菌産生酵素類とは、５’−リン酸生成型ヌクレアーゼ、デアミナーゼ及びプロテアーゼを主要構成酵素とする酵素類を指し、例えば、ストレプトミセス属に属する菌株を公知の方法により培養することにより、その培養物から得ることができる。

酵素処理において担子菌産生酵素類を他の酵素と併用する場合には、食用酵母を含む水性懸濁液にこれらの酵素を連続的に添加することにより酵素処理を行えばよい。その際、担子菌産生酵素類と他の酵素とを添加する順序は問わないが、各酵素類を添加する時点での水性懸濁液のｐＨ及び温度が、添加する各酵素類の至適ｐＨ及び至適温度近位の値に調整されていることに留意する。

本発明に係る方法において、上記のようにして得た酵素処理液は、必要に応じて例えば９０℃以上に加熱して酵素を失活させた後、精密濾過工程に供される。具体的に、本工程は、上記のようにして得た酵素処理液を、精密濾過膜を通過させることにより、該精密濾過膜上に残った濾過残渣を回収する工程である。得られた濾過残渣は、更に洗浄しても良い。洗浄の方法として、加水して濾過残渣を再懸濁し、それをまた精密濾過するという手法を用いることもできる。

精密濾過とは、濾紙と限外ろ過膜との中間の孔径を有する濾過膜を用いた濾過をいう。本発明において、精密濾過に使用するのに適した精密濾過膜は、０．０５〜１０μｍ、好ましくは０．０５〜０．２２μｍ、例えば０．１μｍの平均孔径を有するものである。

精密濾過は、当業者に公知の手法に従って行えばよく、特別な手法を用いる必要はない。例えば、精密濾過に用いる膜には、酢酸セルロース、ポリスルホン、ポリビニルアルコール、セラミック等を用いることができる。中でも、セラミックが好ましい。また、液を全量通過させるバッチ方式でも、液を循環させるクロスフロー方式でも良いが、クロスフロー方式の方が、膜が閉塞しにくく長期間続けて使用できるという点で望ましい。

本発明に係る方法において、精密濾過によって取得した濾過残渣は、必要に応じて例えば９０℃以上に加熱して殺菌処理を施した後、遠心分離工程に供される。具体的に、本工程は、上記のようにして得た濾過残渣を遠心分離に供し、グリコーゲンを含むその上清（ＹＣＡ）を回収する工程である。必要により、遠心分離工程の前に、ｐＨ調整を行っても良い。但し、その範囲は４〜８、好ましくは４〜７である。４以下又は８以上の条件下においては、残渣中の不溶性画分が可溶化し、その後の遠心分離工程による個液分離が著しく困難となるからである。ＹＣＡは、酵母細胞壁由来の炭水化物（食物繊維、糖質）を乾燥重量換算で固形当たり約８割以上含む物質であり、グリコーゲンを固形分量当たり、３５〜５０重量％、例えば約４２重量％含む点で特徴付けられる。その他、ＹＣＡは、粉末化した際に淡白色を示す、可溶性で白濁し、安定的に分散する、味がほとんどない、若干の酵母臭を有するといった特徴も有し得る。

遠心分離条件は、上記特徴のいずれか又は全てを有する濾過残渣上清を得るために、当業者が適宜選択することができるものであるが、例えば、５，０００〜１２，０００×ｇ、５〜２０分、好ましくは８，０００〜１２，０００×ｇ、５〜１０分、より好ましくは１０，０００〜１２，０００×ｇ、５〜１０分、例えば１０，０００×ｇ、１０分間とすることができる。遠心分離の際の温度は、特に制限されず、通常は室温（例えば２５℃）とすることができる。

また、こうして回収されたＹＣＡは、上記特徴の他、食品での食感改良効果、コク味増強効果、並びに粉体の賦形剤としての物性改善効果をも有し得るものである。

したがって、上記ＹＣＡは、それ自体グリコーゲン含有組成物とするか、必要に応じて、さらなる処理を施すことによってさらにグリコーゲン高含有組成物を得て、食品、健康食品、機能性素材等の各種用途に使用することができる。

ＹＣＡに施し得る更なる処理として、これに限定されるものではないが、例えば濃縮処理（加熱濃縮、膜濃縮）、晶析処理、ｐＨ調整処理、乾燥（例えば恒温乾燥、減圧（真空）乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥）処理などを挙げることができる。

濃縮処理においては、固形分含量が１０〜６０重量％程度となるように、例えば減圧下で加熱したり、或いは常圧で加熱することによって、処理すべき液を濃縮する。晶析処理においては組成、特性が変質しなければ特に方法は限定しない。それらにより蒸発乾燥時の効率の向上、ペースト品としての活用等が見込まれる。ｐＨ調整処理においては、定法に従い、アルカリ（例えば水酸化ナトリウム等）を用いて行ってよい。特に、食品用途として用いる場合にはｐＨを中性とすることが好ましい。乾燥処理においては、組成や特性が変質しなければ特に方法は限定されず、上記のいずれの方法を用いてもよい。乾燥して粉末化や顆粒化することで、保存性の向上、計量の簡便さなどの効果を得ることができる。また、ペーストや粉末又は顆粒等の形状にすることにより、他の食品成分や機能性素材等と混合して用いることもできる。

本発明の方法で食用酵母から得ることができるグリコーゲン含有組成物は、グリコーゲンを、以下に限定されないが、約２０重量％以上、好ましくは約３０重量％以上、より好ましくは約３５重量％以上、さらに好ましくは約４０重量％以上を含むことができる。特に、ビール酵母を原料とする場合、上記組成物中のグリコーゲン含量は約３５〜４０重量％以上となりえる。また、該組成物に含まれるグリコーゲン以外の成分は、例えば食物繊維、タンパク質などである。

上記組成物からグリコーゲン含量をさらに高めるための方法には、晶析処理等が含まれる。晶析の方法としては、組成及び特性等に変化がなければ、常套の手段を用いてよい。

以下の実施例により、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、特に断らない限り、「％」は重量％を意味する。

[実施例１]
本実施例では、本発明の方法に従って、食用酵母から遠心分離上清画分（ＹＣＡ）を調製した。

担子菌産生酵素類の調製
（１）担子菌の例としてヒイロタケ（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ）を選択し、その胞子懸濁液（１０^７個／ｍｌ以上）２ｍｌを種培地（塩化カルシウム１ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム１ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／ｍｌ、リン酸一カリウム２ｇ／ｌ、ショ糖５０ｇ／ｌ、コーン・スティープ・リカー３０ｇ／ｌ、ｐＨ７．０）２０ｍｌに接種し、２００ｍｌ容フラスコ中で、２８℃、２００ｒｐｍで４８時間培養し、種培養終了液を得た。

（２）得られた種培養終了液２ｍｌを主培地（塩化カルシウム１ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム１ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム２ｇ／ｌ、リン酸一カリウム２ｇ／ｌ、ショ糖８０ｇ／ｌ、脱脂大豆粉３５ｇ／ｌ、ｐＨ６．０）２０ｍｌに移植し、２００ｍｌ容フラスコ中で２８℃、２００ｒｐｍで９６時間培養し、主培養終了液を得た。主培養終了液を、濾紙で濾過し、得られた酵素液を真空乾燥してヒイロタケ産生酵素類の乾燥粉末を得た。

放線菌産生酵素類の調製
（１）ストレプトミセス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｕｓ ＩＦＯ ３１７５）の胞子懸濁液（１０^７個／ｍｌ以上）１白金耳を種培地（可溶性コーンスターチ３０ｇ／ｌ、コーン・スティープ・リカー３０ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム１ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム０．５ｇ／ｌ、炭酸カルシウム３ｇ／ｌ、ｐＨ７．０）２０ｍｌに接種し、２００ｍｌ容三角フラスコで２８℃、２００ｒｐｍで２４時間培養し、種培養終了液を得た。

（２）得られた種培養終了液１ｍｌを主培地（可溶性コーンスターチ３０ｇ／ｌ、コーン・スティープ・リカー１５ｇ／ｌ、脱脂大豆粉２５ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム１ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム０．５ｇ／ｌ、炭酸カルシウム３ｇ／ｌ、ｐＨ７．０）２０ｍｌに移植し、２００ｍｌ容フラスコで２８℃、２００ｒｐｍで４０時間培養し、主培養終了液を得た。

（３）得られた主培養終了液２０ｍｌを２８℃、２００ｒｐｍで３時間撹拌し、ついでイソブタノール１．６ｍｌを加え、さらに２８℃、２００ｒｐｍで３時間撹拌して溶菌し、酵素処理液を得た。これを品温８０℃以下で乾燥し、放線菌産生酵素類の乾燥粉末を得た。

ＹＣＡの調製
（調製例１）
乾燥ビール酵母２６５ｇを純水２，１４４ｇに懸濁して１１％懸濁液を調製し、３０％苛性ソーダ溶液でｐＨ７．７に調整した。これに、上記放線菌産生酵素乾燥粉末を、酵母固形分に対して０．２５％添加し、４０℃から６５℃まで５時間で昇温させ、ついで６５℃で３時間保持した。ついで５０℃に冷却し、３５％塩酸でｐＨ４．０に調整後、上記で得られたヒイロタケ産生酵素類粉末を酵母固形分に対して０．６４％添加した。５０℃で１２時間反応させた後、９０℃で１０分間加熱殺菌した。６０℃に冷却した反応終了液を、０．１〜０．２μｍの孔径を有するセラミック膜で濾過した。セラミック膜を通過しなかった残渣を３倍量の純水とともに攪拌し、再度濾過して、残渣を洗浄した。この時、残渣のｐＨは４．４であった。この精密濾過残渣を９０℃１０分間で加熱殺菌後、遠心分離（１０,０００×ｇ、１０分間、２５℃）し、上清画分−１を得た後、重液画分へ元の液量となるよう水を加え懸濁した。その後、再度遠心分離（前述同条件）し軽液画分−２を得た。軽液画分−１と２を混合し、固形分３．２％、ｐＨ４．４のＹＣＡ調製品１，７５２ｇ（固形量５６ｇ）を得た。

[実施例２]
本実施例では、上記のようにして調製したＹＣＡ調製品に含まれる糖質成分を同定した。糖質成分の同定は、ＹＣＡのアミログルコシダーゼによる分解処理、ＹＣＡのヨウ素デンプン反応、並びにＹＣＡのβ−アミラーゼ及びプルラナーゼによる分解処理から推定した。

アミログルコシダーゼによる分解処理
ＹＣＡのアミログルコシダーゼによる分解処理は、以下のようにして行った。
ＹＣＡ調製品１％（固形分にして）溶液を作製し、塩酸でｐＨ４．５に調整後、０．２％（ｖ／ｖ）のアミログルコシダーゼ（シグマ社製）を添加し、６０℃で３０分間処理した。本酵素処理によって遊離したグルコース量は、日立製作所製高速液体クロマトグラフィーＡＳ−２０００型で測定した。尚、カラムはｓｈｏｄｅｘ ＫＳ８０２（昭和電工社製）を２本連結したものを使用し、検出は示差屈折率検出器を用い、移動相液は水を使用した。

結果
ＹＣＡをアミログルコシダーゼ（α−１，４およびα−１，６グリコシド結合をグルコースに完全分解）処理したところ、グルコースの生成（約４２％（ｗ／ｗ−ＹＣＡ））が確認された。ＹＣＡは、酵母の酵素処理液を精密濾過し、得られた濾過残渣に由来する高分子画分であることから、ＹＣＡ中の糖質はα−グルカンと考えられた。

ヨウ素デンプン反応
ＹＣＡのヨウ素デンプン反応は、以下のようにして行った。
ＹＣＡ調製品０．５％（固形分にして）溶液を作製した後、０．０５ｍｏｌ／ｌのヨウ素試液を２％添加し、よく攪拌した。

結果
上記のようにしてＹＣＡ溶液のヨウ素デンプン反応を調べたところ、褐色を示した。また、その吸収極大波長（吸収スペクトルを測定した際の最大吸収を示す波長）は約４５０ｎｍであった（表１及び図１）。これらの結果は、一般的なグリコーゲンの特徴と一致した。尚、酵母グリコーゲン抽出液（対照）は、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９７７；１３０（２））に記載の方法に従って調製した。

β−アミラーゼ及びプルラナーゼによる分解処理
ＹＣＡからマンナンを除去したα−グルカン粗精製品を調製し、β−アミラーゼ及びプルラナーゼによる酵素処理によってα−グルカンの分岐構造の存在を調べた。

ＹＣＡからのマンナンの除去は、生物化学実験法２０「多糖の分離・精製法」（学会出版センター）に記載の方法に従った。得られたα−グルカン粗精製品を、固形分含量０．５％になるように水に懸濁して粗精製液を調製し、それに、β−アミラーゼ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を粗精製液の容量に対して１．５％になるように添加し、３０℃で２時間処理した。１００℃で５分間処理して酵素を失活させた後、遊離したマルトースの量を求めた。次に、同反応液に対して０．３％になるようにプルラナーゼ（シグマ社製）を添加し、４０℃で２時間処理した。１００℃で５分間処理した後、本酵素処理によって遊離したマルトースおよびマルトトリオースの量を求めた。マルトースおよびマルトトリオースの量は、日立製作所製高速液体クロマトグラフィーＡＳ−２０００型で測定した。尚、カラムはｓｈｏｄｅｘ ＫＳ８０２（昭和電工社製）を２本連結したものを使用し、検出は示差屈折率検出器を用い、移動相液は水を使用した。

結果
β−アミラーゼ（非還元末端から、最初の分岐点の２〜３残基手前まで、マルトース単位で分解）で処理したところ、分解率は４２％であった（表２）。次に、得られたβ−限界デキストリンにプルラナーゼ（マルトース、マルトトリオースの枝（α−１，６結合）を切断）を作用させたところ、マルトース、マルトトリオースが生成し、その分解率は３４％であった（表２）。このことから、粗精製品のα−グルカンは分岐構造を持つことがわかった。同様に分岐構造を有するアミロペクチンに対しても、β−アミラーゼとプルラナーゼ処理を行った。その結果、それらの分解率は、粗精製品とは異なった。また、粗精製品のヨウ素デンプン反応は、上記と同様、褐色を示した。

以上の結果から、ＹＣＡ中のα−グルカンは、グリコーゲンと判断された。尚、表２中Ｇ２はマルト−ス、Ｇ３はマルトトリオースを表す。マルトースとマルトトリオース濃度はＨＰＬＣで測定し、標準液はラミナリビオースとラミナリトリオースで代替した。

ＹＣＡ中のグリコーゲン含量は、ＹＣＡ重量当たりのα−グルカン重量（アミログルコシダーゼ処理によって遊離したグルコース重量）から求めた。

[実施例３]
本実施例では、ＹＣＡ中のグリコーゲン高含有化に、酵素処理工程又は精密濾過工程のいずれの工程が寄与しているかを検証した。

酵素処理工程の検証
市販の酵母細胞壁溶解酵素とプロテアーゼを用いて、乾燥ビール酵母（２．１２ｇ）を処理した後、酵素反応液中にグリコーゲンがどの程度含まれるのかを調べた。細胞壁溶解酵素にはツニカーゼ（天野エンザイム(株)社製）とＹＬ−ＮＬ「アマノ」（天野エンザイム(株)社製）を、プロテアーゼにはＦｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ（ノボザイムズジャパン(株)社製）とプロテアーゼＭ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム(株)社製）を用い、４通りの組み合わせで酵素反応（酵素細胞壁溶解酵素処理後、プロテアーゼ処理を実施）を行い、実施例１で調製した担子菌産生酵素類（「ヒイロタケ産生酵素類」）を用いた場合と比較した（表３参照）。その結果、市販の酵素においては、最も高い組み合わせで、反応液中の総グリコーゲン量が１６４ｍｇであったのに対し、ヒイロタケ産生酵素類においては２４３ｍｇであった（図２参照）。このことから、乾燥ビール酵母を市販の酵素で処理するよりも、ヒイロタケ産生酵素類で処理した方が、反応液中の総グリコーゲン量が多くなることがわかった。

精密ろ過工程の検証
ツニカーゼとＦｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ（酵素反応液中の総グリコーゲン量が最も高い組み合わせ）を用いて乾燥ビール酵母を処理した後、精密ろ過（孔径０．１μｍのモジュール膜を使用）を行い、酵素反応液中のグリコーゲンが、濾過残渣画分又は濾過膜通過画分のどちらの画分に回収されるかを調べた。その結果、反応液中のグリコーゲンの約８０％が濾過残渣画分に回収された。このことから、本工程において、グリコーゲンが濾過残渣画分に回収される現象は、ヒイロタケ産生酵素類を用いる場合に限ったことではないことが分かった。

以上の結果から、ＹＣＡのグリコーゲン高含有化には、ヒイロタケ産生酵素類を用いた酵素処理工程が寄与していることがわかった。

[実施例４]
本実施例では、上記実施例１で調製したＹＣＡを、さらに濃縮処理、ｐＨ調製処理及び噴霧乾燥処理に付すことにより、グリコーゲン含有組成物を調製した。

ＹＣＡ調製品１，７５２ｇ（固形量５６ｇ）を固形分２０％になるまで減圧濃縮し、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ６．０に調整した。得られた濃縮液を噴霧乾燥（塔内入口温度１４０℃、塔内出口温度９５〜１００℃、アトマイザー回転速度３２,０００ｒｐｍ）し、４１ｇの粉末品を得た。本実施例で使用した乾燥ビール酵母に含まれるグリコーゲン含量は１１．７％（グリコーゲン量３１．０ｇ）で、ＹＣＡ調製品のグリコーゲン含量はグリコーゲン含有組成物と同等の４２％であった。よって、乾燥ビール酵母からのグリコーゲン回収率は、ＹＣＡ調製品の段階で７５．８％であった。
こうして調製したグリコーゲン含有組成物の成分分析値を表４に示す。

各組成の分析は以下の通りである。
乾燥減量は、食品衛生検査指針 理化学編 厚生省生活衛生局監修 社会法人日本食品衛生協会（１９９１年）（以下、食品衛生検査指針 理化学編と示す）の試験法１．水分（１）常圧加熱乾燥法に従って、試料１ｇ、１０５℃、３時間で測定した。

タンパク質含量は、食品添加物公定書解説書 第８版 廣川書店（２００７年）（以下、食品添加物公定解説書と示す）の一般試験法２４．窒素定量法（２）ケルダール法によって定量した全窒素量に係数６．２５を乗じて算出した。

脂質は、食品衛生検査指針 理化学編の試験法３．脂質（１）エーテル抽出法（ソックスレー抽出法）に従って測定した。

食物繊維は、食品衛生検査指針 理化学編の試験法４．炭水化物（３）食物繊維の酵素−重量法（ＡＯＡＣ法）に従って測定した。

糖質は、栄養表示基準（平成１５年厚生労働省告示第１７６号）による計算式（１００から乾燥減量（水分）、タンパク質、脂質、灰分、食物繊維の総和を引いた値）を用いて算出した。

灰分は、食品衛生検査指針 理化学編の試験法５．灰分（１）直接灰化法に従って測定した。

β−グルカンは、試料を耐熱性アミラーゼ、プロテアーゼ、アミログルコシダーゼで酵素反応後、エタノールを添加して濾過を行った。そこで得られた濾過残留物を硫酸にて加水分解し、再度濾過を行い、濾液のグルコース含量をグルコースＣIIテストワコー（和光純薬社製）を用いて測定した。定量したグルコース含量に定数０．９を乗じて算出した。

グルコースとラミナリビオースは、試料を適宜蒸留水で希釈し、メンブレンフィルター（０．４５μｍ）で濾過して調製した検液を、日立製作所高速液体クロマトグラフィーＡＳ−２０００型で測定した。尚、カラムはＳｈｏｄｅｘ ＫＳ−８０２（昭和電工社製）を２本連結したものを使用し、検出は示差屈折率検出器を用い、移動相液は蒸留水を使用した。

濁度は、食品添加物公定解説書の一般試験法１６．紫外可視吸光度測定法に従って、試料濃度１％、波長６６０ｎｍで測定した。

図１は、各種ヨウ素多糖類複合体の吸収スペクトルを示す。 図２は、各種酵素反応（表３参照）により生じた反応液中の総グリコーゲン量の比較を示す。

Claims (4)

1. 以下の工程（a）〜（ｄ）を含む、食用酵母からグリコーゲン含有組成物を調製する方法。
   （a）食用酵母を、担子菌産生酵素類による酵素処理に供する工程；
   （b）工程(a)で生じた酵素処理液を精密濾過して濾過残渣を回収する工程；
   （c）濾過残渣を遠心分離し、グリコーゲンを含む上清を回収する工程；及び
   （d）前記上清からグリコーゲン含有組成物を得る工程。
2. 担子菌産生酵素類は、ヒイロタケ（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ）の培養物又は培養抽出物であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
3. 工程(b)の精密濾過に使用する精密濾過膜は０．０５〜０．２２μmの平均孔径を有することを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
4. グリコーゲン含有組成物は、固形分当たり３５重量％以上のグリコーゲンを含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。

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