JP5106966B2

JP5106966B2 - 培養物観察システム

Info

Publication number: JP5106966B2
Application number: JP2007254164A
Authority: JP
Inventors: 繁之中村; 綾子満田; 弘樹毒島
Original assignee: Panasonic Healthcare Co Ltd
Current assignee: PHC Corp
Priority date: 2007-09-28
Filing date: 2007-09-28
Publication date: 2012-12-26
Anticipated expiration: 2027-09-28
Also published as: JP2009082036A

Description

本発明は、培養物の培養状況を顕微鏡画像にて観察することを可能とする培養物観察システムに関するものである。

近年のバイオ、再生医療関連の分野の発達に伴い、インキュベータ（培養庫）を使用して細胞を培養する作業が、増加傾向にある。細胞の培養を促進するためには、それぞれの細胞に適した培養空間を整備する必要があり、従来より、培養空間の温度制御、湿度制御、雰囲気制御を行うインキュベータが開発されている。

特に、培養条件としてＣＯ₂（二酸化炭素）ガス濃度の厳格な濃度条件を要求する細胞の培養を行う場合には、温度制御及び湿度制御を行うものに加えて、培養空間のＣＯ₂ガス濃度を制御可能とするＣＯ₂インキュベータが用いられている。

一方、当該細胞の培養状態を観察する場合には、前記ＣＯ₂インキュベータにおいて培養されている細胞等のサンプルをインキュベータから取り出し、他の位相差顕微鏡や微分干渉顕微鏡、更には、蛍光顕微鏡などにおいて観察した後、再度、培養を継続するため、インキュベータ内に戻される。

しかしながら、培養状態を観察するたびに、ＣＯ₂インキュベータ内から細胞が取り出されると、当該細胞の培養条件が変化してしまい、場合によっては細胞が死滅してしまうなど、適切な培養を行うことが困難となる。そこで、ＣＯ₂インキュベータ内において細胞の培養を継続しながら、観察することを可能とする培養顕微鏡が開発されている（特許文献１参照）。

この培養顕微鏡は、細胞を培養するインキュベータ室と細胞を観察する顕微鏡部分が一体となって構成されており、インキュベータ室内に配設される回転ベースには、試料容器を設置するトレイが配設されている。トレイは、複数の試料設置穴を有し、回転ベースを回転制御することで、それぞれの試料容器内に収容される細胞（試料）を、顕微鏡を構成する対物レンズから観察可能とされている。

また、顕微鏡室には、照明用のＬＥＤやＣＣＤカメラなどが設置されており、試料からの光は、対物レンズ、倍率変更レンズ等を介してＣＣＤカメラに入射される。ＣＣＤカメラにて撮影されている画像は、コンピュータに取り込まれ、当該コンピュータに接続されたディスプレーにてリアルタイムで表示されている。
特開２００６−１１４１５号公報

上述した如き培養顕微鏡では、試料によっては３分間隔〜２時間間隔で変化を確認していたが、受精卵等の試料は細胞分裂していると共に、移動もしていた。そこで、移動する試料に手動で撮像装置を追尾させていたが、夜間は中止して数時間後の翌日に確認しているのが現状であった。これを解消するため、培養顕微鏡に顕微鏡画像を撮影するための撮像装置を取り付けて、夜間も試料のコマ撮りを行い、後にコマ撮りした画像を再生して培養結果を観察していた。

この場合、固定された撮像装置では、コマ撮り中、撮像装置の視野範囲から試料が外れてしまうという問題があった。

本発明は、係る従来技術の課題を解決するために成されたものであり、試料のコマ撮り中、試料が撮像装置の視野範囲から外れず、且つ、試料を動画で観察し易い培養物観察システムを提供することを目的とする。

即ち、本発明の培養物観察システムは、培養物の培養に適した環境を構成するための培養庫と、該培養庫内に設けられ、培養物を収容した容器が設置されるテーブルと、該テーブルを移動させるテーブル移動手段と、培養物の顕微鏡画像を撮影するための撮像手段と、該撮像手段を制御する制御手段とを備え、該制御手段は、撮像手段により撮影される顕微鏡画像内に所定のエリアを設定し、培養物が前記容器内で移動し、当該エリアから外れようとする場合に、テーブル移動手段によってテーブルを移動させることにより、当該培養物の位置を顕微鏡画像の中央に移動させることを特徴とする。

また、請求項２の発明の培養物観察システムは、上記発明において、制御手段は、エリアの範囲を、顕微鏡画像内において任意に設定可能とされていることを特徴とする。

また、請求項３の発明の培養物観察システムは、上記各発明において、制御手段は、撮像手段により、所定の時間間隔で培養物を自動的に撮影することを特徴とする。

本発明によれば、培養物の培養に適した環境を構成するための培養庫と、該培養庫内に設けられ、培養物を収容した容器が設置されるテーブルと、該テーブルを移動させるテーブル移動手段と、培養物の顕微鏡画像を撮影するための撮像手段と、該撮像手段を制御する制御手段とを備え、該制御手段は、撮像手段により撮影される顕微鏡画像内に所定のエリアを設定し、培養物が前記容器内で移動し、当該エリアから外れようとする場合に、テーブル移動手段によってテーブルを移動させることにより、当該培養物の位置を顕微鏡画像の中央に移動させるので、例えば、撮像手段にて撮影している培養物が動いた場合でも、その動いた培養物を顕微鏡画像の中央に移動させて追尾し撮影することができる。これにより、培養物が動いて撮像手段の撮影視野範囲から外れてしまうなどと言った不都合を確実に防止することが可能となる。従って、従来のように手動で撮像装置を培養物に追尾させるなどと言った手間を省くことができ、移動する培養物が撮影視野範囲から外れることなく観察し易い好適な状態で撮影することができるようになり、例えば、固定した撮像手段で培養物を撮影した場合に対して、動画で培養物を好適な状態で観察することが可能となる。

また、請求項２の発明によれば、制御手段は、エリアの範囲を、顕微鏡画像内において任意に設定可能とされているので、例えば、請求項３の如く、制御手段は、撮像手段により、所定の時間間隔で培養物を自動的に撮影する場合、培養物が大きい場合には、エリア外側周囲の顕微鏡画像の範囲を広くし、培養物が小さい場合には、エリア外側周囲の顕微鏡画像の範囲を狭くすることができる。これにより、撮像装置にて培養物を撮影し、観察する際、移動する培養物が大きくても小さくても顕微鏡画像の視野範囲を最大限利用することができ、更に好適な状態で培養物を観察することができる。

本発明は、撮像手段により、所定の時間間隔で培養物を自動的に追尾して撮影し、動画で再生した際、培養物が移動して観察し難かったのを観察し易くすることを最も主な特徴とする。顕微鏡画像内に所定のエリアを設定し、このエリアから培養物が外れようとする場合だけ、培養物を顕微鏡画像の中央に移動させることで実現した。

次に、図面を参照して本発明の実施形態について詳述する。図１は本発明を適用した培養物観察システムＳを構成する培養物観察装置１の部分透視正面図、図２は図１の培養物観察装置１の側面図、図３は図１の培養物観察装置１の縦断側面図、図４は図１の培養物観察装置１の横断平面図をそれぞれ示している。

本実施例の培養物観察システムＳ（図５）は、培養物として例えば、受精卵内に存在する未分化な幹細胞（所謂ＥＳ細胞）である胚性幹細胞や、既にできあがった体内の各器官に存在する未分化な幹細胞、例えば造血幹細胞や神経管細胞などの体性幹細胞等の再生医療等に用いられる細胞のみならず、受精卵などの細胞の培養操作に用いられるシステムであり、培養しつつ、該培養状況を所定の時間間隔でコマ撮り（微速度撮影）可能とするシステムである。

培養物観察システムＳは、培養物としての細胞（以下、培養物として細胞６０を例に挙げて説明する）の培養に適した環境を構成するための培養手段としての培養庫２と、細胞６０の顕微鏡画像６４（図８に図示）を撮影（所定の時間間隔でコマ撮りを行う場合も含む）するための撮像装置３（本発明の撮像手段に相当）と、撮像装置３により撮影された顕微鏡画像６４を表示するためのディスプレー（図５に図示）４と、これら培養庫２、撮像装置３及びディスプレー４を制御するコンピュータ５（本発明の制御手段に相当：図５に図示）とを備えるものである。このうち、培養庫２と、撮像装置３により図１に示す如き培養物観察装置１が構成され、コンピュータ５は、汎用のマイクロコンピュータにより構成されるｐｅｒｓｏｎａｌｃｏｍｐｕｔｅｒなどから構成される。尚、細胞６０の顕微鏡画像６４を所定の時間間隔でコマ撮りを行う撮像装置３については後で詳しく説明する。

培養物観察装置１は、例えば一面（本実施例では前面）に開口１０（図２に図示）を有する断熱性の箱体により本体１２が構成されており、この本体１２内（庫内）には、培養庫２を構成する培養室１３が形成されている。また、この培養室１３の下方に位置して、本体１２内下部には、撮像装置３が配設される撮像室６（図３に図示）が形成されている。

そして、本体１２には、前面開口１０を開閉自在に閉塞するための内扉１４（図３に図示）が設けられていると共に、更に、内扉１４の外方に位置して断熱扉１５が設けられている。内扉１４は、内部を透視可能とする透明ガラス板などにより構成されており、断熱扉１５を開放し、内扉１４を閉鎖した状態で、培養室１３内を視認可能とされる。また、断熱扉１５の前面には、コントロールパネル１６が設けられていると共に、該断熱扉１５の裏面外周縁には、内扉１４の端面より外側に位置してガスケット１７（図２に図示）が取り付けられている。これにより、培養室１３は、外部から密閉可能とされる。

培養室１３を構成する本体１２内壁面には、所定の間隔を存して熱良導性の区画壁２０（図３に図示）が配設されている。この区画壁２０は、培養室１３を構成する全面、即ち、天面、底面、左右側面、背面に位置して配設されており、当該区画壁２０と本体１２内壁面との間には、庫内ヒータ１９（図５のみ図示）が配設されている。尚、培養室１３の下方には、撮像装置３が配設されているため、培養室１３の底面は、当該撮像装置３が設けられている部分を除く部分に庫内ヒータ１９が配設されているものとする。また、断熱扉１５を閉じた状態で、培養室１３の前面を構成する断熱扉１５の背面にも、扉ヒータ１８（図５のみ図示）が配設されている。これにより、培養室１３は、区画壁２０及び内扉１４を介して間接的に周囲の６面すべての面から加熱可能とされている。

また、培養室１３の左右側壁を構成する各区画壁２０には、内方に突出して図示しない棚架設部が複数段形成されており、当該棚架設部には、熱良導性、且つ、複数の連通穴が形成される棚板（棚）７（図３に図示）が着脱可能に複数段架設されている。尚、詳細は後述する如く、当該培養室１３内後部には、光源４７が配設されているため、本実施例では、棚板７の後端は光源４７の前面より前方となるように架設可能とされているが、これに限定されるものではなく、棚板７は培養室１３を構成する背面に近接する位置まで延在し、光源４７に対応する位置は、該光源４７を回避する形状（断面Ｕ字状の切欠）としても良い。

一方、本体１２には、図２に示すように培養室１３内と連通するようにガス供給口２３が設けられており、当該ガス供給口２３には、図示しないガス供給管が接続されている。このガス供給管には、ＣＯ₂ガス電磁弁２４（図５に図示）を介してＣＯ₂ガスボンベが接続されると共に、Ｏ₂ガス電磁弁２５（図５に図示）を介してＯ₂ガスボンベが接続されている。それぞれのガスボンベには、所定純度以上のガスが封入されているものとする。各電磁弁２４、２５は、詳細は後述する培養庫側制御装置Ｃ１（図５に図示）にて開閉制御される。尚、当該ガス供給管は、湿度調整手段を備えていても良く、これによって、所定のＣＯ₂濃度、Ｏ₂濃度、湿度のガスを培養室１３に供給可能としても良い。また、本実施例では、ＣＯ₂ガス、Ｏ₂ガスの両者を供給可能としているが、ＣＯ₂ガスのみを供給可能としても良い。

また、本体１２内には、培養室１３の空気温度を検出するための庫内温度センサ２６と、培養室１３のＣＯ₂ガス濃度を検出するためのＣＯ₂ガス濃度センサ２７、培養室１３のＯ₂ガス濃度を検出するためのＯ₂ガス濃度センサ２８が設けられている（図５に図示）。これらセンサ２６、２７、２８は、何れも培養庫側制御装置Ｃ１に接続されており、これらセンサの検出に基づき、上記庫内ヒータ１９、扉ヒータ１８、ＣＯ₂ガス電磁弁２４、Ｏ₂ガス電磁弁２５が制御され、詳細は後述する如く設定された培養環境の温度やガス濃度が制御される。尚、本体１２には、培養室１３内の不要な空気を排出するための排気口２９（図１）が設けられており、培養室１３内からの排気が可能とされる。

本体１２内には、培養室１３内の空気を撹拌し、空気の状態を均一とするための図示しない送風機が設けられている。この送風機は送風機用モータ３２（図５）により作動するものであり、該送風機用モータ３２は、培養庫側制御装置Ｃ１により制御される。

他方、この本体１２内に形成される培養室１３内には、詳細は後述する撮像室６内に配設される倍率変更レンズ等のレンズ３５やＣＣＤカメラ３６等（図５に図示）と共に撮像装置３を構成するテーブル３７（図１に図示）が配設されている。このテーブル３７は、熱良導性の材料にて構成されると共に、図４に示されるように本実施例では平面略円形を呈した板状部材である。該テーブル３７には、細胞６０等の試料を収容した試料容器４２を下から観察するため連通して形成される孔４３が複数形成されている。本実施例では、６個の孔４３が所定間隔を存して形成されると共に、これら孔４３は、何れもテーブル３７中心から所定寸法を存して外周側に位置して形成される。

試料容器４２は、少なくとも底面及び上面が透光性を有する容器、例えば、透明のガラス又は樹脂製にて構成されており、光源４７からの照射光を透過し、対物レンズ４４により内容物を観察可能なものとされている。また、この試料容器４２の開口は、通気性を有するフィルタを備えた蓋部材にて閉塞可能とされており、試料容器４２内の湿度、ガス濃度を培養室１３内と同様とすることができる。

また、テーブル３７の中心には、熱良導性材料にて構成される回転軸３８が取り付けられている。この回転軸３８は、一端が撮像室６内に配設されるテーブル移動手段を構成する回転移動用ステージモータ３９（図５のみ図示）に接続され、当該ステージモータ３９の駆動により、水平方向に回転移動可能とされる。また、この回転軸３８は、これもテーブル移動手段を構成する直線移動用のステージモータ４０によって、一方向、本実施例では、前後方向に直線移動可能とされている。これにより、回転移動、直線移動によってテーブル３７を移動させることで、テーブル３７に設置された試料容器４２内の細胞６０等を移動させることができる。

撮像室６の内側面（実施例では前壁、両側壁の内面）には、ステージヒータ４１（図５のみ図示）が取り付けられている。このステージヒータ４１は、回転軸３８の一端に取り付けられて撮像室６の直上に位置する熱良導性のテーブル３７を所定の温度に加熱することが可能とされる。尚、テーブル３７には、該テーブル３７の温度を検出するためのステージ温度センサ４６（図５のみ図示）が取り付けられている。

そして、テーブル３７が配設される培養室１３と、撮像装置３が配設される撮像室６内とは、仕切壁４５にて区画されており、培養室１３内の調整された空気が撮像室６内に進入しないように密閉構造とされている。

テーブル３７の下方には、仕切壁４５を介して撮像室６側から突出して対物レンズ４４が設けられている（図３）。この対物レンズ４４は、テーブル３７の孔４３に設置された試料容器４２内の細胞６０等を観察可能とするものであり、回転軸３８（テーブル３７中心）から所定間隔を存した位置、即ち、孔４３が形成される位置に対応する位置に設けられる。そして、当該対物レンズ４４に対向する位置（対物レンズ４４の上方）には、撮像装置３を構成する光源４７がアーム４８を介して培養室１３内に位置する本体１２に設けられている。

本実施例における光源４７は、ＬＥＤ照明が用いられており、培養室１３内に上下に延在して配設され、上方から対物レンズ４４と該光源４７の照射孔との間に位置する細胞６０等を照明する。尚、光源４７は、ＬＥＤ照明に限定されるものではなく、例えば水銀ランプや光ファイバーなどであっても良いものとする。

尚、本実施例では、テーブル３７の上方の培養室１３には、複数段の棚板７・・が架設可能とされることから、光源４７は、前面開口１０から行われる培養物（容器に収容された状態の細胞６０など）の納出作業の邪魔とならない位置、本実施例では培養空間後部に配置されるものとする。また、光源４７の照射孔に対向して設けられる対物レンズ４４も同様に、培養空間後部に位置して配設されるものとする。

そして、これら対物レンズ４４と、光源４７と、テーブル３７と共に、撮像装置３を構成する倍率変更レンズ３５やＣＣＤカメラ３６等は、上述した如きモータ３９、４０と共に、撮像室６内に配設される。尚、当該対物レンズ４４や倍率変更レンズ３５、ＣＣＤカメラ３６等により構成される撮像システムについては、従来の構造と同様のものであるため、詳細な説明は省略する。

次に、図５の電気ブロック図を参照して、本実施例における培養物観察システムＳの制御について説明する。上述したように培養物観察システムＳは、培養室１３に培養環境を構成する培養庫２と、該培養庫２内（培養室１３内）において培養される細胞６０等（培養物）のコマ撮りを実行する撮像装置３とを備えた培養物観察装置１と、該培養物観察装置１と通信線により接続されるコンピュータ５とから構成される。培養物観察装置１は、培養庫側制御装置Ｃ１と、撮像装置側制御装置Ｃ２を備えている。

培養庫側制御装置Ｃ１の入力側には、庫内温度センサ２６、ＣＯ₂ガス濃度センサ２７、Ｏ₂ガス濃度センサ２８、ステージ温度センサ４６、コントロールパネル１６が接続され、出力側には、庫内ヒータ１９、扉ヒータ１８、ステージヒータ４１、ＣＯ₂ガス電磁弁２４、Ｏ₂ガス電磁弁２５及び送風機用モータ３２が接続されている。また、培養庫側制御装置Ｃ１には、コンピュータ５とデータ通信を実行するための通信線５０が接続されている。また、培養庫側制御装置Ｃ１は、メモリ５３を内蔵しており、コンピュータ５からの出力及びコントロールパネル１６の操作に基づく出力に基づいて、各設定値をメモリ５３に保存可能とし、当該設定値に基づいて培養室１３の温度、ガス濃度及びテーブル３７の温度が制御される。また、各温度データやガス濃度データは、培養庫側制御装置Ｃ１により、コンピュータ５へ出力される。

撮像装置側制御装置Ｃ２の出力側には、撮像装置３を構成するレンズ３５、ＣＣＤカメラ３６、ステージモータ３９、４０、光源４７等が接続される。また、撮像装置側制御装置Ｃ２には、コンピュータ５とデータ通信を実行するための通信線５１（画像取込用通信線、制御用通信線などから構成される）が接続されている。これにより、コンピュータ５からの出力に基づいて、観察する座標移動や光源２７による照射ＯＮ／ＯＦＦ、輝度調整、ＣＣＤカメラ３６による画像取込などの制御が行われる。また、観察する座標位置データや光源の輝度データは、撮像装置側制御装置Ｃ２により、コンピュータ５へ出力される。

コンピュータ５は、培養物観察装置１の制御及び各種データの取込、そのデータの参照・保存を可能とする記憶装置としての半導体メモリ９、及び、それらの実行を行うアプリケーションプログラムを備えており、接続されるディスプレー４の表示画面に各種データや取得画像（顕微鏡画像６４）を表示可能とする。各種設定は、ディスプレー４に表示される画面に従って、数値入力や決定操作を行うことによって実行することが可能とされる。また、コンピュータ５には、操作手段としてマウス８が接続されている。尚、記憶装置としては半導体メモリ９に限らず、ハードディスクや、シリコン記憶装置等を記憶装置として利用しても差し支えない。

次に、本実施例の培養物観察システムＳの動作について説明する。コントロールパネル１６、又は、コンピュータ５を操作することにより、培養室１３における培養条件、実施例では、庫内温度、庫内ＣＯ₂ガス濃度、Ｏ₂ガス濃度を設定する。ここでは、庫内温度は＋３７．０℃、ＣＯ₂ガス濃度は５．０％、Ｏ₂ガス濃度は５．０％とする。

これに基づき培養庫側制御装置Ｃ１は、庫内ヒータ１９、扉ヒータ１８、ステージヒータ４１の通電制御を行い、培養室１３及びテーブル３７の温度を設定温度である＋３７．０℃に維持する。具体的には、庫内温度センサ２６が＋３６．５℃に低下した場合に、庫内ヒータ１９及び扉ヒータ１８を通電し、＋３７．５℃に上昇した場合に庫内ヒータ１９及び扉ヒータ１８を非通電とする。また、ステージ温度センサ４６が＋３６．５℃に低下した場合に、ステージヒータ４１を通電し、＋３７．５℃に上昇した場合にステージヒータ４１を非通電とする。

このように、庫内ヒータ１９と扉ヒータ１８は、ステージヒータ４１とは独立して温度制御が行われる。この場合において、本実施例では、培養庫側制御装置Ｃ１は、テーブル３７の温度を培養室１３内の温度以下であって、培養物としての細胞６０の培養に適した温度に制御する。即ち、制御装置Ｃ１は、テーブル３７の温度を培養室１３内の温度と同じか、若しくは、培養室１３内の温度よりも低く、且つ、細胞６０の培養に適した温度（本実施例では＋３６．５℃）より高い温度となるように制御を行う。

これにより、常に培養室１３内の空気温度をテーブル３７の温度以上とすることが可能となる。従って、テーブル３７の孔４３に設置された試料容器４２上部の温度（培養室１３内の空気温度に近似）がテーブル３７に接触する試料容器４２下部の温度（テーブル３７の温度に近似）より低くなることで、試料容器４２内面に結露が発生する不都合を回避することが可能となる。

そのため、テーブル３７に設置された試料容器４２内の、細胞６０の培養に適した温度を維持しつつ、試料容器４２内面に発生する結露を回避することが可能となるため、該結露により、試料容器４２を介して行われる細胞６０の撮影に結露が邪魔となる不都合を回避することができる。これによって、テーブル３７上に設置された細胞６０を適切に観察することが可能となる。

また、培養庫側制御装置Ｃ１は、ＣＯ₂ガス濃度センサ２７及びＯ₂ガス濃度センサ２８により検出される培養室１３内の各ガス濃度（ＣＯ₂ガス濃度、Ｏ₂ガス濃度）に基づき、ＣＯ₂ガス電磁弁２４、Ｏ₂ガス電磁弁２５の開閉制御を行い、培養室１３内を設定ガス濃度（本実施例では、ＣＯ₂ガス濃度は５．０％、Ｏ₂ガス濃度は５．０％）に維持する。

これにより、培養室１３内は、上述した如く設定された温度、ガス濃度等とすることが可能となる。そのため、培養室１３内に設けられるテーブル３７の各孔４３に細胞６０等を収容した各試料容器４２を設置することで、当該培養条件によって、該細胞６０の培養を行うことが可能となる。

ここで、前記撮像装置３を詳しく説明する。尚、テーブル３７に設置された細胞６０等は、レリーフコントラストタイプを用いた撮像装置３によって、所定の時間間隔でコマ撮り可能とされている。前述した如き、移動する細胞６０を追尾して、常に細胞６０を顕微鏡画像６４の中心に位置させた場合、再生した動画の映像は、細胞６０が画像の中央に位置した状態で一部或いは全体が変化するだけであった。このため、細胞６０がどちらの方向に移動し変化していくのかがよく分からず、細胞６０の細かな分裂や動きを観察するのが極めて困難であった。

該細胞６０が移動する際、一定方向に一定の速度で移動するのであれば、方向と速度から計算して、容易に撮像装置３を追尾させることができるが、細胞６０は前後左右どちらの方向に移動していくのか分からないので、このような方法では細胞６０の追尾撮影はできなかった。そこで、本発明では撮像装置３により撮影される顕微鏡画像６４の周囲近傍に予めエリア６２（図８に図示）を設定し、中央に位置する細胞６０が設定したエリア６２まで移動していき、エリア６２から外れようとした場合に、細胞６０の位置を顕微鏡画像６４の中央に移動させるようにしている。尚、コンピュータ５が撮像装置側制御装置Ｃ２を制御して物体の中心を識別する技術、及び、移動する物体を追尾する技術については、既に周知の技術であるため、詳細な説明を省略する。

即ち、コンピュータ５は、両ステージモータ３９、４０の駆動制御を行うことにより試料容器４２内を移動する細胞６０を、撮像装置３により追尾する機能を有している。これにより、移動する細胞６０を観察し易くしている。係るコンピュータ５は、撮像装置３による細胞６０を所定時間間隔（例えば、約３分間隔）で自動的に撮影すると共に、試料容器４２内で移動する細胞６０を、撮像装置３により追尾する。尚、コンピュータ５にて、細胞６０を撮像装置３で撮影する時間間隔は、約３分間隔に限らず、細胞６０（試料）の移動速度などによって、約３分間隔よりも短い間隔、或いは、長い間隔であっても差し支えない。

該コンピュータ５は、撮像装置３で撮影した画像をメモリ９に記憶し、その画像をトレースして物体（細胞６０）の外接円（輪郭）を描く。細胞６０は、予め輪郭の大きさ範囲が決められており、その輪郭のデータはメモリ９に記憶されている。そして、コンピュータ５は、トレースして描いた輪郭から、当該輪郭の大きさがメモリ９に記憶された輪郭の大きさ（細胞６０の輪郭の大きさ）の範囲内であり、円形に近いものであるならば、それが培養細胞６０であると識別する。

即ち、コンピュータ５は撮像装置３で撮影した画像を、Ｘ軸方向、及び、Ｙ軸方向にトレースすることにより、物体の輪郭を作成する。尚、コンピュータ５は、作成した輪郭が、予め決められメモリ９に記憶された輪郭の大きさ（細胞６０の大きさ）と異なる場合は、細胞６０以外のもの（例えばゴミ）と判断する。これによって、コンピュータ５は、試料容器４２内のゴミを除外し、細胞６０だけを識別する。

また、コンピュータ５は、作成した輪郭の中心（Ｘ軸とＹ軸）を求め、これを細胞６０の中心としている。これにより、その細胞６０が顕微鏡画像６４（ディスプレー４）の何処に位置するかを把握している。即ち、図６に示すように、コンピュータ５はトレースした顕微鏡画像６４の、Ｙ軸方向の輪郭中心線Ｗ１（図中１点鎖線）と、Ｘ軸方向の輪郭中心線Ｈ１（図中１点鎖線）との交点から細胞６０（１）の中心位置を認識する。同様にコンピュータ５は、所定時間経過後（例えば３分後）撮影した後、再度トレースした顕微鏡画像６４の、Ｙ軸方向の輪郭中心線Ｗ２（図中２点鎖線）と、Ｘ軸方向の輪郭中心線Ｈ２（図中２点鎖線）との交点から細胞６０（２）の中心位置を認識する。これにより、コンピュータ５は、細胞６０が（１）から（２）に移動したことを認識する。

また、培養物観察システムＳには、撮像装置３により撮影される顕微鏡画像６４内に所定範囲のエリア６２を設定している。即ち、顕微鏡画像６４内の周囲に、顕微鏡画像６４全体面積の約２０％を空け、その内側（約８０％）に移動する細胞６０を表示するエリア６２（図中点線枠内側）を設けている（図８）。そして、コンピュータ５は、顕微鏡画像６４内に設定したエリア６２内に位置する細胞６０が、エリア６２から外れようとした場合に、細胞６０の位置を顕微鏡画像６４の中央に移動する。

詳しくは、コンピュータ５は前述した如く撮像装置３により撮影した細胞６０の位置を認識すると共に、両ステージモータ３９、４０を駆動することによりテーブル３７を移動させ、細胞６０を顕微鏡画像６４の中心に位置させる。即ち、コンピュータ５は、細胞６０が顕微鏡画像６４に設けたエリア６２まで移動したのを認識したとき（この場合、細胞６０の輪郭がエリア６２の境界線（図中破線で表示）に接したとき）、両ステージモータ３９、４０を駆動して、顕微鏡画像６４の中心に細胞６０を位置させる。

また、細胞６０の中心から輪郭までの距離は、前述した如きメモリ９に記憶されており、細胞６０の中心がエリア６２に所定距離（細胞６０の中心から輪郭までの距離）近接した時点で、コンピュータ５は輪郭がエリア６２の境界線（図中破線で表示）に接したと判断している。また、エリア６２は、細胞６０の中心がエリア６２に接した時点でも、顕微鏡画像６４から細胞６０の外縁部が外れない位置に設定されている。これにより、撮像装置３にて細胞６０全体を確実に撮影できるように構成されている。

また、コンピュータ５は、エリア６２の範囲を、顕微鏡画像６４内において任意に設定可能に構成されている。この場合、試料（細胞６０）が培養物としての対象細胞６０の内、細胞６０が比較的大きい場合には、エリア６２周囲の顕微鏡画像６４範囲を大きくすることができる。また、試料が培養物としての対象細胞６０の内、細胞６０が比較的小さい場合には、エリア６２周囲の顕微鏡画像６４範囲を小さくすることができる。これにより、撮像装置３にて撮影した画像（細胞６０）が、顕微鏡画像６４の画面からはみ出してしまう不都合を防止している。また、対象細胞６０の内、比較的大きい細胞６０や小さい細胞６０でも、顕微鏡画像６４の端から端まで全体を移動する細胞６０の、細かな移動や分裂状態を観察できるようにしている。

該エリア６２（図中点線枠）は、実際はディスプレー４に表示されず、コンピュータ５のプログラムに書かれている。尚、エリア６２表示用のＯＮ／ＯＦＦスイッチを設け、この表示用のＯＮ／ＯＦＦスイッチによりエリア６２をディスプレー４に表示したり、消したりできるようにしても差し支えない。

そして、撮像装置３により撮影された細胞６０の画像は、メモリ９記憶される。また、試料容器４２には識別番号が付与されると共に、メモリ９に記憶された画像は、撮影された順に連続番号が付与される。即ち、コンピュータ５は、識別番号が付与された試料容器４２と、この試料容器４２内の細胞６０の画像とを関連づけて、メモリ９に記憶する。これによって、コンピュータ５は、撮像装置３で撮影した細胞６０がどの試料容器４２内の細胞６０であるかを識別できるようになっている。そして、撮影された細胞６０の画像は、識別番号別に連番順に並べられて、動画が制作される。尚、撮影した細胞６０の画像を連番順に並べて動画を制作する技術については、既に周知の技術であるため、詳細な説明を省略する。

次に、試料容器４２内を移動する細胞６０の追尾を図７のフローチャートと図８〜図１２の顕微鏡画像６４を参照して説明する。尚、テーブル３７の各孔４３には試料容器４２が設置され、試料容器４２内には、一つの細胞６０が培養されているものとする。また、図８〜図１２は、所定時間（例えば、４０分、或いは、１時間２０分）の動画画像を５分割（１０分間隔、２０分間隔）で分割した時の顕微鏡画像６４の図である。また、撮像装置３にて所定の試料容器４２内で培養されると共に、顕微鏡画像６４の略中心に位置している細胞６０の画像（図８に図示）が１枚撮影（１回目の撮影）され、動画データとしてメモリ９に記憶されているものとする。

ステップＳ１で、コンピュータ５は１回目の撮影から所定時間経過しているか否か判断し、所定時間を経過している場合は、ステップＳ２に進む。コンピュータ５は所定の試料容器４２内で培養されている細胞６０を撮像装置３にて２回目の撮影を行い、メモリ９に一時記憶してステップＳ３に進む。このとき、２回目の撮影（図９）では、１回目に撮像装置３で撮影した顕微鏡画像６４の、所定位置の細胞６０よりも斜め右下方向に移動している。コンピュータ５は、メモリ９に記憶した画像を、Ｘ軸方向、及び、Ｙ軸方向にトレースして細胞６０の輪郭を作成し、その輪郭から、前述した如き細胞６０の位置を認識する。尚、細胞６０を撮像装置３にて撮影せずに、撮像装置３にて映し出した細胞６０の画像をＸ軸方向、及び、Ｙ軸方向にトレースして細胞６０の位置を認識するようにしても差し支えない。

コンピュータ５は、ステップＳ３で、撮像装置３で撮影した顕微鏡画像６４の細胞６０位置がエリア６２内であるか否か判定する。ステップＳ４で、コンピュータ５は顕微鏡画像６４の細胞６０の位置が、エリア６２の外に出ていない場合（エリア６２内の場合）、ステップＳ５に進み、メモリ９に一時記憶した細胞６０の画像を、動画データとしてメモリ９に記憶しステップＳ１に戻る。これが、所定時間、所定回数繰り返される。該撮像装置３で３回目に撮影した顕微鏡画像６４の細胞６０位置（図１０）は、２回目に撮像装置３で撮影した顕微鏡画像６４の細胞６０位置（図９）よりも、更に斜め右下方向に移動している。

そして、更に所定時間が経過した後、コンピュータ５はステップＳ４で、４回目に撮像装置３で撮影した顕微鏡画像６４内の、細胞６０の輪郭がエリア６２の何れかの部分に接した時（図１１）、或いは、外れたときはステップＳ６に進む。そこで、コンピュータ５は前述の如き両ステージモータ３９、４０を駆動し、ステップＳ７に進んで細胞６０が顕微鏡画像６４の中心に位置するようにテーブル３７を移動させる（図１２）。この時、４回目に撮像装置３で撮影した顕微鏡画像６４内の、細胞６０の輪郭がエリア６２に接しているときにメモリ９に一時記憶した画像データは消去する。

そして、コンピュータ５は、ステップＳ８で顕微鏡画像６４の中心に位置している細胞６０を、撮像装置３にて撮影し、ステップＳ５で動画データとしてメモリ９に記憶しステップＳ１に戻り、これを繰り返す。即ち、コンピュータ５は、図１３に示すように試料容器４２内を移動する細胞６０の追尾を行い、細胞６０がエリア６２内から外側に外れようとした場合（図中実線矢印）に、細胞６０の位置を顕微鏡画像６４の中央に移動するようにしている（図中点線矢印）。これにより、ゆっくり動く細胞６０の動作を短縮（例えば、１時間を１秒、１２時間を１秒に短縮）して動画で再生することができる。従って、手動で撮像手段を動かして、移動する細胞６０を追尾しなくても、後で動画を見るだけで細胞６０の細かな分裂や動きを観察できるので、細胞６０の観察効果を著しく向上させることができる。

また、前記ステップＳ１で、コンピュータ５は１回目の撮影から所定時間経過しているか否か判断し、所定時間経過していない場合は、ステップＳ９に進み、他の処理（次の処理）を行う。即ち、コンピュータ５は、テーブル３７の各孔４３に設置された試料容器４２内で、ゆっくり動く細胞６０の動作を所定の時間間隔で順次コマ撮りを行う。この場合、各テーブル３７の各孔４３に設置された試料容器４２内の細胞６０位置はメモリ９に記憶されている。尚、撮像装置３での撮影は、両ステージモータ３９、４０の駆動や、細胞６０がエリア６２内から外側に外れようとした場合に、細胞６０の位置を顕微鏡画像６４の中央への移動を含めても、約１秒で終了するので、テーブル３７の各孔４３に設置された、試料容器４２内の細胞６０の撮影を順次行うことができる。

そして、撮像装置３で各試料容器４２内の細胞６０を撮影する際、コンピュータ５は試料容器４２を撮影前の記憶した位置（前回撮影したときの試料容器４２の位置）に移動し、そこで、前述した如き顕微鏡画像６４の細胞６０の輪郭がエリア６２内の場合に、細胞６０の撮影を行う。これにより、テーブル３７の６個の孔４３に設置された、各試料容器４２内の細胞６０のコマ送り撮影を１台の撮像装置３にて行うことが可能になり、培養物観察システムＳの利便性を大幅に向上することができる。

このようにコンピュータ５は、移動する細胞６０を、撮像装置３により追尾する機能を有しているので、撮像装置３にて撮影している細胞６０が動いた場合でも、その動いた細胞６０を撮像装置３で追尾することができる。これにより、細胞６０が動いて撮像装置３の撮影視野範囲から外れてしまうなどと言った不都合を防止することが可能となる。従って、従来のように手動で撮像装置３を、細胞６０に追尾させるなどと言った手間を省くことができ、移動する細胞６０が撮影視野範囲から外れることなく観察し易い好適な状態で撮影することができる。

また、コンピュータ５は、撮像装置３により撮影される顕微鏡画像６４内に所定のエリア６２を設定し、細胞６０がエリア６２から外れようとする場合に、その細胞６０の位置を顕微鏡画像６４の中央に移動させるので、細胞６０が撮像装置３の視野範囲から外れてしまうなどと言った不都合を確実に防止することができる。これにより、例えば、固定した撮像装置３で細胞６０を撮影した場合に対して、動画で細胞６０を好適に観察することが可能となる。

また、コンピュータ５は、エリア６２の範囲を、顕微鏡画像６４内において任意に設定可能とされているので、撮像装置３により、所定の時間間隔で細胞６０を自動的に撮影する場合、培養物としての細胞６０の内、比較的大きい細胞６０の場合には、エリア６２外側周囲の顕微鏡画像６４の範囲を広くし、内比較的小さい細胞６０の場合には、エリア６２外側周囲の顕微鏡画像６４の範囲を狭くすることができる。

これにより、撮像装置にて細胞６０を撮影し、観察する際、移動する細胞６０が大きくても小さくても顕微鏡画像６４内を最大範囲利用することができ、更に細胞６０の観察が行い易くなる。また、撮像装置３にて撮影した画像（細胞６０）が、顕微鏡画像６４の画面からはみ出して観察できなくなってしまうなどという不都合を防止することができる。従って、対象細胞６０の内、比較的大きい細胞６０や小さい細胞６０でも、顕微鏡画像６４の端から端まで全体を移動する細胞６０の、細かな動きや分裂などを好適に観察することができる。

尚、実施の形態では、培養物観察システムＳの形状や時間、或いは、温度や倍率などを記載したが、培養物観察システムＳの要旨を逸脱しない範囲内で形状や時間、或いは、温度や倍率などを変更しても良いのは言うまでもない。勿論本発明は、上記実施例のみに限定されるものではなく、この発明の趣旨を逸脱しない範囲で他の様々な変更を行っても本発明は有効である。

本発明を適用した培養物観察システムを構成する培養物観察装置の部分透視正面図である。図１の培養物観察装置の側面図である。図１の培養物観察装置の縦断側面図である。図１の培養物観察装置の横断平面図である。培養物観察システムを構成する制御装置の電気ブロック図である。顕微鏡画像内の細胞移動状態を説明する図である。本発明の培養物観察システムの動作を説明するためのフローチャートである。顕微鏡画像（エリア内の中心に細胞が位置している状態を示す）の図である。顕微鏡画像（同図８のエリア内の細胞が斜め右下方向に移動した状態を示す）の図である。顕微鏡画像（同図９のエリア内の細胞が斜め右下方向に移動した状態を示す）の図である。顕微鏡画像（同図９のエリア内の細胞が斜め右上に移動し、エリアから外れようとした状態を示す）の図である。顕微鏡画像（同図９のエリアから外れようとした細胞を中央に戻した状態を示す）の図である。顕微鏡画像（図８〜図１２の細胞の移動を分かり易くまとめた状態を示す）の図である。

１培養物観察装置
２培養庫
３撮像装置（撮像手段）
４ディスプレイ（表示手段）
５コンピュータ（制御手段）
３７テーブル
３８回転軸
３９回転移動用ステージモータ
４０直線移動用ステージモータ
４２試料容器
４３孔
６０細胞
６２エリア
６４顕微鏡画像
Ｃ２撮像装置側制御装置
Ｓ培養物観察システム

Claims

培養物の培養に適した環境を構成するための培養庫と、
該培養庫内に設けられ、前記培養物を収容した容器が設置されるテーブルと、
該テーブルを移動させるテーブル移動手段と、
前記培養物の顕微鏡画像を撮影するための撮像手段と、
該撮像手段を制御する制御手段とを備え、
該制御手段は、前記撮像手段により撮影される前記顕微鏡画像内に所定のエリアを設定し、前記培養物が前記容器内で移動し、当該エリアから外れようとする場合に、前記テーブル移動手段によって前記テーブルを移動させることにより、当該培養物の位置を前記顕微鏡画像の中央に移動させることを特徴とする培養物観察システム。
前記制御手段は、前記エリアの範囲を、前記顕微鏡画像内において任意に設定可能とされていることを特徴とする請求項１に記載の培養物観察システム。
前記制御手段は、前記撮像手段により、所定の時間間隔で前記培養物を自動的に撮影することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の培養物観察システム。