JP5083759B2 - Ｄｎａ抽出方法及びそのためのキット - Google Patents

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本発明は、ＤＮＡ抽出方法及びそのためのキットに関する。
一般に、細胞からゲノムＤＮＡを抽出する方法は、多数知られているが、爪などの硬質な皮膚片からゲノムＤＮＡを抽出するのは難しく、一般的なゲノムＤＮＡ抽出方法では、効率よく純度の高いＤＮＡは抽出できない（例えば、非特許文献１）。
FujiFilm QuickGene シリーズ Application Guide No.16
特に、2mL容積のポリプロピレン製小型遠心器用プラスティックチューブを用いて、硬質な皮膚片からＤＮＡを抽出しようとする場合、穏やかに処理をするとＤＮＡが少量しか抽出されず、激しく処理するとチューブが破損するため、効率よくＤＮＡを抽出することができなかった。また、爪の溶解に長時間かかったり、純度が低かったりすることもあった。
そこで、本発明は、2mL容積のポリプロピレン製小型遠心器用プラスティックチューブを用いて、爪や皮膚片からＤＮＡを効率よく抽出する方法を提供することを目的としてなされた。
本発明者らは、Qiagen社製EZ1 Tissue Kit及びジルコニアビーズを用いて、2mL容積のポリプロピレン製小型遠心器用プラスティックチューブ中で爪からＤＮＡを抽出する際、特定の条件において、チューブが破損せず、なおかつＤＮＡが効率よく抽出されることを見出し、本発明の完成に至った。
本発明にかかるＤＮＡ抽出方法は、爪または皮膚片の試料からゲノムＤＮＡを抽出する方法であって、2mL容積のポリプロピレン製小型遠心器用プラスティックチューブに、１粒の直径5.0mmのジルコニアビーズと、９粒の直径2.3mmのジルコニアビーズと0.18g以上0.22g以下の直径1.2mmのジルコニアビーズと、グアニジンバッファーと、前記試料と、を入れる第一工程と、第一工程で準備した前記チューブを振とうして、前記試料を破砕する第二工程と、を含む方法である。
さらに、第二工程で処理した前記チューブにタンパク分解酵素を加えて、前記試料をタンパク分解処理する第三工程と、第三工程で処理した前記チューブを振とうして、前記試料を破砕する第四工程と、第四工程で処理した前記チューブを小型遠心器で遠心し、上清からＤＮＡを精製する第五工程と、を含んでもよい。
また、本発明にかかるキットは、2mL容積のポリプロピレン製小型遠心器用プラスティックチューブと、１粒の直径5.0mmのジルコニアビーズと、９粒の直径2.3mmのジルコニアビーズと0.18g以上0.22g以下の直径1.2mmのジルコニアビーズとを含有したキットである。
本発明により、2mL容積のポリプロピレン製小型遠心器用プラスティックチューブを用いて、爪や皮膚片からＤＮＡを効率よく抽出する方法を提供することができる。
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。なお、本発明の目的、特徴、利点、および、そのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
本発明にかかるＤＮＡ抽出方法は、皮膚片の試料からゲノムＤＮＡを抽出する方法である。試料は、どの動物由来でもよく、また、皮膚片は体のどの部位由来の皮膚でもよいが、爪や髪などの硬質な皮膚にも適用可能である。
このＤＮＡ抽出方法は、以下の工程を含む。
（１）まず、2mL容積のポリプロピレン製小型遠心器用プラスティックチューブに、１粒の直径5.0mmのジルコニアビーズと、９粒の直径2.3mmのジルコニアビーズと0.18g以上0.22g以下の直径1.2mmのジルコニアビーズと、グアニジンバッファーと、前記試料と、を入れる。
用いる2mL容積のポリプロピレン製小型遠心器用プラスティックチューブは、マスターチューブ（バイオメディカルサイエンス社製MT020-01）またはその相当物（例えば、スクリューキャップチューブ（TOHO社44014））であれば、特に限定はなく、小型遠心器（例えば、トミー社製MX-300等）に使用できるチューブであれば、限定されない。例えば、キャップはチューブ胴体から取り外せるようになっていても、チューブ胴体と一体式のものであっても構わない。ただし、材質は、強度、耐圧性、有機溶媒耐性などの性質から、ポリプロピレン製を用いるものとする。
ジルコニアビーズは、ZZ50-0001,ZZ23-0001,ZS12-0001（バイオメディカルサイエンス社製）またはその相当物（例えば、TORAY社製ジルコニアビーズ）であれば、特に限定はなく、平均直径が凡そ上記に記載のビーズであれば、限定されない。
グアニジンバッファーは、0.5〜6Ｍのグアニジンを含むバッファーであればよいが、好ましくは、以下の組成のバッファーであって、市販の試薬で調製してもよく、EZ1 Tissue Kit Buffer G2（Qiagen社）を使用してもよい。
グアニジンバッファー：８００mMグアニジン塩酸、３０mMトリス（pH 8.0）、３０mM ＥＤＴＡ（pH 8.0）、５％ Tween-20、０．５％ Triton X-100（最終的に水酸化ナトリウムでpHを8.0に調整する。）
また、チューブに添加する量は、適宜決めればよいが、試料500μlに対し150〜500μlであることが好ましく、230μlであることが最も好ましい。チューブに加える際は、予め調整したバッファーを加えても、グアニジンバッファー濃縮液と蒸留水を加えても、各試薬を別々に加えても構わず、これらの態様は全て本発明の技術的範囲に含まれる。
（２）次に、チューブを振とうして、前記試料を破砕する。具体的には、チューブをFastPrep FP120（Thermo Savant社）にセットし、試料をSpeed 5.5で２分間以上４分間以下破砕するのが好ましい。この時間より破砕時間が短くなると、ＤＮＡは効率よく抽出されず、この時間より長くなると、チューブが割れてしまう。振とう方法は、これに限らず、同程度の力で振とうすることができれば、どのように振とうしても構わない。
（３）さらに、チューブにタンパク質分解酵素を加えて、試料をタンパク分解処理する。タンパク質分解酵素は、特に限定されず、proteaseであってもproteinaseKであってもよい。酵素濃度は、10〜20mg／mlであることが好ましい。市販品として、EZ1 Tissue Kit proteinase K溶液（Qiagen社）を代用してもよい。
酵素溶液の量は5〜50μlであることが好ましいが、試料500μlに対し10μlであることが最も好ましい。反応温度や反応時間は、適宜調整すればよいが、３０〜７０℃で１〜２４時間反応することが好ましい。
（４）次に、チューブを振とうして、前記試料を破砕する。具体的には、チューブをFastPrep FP120（Thermo Savant社）にセットし、試料をSpeed 5.5で２分間以上4分間以下破砕するのが好ましい。この時間より破砕時間が短くなると、ＤＮＡは効率よく抽出されず、この時間より長くなると、チューブが割れてしまう。振とう方法は、これに限らず、同程度の力で振とうすることができれば、どのように振とうしても構わない。
（５）次に、チューブを小型遠心器で遠心し、上清からＤＮＡを精製する。精製方法は特に限定されず、当業者に公知の方法を用いればよいが、BioRobot EZ1 (Qiagen社)、AutoPure (Gentra社)、Magtration 12GC (PSS Bio社)、MagNA Pure LC (Roche社)などの核酸精製ロボットを用いてもよい。
試料は、髪の毛（サンプルあたり１ｃｍ、３本用いた）を2mL容積のポリプロピレン製小型遠心器用プラスティックチューブ（住友ベークライト社）に入れ、500μlの50mM ＥＤＴＡ含有ＰＢＳを加えた。各表に示した量の石英砂、直径5.0mmのジルコニアビーズ、直径2.3mmのジルコニアビーズ、直径1.2mmのジルコニアビーズを加え、230 EZ1 Tissue Kit Buffer G2（Qiagen社）を加えた。このチューブをFastPrep FP120（Thermo Savant社）にセットし、Speed 5.5で表に示した時間破砕した。破砕の結果を髪の長さで示した。なお、1.2mmジルコニアビーズをスパーテル１杯は、約0.2g（0.18〜0.22g）であった。
Figure 0005083759
表より、１０番の条件（石英砂０、ジルコニアビーズ1.2mm３杯・2.3mm９粒・5mm１粒、破砕時間２分）で最もよく破砕された。なお、３番、６番、９番、１２番のような条件では、半数以上のチューブが破壊された。

Claims (3)

  1. 皮膚片の試料からゲノムＤＮＡを抽出する方法であって、
    2mL容積のポリプロピレン製小型遠心器用プラスティックチューブに、
    １粒の直径5.0mmのジルコニアビーズと、
    ９粒の直径2.3mmのジルコニアビーズと
    0.18g以上0.22g以下の直径1.2mmのジルコニアビーズと、
    グアニジンバッファーと、
    前記試料と、
    を入れる第一工程と、
    第一工程で準備した前記チューブを振とうして、前記試料を破砕する第二工程と、
    を含むことを特徴とする方法。
  2. さらに、
    第二工程で処理した前記チューブにタンパク分解酵素を加えて、前記試料をタンパク分解処理する第三工程と、
    第三工程で処理した前記チューブを振とうして、前記試料を破砕する第四工程と、
    第四工程で処理した前記チューブを小型遠心器で遠心し、上清からＤＮＡを精製する第五工程と、
    を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 2mL容積のポリプロピレン製小型遠心器用プラスティックチューブと、
    １粒の直径5.0mmのジルコニアビーズと、
    ９粒の直径2.3mmのジルコニアビーズと
    0.18g以上0.22g以下の直径1.2mmのジルコニアビーズと
    を含有したキット。
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