JP5068806B2 - 可逆的に阻害された酵素の混合物 - Google Patents
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Description
DNAポリメラーゼ:1単位は、テンプレートとして活性化DNAを用いて、最適反応条件(温度、緩衝組成物)下で、30分間で、dNTP10nmolを酸不溶性材料に組み込む酵素の量と定義される。
逆転写酵素:1単位は、テンプレート/プライマーとしてポリ(rA)・p(dT)12−18を用いて、最適反応条件(温度、緩衝組成物)下で、10分間で、dNTP1nmolを酸不溶性材料に組み込む酵素の量と定義される。
DNAリガーゼ:ワイス(Weiss)単位は、最適反応条件(温度、緩衝組成物)下で、20分間で、[32PPi]1ナノモルのノリット(Norit)吸着形への変換を触媒する酵素の量と定義される。
RNAリガーゼ:1単位は、最適反応条件(温度、緩衝組成物)下で、30分間で、5'−[32P]−ポリ(A)12−18中の5'−ホスホリル末端1nmolのホスファターゼ耐性形への変換を触媒する酵素の量と定義される。
制限エンドヌクレアーゼ:1単位は、最適反応条件(温度、緩衝組成物)下で、1時間で、基質DNA1μgの完全消化を触媒する酵素の量と定義される。
エキソヌクレアーゼ:1単位は、最適反応条件(温度、緩衝組成物)下で、30分間で、酸可溶性ヌクレオチド1nmolの放出を触媒する酵素の量と定義される。
共有的におよび非共有的に修飾されたDNAポリメラーゼを用いる、SYBRグリーンに基づく検出を用いるリアルタイムPCRにおける長いPCR断片の増幅
長いDNA断片の増幅に対する、異なる修飾がされた熱安定性DNAポリメラーゼの作用を調べるため、ヒトCTNNA1遺伝子(NM_001903)の転写物の690塩基対断片が増幅された。このために用いられたプライマーは下記の配列を有した:
順方向プライマー:AGCTGAAAGTTGTGGAAGATG(配列番号:1)
逆方向プライマー:GGAGCTGTCTACGCAAGTC(配列番号:2)
1.ホットマスターTaq(HotMasterTaq)DNAポリメラーゼ(エッペンドルフ社(Eppendorf AG)、ハンブルク(Hamburg))、米国特許6,667,165によると,非核酸型ポリアニオンとの非共有錯体化によって温度依存性阻害を受け、および55℃を上回る温度で完全な活性を生じる酵素(下記で「非共有的に修飾された酵素」と呼ばれる):使用した量は反応当たり1.5単位であった
2.Taq−DNAポリメラーゼ、米国特許6,183,998によるとホルムアルデヒドで共有的に修飾されおよびしたがって阻害された(キアゲン社、ヒルデン)(下記で「共有的に修飾された酵素」と呼ばれる)。使用した量は反応当たり1.25単位であった
3.非共有的におよび共有的に修飾された酵素の、反応当たり、非共有的に修飾された酵素0.125単位の、共有的に修飾された酵素1.25単位に対する比での混合物。
A:最初のテンプレートの変性/酵素の活性化
95℃、5分間
B:増幅:
変性:95℃、15秒間
プライマーアニーリング:55℃、30秒間
プライマー伸長:72℃、30秒間
各サイクルの伸長中の蛍光光度分析
サイクル数:45
C:融解曲線分析
PCR産物の最初の変性:95℃、15秒間
PCR産物の再ハイブリダイゼーション:60℃、20秒間
PCR産物の融解:60℃から95℃へ加熱速度約0.2℃/秒で加熱
PCR産物の融解中の蛍光光度分析
反応混合物は室温にて分析された。
二量体形成の傾向を有するプライマーを使用する、共有的におよび非共有的に修飾されたDNAポリメラーゼを用いる、SYBRグリーンに基づく検出を用いるリアルタイムPCRにおけるPCR断片の増幅
二量体形成の傾向を有するプライマーを使用する増幅に対する、異なる修飾がされた熱安定性DNAポリメラーゼの作用を調べるため、ヒトMYC遺伝子(NM_002467)の転写物の129塩基対断片が増幅された。このために用いられたプライマーは下記の配列を有した:
順方向プライマー:TGCTCCATGAGGAGACA(配列番号:3)
逆方向プライマー:GTGATCCAGACTCTGACCTTT(配列番号:4)
共有または非共有修飾の異なる方法を用いて作製された、共有的におよび非共有的に修飾されたDNAポリメラーゼを用いる、SYBRグリーンに基づく検出を用いるリアルタイムPCRにおけるPCR断片の増幅
異なる修飾がされた熱安定性DNAポリメラーゼの組み合わせの有利な作用が、特定の種類の共有および非共有修飾に限定されないことを実証するため、本実施例に示されるPCRについて2つの酵素の組み合わせが使用され、その両方が実施例1および2で使用された酵素とは修飾の種類が異なる。下記の2つのDNAポリメラーゼが使用された。
アンプリタック・ゴールド(AmpliTaq Gold)(アプライド・バイオシステムズ社(Applied Biosystems)、米国カリフォルニア州フォスターシティ(Foster City))、Taq DNAポリメラーゼの共有的に修飾された型、酸無水物での処理によって可逆的に阻害された(詳細は米国特許5,677,152および5,773,258に見ることができる)。
プラチナ(Platinum(登録商標))TaqDNAポリメラーゼ(インビトロゲン社(Invitrogen)、米国カリフォルニア州カールズバッド(Carlsbad))、組み換えTaqDNAポリメラーゼ、室温にてポリメラーゼ活性を遮断する抗体と複合体化されている。典型的には変性段階中で起こる通り、94℃へ加熱することによって、抗体は変性しおよび遮断が除去される(詳細は米国特許5,338,671および5,587,287に見ることができる)。
順方向プライマー:AAGAGAAGCTGAAGAAAACCAA(配列番号:5)
逆方向プライマー:GTGGAGAGGTGGGTGTAG(配列番号:6)
4.アンプリタック・ゴールド(AmpliTaq Gold)DNAポリメラーゼ単独:使用した量は反応当たり1.25単位であった(製造元の推奨通り)
5.プラチナ(Platinum)TaqDNAポリメラーゼ単独:使用した量は0.5Uであった(製造元の推奨通り)
6.アンプリタック・ゴールドDNAポリメラーゼ(共有的に修飾された酵素)およびプラチナTaqDNAポリメラーゼ(非共有的に修飾された酵素)の、反応当たり、非共有的に修飾された酵素0.125単位の、共有的に修飾された酵素1.25単位に対する比での混合物。
A:最初のテンプレートの変性/酵素の活性化
95℃、10分間
B:増幅:
変性:95℃、15秒間
プライマーアニーリング:55℃、30秒間
プライマー伸長:72℃、30秒間
各サイクルの伸長中の蛍光光度分析
サイクル数:45
C:融解曲線分析
PCR産物の最初の変性:95℃、15秒間
PCR産物の再ハイブリダイゼーション:60℃、20秒間
PCR産物の融解:60℃から95℃へ加熱速度0.1℃/秒で加熱
PCR産物の融解中の蛍光光度分析
反応混合物は室温にて分析された。
Claims (29)
- 共有結合修飾によって可逆的に阻害された少なくとも1つのポリメラーゼ(A)、およびポリアニオンの非共有結合によって可逆的に阻害された少なくとも1つのポリメラーゼ(B)の両方を含む組成物。
- 上記ポリメラーゼ(A)及び(B)が熱安定性ポリメラーゼである点で特徴づけられる、請求項1に記載の組成物。
- 上記ポリメラーゼ(A)及び(B)の阻害が熱の供給によって逆転されうる点で特徴づけられる、請求項1又は2に記載の組成物。
- 上記ポリメラーゼ(A)及び(B)が、互いに独立して、DNAポリメラーゼ又はRNAポリメラーゼである、請求項1から3の何れか1項に記載の組成物。
- 上記ポリメラーゼ(A)及び(B)の両方が熱安定性DNAポリメラーゼである点で特徴づけられる、請求項1から4の何れか1項に記載の組成物。
- 上記ポリメラーゼ(B)に対する上記ポリメラーゼ(A)の混合比が、0.1:1ないし100:1である、請求項1から5の何れか1項に記載の組成物。
- ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または組み合わされた逆転写PCRのためのさらなる成分を追加で含む、請求項1から6の何れか1項に記載の組成物。
- 共有結合修飾によって可逆的に阻害された少なくとも1つのポリメラーゼ(A)およびポリアニオンの非共有結合によって可逆的に阻害された少なくとも1つのポリメラーゼ(B)、または前記ポリメラーゼ(A)及び(B)の混合物を含むキット。
- 上記ポリメラーゼ(A)及び(B)が熱安定性ポリメラーゼである点で特徴づけられる、請求項8に記載のキット。
- 上記ポリメラーゼ(A)及び(B)の阻害が熱の供給によって逆転されうる点で特徴づけられる、請求項8又は9に記載のキット。
- 上記ポリメラーゼ(A)及び(B)が、互いに独立して、DNAポリメラーゼ又はRNAポリメラーゼである、請求項8から10の何れか1項に記載のキット。
- 上記ポリメラーゼ(A)及び(B)の両方が熱安定性DNAポリメラーゼである点で特徴づけられる、請求項8から11の何れか1項に記載のキット。
- 上記混合物における上記ポリメラーゼ(B)に対する上記ポリメラーゼ(A)の混合比が、0.1:1ないし100:1である、請求項8から12の何れか1項に記載のキット。
- ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または組み合わされた逆転写PCRのためのさらなる成分を追加で含む、請求項8から13の何れか1項に記載のキット。
- ポリヌクレオチドのプロセシングまたは増幅のための、共有結合修飾によって可逆的に阻害された少なくとも1つのポリメラーゼ(A)とポリアニオンの非共有結合によって可逆的に阻害された少なくとも1つのポリメラーゼ(B)との混合物の使用。
- プロセシングまたは増幅が、特異的増幅である点で特徴づけられる、請求項15に記載の使用。
- 特異的増幅が、PCRまたは組み合わされた逆転写PCR(一段階RT−PCR)によって起こる点で特徴づけられる、請求項16に記載の使用。
- 上記ポリメラーゼ(A)及び(B)が熱安定性ポリメラーゼである点で特徴づけられる、請求項15から17の何れか1項に記載の使用。
- 上記ポリメラーゼ(A)及び(B)の阻害が熱の供給によって逆転されうる点で特徴づけられる、請求項15から18の何れか1項に記載の使用。
- 上記ポリメラーゼ(A)及び(B)が、互いに独立して、DNAポリメラーゼ又はRNAポリメラーゼである、請求項15から19の何れか1項に記載の使用。
- 上記ポリメラーゼ(A)及び(B)の両方が熱安定性DNAポリメラーゼである点で特徴づけられる、請求項15から20の何れか1項に記載の使用。
- 上記ポリメラーゼ(B)に対する上記ポリメラーゼ(A)の混合比が、0.1:1ないし100:1である、請求項15から21の何れか1項に記載の使用。
- 少なくとも1つの反応負荷において、共有結合修飾によって可逆的に阻害された少なくとも1つのポリメラーゼ(A)、およびポリアニオンの非共有結合によって可逆的に阻害された少なくとも1つのポリメラーゼ(B)の両方が共に存在する点で特徴づけられる、DNAまたはRNAの特異的増幅のための方法。
- 特異的増幅が、PCRまたは組み合わされた逆転写PCR(一段階RT−PCR)によって起こる点で特徴づけられる、請求項23に記載の方法。
- 上記ポリメラーゼ(A)及び(B)が熱安定性ポリメラーゼである点で特徴づけられる、請求項23又は24に記載の方法。
- 上記ポリメラーゼ(A)及び(B)の阻害が熱の供給によって逆転されうる点で特徴づけられる、請求項23から25の何れか1項に記載の方法。
- 上記ポリメラーゼ(A)及び(B)が、互いに独立して、DNAポリメラーゼ又はRNAポリメラーゼである、請求項23から26の何れか1項に記載の方法。
- 上記ポリメラーゼ(A)及び(B)の両方が熱安定性DNAポリメラーゼである点で特徴づけられる、請求項23から27の何れか1項に記載の方法。
- 上記ポリメラーゼ(B)に対する上記ポリメラーゼ(A)の混合比が、0.1:1ないし100:1である、請求項23から28の何れか1項に記載の方法。
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