JP5067520B2 - 土壌の硝化抑制方法 - Google Patents

Description

本発明は、土壌の硝化抑制方法に関する。

土壌微生物の働きにより起きるアンモニアの酸化反応、即ち硝化は、農業や園芸などの生産に用いる窒素肥料の大幅な損失を引き起こし、土壌環境汚染の原因ともなっている。このような土壌の硝化を抑制するため、従来、主にニトラピリン（２−クロロ−６−トリクロロメチルピリジン）及びジシアンジアミド等の合成薬剤が用いられてきた（例えば、特許文献１参照）。

合成薬剤のうち、ニトラピリンは揮発性が高く、地温が２０℃以上の条件ではほとんど効果がないため、北米の冬季作等、限られた環境でのみ使用可能であった。

一方、ジシアンジアミドは、ニトラピリンに比較して高い温度でも有効であるが、使用濃度が高く、かつ、高価であることから農業生産コストに大きく影響するため、利用されている地域は限られている。このような背景から、熱帯から温帯にかけての広い地域で利用しうる、経済的な硝化抑制方法の開発が求められている。

非特許文献１及び２においては、熱帯イネ科牧草であるクリーピングシグナルグラス（Ｂｒａｃｈｉａｒｉａ ｈｕｍｉｄｉｃｏｌａ）が生育する土壌において硝化が抑制される現象が報告されている。

特開平１１−２７８９７３号公報 CIAT 1983 annual report, p.224 CIAT 1985 annual report, pp.210-211 米国食品医薬品局 21CFR573.640 Iizumi et al. Appl. Environment. Microbiol., vol. 64, p. 3656-3662, 1998

農地用や園芸用の土壌の硝化を抑制するため、従来、上記の合成薬剤などが用いられてきたが、各合成薬剤にはそれぞれ固有の欠点があり、利用される地域や対象作物は限られているという課題がある。

このような背景から、熱帯から温帯にかけての広い地域で利用し得る経済的な硝化抑制剤が得られていないという課題がある。

本発明は、上記課題に鑑み、熱帯から温帯にかけての広い地域で利用でき、かつ、天然由来の材料から容易に得られる化合物を用いる硝化抑制方法を提供することを目的としている。

本発明者らは、熱帯イネ科牧草であるクリーピングシグナルグラスが生育する土壌において硝化が抑制されるという現象に基づき、同植物組織内に硝化抑制物質が存在するものと予想し、鋭意研究を重ねた結果、硝化抑制物質を単離取得し、硝化抑制物質の本体が２種の不飽和脂肪酸、即ちリノール酸及びα−リノレン酸であることを見出し、さらに、γ−リノレン酸及びリノール酸メチルエステルの硝化抑制効果も確認して、本発明を完成するに至った。

本発明の硝化抑制方法は、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、及びリノール酸メチルの何れか１種または２種以上の混合物を主成分とし、土壌の硝化を抑制することを特徴とする。

本発明の硝化抑制方法は、天然由来の材料から容易に得られる化合物を使用するものであり、熱帯から温帯にかけての広い地域で利用でき、かつ、土壌中の有効窒素成分を保全し、土壌環境の劣化を防止することができる。

以下、本発明の実施の形態を、図面に基づいて詳細に説明する。
本発明の硝化抑制方法で使用する化合物は、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、及びリノール酸メチルの何れか１種または２種以上の混合物である。
上記リノール酸（Ｃ₁₇Ｈ₃₁ＣＯＯＨ）、α−リノレン酸（Ｃ₁₇Ｈ₂₉ＣＯＯＨ）、γ−リノレン酸（Ｃ₁₇Ｈ₂₈ＣＯＯＨ）、及びリノール酸メチル（Ｃ₁₇Ｈ₃₁ＣＯＯＣＨ₃ ）の各化学構造式を、下記の化学式（１）〜（４）に示す。
式（１）
ＣＨ₃ （ＣＨ₂ ）₄ ＣＨ＝ＣＨＣＨ₂ ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ₂ ）₇ ＣＯＯＨ
式（２）
ＣＨ₃ ＣＨ₂ ＣＨ＝ＣＨＣＨ₂ ＣＨ＝ＣＨＣＨ₂ ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ₂ ）₇ ＣＯＯＨ
式（３）
ＣＨ₃ （ＣＨ₂ ）₄ ＣＨ＝ＣＨＣＨ₂ ＣＨ＝ＣＨＣＨ₂ ＣＨ＝（ＣＨ₂ ）₄ ＣＯＯＨ
式（４）
ＣＨ₃ （ＣＨ₂ ）₄ ＣＨ＝ＣＨＣＨ₂ ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ₂ ）₇ ＣＯＯＣＨ₃

上記化合物は、何れもが天然油脂由来の化合物であって、公知の方法すなわち、各種植物油に含まれる中性脂質を分解することにより容易に製造することが可能である。リノール酸及びα−リノレン酸は、クリーピングシグナルグラスからも、抽出することができる。

上記したリノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸及びリノール酸メチルは、硝化能を有するニトロソモナス菌を用いた試験及び土壌を用いた試験において硝化作用を強く阻害する。この硝化抑制作用は、従来から用いられてきた硝化抑制物質と同等、又はそれ以上の優れた効果を示す。

本発明の硝化抑制方法で用いる上記化合物は、不揮発性である。このため、土壌に散布、又は混合した場合、長期間にわたり土壌中で硝化抑制作用を持続させることが可能である。

リノール酸、α−リノレン酸及びγ−リノレン酸は多くの食品に含まれている栄養成分であるので、安全性はきわめて高い。また、リノール酸メチルも、通常の使用範囲においては人体に無害であることから（非特許文献３参照）、安全性はきわめて高い。

次に、上記化合物は、石灰のような無機素材や、黒ボク土のような肥沃土などを含んで土壌改良剤として構成することができる。さらには、園芸用の土壌改良剤として、肥料を含ませた培養土としてもよい。好ましい含有量は、０．１〜１重量％程度である。１重量％で十分に硝化抑制ができるので、これ以上の添加をする必要はない。逆に、０．１重量％以下では、硝化抑制の効果が小さく好ましくない。

硝化抑制効果を有する化合物を含有する土壌改良剤は、窒素成分の硝化を抑制し、土壌環境の劣化を防止することができる。リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸及びリノール酸メチルは、各種植物油に含まれる中性脂質を分解することにより容易に製造することができる。このため、土壌改良剤は、低コストで製造することができる。

本発明で用いるリノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸及びリノール酸メチルは、肥料に含ませて構成されてもよい。
ここで、肥料としては、無機肥料や有機肥料が挙げられ、これらの混合肥料でもよい。このような無機肥料としては、尿素、硫安、塩安などの窒素質肥料、過リン酸石灰などのリン酸肥料、硫酸カリウム、塩化カリウムなどのカリ肥料を用いることができる。また、有機肥料としては、骨粉、たい肥などを用いることができる。肥料に添加する含有量は、０．１〜１重量％程度である。１重量％で十分に硝化抑制ができるので、これ以上の添加をする必要はない。逆に、０．１重量％以下では、硝化抑制の効果が小さく好ましくない。

硝化抑制効果を有する化合物を含有する肥料は、窒素成分の硝化を抑制し、肥料の節約と土壌環境の劣化を防止することができる。

以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。
実施例１として、クリーピングシグナルグラスからの硝化抑制作用物質の抽出を行なった。
最初に、凍結乾燥させたクリーピングシグナルグラス植物体の地上部１００ｇを、２０００ｃｍ³ の８０％メタノールと共に均一化し、３時間室温で浸漬し、メタノール抽出液を得た。
次に、メタノール抽出液を、ロータリーエバポレータを用いて濃縮した。この濃縮液を、ジエチルエーテル：水＝５：２により分配した。活性はジエチルエーテル層に検出された。ジエチルエーテル層を濃縮し、少量のメタノールに溶解させ、これを逆相カラムクロマトグラフィー（和光純薬工業製、Wakogel40C18）により分画し、活性画分を得た。この活性画分を、カラム（東ソー社製、TSKgel Super ODS）を接続した高速液体クロマトグラフィーにより更に分画した。最終的に２つの活性物質を精製した。

得られた二つの化合物について質量分析ならびにプロトン及びカーボン核磁気共鳴分析により化学構造を決定した。これら二つの化合物は、それぞれ、リノール酸及びα−リノレン酸と同一のスペクトルを示し、リノール酸及びα−リノレン酸であると同定した。

実施例２の硝化抑制剤として、リノール酸を以下の方法で製造した。
アマニ油１リットル（１０００ｃｍ³ ）に、０．１％の水酸化ナトリウムを適量加熱しながら加え、加水分解した後、塩酸により中和し、水と分離した油分を得た。この油分を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等により精製し、リノール酸を製造した。

実施例３の硝化抑制剤として、α−リノレン酸を以下の方法で製造した。
アマニ油１リットルに、０．１％の水酸化ナトリウムを適量加熱しながら加え、加水分解した後、塩酸により中和し、水と分離した油分を得た。この油分を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等により精製し、α−リノレン酸を製造した。

実施例４の硝化抑制剤として、γ−リノレン酸を以下の方法で製造した。
サクラソウ種子から圧搾して得られた油０．１リットルに、０．１％の水酸化ナトリウムを適量加熱しながら加え、加水分解した後、塩酸により中和し、水と分離した油分を得た。この油分を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等により精製し、γ−リノレン酸を製造した。

実施例５の硝化抑制剤として、リノール酸メチルを以下の方法で製造した。
アマニ油１リットルへ０．２リットルのメタノールを加えたものに、０．１％の水酸化ナトリウムを適量加熱しながら加え、加水分解した後、塩酸により中和し、水と分離した油分を得た。この油分を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー等により精製し、リノール酸メチルを製造した。

（比較例１〜７）
脂肪酸の比較例として、市販のステアリン酸（比較例１）、オレイン酸（比較例２）、バクセン酸（比較例３）、アラキドン酸（比較例４）を用意した。
また、脂肪酸メチルエステル又は脂肪酸エチルエステル（以下、適宜、脂肪酸メエステルと呼ぶ）として、何れも市販の、オレイン酸メチル（比較例５）、α−リノレン酸メチル（比較例６）、リノール酸エチル（比較例７）を用意した。

次に、上記実施例及び比較例の脂肪酸及び脂肪酸エステルの硝化抑制作用について説明する。
測定は、試験管内の硝化細菌を用いて行った。最初に、測定に用いた硝化細菌の懸濁液の調製について説明する。
細菌由来のルシフェラーゼ遺伝子（luxAB ）を導入した硝化細菌（Nitrosomonas europaea IFO14298 、非特許文献４参照）を、カナマイシン２５ｍｇ／１０００ｃｍ³ を含むＰ培地中で、３０℃において好気的に７〜９日間培養し、洗浄後、新鮮なＰ培地に懸濁して、硝化細菌懸濁液を調製した。この硝化細菌懸濁液は、実験前に３０分以上暗所に静置した。
ここで、Ｐ培地の組成は、（ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ ２．５ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．７ｇ、Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ １３．５ｇ、ＮａＨＣＯ₃ ０．５ｇ、ＭｇＳＯ₄ −７Ｈ₂ Ｏ１００ｍｇ、ＣａＣｌ₂ −２Ｈ₂ Ｏ５ｍｇ、Ｆｅ−ＥＤＴＡ１ｍｇ、水１０００ｃｍ³ からなり、そのｐＨは８．０であった。

硝化作用は、上記の硝化細菌懸濁液０．２５ｃｍ³ と水０．２ｃｍ³ からなる硝化細菌懸濁液の水溶液と、各実施例及び比較例の試料溶液０．０１ｃｍ³ と、を試験管内で混合した後で、１５℃で３０分間培養する間における、硝化反応に伴う生物発光量を、ルミノメータ（ターナー・デザインズ社製、型名ＴＤ２０／２０）を用いて測定することにより評価した。硝化反応に伴う生物発光量は、各実施例及び比較例の試料溶液に、硝化抑制作用物質が存在すれば、発光量が減少する。このため、硝化細菌懸濁液の水溶液に各実施例及び比較例の試料溶液を添加した場合の発光量を、各実施例及び比較例の試料溶液を加えないで、菌体懸濁液の水溶液だけの場合の発光量で割った値を硝化抑制率とした。

図１は、実施例及び比較例の各種脂肪酸及び脂肪酸エステルの硝化抑制率を示す表である。この場合の各実施例及び比較例の試料溶液の濃度は２０ｐｐｍである。
図から明らかなように、脂肪酸として、実施例１及び２のリノール酸、実施例１及び３のα−リノレン酸、及び実施例４のγ−リノレン酸の硝化抑制率は９５％であることが分かった。脂肪酸エステルとして、実施例５のリノール酸メチルの硝化抑制率は９５％であることが分かった。
実施例に対して、比較例１〜４の脂肪酸であるステアリン酸、オレイン酸、バクセン酸、アラキドン酸及び脂肪酸エステルである比較例５〜７のオレイン酸メチル、α−リノレン酸メチル、リノール酸エチルの何れも、硝化反応を抑制しないことが判明した。

次に、硝化抑制剤であることが判明した、実施例１〜５のリノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸及びリノール酸メチルの硝化抑制率に対する濃度依存性を調べた。測定は、硝化細菌懸濁液の水溶液に対する各実施例及び比較例の試料溶液の濃度を、０〜２０ｐｐｍまで変化させて上記と同様に行なった。

図２は、実施例の硝化抑制剤による硝化抑制率の濃度依存性を示す図である。図２において、横軸は各実施例及び比較例の試料溶液の濃度（ｐｐｍ）を示し、縦軸は硝化抑制率（％）を示している。
図から明らかなように、実施例１及び２のリノール酸の硝化抑制率は、リノール酸濃度を８ｐｐｍ，１２ｐｐｍ，１６ｐｐｍ，２０ｐｐｍと変化させたときに、それぞれ、４０％，６５％，９０％，９５％となることが分かった。
実施例１及び３のα−リノレン酸の硝化抑制率は、α−リノレン酸濃度を８ｐｐｍ，１２ｐｐｍ，１６ｐｐｍ，２０ｐｐｍと変化させたときに、それぞれ、４０％，８０％，９０％，９５％となることが分かった。
実施例４のγ−リノレン酸の硝化抑制率は、γ−リノレン酸の濃度を８ｐｐｍ，１２ｐｐｍ，１６ｐｐｍ，２０ｐｐｍと変化させたときに、それぞれ、３０％，７２％，９０％，９５％となることが分かった。
実施例５のリノール酸メチルの硝化抑制率は、リノール酸メチル濃度を８ｐｐｍ，１２ｐｐｍ，１６ｐｐｍ，２０ｐｐｍと変化させたときに、それぞれ、８０％，９０％，９２％，９５％となることが分かった。
上記結果から、実施例のリノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸及びリノール酸メチルの何れの物質も、その濃度が上昇すると共に、硝化抑制率が増加することが判明した。そして、各物質の硝化抑制率が８０％となる濃度（以下、適宜に、８０％抑制濃度と呼ぶ）は、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸及びリノール酸メチルにおいて、それぞれ、約１６、１２、約１６、８ｐｐｍであった。これから、８０％抑制濃度は、リノール酸、γ−リノレン酸、α−リノレン酸、リノール酸メチルの順に低下し、リノール酸メチルが最も低い濃度となることが判明した。

従来の合成薬剤からなる硝化抑制剤の８０％抑制濃度は、ニトラピリンで４ｐｐｍであり、ジシアンジアミドで１８５ｐｐｍである。
これにより、実施例１〜５の硝化抑制剤における８０％抑制濃度は、ニトラピリンに匹敵し、ジシアンジアミドよりも、はるかに低濃度でも十分な硝化作用が得られることが判明した。実施例のこれら脂肪酸及び脂肪酸エステルによる硝化細菌の硝化反応を阻害するという事実は、新規の知見である。

実施例６として、肥料成分として硫酸アンモニウムと、硝化抑制剤としてリノール酸メチルと、黒ボク土と、からなる肥料組成物を製造した。
黒ボク土は、茨城県つくば市八幡台にある独立行政法人国際農林水産業研究センター試験圃場の深さ０〜１５ｃｍの表土から採取し、粘土５４．８％、シルト２６．３％、砂１８．９％より構成され、全炭素含量は３０ｇ／ｋｇ、全窒素含量は２．６４ｇ／ｋｇであった。この黒ボク土を風乾して、２ｍｍのふるいを用いて均一にして、乾燥した黒ボク土（以下、適宜、乾土と呼ぶ）とした。
乾土あたりの窒素添加量が２００ｐｐｍである硫酸アンモニウムと、乾土あたりの添加量が１０００ｐｐｍのリノール酸メチルと、を乳鉢を用いて、均一に乾土と混ぜ合わせて、実施例６の肥料を得た。

硝化抑制剤を実施例１のリノール酸メチルの代わりにα−リノレン酸とした以外は、実施例１と同様にして、実施例７の肥料を得た。

硝化抑制剤を実施例１のリノール酸メチルの代わりにリノール酸とした以外は、実施例１と同様にして、実施例８の肥料を得た。

（比較例８）
硝化抑制剤を添加しない以外は、実施例１と同様にして比較例８の肥料を得た。

次に、実施例６〜８及び比較例８の肥料の硝化抑制効果について測定した。
測定は、実施例６〜８及び比較例８の肥料を、ガラス容器中に入れ、針穴を開けた樹脂製のフィルム、例えばパラフィルム（商品名）で蓋をして、恒温恒湿装置に設置した。そして、温度が２０℃、肥料の土壌孔隙の水分飽和度が６０％となるように制御した。
一定時間後に、肥料２ｇを取り出し、２０ｃｍ³ の２Ｍ（モル）塩化カリウムを加え、２時間振とうし、肥料中の硝酸を抽出し、ろ過した。このろ液に含まれる硝酸イオンを自動イオン分析装置（Ｂｒａｎｔ＋Ｌｕｅｂｂｅ社製、型番ＡＡＩＩ）により定量した。

図３は、実施例６〜８及び比較例８の肥料における３０日後及び６０日後の硝酸濃度の測定結果を示す表である。
図から明らかなように、実施例６のリノール酸メチルを１０００ｐｐｍ含む肥料においては、３０日後及び６０日後の硝酸濃度は、何れも１０ｐｐｍＮであった。ここで、ｐｐｍＮは、土壌中の窒素含有量である。
実施例７のα−リノレン酸を１０００ｐｐｍ含む肥料においては、３０日後及び６０日後の硝酸濃度は、それぞれ、１８ｐｐｍＮ，１６ｐｐｍＮであった。
実施例８のリノール酸を１０００ｐｐｍ含む肥料においては、３０日後及び６０日後の硝酸濃度は、それぞれ、１９ｐｐｍＮ，６２ｐｐｍＮであった。
これに対して、比較例８の硝化抑制剤を添加していない肥料の場合には、３０日後及び６０日後の硝酸濃度は、それぞれ、１０１ｐｐｍＮ，２０９ｐｐｍＮとなった。この比較例８の３０日後の硝酸濃度は、実施例６〜８の硝化抑制剤を含む肥料の硝酸濃度の数倍から１０倍の大きい値である。さらに、比較例の６０日後の硝酸濃度は３０日後の硝酸濃度の約２倍となり、保管日数に比例して増加した。

次に、実施例６〜８の肥料の５０％作用濃度、即ち、硝化に対して５０％の阻害を与える硝化抑制剤の濃度を調べた。具体的には、実施例６〜８の肥料において、硝化抑制剤の濃度を変えた肥料を調製し、上記と同様に恒温恒湿装置に３０日間保管した。その結果、３０日間の保管後の実施例６〜８の各硝化抑制剤の５０％作用濃度は、それぞれ、３３０ｐｐｍ、２００ｐｐｍ及び３３０ｐｐｍであった。
これから、実施例６〜８の肥料における硝化抑制効果が顕著であることが判明し、特に、リノール酸メチルは土壌中でも効果的に硝化を抑制した。

上記実施例から分かるように、実施例の硝化抑制剤は、従来の合成薬剤からなる硝化抑制剤のニトラピリンに匹敵する硝化抑制効果を有している。また、実施例の硝化抑制剤を含有させた肥料においても、効果的に硝化抑制ができることが判明した。

本発明は、上記実施例に限定されることなく、特許請求の範囲に記載した発明の範囲内で種々の変形が可能であり、それらも本発明の範囲内に含まれることはいうまでもない。例えば、本発明の硝化抑制剤を含む土壌改良剤や肥料の組成は、栽培する農産物や花木類に応じて適宜に設計すればよく、上記実施例に限らないことはいうまでもない。

実施例及び比較例の各種脂肪酸及び脂肪酸エステルの硝化抑制率を示す表である。 実施例の硝化抑制剤による硝化抑制率の濃度依存性を示す図である。 実施例６〜８及び比較例８の肥料における３０日後及び６０後の硝酸濃度の測定結果を示す表である。

Claims (1)

1. リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、及びリノール酸メチルの何れか１種または２種以上の混合物を主成分とし、土壌の硝化を抑制することを特徴とする、硝化抑制方法。

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