JP2017160100A

JP2017160100A - 発芽阻害物質を低減した堆肥の製造方法

Info

Publication number: JP2017160100A
Application number: JP2016048426A
Authority: JP
Inventors: 木邑　敏章; Toshiaki Kimura; 敏章木邑
Original assignee: Toyota Motor Corp
Current assignee: Toyota Motor Corp
Priority date: 2016-03-11
Filing date: 2016-03-11
Publication date: 2017-09-14
Anticipated expiration: 2036-03-11
Also published as: JP6685492B2

Abstract

【課題】家畜糞等の有機残渣に存在するフェノール性化合物のような発芽阻害物質を分解して、発芽阻害物質を低減した堆肥を製造する手段を提供する。【解決手段】本発明は、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）に属し、受託番号NITE BP-998で特定される微生物を有機残渣に添加して、有機残渣中に存在するバニリン酸及びt-フェルラ酸からなる群より選択される少なくとも1種の発芽阻害物質を分解する、発芽阻害物質分解工程；前記微生物を含む有機残渣を堆肥化する、堆肥化工程;を含む、発芽阻害物質を低減した堆肥の製造方法に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、発芽阻害物質を低減した堆肥の製造方法に関する。

家畜糞堆肥は、地力を維持し且つ作物の生産性を向上させる有機質資材である。従来、作物の生産性向上には、化学肥料が多用されてきた。しかしながら、近年の減農薬・減化学肥料農法、或いは有機農法の広がりに伴い、家畜糞堆肥の使用量も増加している。

家畜糞堆肥は、通常は、家畜の糞尿等にオガクズ、ワラ又はバーク等の副資材を添加した有機残渣を混合して堆肥化する。この際、糞尿に由来する低級脂肪酸類が揮発して、悪臭を発生させる場合がある。また、家畜糞又は副資材として添加するワラ等に由来するリグニンが代謝されて、発芽阻害活性を有するフェノール性化合物が生成する場合がある。これに対し、低級脂肪酸及び／又はフェノール性化合物を代謝する能力を有する微生物を堆肥の製造に使用する技術が知られている。

特許文献1は、有機質肥料の製造方法であって、畜糞尿に天然ウオラストナイト及び濃硫酸を添加混合して粒状の培地とするステップ、当該培地に別のステップで培養した有効微生物を加えて醗酵させるステップ、醗酵の旺盛な当該培地の一部を種菌として繰り返し使用することにより連続して培養と醗酵を行うステップ、とを含むことを特徴とする、有機質肥料の製造方法を記載する。当該文献は、前記方法で得られる有機質肥料は、オガクズ、ワラ又はバーク等のような水分調整剤を必要としないので、これらに由来するフェノール性化合物による植物に対する生育阻害が起こらないと記載する。

特許文献2は、低級脂肪酸に対して脱臭能を有し、且つバチルス・リケニホルミス(Bacillus licheniformis)に属する好熱性微生物、及び該微生物を有効成分として含有する脱臭剤を記載する。当該文献はまた、前記微生物又は脱臭剤を有機残渣に添加する工程を含む、堆肥の製造方法を記載する。

非特許文献1は、リグニン由来のフェノール性化合物を分解する能力を有する微生物として、特定のスフィンゴモナス（Sphingomonas）属細菌及びシュードモナス（Pseudomonas）属細菌を記載する。

特開平10-152385号公報特開2012-105556号公報

Masaiら, Biosci. Biotechnol. Biochem., 2007年, 第71巻, p. 1-5

前記のように、微生物の代謝能力を利用して堆肥の性質を改良する技術が知られている。しかしながら、堆肥に添加した場合に、発芽阻害活性を有するフェノール性化合物を顕著に分解し、且つ長期間に亘って安定に生存し得る微生物は知られていなかった。

それ故、本発明は、家畜糞等の有機残渣に存在するフェノール性化合物のような発芽阻害物質を分解して、発芽阻害物質を低減した堆肥を製造する手段を提供することを目的とする。

本発明者は、前記課題を解決するための手段を種々検討した。本発明者は、バチルス・リケニホルミスに属する特定の細菌が、発芽阻害活性を有するフェノール性化合物を顕著に分解する能力を有することを見出した。本発明者らは、前記知見に基づき、本発明を完成した。

すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（1）バチルス・リケニホルミスに属し、受託番号NITE BP-998で特定される微生物を有機残渣に添加して、有機残渣中に存在するバニリン酸及びt-フェルラ酸からなる群より選択される少なくとも1種の発芽阻害物質を分解する、発芽阻害物質分解工程；
前記微生物を含む有機残渣を堆肥化する、堆肥化工程;
を含む、発芽阻害物質を低減した堆肥の製造方法。

本発明により、家畜糞等の有機残渣に存在するフェノール性化合物のような発芽阻害物質を分解して、発芽阻害物質を低減した堆肥を製造する手段を提供することが可能となる。

図1は、LB培地で30℃、5日間前培養したバチルス・リケニホルミスTAB7株又はスフィンゴモナス・パウシモビリス（Sphingomonas paucimobilis）SYK-6株を、t-フェルラ酸を含有する培地で、30℃、300ストローク／分の条件で12時間振盪培養した結果を示す図である。図2は、LB培地で30℃、5日間前培養したバチルス・リケニホルミスTAB7株又はスフィンゴモナス・パウシモビリスSYK-6株を、バニリンを含有する培地で、30℃、300ストローク／分の条件で48時間振盪培養した結果を示す図である。図3は、LB培地で30℃、5日間前培養したバチルス・リケニホルミスTAB7株又はスフィンゴモナス・パウシモビリスSYK-6株を、シリンガ酸又はバニリン酸を含有する培地で、30℃、300ストローク／分の条件で48時間振盪培養した結果を示す図である。図4は、LB培地で30℃、5日間前培養したバチルス・リケニホルミスTAB7株又はスフィンゴモナス・パウシモビリスSYK-6株を、プロトカテク酸を含有する培地で、30℃、300ストローク／分の条件で48時間振盪培養した結果を示す図である。図5は、LB培地で30℃、3.5日間前培養したバチルス・リケニホルミスTAB7株又はスフィンゴモナス・パウシモビリスSYK-6株を、各種フェノール性化合物を含有する培地で、30℃、120ストローク／分の条件で48時間振盪培養した結果を示す図である。図6は、バチルス・リケニホルミスTAB7株の休止菌体を含む反応液中のフェノール性化合物のHPLC分析による定量の結果を示す図である。図7は、発芽阻害物質を低減した豚糞堆肥の発芽試験の結果を示す図である。A〜C：対照区の堆肥を施用した結果、D〜F：試験区の堆肥を施用した結果。A及びD：M農場由来の原料糞を用いて3日間堆肥化した堆肥を施用した結果、B及びE：H農場由来の原料糞を用いて3日間堆肥化した堆肥を施用した結果、C及びF：H農場由来の原料糞を用いて7日間堆肥化した堆肥を施用した結果。

以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。

＜1：発芽阻害物質を低減した堆肥の製造方法＞
家畜糞堆肥には、フェノール性化合物のような発芽阻害物質が含まれる場合があることが知られている。これらの発芽阻害活性を有するフェノール性化合物は、多くの場合、家畜糞又は副資材として添加するオガクズ、ワラ又はバーク等に由来するリグニンが代謝されて生成する。

堆肥に含まれる発芽阻害物質を低減するために微生物を使用する場合、リグニン代謝能力を有することに加えて、芽胞を形成する能力を有することが重要である。芽胞形成能力を有していない微生物の場合、高温条件下となる有機残渣の堆肥化の間、又はその前後において、常温〜高温で長期間に亘って安定に生存することが困難である。しかしながら、芽胞形成能力を有するバチルス属細菌又はその類縁細菌において、芳香族化合物を分解する能力を有することが知られている菌株は少ない。さらに、これらの細菌において、リグニン由来のフェノール性化合物を分解する能力を有することが知られている菌株は存在しなかった（特開平7-155175号公報；長谷川志、微生物進化プロジェクト研究終了報告書、1996年、p. 355-368；Shimura, M.ら, 1999年, FEMS Microbiol. Lett., 第178巻, p. 87-93）。

本発明者は、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）に属する特定の細菌が、発芽阻害活性を有するフェノール性化合物を顕著に分解する能力を有することを見出した。それ故、本発明の一態様は、発芽阻害物質を低減した堆肥の製造方法に関する。本態様に係る発芽阻害物質を低減した堆肥の製造方法は、発芽阻害物質分解工程及び堆肥化工程を含む。各工程について、以下において詳細に説明する。

［I-1：発芽阻害物質分解工程］
本態様の方法は、バチルス・リケニホルミスに属する微生物を有機残渣に添加して、有機残渣中に存在する少なくとも1種の発芽阻害物質を分解する、発芽阻害物質分解工程を含むことが必要である。

本態様の方法において使用される微生物は、バチルス・リケニホルミスに属し、受託番号NITE BP-998で特定される好熱性微生物である（特開2012-105556号公報）。本明細書において、前記微生物を「バチルス・リケニホルミスTAB7株」又は単に「TAB7株」と記載する場合がある。TAB7株は、受託番号NITE BP-998として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている。TAB7株は、50℃以上、例えば50〜60℃、好ましくは55〜60℃の範囲の高温条件下でも生育できる好熱性微生物である。それ故、前記微生物は、有機残渣の堆肥化における50℃以上の高温条件下においても活発に生育し、且つ発芽阻害物質を分解することができる。また、TAB7株は、有機残渣の悪臭の原因となる低級脂肪酸を分解する能力を有する。それ故、本態様の方法に前記微生物を使用することにより、有機残渣から発生する悪臭を低減することができる。

本発明において、バチルス・リケニホルミスに属し、受託番号NITE BP-998で特定される微生物は、TAB7株自体だけでなく、以下において説明する発芽阻害物質を分解する能力を有するTAB7株の変異株も包含する。本発明において、TAB7株の変異株は、TAB7株の自然変異株又は人工変異株を意味する。TAB7株の人工変異株は、当該技術分野で通常使用される任意の人工変異株の作出手段によって得ることができる。TAB7株自体だけでなく、TAB7株の変異株であっても、発芽阻害物質を分解する能力を有する微生物であれば、本工程において有機残渣中に存在する少なくとも1種の発芽阻害物質を分解することができる。

前記微生物は、例えば、LB培地、有機成分を添加したWx培地若しくはCFMM培地、又は1％グルコース、1％酵母抽出物、0.1％ Na₂HPO₄及び0.1％ (NH₄)₂SO₄を含有する培地において、pH6.0〜9.0（例えば、pH7.0）及び温度25℃〜55℃（好ましくは45℃〜52℃）の条件下で培養し、生育させることができる。なお、前記微生物の培養に使用する培地は、前記で例示した培地に限定されず、例えば肉汁若しくはペプトン等の有機成分及び微量の無機成分を含有する、一般的な発酵技術に使用される多数の栄養培地のいずれであってもよい。

前記微生物は、増殖菌体及び休止菌体のいずれの状態であってもよい。いずれの状態であっても、前記微生物の有するリグニン代謝系の酵素活性により、リグニン由来のフェノール性化合物を分解することができる。

前記微生物は、芽胞を含む状態であってもよく、芽胞を含まない状態であってもよい。前記微生物は、芽胞を含む状態であることが好ましい。芽胞を含む状態の前記微生物を使用することにより、該微生物を常温〜高温で長期間に亘って安定に生存させることができる。

前記微生物は、前記で説明したそのままの形態で有機残渣に添加することができる。しかしながら、前記微生物は、担体に担持された形態（以下、「微生物資材の形態」又は単に「微生物資材」とも記載する）で有機残渣に添加することが好ましい。前記微生物を微生物資材の形態で使用する場合、担体としては、例えば、パーライト、ベントナイト、ゼオライト、バーミキュライト、珪藻土、ピートモス、又は活性炭等を挙げることができる。微生物資材の形態の場合、例えば、1 kgのパーライトに100 mlの前記微生物の培養液（660 nmでの濁度（OD）が約2.0）を添加し、約5分間撹拌することにより、パーライトに前記微生物が吸着された微生物資材を得ることができる。また、微生物資材は、所望により、デンプン、油、フスマ、オガクズ、セルロース、糖質、キチン、ゼラチン、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸マグネシウム、活性炭、珪藻土、ゼオライト、ガラス、ナイロン、ウレタン又はポリエステル等の1個以上の添加物を含むことができる。好適な微生物資材としては、例えば、豚レスキュー資材（商標）及びモーレスキュー資材（商標）（トヨタルーフガーデン社製）を挙げることができる。

本工程において、有機残渣に添加する前記微生物の菌数は、使用される有機残渣の種類及び量、並びに使用される前記微生物の状態等に基づき適宜設定することができる。例えば、家畜糞を含む約60％の含水率の有機残渣を使用する場合、1 kgの前記微生物及び有機残渣の混合物に対して、10⁵〜10¹³個の前記微生物が存在するように該微生物を添加すればよい。前記範囲の菌数で前記微生物を有機残渣に添加することにより、有機残渣中に存在する少なくとも1種の発芽阻害物質を分解することができる。

本態様の方法において、有機残渣としては、限定するものではないが、例えば、人糞又は家畜（例えば、ブタ、ウシ若しくはニワトリ）の糞を含む、動物の糞又は糞尿混合物を挙げることができる。有機残渣は、物性、成分及び／又は水分の調整等の目的により、オガクズ、ワラ又はバーク等の1個以上の副資材を含むことができる。有機残渣の含水率は、当該技術分野で堆肥の製造に使用される通常の範囲であればよく、例えば約60％である。

これらの有機残渣中には、通常は、フェノール性化合物のような発芽阻害物質が存在する。フェノール性化合物である発芽阻害物質としては、例えば、バニリン酸、t-フェルラ酸、バニリン、シリンガ酸及びプロトカテク酸を挙げることができる。本発明者は、バチルス・リケニホルミスTAB7株が、これらのフェノール性化合物のうち、バニリン酸及びt-フェルラ酸を顕著に分解する能力を有することを見出した。それ故、本工程において、前記微生物を有機残渣に添加することにより、有機残渣中に存在するバニリン酸及びt-フェルラ酸からなる群より選択される少なくとも1種の発芽阻害物質を分解することができる。本発明において、「有機残渣中に存在するバニリン酸及びt-フェルラ酸からなる群より選択される少なくとも1種の発芽阻害物質を分解する」は、有機残渣中に存在する少なくとも1種の発芽阻害物質を、微生物を添加しない有機残渣中の含有量と比較して有意に減少させることを意味し、好ましくは、有機残渣中に存在する少なくとも1種の発芽阻害物質を、当該技術分野で通常使用される機器分析手段によって実質的に検出されない含有量まで分解することを意味する。一実施形態において、有機残渣中に存在するバニリン酸及びt-フェルラ酸からなる群より選択される少なくとも1種の発芽阻害物質は、発芽阻害物質の合計として、前記微生物を含む有機残渣の総質量に対して、例えば、100mg/kg以下、好ましくは10 mg/kg以下の含有量となるまで分解される。有機残渣中に存在するバニリン酸及びt-フェルラ酸からなる群より選択される少なくとも1種の発芽阻害物質を分解することにより、本態様の方法により得られる堆肥の発芽阻害物質を低減することができる。

前記微生物を含まない有機残渣又は前記微生物を含む有機残渣中に存在する発芽阻害物質の含有量は、例えば、有機残渣を溶媒抽出し、得られた抽出物を所望により溶媒分画又は各種クロマトグラフィー等の手段で精製処理した後、該抽出物又は精製画分に含まれる発芽阻害物質を、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）又は液体クロマトグラフィー／質量分析（LC/MS）等の機器分析手段によって定量することにより、決定することができる。

［I-2：堆肥化工程］
本態様の方法は、発芽阻害物質分解工程で得られた微生物を含む有機残渣を堆肥化する、堆肥化工程を含むことが必要である。

本工程において、前記微生物を含む有機残渣を堆肥化する手段は特に限定されず、レーン式通気攪拌装置による好気発酵、又はレーン若しくはピット内での切り返しによる好気発酵等、当該技術分野で通常実施される有機残渣の堆肥化手段を適宜選択することができる。

本態様の方法において、発芽阻害物質分解工程及び堆肥化工程は、別々の工程として実施してもよく、実質的に同時に実施してもよい。両工程を別々の工程として実施する場合、発芽阻害物質分解工程を実施し、次いで、発芽阻害物質分解工程で得られた微生物を含む有機残渣を堆肥化することにより、堆肥化工程を実施する。或いは、両工程を実質的に同時に実施する場合、前記微生物を有機残渣に添加することにより、有機残渣中に存在するバニリン酸及びt-フェルラ酸からなる群より選択される少なくとも1種の発芽阻害物質を分解し、且つ、実質的に同時に、前記微生物を含む有機残渣を堆肥化する。前記で説明したように、TAB7株は好熱性微生物であることから、両工程を実質的に同時に実施する場合であっても、有機残渣の堆肥化における50℃以上の高温条件下で該微生物が活発に生育し、発芽阻害物質を分解することができる。

＜II：発芽阻害物質が低減された堆肥＞
本態様の方法により、有機残渣中に存在するバニリン酸及びt-フェルラ酸からなる群より選択される少なくとも1種の発芽阻害物質が分解されて、発芽阻害物質が低減された堆肥が得られる。それ故、本発明の別の一態様は、有機残渣中に、バチルス・リケニホルミスに属し、受託番号NITE BP-998で特定される微生物を含有する、バニリン酸及びt-フェルラ酸からなる群より選択される少なくとも1種の発芽阻害物質が低減された堆肥に関する。一実施形態において、本態様の堆肥は、総質量に対して、例えば、100 mg/kg以下、好ましくは10mg/kg以下の含有量で、バニリン酸及びt-フェルラ酸からなる群より選択される少なくとも1種の発芽阻害物質を含有する。本態様の堆肥は、前記範囲の含有量まで少なくとも1種の発芽阻害物質が低減されていることにより、前記微生物を含有しない堆肥と比較して、各種の作物に対して高い発芽活性を発現することができる。

本態様の堆肥における少なくとも1種の発芽阻害物質の含有量は、前記で説明した有機残渣中に存在する発芽阻害物質の含有量の決定手段と同様の手段により、決定することができる。

本態様の堆肥の発芽活性は、コマツナ等の試験作物の種子を用いる通常の発芽試験により、決定することができる。

本態様の堆肥は、例えば、コマツナ、キャベツ、ネギ、レタス、ハクサイ、ホウレンソウ、ブロッコリー、アスパラガス、トマト、ナス、ダイズ又はイネ等の様々な作物に対して施用することができる。施用時期は特に限定されないが、播種前が好ましい。播種前のこれらの作物の圃場に本態様の堆肥を施用することにより、発芽阻害を実質的に回避して、該作物を良好に生育させることができる。

本態様の堆肥に含有される前記微生物は、有機残渣中に存在する少なくとも1種の発芽阻害物質を分解することができる。また、前記微生物の低級脂肪酸分解能力により、有機残渣の悪臭を低減することができる。さらに、前記微生物は芽胞形成能力を有することから、長期間に亘って前記効果を発現することができる。それ故、本態様の堆肥は、作物の発芽阻害及び悪臭の発生を長期間に亘って実質的に回避することができる。

＜III：有機残渣に含まれる発芽阻害物質を低減する方法＞
本発明の別の一態様は、有機残渣に含まれる発芽阻害物質を低減する方法に関する。本態様の方法は、バチルス・リケニホルミスに属し、受託番号NITE BP-998で特定される微生物を有機残渣に添加して、有機残渣中に存在するバニリン酸及びt-フェルラ酸からなる群より選択される少なくとも1種の発芽阻害物質を分解する、発芽阻害物質分解工程を含むことが必要である。

本態様の方法に含まれる発芽阻害物質分解工程は、本発明の一態様に係る発芽阻害物質を低減した堆肥の製造方法に含まれる発芽阻害物質分解工程と同様に実施することができる。前記で説明した特徴を備える発芽阻害物質分解工程を実施することにより、有機残渣中に存在する少なくとも1種の発芽阻害物質を分解して、有機残渣に含まれる発芽阻害物質を低減することができる。この際、前記微生物の低級脂肪酸分解能力により、有機残渣の悪臭を低減することができる。さらに、前記微生物は芽胞形成能力を有することから、長期間に亘って前記効果を発現することができる。それ故、本態様の方法を実施することにより、作物の発芽阻害及び悪臭の発生を長期間に亘って実質的に回避し得る有機残渣を、堆肥の原料等の農業資材として提供することができる。

以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

＜I：材料＞
［I-1：使用する微生物］
試験株として、バチルス・リケニホルミスTAB7株（FERM BP-4493、受託番号NITE BP-998）を、対照株として、スフィンゴモナス・パウシモビリス（Sphingomonas paucimobilis）SYK-6株（Masaiら, Biosci. Biotechnol. Biochem., 2007年, 第71巻, p. 1-5）を、それぞれ使用した。SYK-6株は、リグニン分解物の代謝経路（Y. Katayamaら, FEBS Lett., 1988年, 第233巻, p. 129-133）及びリグニン分解物の代謝酵素遺伝子（X. Pengら, Appl. Environ. Microbiol., 1998年, 第64巻, p. 2520-2527）が明らかにされている。SYK-6株は、長岡技術科学大学の政井教授から分譲して頂いた。

［I-2：使用する化合物］
リグニン分解物として、t-フェルラ酸（東京化成工業）、バニリン（関東化学）、バニリン酸（ナカライテスク）、シリンガ酸（東京化成工業）及びプロトカテク酸（和光純薬工業）を使用した。

＜II：フェノール性化合物を炭素源とする培地における微生物の生育試験＞
［II-1：使用する培地］
本試験に使用するWx培地の組成を表1に、培地に添加する有機成分（SEMP）の組成を表2に、CFMM培地の組成を表3に、それぞれ示す。Wx培地にSEMPを所定量添加し、さらに各フェノール性化合物を3 mM又は10 mMの最終濃度となるように添加した。また、CFMM培地に、各フェノール性化合物を唯一の炭素源として添加した。

［II-2：方法］
TAB7株及びSYK-6株を、LB培地で30℃、3.5又は5日間前培養した。SEMP及びフェノール性化合物を含有するWx培地に、新鮮培地で3回洗浄した前培養後のTAB7株又はSYK-6株を植菌した。また、フェノール性化合物を唯一の炭素源として含有するCFMM培地に、新鮮培地で3回洗浄した前培養後のTAB7株又はSYK-6株を植菌した。植菌した微生物を、30℃、120又は300ストローク／分の条件で12時間又は48時間振盪培養した。

［II-3：結果］
培養結果を図1〜5に示す。12時間培養後、3 mM又は10 mM t-フェルラ酸を含有するWx+SEMP培地において、培地が白濁した（図1）。48時間培養後、シリンガ酸を含有するWx+SEMP培地以外の培地において、TAB7株の生育が確認された（図2〜5）。CFMM培地においては、48時間培養後であっても微生物の生育は確認されなかった。

＜III：微生物によるフェノール性化合物の分解試験＞
［III-1：微生物の休止菌体の調製］
TAB7株を、LB寒天培地又はペプトン含有培地（10 g/L ペプトン、10 g/L Tween 20、5 g/L NaCl、0.1 g/L CaCl₂・2H₂O、1.5％寒天）に植菌して、30℃又は50℃で前培養した。SEMP及び10 mM t-フェルラ酸を含有するWx培地に、前培養後のTAB7株を植菌した。植菌した微生物を、30℃、300ストローク／分の条件で20時間振盪培養した。培養終了後、微生物菌体を回収して、CF緩衝液（Na₂HPO₄ 2.2 g/L, KH₂PO₄ 0.8 g/L, NH₄NO₃ 3.0 g/L）で2回洗浄した。得られた微生物菌体を、休止菌体として以下の実験に用いた。

［III-2：微生物の休止菌体によるフェノール性化合物の分解反応］
前記III-1で得られた微生物菌体を、660 nmでのODが10となるようにCF緩衝液で希釈した。得られた10 mLの微生物菌体液を、20 mLのバイアルビンに入れた。このバイアルビンに、それぞれ200 μg/mLの最終濃度となるように、200 μLのフェノール性化合物（プロトカテク酸、バニリン酸、シリンガ酸及びt-フェルラ酸）のストック溶液を入れた。休止菌体を含む反応液を、30℃、60時間の条件で振盪させた。正の対照として、微生物菌体を添加しない反応液を調製し、前記と同様の条件で振盪させた。また、負の対照として、前記と同様の手順で調製した休止菌体を含む反応液をオートクレーブした後、前記と同様の条件で振盪させた。反応終了後、各反応液を遠心分離して上清を得た。上清を、0.22 μmの濾過フィルターで濾過した。濾過後の各反応液の上清30 μLを、HPLCで分析した。HPLCの条件は、以下の通りである；カラム：PEGASIL-B ODS, 内径4.6 mm×長さ250 mm；装置：HITACHI L-2000；移動相：（A）2％ CH₃COOH、（B）CH₃OH；溶出条件：15％→40％移動相（B）（0→22.5分）、40％移動相（B）（22.5→25分）、40％→15％移動相（B）（25→25.1分）、15％移動相（B）（25.1→30分）；流速：1 ml/分；カラム温度：40℃；検出：UV254 nm。各試料、正の対照及び負の対照の反応液について、前記実験を三連で実施した。

［III-3：結果］
休止菌体を含む反応液中のフェノール性化合物のHPLC分析による定量の結果を図6に示す。図6に示すように、バニリン酸及びt-フェルラ酸は、TAB7株の休止菌体によって検出限界以下の量まで分解された。これに対し、シリンガ酸及びプロトカテク酸は、TAB7株の休止菌体によって分解されなかった。

シリンガ酸は、フェルラ酸又はバニリン酸とは、微生物による分解経路が異なると予想されている。前記結果から、TAB7株は、シリンガ酸を分解する能力を有していない可能性が示唆される。

プロトカテク酸は、微生物によるリグニン代謝系において、t-フェルラ酸及びバニリン酸の下流に位置することが知られている。しかしながら、本実験では、プロトカテク酸はTAB7株の休止菌体によって分解されなかった。前記IIの実験で示すように、TAB7株は、t-フェルラ酸及びバニリン酸、並びに微弱ではあるがプロトカテク酸を含有する培地において生育した。この生育試験の結果を考慮すると、TAB7株の休止菌体においても、t-フェルラ酸及びバニリン酸はプロトカテク酸を経由して代謝及び分解されたと推測される。本実験において、プロトカテク酸の分解が確認されなかった原因としては、プロトカテク酸が親水性物質であることからTAB7株の細胞内へ取り込まれず、分解反応が十分に進行しなかったことが考えられる。

＜IV：微生物による発芽阻害物質を低減した堆肥の製造＞
［IV-1：TAB7株による発芽阻害物質の分解及び豚糞の堆肥化］
10 m³（8 kg）の原料糞（豚）に対して、1袋（9.5 kg）の豚レスキュー資材（商標）（トヨタルーフガーデン社製）を添加し、豚糞混合物を調製した。原料糞は、M農場（静岡県）及びH農場（宮城県）から入手したものを別々に使用した。負の対照として、豚レスキュー資材を添加しない豚糞混合物を調製した。これらの混合物を、レーン式通気攪拌装置を用いて3又は7日間処理し、堆肥化した。

［IV-2：発芽阻害物質を低減した豚糞堆肥の発芽試験］
試験区及び対照区の堆肥から少量を採取して、乾燥及び粉砕させた。得られた5 gの乾燥堆肥及び95 mLの沸騰水を、100 mLのポリ容器に入れて、振盪機を用いて200ストローク／分の条件で10分間振盪した。得られた混合物を遠心分離して、上清を得た。上清を、4倍に希釈した。試験区及び対照区の堆肥の希釈液を、発芽インデックス測定キット（ジェイペック社製）に入れた。次いで、コマツナの種子を測定キットの各レーンに播種し、インキュベーター内で25℃、7日間栽培した。

発芽阻害物質を低減した豚糞堆肥の発芽試験の結果を図7に示す。図中、A〜Cは、対照区の堆肥を施用した結果を、D〜Fは、試験区の堆肥を施用した結果を示す。また、A及びDは、M農場由来の原料糞を用いて3日間堆肥化した堆肥を施用した結果を、B及びEは、H農場由来の原料糞を用いて3日間堆肥化した堆肥を施用した結果を、C及びFは、H農場由来の原料糞を用いて7日間堆肥化した堆肥を施用した結果を、それぞれ示す。図7に示すように、対照区の堆肥を施用した場合と比較して、試験区の堆肥を施用した場合の発芽率は、顕著に向上した。

［IV-3：TAB7株による発芽阻害物質の分解及び牛糞の堆肥化］
10 m³（7 kg）の原料糞（肉牛）に対して、1袋（9.5 kg）のモーレスキュー資材（商標）（トヨタルーフガーデン社製）を添加し、牛糞混合物を調製した。原料糞は、K牧場（愛知県）及びAファーム（愛知県）から入手したものを別々に使用した。負の対照として、モーレスキュー資材を添加しない牛糞混合物を調製した。これらの混合物を、通気設備のないレーン又はピット内で適宜切り返しを行いながら堆肥化した。堆肥化の終了は、温度が上がらなくなった時点とした。

［IV-4：発芽阻害物質を低減した牛糞堆肥の発芽試験］
試験区及び対照区の堆肥を用いるコマツナの発芽試験を、一般財団法人畜産環境整備機構で実施した。発芽試験の方法は、農林水産技術会議事務局「家畜ふん堆肥の品質評価・利用マニュアル」(2004)に従った。

発芽阻害物質を低減した豚糞堆肥の牛糞堆肥の結果を表4に示す。

表4に示すように、対照区の堆肥を施用した場合の発芽率は、いずれの採取地由来の牛糞堆肥であっても0％であったのに対し、試験区の堆肥を施用した場合の発芽率は、60％を超える顕著に高い値を示した。

Claims

バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）に属し、受託番号NITE BP-998で特定される微生物を有機残渣に添加して、有機残渣中に存在するバニリン酸及びt-フェルラ酸からなる群より選択される少なくとも1種の発芽阻害物質を分解する、発芽阻害物質分解工程；
前記微生物を含む有機残渣を堆肥化する、堆肥化工程;
を含む、発芽阻害物質を低減した堆肥の製造方法。