JP5062578B2 - 薬物誘発性リン脂質症の予測方法 - Google Patents
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Description
このように、従来の薬物誘発性リン脂質症のスクリーニング法はいずれも信頼性および/または迅速性などの面で不十分であり、未だ実用的なスクリーニング系の確立には至っていない。
[1]薬物誘発性リン脂質症の予測方法であって、哺乳動物細胞と被検化合物とを接触させる工程、該細胞外および/または細胞内のリソソーム酵素の量もしくは活性を測定する工程、および該酵素の細胞外への分泌を促進した被検化合物を、薬物誘発性リン脂質症を誘発し得る化合物として選択する工程を含む方法;
[2]細胞外のリソソーム酵素の量もしくは活性を測定することを特徴とする、上記[1]記載の方法;
[3]薬物誘発性リン脂質症の予測方法であって、哺乳動物細胞と被検化合物とを接触させる工程、該細胞内のLC3の量を測定する工程、および該蛋白質の細胞内の量を増加させた被検化合物を、薬物誘発性リン脂質症を誘発し得る化合物として選択する工程を含む方法;
[4]哺乳動物がヒト、ラット、マウス、ハムスター、サルおよびイヌから選択される、上記[1]〜[3]のいずれかに記載の方法;
[5]細胞が肝臓、腎臓または肺由来のもの、あるいはリンパ球である、上記[1]〜[4]のいずれかに記載の方法;
[6]細胞が培養細胞である、上記[1]〜[5]のいずれかに記載の方法;
[7]リソソーム酵素が、β−ヘキソサミニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−マンノシダーゼ、カテプシンDおよびカテプシンLからなる群より選択される1以上の酵素である、上記[1]、[2]、[4]〜[6]のいずれかに記載の方法;および
[8]上記[1]または[3]記載の方法により選択された薬物誘発性リン脂質症を誘発し得る化合物を、候補から除外することを特徴とする医薬候補化合物の毒性スクリーニング方法を提供する。
[9]哺乳動物における薬物誘発性リン脂質症またはその関連疾患の診断のための検査方法であって、被検動物より採取した試料中のリソソーム酵素の量もしくは活性を測定する工程、および対照動物と比較して該酵素の細胞外への分泌が増大しているか否かを検定する工程を含む方法;
[10]哺乳動物における薬物誘発性リン脂質症またはその関連疾患の診断のための検査方法であって、被検動物より採取した試料中のLC3の量を測定する工程、および対照動物と比較して該蛋白質の細胞内の量が増大しているか否かを検定する工程を含む方法;
[11]試料が血清、血漿または尿である、上記[9]または[10]記載の方法;
[12]薬物誘発性リン脂質症の予測方法であって、哺乳動物細胞と被検化合物とを接触させる工程、該細胞内のマンノース6−リン酸受容体の局在を調べる工程、および該受容体の局在性を変化させた被検化合物を、薬物誘発性リン脂質症を誘発し得る化合物として選択する工程を含む方法;および
[13]哺乳動物における薬物誘発性リン脂質症またはその関連疾患の診断のための検査方法であって、被検動物より採取した細胞内のマンノース6−リン酸受容体の局在を調べる工程、および該受容体の局在性が変化しているか否かを検定する工程を含む方法などを提供する。
あるいは本発明はまた、哺乳動物細胞と被検化合物とを接触させ、該細胞内のLC3の量を測定し、該被検化合物が該蛋白質の細胞内での量を増大させるか否かを指標として、該被検化合物が薬物誘発性リン脂質症を誘発し得るか否かを予測する方法に関する。
一方、非ヒト哺乳動物としては、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、マウス、サル、イヌ、ブタ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウシ等が例示されるがこれらに限定されない。好ましくは、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、マウス、サル、イヌ等である。例えば、ラット培養細胞としては腎由来のNRK細胞株などが、ハムスター培養細胞としては肺由来のCHL細胞株などが好ましく挙げられるが、それらに限定されない。リン脂質症誘発性薬物に曝露した際のリソソーム酵素の細胞外への分泌の増大が顕著である点、その結果として細胞内のLC3の量変化を検出しやすい点で、NRK細胞の使用が特に好ましい。
一方、哺乳動物細胞が動物個体として提供される場合、上記のようにして該動物から採取される血液などの細胞含有試料を同様に細胞画分(血液の場合、血球細胞など)と液性画分(血液の場合、血清または血漿)とに分離し、細胞画分については上記と同様にして抽出液を回収することにより検体を調製することができる。あるいは細胞外のリソソーム酵素の量もしくは活性のみを測定するのであれば、標的細胞の外液などの細胞を含まない体液を採取することによって検体を得ることもできる。
上記 (ii) の定量法においては、2種の抗体は本発明の蛋白質の異なる部分を認識するものであることが望ましい。例えば、一方の抗体が本発明の蛋白質のN端部を認識する抗体であれば、他方の抗体として該蛋白質のC端部と反応するものを用いることができる。
競合法では、検体中の本発明の蛋白質と標識した該蛋白質とを抗体に対して競合的に反応させた後、未反応の標識抗原 (F) と、抗体と結合した標識抗原 (B) とを分離し(B/F分離)、B、Fいずれかの標識量を測定することにより、検体中の本発明の蛋白質を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、ポリエチレングリコールや前記抗体 (1次抗体) に対する2次抗体などを用いてB/F分離を行う液相法、および、1次抗体として固相化抗体を用いるか (直接法)、あるいは1次抗体は可溶性のものを用い、2次抗体として固相化抗体を用いる固相化法 (間接法) とが用いられる。
例えば、Meth. Enzymol., Vol. 70: (Immunochemical Techniques (Part A)), 同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)), 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques(Part C)), 同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)), 同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), 同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: HybridomaTechnology and Monoclonal Antibodies)) (以上、Academic Press発行) などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、細胞内外における本発明の蛋白質の量を感度よく定量することができる。
尚、リソソーム酵素がカテプシンなどのプロテアーゼである場合、該酵素は不活性なプロ体(プロ酵素)としてリソソームに輸送され、そこでプロセッシングを受けて活性の成熟蛋白質となる場合が多い。したがって、細胞のリン脂質症の発現のために細胞外に分泌されるプロテアーゼはプロ体である。そのため、リソソーム酵素が不活性な前駆体を経由する蛋白質である場合は、抗体を用いてリソソーム酵素の量を測定するか、あるいは自体公知の手法によりプロセッシングして成熟体とした後に活性測定を行う必要がある。
NRK細胞(正常ラット腎由来細胞株)を、リン脂質症誘発性薬物(PLIDs)であるアミオダロン(AD)に24時間曝露し、後期エンドソーム/リソソームに局在する膜タンパク質であるLGP85の抗体を用いて共焦点レーザー顕微鏡により観察したところ、これらのオルガネラが肥大していることが判明した(図1A)。また、Nile Red染色によりそこにはリン脂質が蓄積していることが判明した(図1B)。
また、通常の胎児ウシ血清の代わりに、リポ蛋白質を除去した血清を10%となるように添加したDMEM培地で細胞を培養し、細胞外からのリポ蛋白質の供給を絶った条件下でのAD曝露によるリソソームの形態変化およびリン脂質蓄積の有無を検討した結果、AD用量依存的に後期エンドソーム/リソソームの肥大化が起こり(図1C)、そこにリン脂質が蓄積していることが判明した。したがって、AD曝露により蓄積するリン脂質は細胞外から供給されたものではなく、リン脂質症の病態の発現であることが確認された。
NRK細胞を種々の濃度のADに24時間曝露した後、後期エンドソーム/リソソーム、ゴルジ装置、TGNなどに局在する蛋白質に対する抗体を用いて、これらのオルガネラを共焦点レーザー顕微鏡により観察したところ、MPRの局在パターンが、AD曝露によって、非曝露時にみられる通常のTGN局在から、肥大した顆粒状構造物に変化していることが明らかとなった(図2)。同様のMPR局在の変化は、クロロキン(CQ)、チロロン(TLR)、塩化アンモニウムへの曝露によっても認められた。
NRK細胞を0(溶媒対照)、5、10、20、40および80μMのADに24時間曝露したときの細胞内および培地中のリソソーム酵素活性を常法により測定した。その結果、ADの用量依存的に培地中のリソソーム酵素活性が上昇し、細胞内の酵素活性が低下することが判明した(図3A〜E)。一方、小胞体酵素であるα−グルコシダーゼの活性はADが細胞毒性を示す用量である80μMにおいてしか変化が認められなかったことから(図3F)、培地中のリソソーム酵素活性の上昇は、細胞損傷による細胞外への漏出ではなく、リソソーム酵素が選択的に細胞外に分泌されたためであることが証明された。
NRK細胞を、表1に記載される18種の薬物(うち15種はインビトロまたはインビボでリン脂質症誘発性ありと報告されている)に24時間曝露したときの培地中のβ−ヘキソサミニダーゼ活性を常法により測定した。その結果、ゲンタマイシン以外の14種のリン脂質症誘発薬物で培地中のリソソーム酵素活性の上昇が認められ、また、ほとんどの化合物で後期エンドソーム/リソソームの肥大およびMPRの局在変化との相関が認められた(表1)。HeLa細胞を用いて同様の実験を行った場合も培地中のリソソーム酵素活性の上昇が認められたが、最大で対照の1.7倍の上昇であり、NRK細胞を用いた方がより高感度に酵素活性の上昇を検出できることが示唆された。
カテプシンのようなプロテアーゼはゴルジ装置からリソソームに輸送される間は不活性なプロ酵素の形態をとり、リソソーム内でプロセッシングされて活性な成熟型酵素となる。カテプシンD(CTD)の場合、ラット(NRK)細胞では約45kDaのプロ酵素として生合成され、リソソームの酸性環境でプロセッシングされて約43kDaの成熟型酵素となる。
そこで、NRK細胞を0(対照)、5、10、20、40および80μMのADに24時間曝露したときの細胞内および培地中のリソソーム酵素(CTDおよびカテプシンL(CTL))の量を該酵素に対する抗体を用いたウェスタンブロッティングにより測定した。即ち、細胞溶解液および培地の抗CTD抗体による免疫沈降物もしくは細胞溶解液および培地そのものを、それぞれ抗CTD抗体もしくは抗CTL抗体でウェスタンブロット解析した。その結果、細胞内のCTDは、対照では成熟型酵素がほとんどであるが、AD曝露により細胞毒性の小さい40μMの濃度まではプロ酵素の割合が用量依存的に増加し、CTDが正常にリソソームに輸送されていないことが示された。また、培地中には成熟型酵素は全く認められず、プロ酵素のみがADの用量依存的に増加した(図4A)。このことからも、培地中のリソソーム酵素の増加が、細胞損傷などによる細胞外への漏出のためではなく、選択的な細胞外への分泌の結果であることが示された。更に、NRK細胞をCQ、TLRおよび塩化アンモニウムに24時間曝露した場合でも、対照に比べて細胞内のプロ酵素の割合が増加し、培地中へのプロ酵素の分泌量が増加することが明らかとなった(図5)。
一方、CTLは約39kDaのプロ酵素として生合成された後、細胞内輸送の過程で30kDaの一本鎖型と23kDaおよび7kDaからなる二本鎖型の成熟型酵素に変換される。細胞内のCTL活性はAD曝露により用量依存的に減少したのに対し、培地中のCTL活性は細胞毒性の顕著な80μMでしか変化が認められなかった(図6B)。しかし、抗CTL抗体を用いたウェスタンブロッティングの結果、細胞内ではADの用量依存的に成熟型酵素の割合が減少し、プロ酵素の割合が増加していた。また、培地中には成熟型酵素は全く認められず、プロ酵素のみがADの用量依存的に増加した(図6A)。CTDでは培地中の酵素活性がADの用量依存的に上昇したのに対し、CTLでは変化がなかったのは、CTD活性は自己触媒的なプロセッシングが起こるpH4.0で測定しているのに対し、CTL活性はほとんどプロセッシングが起こらないpH6.0で測定していることによると考えられる。
NRK細胞を0(溶媒対照)、10および20μMのADに1、3、6および12時間曝露したときのMPRおよびLGP85の局在を、各蛋白質に対する抗体を用いて共焦点レーザー顕微鏡により観察した。さらに、培地中のβ−ヘキソサミニダーゼの活性を常法により測定した。その結果、6時間の曝露によりMPRの局在に顕著な変化が認められ(図7A)、12時間以上の曝露では培地中のリソソーム酵素活性が対照の約2倍以上に上昇した(図7B)。
NRK細胞に20μMのADを1、3、6、12および24時間曝露したとき、各細胞についてオートファジーのマーカーであるLC3(microtuble-associated protein 1 light chain 3)の量を該酵素に対する抗体を用いたウェスタンブロッティングにより測定した。即ち、細胞溶解液を抗LC3の抗体でウェスタンブロット解析した。その結果、3時間の曝露によりLC3-IIの量が増加し,12及び24時間では顕著に増加した(図8A)。また、共焦点レーザー顕微鏡により観察したところ、AD曝露によって、非曝露時にはみられなかったLC3で染色された顆粒が時間依存的に増加していることが明らかとなった(図8B)。
NRK細胞を種々のPLIDsに24時間曝露したときの細胞中のLC3の量をウェスタンブロッティングにより測定した。その結果、リン脂質症誘発薬物で細胞内のLC3の量の増加(図9AおよびB)が認められ、細胞外のリソソーム酵素活性の増加と良い相関が認められた。
さらに、本発明の予測・診断方法は、血漿などの末梢体液を試料とすれば非侵襲的な診断が可能となることから、薬物誘発性リン脂質症の臨床診断においてもきわめて有用である。
本出願は、日本で出願された特願2007−261125(出願日:平成19年10月4日)を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
Claims (8)
- 薬物誘発性リン脂質症を誘発し得る化合物の予測方法であって、哺乳動物の培養細胞と被検化合物とを3時間〜168時間接触させる工程、該細胞外および/または細胞内のリソソーム酵素の量もしくは活性を測定する工程、および該酵素の細胞外への分泌を促進した被検化合物を、薬物誘発性リン脂質症を誘発し得る化合物であると予測する工程を含む方法。
- 細胞外のリソソーム酵素の量もしくは活性を測定することを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 薬物誘発性リン脂質症を誘発し得る化合物の予測方法であって、哺乳動物の培養細胞と被検化合物とを3時間〜168時間接触させる工程、該細胞内のLC3の量を測定する工程、および該蛋白質の細胞内の量を増加させた被検化合物を、薬物誘発性リン脂質症を誘発し得る化合物であると予測する工程を含む方法。
- 哺乳動物がヒト、ラット、マウス、ハムスター、サルおよびイヌから選択される、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 細胞が肝臓、腎臓または肺由来のもの、あるいはリンパ球である、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- リソソーム酵素が、β−ヘキソサミニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−マンノシダーゼ、カテプシンDおよびカテプシンLからなる群より選択される1以上の酵素である、請求項1または2記載の方法。
- 医薬候補化合物の毒性スクリーニング方法であって、哺乳動物の培養細胞と被検化合物とを3時間〜168時間接触させる工程、該細胞外および/または細胞内のリソソーム酵素の量もしくは活性を測定する工程、および該酵素の細胞外への分泌を促進しなかった被検化合物を、薬物誘発性リン脂質症を誘発しない化合物として選択する工程を含む方法。
- 医薬候補化合物の毒性スクリーニング方法であって、哺乳動物の培養細胞と被検化合物とを3時間〜168時間接触させる工程、該細胞内のLC3の量を測定する工程、および該蛋白質の細胞内の量を増加させなかった被検化合物を、薬物誘発性リン脂質症を誘発しない化合物として選択する工程を含む方法。
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