KR20140033365A

KR20140033365A - 가용성 lr11의 면역학적 측정방법

Info

Publication number: KR20140033365A
Application number: KR1020137029286A
Authority: KR
Inventors: 코헤이 타쿠보; 히로유키 에비누마; 이사무 후카마치; 히데아키 부조; 야스시 사이토
Original assignee: 세키스이 메디칼 가부시키가이샤
Priority date: 2011-05-09
Filing date: 2012-05-09
Publication date: 2014-03-18
Also published as: JP5101758B1; CN103502813A; CN103502813B; EP2708893B1; KR101894417B1; EP2708893A4; WO2012153773A1; JPWO2012153773A1; US20140080158A1; EP2708893A1; US9541550B2; CA2835068C; CA2835068A1

Abstract

혈청 등의 생물 유래 시료로부터, 가용성 LR11의 분리 조작을 하는 일 없이, 간편하고 정확하게 면역학적 수단에 의해, 당해 생물 유래 시료 중의 가용성 LR11를 측정하는 방법을 제공.
생물 유래 시료 중의 가용성 LR11의 면역학적 측정방법으로, 당해 시료를 술포베타인형 양쪽성 계면활성제 및 아미도술포베타인형 양쪽성 계면활성제로부터 선택되는 1종 이상으로 처리하는 것을 특징으로 하는 가용성 LR11의 면역학적 측정방법.

Description

가용성 LR11의 면역학적 측정방법{METHOD FOR IMMUNOLOGICALLY MEASURING SOLUBLE LR11}

본 발명은 생물 유래 시료 중의 가용성 LR11의 면역학적 측정방법에 관한　것이다．

LDL　receptor　relative　with　11　ligand-binding　repeats(LR11)는 LDL 수용체 패밀리에게 특징적인 구조를 가지는 분자량 약 250kD의 LDL 수용체 유사 단백질(특허문헌 1, 비특허문헌 1)이고, 막결합형 이외에, 프로테아제에 의해 절단된 가용성 LR11가 존재하는 것이 나타나 있다(비특허문헌 4). LR11는 정상 혈관벽 세포에서는 거의 발현하고 있지 않지만, 비후 내막 평활근 세포에서 특이적으로 발현하는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 2). 또한, 배양 평활근 세포의 증식에 수반하여 LR11의 발현량이 항진하여 배양액 중에 가용성 LR11가 분비되는 것이나, 카프 장해 모델 마우스(cuff injury mouse model)에서 LR11 유전자를 발생공학적으로 기능 결손시키면, 평활근 세포의 유주(遊走) 및 증식에 의해 일으켜지는 혈관 내막의 비후가 저해되는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 3). 더욱이 본 발명자들은 동맥 경화성 질환 환자의 혈중 가용성 LR11의 농도가 정상인에 비해 유의하게 높은 값인 것을 발견하고, 혈중에 존재하는 가용성 LR11를 새로운 동맥 경화성 질환의 마커로서 이용할 수 있음을 보고했다(비특허문헌 5, 특허문헌 2).

가용성 LR11의 측정방법으로서는 LR11에 대해서 친화성을 가지는 샤페론 분자(shaperone molecule) RAP(receptor　associated　protein)를 결합시킨 불용성 담체를 이용하여 시료로부터 가용성 LR11를 분리한 후, SDS-PAGE, 웨스턴 블롯을 행하여 항LR11 항체에 의한 면역 염색으로 검출하는 방법(비특허문헌 5, 6)이 알려져 있지만, 시료로부터 가용성 LR11를 분리하는 공정을 비롯하여 조작이 많이 번잡하고, 임상 검사 등에의 적용을 고려할 경우 실용적인 방법이라고는 할 수 없다.

본 발명자들은 조작이 간편하고, 실용적인 가용성 LR11의 측정방법으로서 항가용성 LR11 항체를 이용하는 면역학적 측정방법의 확립을 시도했지만, 혈청 등의 생물 유래 시료를 시료로서 이용했을 경우, 상기 시료 중에 존재하는 동정되지 않은 측정 방해물질(이하, 단순히 '방해물질'이라 부르기로 한다)의 영향에 의해, 가용성 LR11를 정확하게 정량할 수 없는 것이 판명되었다.

그리하여, 본 발명자들은 방해물질이 면역학적 측정방법에 주는 영향을 회피하는 수단에 대해서 여러 가지로 검토했다. 그 결과, 혈청 등의 생물 유래 시료를 N-아실-N-메틸글루카민 등의 특정의 계면활성제와 혼합하는 처리를 행하고, 당해 처리한 시료를 이용하여 면역학적 측정방법으로 측정을 행하면, 방해물질의 영향을 회피하고, 시료 중의 가용성 LR11를 간편하고 정확하게 정량할 수 있음을 발견하고, 이미 특허출원했다(특허문헌 3).

특허문헌 1: 일본국 특허공개 평9-163988호 공보 특허문헌 2: 국제 공개 WO2008/155891호 팜플렛 특허문헌 3: 국제 공개 WO2009/116268호 팜플렛

비특허문헌 1: J. Biol. Chem.1996; 　271,　p24761-24768 비특허문헌 2: Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.1999; 　19,　p2687-2695 비특허문헌 3: Circ. Res.2004; 　94; 　p752-758 비특허문헌 4: 의학의 발걸음(醫學のあゆみ), Vol.221,　No.13,　p1200-1203 비특허문헌 5: J　Clin　Inｖest.　2008　; 　118,　p2733-2746 비특허문헌 6: 제39회　일본동맥경화학회·학술집회　프로그램·초록집, 일반 렉춰(포스터) 189,　p264

그러나, 특허문헌 3에 기재된 종래법(이하, 단지 "종래법"이라고 하기도 한다.), 예를 들면, N-아실-N-메틸글루카민으로 처리한 사람 혈청 시료를, 2종류의 항가용성 LR11 항체를 사용한 샌드위치 ELISA에 의해 측정하는 방법에서는 고상화한 항가용성 LR11 항체와 가용성 LR11의 반응(이하, "1차 반응"이라고 하기도 한다)에 실온, 하룻밤을 요하기 때문에, 측정에 이틀이 걸린다는 문제가 있었다. 본 발명자들은 상기 종래법에서의 1차 반응의 시간단축을 시도한 바, 1차 반응의 반응시간 단축에 수반하여 측정되는 각 시료의 흡광도가 저하할 뿐만 아니라, 일부의 시료에서, 반응시간단축에 수반하는 흡광도의 저하 정도가 다른 시료에 있어서의 저하 정도와 다른 것이 있고, 그 때문에 종래법으로 측정했을 경우와 1차 반응의 반응시간을 단축하여 측정했을 경우, 시료 사이의 상대관계(가용성 LR11 농도의 고저)가 다른, 즉 종래법의 측정결과와 시간 단축한 측정결과와의 상관성이 저하하는 경우가 있는 것을 알았다.

따라서, 본 발명의 과제는 종래법으로 측정된 시료 사이의 상대 관계에 영향을 주지 않고, 측정시간이 단축된, 보다 실용적인 생물시료 중의 가용성 LR11의 면역학적 측정방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 상기 과제에 대해서 예의 검토한 바, 술포베타인형 또는 아미도술포베타인형의 양쪽성 계면활성제로 처리한 시료를 이용하여 면역학적 측정을 행하면, 특허문헌 3에 기재의 N-아실-N-메틸글루카민 등과 동일하게 시료 중의 방해물질의 영향을 회피할 수 있고, 또한, 1차 반응의 반응시간을, 예를 들면, 실온, 1시간에 단축했을 경우에도, 종래법으로 측정된 시료 사이의 상대 관계에 영향을 주지 않고, 가용성 LR11 농도에 의존한 측정결과를 얻을 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성했다.

즉, 본 발명은 생물 유래 시료 중의 가용성 LR11의 면역학적 측정방법에서, 당해 시료를 술포베타인형 양쪽성 계면활성제 및 아미도술포베타인형 양쪽성 계면활성제로부터 선택되는 1종 이상으로 처리하는 것을 특징으로 하는 가용성 LR11의 면역학적 측정방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 항가용성 LR11 항체와 술포베타인형 양쪽성 계면활성제 및 아미도술포베타인형 양쪽성 계면활성제로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 가용성 LR11 면역학적 측정용 시약을 제공하는 것이다.

본 발명의 면역학적 측정방법 및 면역학적 측정용 시약에 의하면, 항가용성 LR11 항체와 가용성 LR11의 반응(예를 들면, 고상화한 항가용성 LR11 항체와 가용성 LR11와의 반응)의 시간을, 예를 들면, 특허문헌 3 기재의 하룻밤으로부터, 1시간으로 대폭 단축하고, 생물 유래 시료, 예를 들면 혈액 등의 시료 중에 존재하는 가용성 LR11의 농도를, 보다 단시간으로, 간편하게, 고감도로, 정량적으로 측정할 수 있다.

도 1은 특허문헌 3 기재의 계면활성제 또는 본 발명의 양쪽성 계면활성제를 이용하고, 1차 반응을 16시간 수행하였을 때 얻어지는 가용성 LR11를 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 1차 반응을 16시간 수행하였을 때, 본 발명의 양쪽성 계면활성제의 농도와 측정되는 시료 흡광도와의 관계를 검토한 결과를 나타낸다.
도 3은 특허문헌 3 기재의 계면활성제 또는 본 발명의 양쪽성 계면활성제를 이용하여 1차 반응을 1시간 수행하였을 때 가용성 LR11를 측정한 결과를 나타낸다.
도 4는 특허문헌 3 기재의 계면활성제 또는 본 발명의 양쪽성 계면활성제를 이용하여 1차 반응을 1시간 수행하였을 때 가용성 LR11를 측정한 결과(세로축)와 특허문헌 3 기재의 계면활성제를 이용하여 1차 반응을 16시간 수행하였을 때의, 종래법으로 측정한 결과(횡축)의 상관성을 나타낸다.
도 5는 특허문헌 3 기재의 계면활성제 또는 본 발명의 양쪽성 계면활성제를 이용하여 1차 반응을 1시간 수행하였을 때 가용성 LR11를 측정한 결과(세로축)와 특허문헌 3 기재의 계면활성제를 이용하여 1차 반응을 16시간 수행하였을 때의 종래법으로 측정한 결과(횡축)의 상관성을 나타낸다.

본 발명의 측정방법은 생물 유래 시료 중의 가용성 LR11의 면역학적 측정방법이다. 여기서, 생물로서는 사람을 포함한 포유동물, 예를 들면 사람, 원숭이, 말, 소, 돼지, 토끼, 래트, 기니 피그, 마우스 등을 들 수 있다. 시료로서는 예를 들면, 혈액, 혈장, 혈청, 골수액, 뇨(尿) 등의 체액; 예를 들면, 혈관, 장기, 근육 등의 조직; 예를 들면 각 조직으로부터 분리한 세포, 백혈구 등의 세포; 및 상기 각각 유래하는 성분을 함유하는 용액(희석된 시료액, 파쇄액, 용해액, 추출액 등)을 들 수 있다.

본 발명에 있어서의 면역학적 측정방법은 항원 항체 반응을 이용한 가용성 LR11의 측정방법이면 특히 제한되지 않지만, 다른 항원 인식 부위를 갖는, 적어도 2종의 항체를 이용하여 면역 복합체를 형성시키는 공정을 포함한 측정방법이 바람직하다. 다른 항원 인식 부위를 가지는, 적어도 2종의 항체를 이용하여 면역 복합체를 형성시키는 공정을 포함한 측정방법으로서는 후기하는 측정방법, 예를 들면 샌드위치 ELISA, 면역비탁법(TIA나 LTIA(라텍스 비탁 이뮤노앗세이)), 이뮤노크로마토그래피법 등을 들 수 있다.

항가용성 LR11 항체로서는, 생물 유래 시료 중의 가용성 LR11, 예를 들면, 포유동물의 혈청으로부터 정제한 가용성 LR11와 반응하는 항체이면, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체의 어느 것이어도 좋으나, 모노클로날 항체가 바람직하게 이용된다. 당해 항체는 주지의 방법으로 제작할 수 있다. 본 명세서에서 "항가용성 LR11 항체"라고 할 때는 상기한 바와 같이 생물 유래 시료 중의 가용성 LR11와 반응하는 항체인 것을 한도로 하여 특히 제한은 없고, 예를 들면, 세포 표면에 존재하는 막결합형의 LR11와도 반응하는 항체나 문헌 등에 단지 "항LR11 항체"라고 기재되어 있는 항체 등도 사용할 수 있다.

폴리클로날 항체 제작 시, 면역하는 동물로서는 예를 들면, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 염소, 양, 닭 등을 이용할 수 있다. 항가용성 LR11 항혈청은 항원을 동물의 피하, 피내, 또는 복강 등에, 1회 또는 수회 투여한 후, 채취한 혈액으로부터 얻을 수 있다. 면역 시, 항원은 면역 부활효과를 가지는 보액(어주번트)과의 혼합물로서 투여하여 면역하는 것이 보다 바람직하다.

모노클로날 항체는 공지의 모노클로날 항체 제작 방법, 예를 들면, 나가무네 히데아키, 테라다 히로시 공저, "모노클로날 항체" 히로카와쇼텐(廣川書店)(1990년)이나, Jame　W.　Golding, "Monoclonal　Antibody", 3rd　edition, Academic　Press(1996년)에 따라 제작할 수 있다. 또한, DNA 면역법에 의한 모노클로날 항체의 제작은 예를 들면, Nature　1992　Mar　12; 356, p152-154 또는 J. Immunol　Methods　Mar　1; 249, p147-154를 참고로 하여 제작할 수 있다.

항체 제작용 항원으로서는 LR11 단백질 또는 당해 단백질의 단편(펩티드)이 이용된다. 상기 LR11 단백질은 혈액, 뇨, 가용성 LR11를 세포 바깥으로 분비하는 세포(평활근 세포나 조혈기 종양 세포 등)의 배양 상청 등으로부터, 필요에 따라 정제 등을 행하여 얻을 수 있다. 또한, LR11를 세포 표면에 발현하고 있는 조혈기 종양 세포 그 자체를 항원으로서 이용할 수도 있다(WO2012/008595). 상기 펩티드는 상기 단백질을 프로테아제로 소화시키고, 정제 등을 행하여 얻을 수 있지만, 합성 펩티드를 사용할 수도 있다. 상기 펩티드로서는 예를 들면, 특허문헌 3 기재의 아미노산 배열을 가지는 펩티드 등을 들 수 있다. 상기 펩티드의 아미노산 배열은 1 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 것이어도 좋다.

DNA 면역법에 의해 항체를 제작할 때에는 LR11 단백질 또는 당해 단백질의 단편(펩티드)을 코드하는 cDNA를 재조합한 벡터를, 면역되는 동물에 투여하고, 당해 동물의 체내에서 항원을 발현시킴으로써 면역을 행할 수 있다. 상기 펩티드로서는 예를 들면, 특허문헌 3 기재의 아미노산 배열을 가지는 펩티드 등을 들 수 있으며, 당해 펩티드의 아미노산 배열은 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 것이어도 좋다.

또한, LR11의 고차(高次) 구조를 인식하는 모노클로날 항체를 얻기 위해서는 사람 LR11 전장(全長) 유전자가 삽입된 벡터의 사용이 최적이지만, 상기 LR11 단백질의 단편(펩티드)을 코드하는 유전자가 삽입된 벡터도 사용할 수 있다.

DNA 면역법은 상기 벡터를 단독 또는 혼합하여, 종래 공지의 각종 유전자 도입법(예를 들면, 근육주사, 일렉트로포레이션, 또는 유전자총 등)의 어느 하나를 이용하여 면역하는 동물(마우스, 또는 래트 등)의 피하에 주입하여 면역하는 동물 유래의 세포 내에 집어넣음으로써 행할 수 있다.

펩티드 항원을 이용한 모노클로날 항체의 제작법 및 DNA 면역법에 의한 모노클로날 항체의 제작법은 특허문헌 3 기재의 방법을 참조할 수가 있으며, 이것을 사용하는 것이 바람직하다. 이들 항가용성 LR11 모노클로날 항체의 예로서는 특허문헌 3 기재의 합성 펩티드를 마우스에 면역하여 얻어진 A2-2-3 항체, DNA 면역법에 의해 얻어진 마우스 모노클로날 항체 M3 및 M5, DNA 면역법에 의해 얻어진 래트 모노클로날 항체 R14 및 R23를 들 수 있다.

본 발명의 측정방법에 대해서는 술포베타인형 및 아미도술포베타인형 양쪽성 계면활성제 중 1종 이상으로 처리한 시료를 이용하여 면역학적 측정을 행한다. 당해 처리에 의해, 시료 중의 가용성 LR11의 측정을 방해하는 물질의 영향을 회피할 수 있으며, 더욱이 1차 반응의 반응시간을, 예를 들면, 실온, 1시간에 단축했을 경우에도, 종래 법으로 측정된 시료 사이의 상대 관계에 영향을 주지 않고, 가용성 LR11 농도에 의존한 측정결과를 얻을 수 있다.

본 발명에 이용하는 술포베타인형 및 아미도술포베타인형 양쪽성 계면활성제로서는 각각 하기 일반식(1) 및 (2)

(식중, R¹은 탄소수 6~18의 알킬기 또는 알케닐기를 나타내고, R²CO는 탄소수 6~18의 아실기 또는 콜산(cholic acid) 유래 아실기를 나타내고, A는 탄소수 2~5의 알킬렌기 또는 탄소수 2~5의 히드록시 알킬렌기를 나타내고, B는 탄소수 1~5의 알킬렌기를 나타낸다)

로 표시되는 화합물이 바람직하다.

R¹로 표시되는 탄소수 6~18의 알킬기 또는 알케닐기로서는 직쇄 또는 분기쇄의 알킬기 또는 알케닐기를 들 수 있지만, 이 중 직쇄 또는 분기쇄의 알킬기가 바람직하고, 직쇄의 알킬기가 보다 바람직하다. 또한, 당해 알킬기 또는 알케닐기의 탄소수는 6~14가 바람직하고, 8~14가 더 바람직하고, 10~14가 특히 바람직하다. R¹로 표시되는 알킬기 또는 알케닐기 중, 특히 바람직한 것은 데실기, 도데실기 및 테트라데실기이다.

R²CO로 표시되는 탄소수 6~18의 아실기로서는 탄소수 6~18의 지방족 아실기를 들 수 있으며, 헥사노일기, 옥타노일기, 데카노일기, 도데카노일기, 테트라데카노일기, 헥사데카노일기, 옥타데카노일기 등을 들 수 있다. 또한, R²CO로서는 콜산유래의 아실기가 바람직하다.

A로 표시되는 탄소수 2~5의 알킬렌기로서는 에틸렌기, 트리메틸렌기, 테트라메틸렌기, 펜타메틸렌기를 들 수 있으며, 에틸렌기 또는 트리메틸렌기가 보다 바람직하다. A로 표시되는 탄소수 2~5의 히드록시 알킬렌기로서는 -CH₂CH(OH)CH₂-로 표시되는 히드록시트리메틸렌기 등을 들 수 있다.

B로 표시되는 탄소수 1~5의 알킬렌기로서는 메틸렌기, 에틸렌기, 트리메틸렌기, 테트라메틸렌기, 펜타메틸렌기를 들 수 있다.

일반식 (1)로 표시되는 술포베타인형 양쪽성 계면활성제의 시판품으로서는 술포베타인10 (SB10: R¹=C₁₀H₂₃, A=-(CH₂)₃-), 술포베타인12 (SB12: R¹=C₁₂H₂₅, A=-(CH₂)₃-), 술포베타인14 (SB14: R₁=C₁₄H₂₉, A=-(CH₂)₃-) (이상, AMRESCO사 제품) 등을 들 수 있으며, 본 발명에 바람직하게 사용된다. 또한, 일반식 (2)로 표시되는 아미도술포베타인형 양쪽성 계면활성제의 시판품으로서는 3-[(3-코라미드프로필)디메틸암모니오]프로판술포네이트 (CHAPS: R₂CO= 콜산 유래 아실, A=-(CH₂)₃-), B=-(CH₂)₃-), 3-[(3-코라미드프로필) 디메틸암모니오]-2-히드록시프로판술포네이트 (CHAPSO: R₂CO= 콜산 유래 아실, A=-CH₂CH(OH)CH₂-, B=-(CH₂)₃-)(이상, 同仁化學硏究所社 제품) 등을 들 수 있으며, 본 발명에 바람직하게 사용된다.

생물 유래 시료를 술포베타인형 및 아미도술포베타인형 양쪽성 계면활성제로부터 선택되는 1종 이상으로 처리하는 수단으로서는 면역 측정 전 또는 측정시의 시료 중에, 상기 특정의 양쪽성 계면활성제가 존재하도록 하면 좋고, 면역 측정 전에 시료와 혼합하여 공존시키는 것이 바람직하다. 상기 시료와의 혼합, 공존의 방법으로서는 예를 들면, 본 발명의 양쪽성 계면활성제를 시료 희석액에 함유시켜 놓고, 시료 희석 시에 혼합, 공존시키는 방법, 항가용성 LR11 항체를 함유하는 시약에 본 발명의 양쪽성 계면활성제를 함유하게 하고, 시료 중의 가용성 LR11과 항가용성 LR11 항체와의 반응 시에 혼합, 공존시키는 방법 (구체적인 예로서 마이크로플레이트를 이용한 샌드위치 ELISA에서 효소 표지한 항가용성 LR11 항체 용액이 충전되어 있는 웰 중에 희석하지 않은, 또는 미리 희석된 시료를 첨가하는 경우 등을 들 수 있다), 이뮤노크로마토그래피법으로 이용되는 샘플 패드와 같은 시료를 투입하는 부재(部材)에 함유시켜 놓고, 시료가 당해 부재를 통과할 때에 혼합, 공존시키는 방법을 예시할 수 있다.

또, 본 명세서에 있어서의 "시료 희석액"이란, 생물 유래 시료 중의 가용성 LR11의 농도를 면역 반응에 바람직한 농도 또는 함량에, 직접 또는 간접적으로 조정(희석)하기 위한 시액을 말한다. "전처리액" 또는 "제1 시약(액)" 등, 명칭의 여하를 따지지 않는다.

본 발명의 양쪽성 계면활성제의 사용 농도는 이용하는 측정방법의 특성, 이용하는 양쪽성 계면활성제의 종류, 본 발명의 양쪽성 계면활성제가 혼합, 공존한 시점에서의 시료 중의 가용성 LR11 농도와 양쪽성 계면활성제의 농도비 등을 감안하여 적의 결정하면 좋지만, 예를 들면, 가용성 LR11를 함유하는 시료와 혼합, 공존시킨 시점의 농도로서 0.001~10질량%가 바람직하고, 0.001~5질량%가 보다 바람직하고, 0.05~5질량%가 한층 더 바람직하다. 이용하는 측정방법이 샌드위치 ELISA인 경우에는 더욱이 0.1~5질량%가 바람직하고, 0.5~5질량%가 보다 바람직하다. 이용하는 측정방법이 LTIA인 경우에는 더욱이 0.001~3질량%가 바람직하고, 0.05~2질량%가 보다 바람직하다. 또한 당업자라면, 상기 기재를 지표로, 예시된 범위 이외의 농도에서의 사용을 생각해 낼 수 있음은 말할 필요도 없다. 생물 유래 시료를 본 발명의 양쪽성 계면활성제로 처리할 때의 온도는 5~40℃, 특히 10~30℃이 바람직하다. 생물 유래 시료를 본 발명의 양쪽성 계면활성제로 처리하는 시간은 사용하는 양쪽성 계면활성제의 종류나 농도, 또 온도 등의 조건을 고려해, 적의 설정할 수 있다. 본 발명의 양쪽성 계면활성제로 생물 유래 시료를 처리했을 경우의, 생물 유래 시료 중의 가용성 LR11와 항가용성 LR11 항체와의 반응시간은 종래법 (예를 들면, N-아실-N-메틸글루카민을 사용하는 특허문헌 3 기재의 방법)에 비해 단시간에 좋고, 본 발명의 방법에 의하면, 생물 유래 시료 중의 가용성 LR11의 측정시간을 큰폭으로 단축할 수 있다.

또한, 측정계의 설계(검출 감도나 반응시간 등)에 맞추어 시료는 예를 들면, 1(원액)~50배에 희석해 사용할 수 있다. 상기 희석은 본 발명의 양쪽성 계면활성제를 함유하는 시료 희석액에 의해 행하여도, 본 발명의 양쪽성 계면활성제를 함유하지 않는 완충액 등에 의해 행하여도 좋으나, 본 발명의 양쪽성 계면활성제를 함유하는 시료 희석액에 의해 실시하면 간편하다. 생물 유래 시료를 시료 희석액으로 희석해 측정하는 경우에는 4~30배에 희석하는 것이 바람직하다. 시료 희석액의 조성으로서는 본 발명의 효과를 해치지 않는 한, 통상 면역학적 측정방법으로 사용되는 조성이면 특히 제한은 없다. 예를 들면, GOOD 완충액, 인산 완충액, 글리신 완충액, 탄산 완충액, 트리스 완충액 등의 완충액(pH도 통상의 면역학적 측정방법으로 사용되는 범위), NaCl 등의 염, BSA 등의 단백 성분, 본 발명의 양쪽성 계면활성제 이외의 계면활성제, 시판의 비특이 반응 방지 성분 등이 사용 가능하다.

상기 특정의 양쪽성 계면활성제를 함유하는 시료를 이용하여 통상의 수단에 의해 항가용성 LR11 항체를 이용한 면역학적 측정을 행하면 좋다.

면역학적 측정방법으로서는 전술한 바와 같이, 항원 항체 반응을 이용한 가용성 LR11의 측정방법이면 특히 제한되지 않지만, 다른 항원 인식 부위를 가지는, 적어도 2종의 항체를 이용하여 면역 복합체를 형성시키는 공정을 포함한 측정방법이 바람직하다. 다른 항원 인식 부위를 가지는, 적어도 2종의 항체를 이용하여 면역 복합체를 형성시키는 공정을 포함하는 측정방법으로서는 예를 들면, 샌드위치 ELISA(효소 표지 면역 흡착 측정법), 면역비탁법(TIA나 LTIA), 이뮤노크로마토그래피법 등을 들 수 있다. 상기 예시한 태양으로부터 명백한 바와 같이, 본 발명의 면역학적 측정방법은 헤테로지니어스계이어도 호모지이어스계이어도 좋다. 중요한 것은 본 발명의 양쪽성 계면활성제로 처리한 시료가, 한 번 이상, 항가용성 LR11 항체와의 사이에 항원 항체 반응을 하도록 설계되어 있으면 좋다.

본 명세서에서, 항원 항체 반응을 "1차 반응", "2차 반응"과 같이 구별하여 기재하는 경우가 있지만, 그것은 반응 스텝이 다수 있는 등, 그 실시 형태의 설명을 위해서 기재한 것이며, 본 발명을 한정하는 것을 의도하고 있지 않다.

상기 각 측정방법에 있어서의 검출 수단도, 특히 제한되지 않고, 샌드위치 ELISA이면, 발색 기질, 발광 기질, 형광 기질 등을 이용한 엔자임이뮤노앗세이, 발광(화학 발광, 생물 발광) 이뮤노앗세이, 형광 이뮤노앗세이 등을 들 수 있으며, 면역비탁법이면, 면역 복합체 형성에 의해 생기는 탁도를 흡광도나 산란광으로 검출하는 방법을 들 수 있으며, 이뮤노크로마토그래피법으로는 금속 콜로이드 입자나 착색 라텍스 입자를 이용한 광학적 검출법을 들 수 있다. 상기 특정의 양쪽성 계면활성제로 처리한 시료를 이용하여 통상의 수단에 의해 항가용성 LR11 항체를 이용한 면역학적 측정을 행하는 한, 면역 염색(웨스턴 블롯)이나 경합 이뮤노앗세이 등에도 본 발명이 적용 가능하다 것은 당업자에게는 용이하게 이해될 수 있다.

항가용성 LR11 항체와 반응하는 가용성 LR11를, 정량 또는 반정량적으로 평가하는 경우, 기준이 되는 LR11와 비교하는 것이 바람직하다. 기준이 되는 LR11로서는 예를 들면, 가용성 LR11 농도 기존의 혈청, 평활근 세포나 신경 아세포주의 배양 세포 또는 배양상청으로부터 회수한 가용성 LR11, 뇨(尿) 유래의 가용성 LR11(WO2012/008595), 리컴비난트 LR11, 또는 항체 제작에서 면역원으로서 사용하는 합성 펩티드 등을 사용하는 것이 바람직하다.

　전술한 바와 같이, 본 발명에서 "정량"이란 말은 소위 "정량"과 "반정량"의 양쪽 모두의 개념을 포함하며, 또한, 임상 진단에 있어서의 질병 이환의 판단 기준이 되도록 검출 감도가 설정되어 있는 경우 등에는 가용성 LR11 존재의 유무를 검출하는 이른바 "정성"의 개념도 포함하고 있다.

상기 면역학적 측정에 있어서, 샌드위치 ELISA를 예로 들어 설명하면, 예를 들면 항가용성 LR11 모노클로날 항체의 1종을 적당한 완충액 중에서 불용성 담체에 고정화하여 고상화 항체로 하고, 제2 항체로서 불용성 담체에 고정화한 항가용성 LR11 모노클로날 항체와는 인식 부위가 다른 항가용성 LR11 모노클로날 항체를 효소로 표지하고, 이들을 시료와 반응시켜, 제2 항체를 표지한 효소의 활성을 측정함으로써 시료 중의 가용성 LR11를 측정할 수 있다. 또한, 예를 들면, 제2 항체로서 비오틴 표지한 항가용성 LR11 모노클로날 항체를 이용하여 시료와의 반응 후에 다시 효소 표지한 아비딘을 반응시키고, 이 표지 효소의 활성을 측정함으로써 시료 중의 LR11를 측정할 수도 있다.

상기에서 사용하는 불용성 담체로서는, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 등의 각종 합성 고분자, 유리, 실리콘, 불용성 다당(가교 덱스트란, 폴리사카라이드) 등이 바람직하고, 이들의 담체는 구상, 봉상, 미립자 등의 형상, 또는 시험관, 마이크로플레이트 등의 형태로 이용할 수 있다. 고상화 항체 작성의 조건으로서는 구상, 봉상, 시험관, 마이크로플레이트의 형태의 담체를 이용하는 경우의 항체 농도는 각각 1~10㎍/mL이고, 미립자의 형태의 담체를 이용하는 경우의 항체 농도는 1~10 mg/mL이다. 또한, 완충액은 인산 완충액, 글리신 완충액, 탄산 완충액, 트리스 완충액 등의 pH 7~10의 중성~알칼리성의 완충액을 이용하여 4℃~25℃에서, 1시간~72시간 감작하여 조제하는 것이 바람직하다.

사용하는 효소 표지 항체는 공지의 방법에 의해 제작할 수 있다. 예를 들면, 나카네 등의 방법 (Nakane　P. K　et　al, J. Histochem　Cytochem, 22,　p1084-1089,　1974) 또는 이시카와 등의 방법 (말레이미드법: "효소 면역 측정법　제3판" 醫學書院) 등에 따라, 단편화하고 있지 않은 면역글로블린 분자를 그대로 하든가 또는 필요에 따라 항체를 적당한 프로테아제로 한정 분해하여 F(ab')₂, 또는 Fab'로 한 후, 효소로 표지함으로써 효소 표지 항체를 제작할 수 있다. 표지에 사용하는 효소로서는 예를 들면, 퍼옥시다제, 알카리포스파타제, β-D-갈락토시다아제, 글루코오스옥시다아제 등을 들 수 있다.

비오틴 표지 항체도 공지의 방법에 의해 제작할 수 있지만, 시판의 비오틴화 시약(예를 들면, PIERCE사 제품인 Sulfo-NHS-Biotinylation　Kit)를 이용하면, 더 용이하게 제작할 수 있다.

효소 표지 아비딘도 공지의 방법에 의해 제작할 수 있지만, 시판품 (예를 들면, PIERCE사 제품인 StreptAｖidin,　Horseradish　Peroxidase　Conjugated)를 사용할 수도 있다.

또한, 표지 물질이 효소인 경우에는 그 활성을 측정하기 위해서 기질 및 필요에 따라 발색제가 이용된다. 효소로서 퍼옥시다제를 이용하는 경우에는 기질로서 과산화 수소를 이용하고, 발색제로서 o-페닐렌디아민, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, 2,2'-아디노딘-[3-에틸벤즈티아졸린술폰산]암모늄염 등; 효소로서 알카리포스파타제를 이용하는 경우에는 기질로서 p-니트로페닐포스페이트, 3-(4-메톡시스피로{1,2-디옥세탄-3,2'-트리시클로-[3.3.1.1^3,7]데칸}-4-일)페닐포스페이트: AMPPD 등; 효소로서 β-D-갈락토시다아제를 이용하는 경우에는 기질로서 β-D-갈락토피라노시드, 4-메틸운베리페릴-β-D-갈락토피라노시드 등; 효소로서 글루코오스옥시다아제를 이용하는 경우에는 퍼옥시다제의 공존하에서 기질로서 β-D-글루코오스, 발색제로서 퍼옥시다제의 발색제를 이용할 수 있다.

면역비탁법(TIA나 LTIA)이면, 본 발명의 양쪽성 계면활성제와 처리한 시료를 2 종류의 항가용성 LR11 항체(LTIA의 경우에는 라텍스 등의 입자에 고정화되어 있다)와 순차적으로, 또는 동시에 반응시키고, 이뮤노크로마토그래피법이면, 본 발명의 양쪽성 계면활성제와 처리한 시료를, 맴브레인 등에 고정화되어 있는 한쪽의 항가용성 LR11 항체에 포착시키고, 금 콜로이드 등의 금속 콜로이드나 착색 라텍스로 표지된 다른 한쪽의 항가용성 LR11 항체로 검출함으로써 행할 수 있다.

혈청 등의 면역 반응 등을 방해하는 물질을 포함한 생물 유래 시료이어도, 상기의 양쪽성 계면활성제로 처리한 후, 가용성 LR11와 반응하는 항체에서 면역학적 측정을 행하면, 상기 시료 중의 가용성 LR11를 간편하고 정확하게 정량할 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 면역학적 측정을 실시함에 있어서, 항가용성 LR11 항체와, 상기 특정의 양쪽성 계면활성제를 포함하는, 가용성 LR11 면역학적 측정용 시약을 제공할 수 있다. 또한, 항가용성 LR11 항체 및 상기 특정의 양쪽성 계면활성제를, 가용성 LR11 면역학적 측정용 시약을 제조하기 위해서 사용할 수 있다.

당해 면역학적 측정용 시약은 항가용성 LR11 항체와 상기 특정의 양쪽성 계면활성제를 포함하지만, 이들 성분이, 시료 희석액과 측정 시약, 또는 제1 시약과 제２ 시약으로서 별개의 상태, 또는 혼합된 상태이어도 좋다. 또한, 당해 시약에는 가용성 LR11의 검출에 이용하는 임의의 원가요소, 예를 들면 완충액, 안정화제나 반응 용기 등을 포함하고 있어도 좋다.

면역학적 측정용 시약의 구체적인 예로서는 이하를 들 수 있다.

샌드위치 ELISA의 경우, 예를 들면, 본 발명의 양쪽성 계면활성제를 함유하는 시료 희석액, 본 발명의 양쪽성 계면활성제를 함유하는 표지 항체액, 본 발명의 양쪽성 계면활성제를 건조 상태에서 함유하는 항가용성 LR11 항체가 고정화된 마이크로플레이트를 들 수 있다. LTIA의 경우, 예를 들면, 본 발명의 양쪽성 계면활성제를 함유하나, 항가용성 LR11 항체가 고정화된 라텍스 입자를 함유하지 않는 시액, 본 발명의 양쪽성 계면활성제를 함유하고, 또한 항가용성 LR11 항체가 고정화된 라텍스 입자를 함유하는 시액을 들 수 있다. 이뮤노크로마토그래피법의 경우, 예를 들면, 본 발명의 양쪽성 계면활성제를 함유하는 시료 희석액, 샘플 패드 또는 표지 항체 함유 패드에 본 발명의 계면활성제를 함침시킨 이뮤노크로마트용 스트립(시험편)을 들 수 있다.

또한, 가용성 LR11 면역학적 측정용 킷으로서는 사용하는 측정계에 맞은 상기 면역학적 측정용 시약을 적의 조합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 측정계의 성립에 필요한 다른 시약 또는 첨부 문서 등도 포함하기도 한다.

[실시예]

이하, 실시예에 의해, 본 발명을 구체적으로 설명한다. 다만, 본 발명은 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 (본 발명의 양쪽성 계면활성제의 효과 확인(샌드위치 ELISA))

(1) 샌드위치 ELISA용 마이크로플레이트의 제작

96-웰 마이크로플레이트(NUNC 사제)에, 150mmol/L　NaCl 함유 20mmol/L　인산 완충액(이하, "PBS"라고 한다)(pH 7.2)로 10㎍/mL에 희석한 항가용성 LR11 모노클로날 항체(M3항체)를 1웰당 100㎕를 첨가하고, 실온에서 2시간 정치하여 M3 항체를 고상화했다. 96-웰 마이크로플레이트를 400㎕의 0.05% Tween 20(등록상표) 함유 PBS(이하, "PBST"라고 한다)로 세정한 후, 10% 슈크로오스, 1% BSA 함유 PBST(이하, "BSA-PBST"라고 한다)를 1웰 당 200㎕ 첨가하고, 실온에서 2시간 블로킹했다. 웰 내의 액을 제거한 후, 데시케이타 내에서 밤새 건조하고, 건조제와 함께 알루미늄 봉지에 넣어 밀봉하고, 사용까지 냉장 보존했다.

(2) 샌드위치 ELISA를 이용한 가용성 LR11 측정

하기의 계면활성제를 각각 5.0%가 되도록 첨가한 PBS를 시료 희석액으로서 이용하여 사람 혈청(TENNESSEE　BLOOD　SERVICES　INC사부터 구입. MEGA-9를 사용하는 종래법으로 측정한 가용성 LR11 농도는　3.9ng/㎖. 이하, 당해 사람 혈청을 "시험 혈청"이라고 하기도 한다)를 11배 희석하여 측정 시료액으로 했다(측정 시료액 중의 계면활성제의 농도는 시료 희석액 중의 농도의 10/11배 농도). 각 측정 시료액을 (1)에서 제작한 마이크로플레이트에 1웰 당 100㎕ 첨가하고, 실온에서 16시간 정치했다(상기와 같이, 이 때의 고상화 항가용성 LR11 항체와 측정 시료 중의 가용성 LR11와의 항원 항체 반응을, "1차 반응"이라고 하기도 한다).

＜사용한 계면활성제＞

(비교예: N-아실-N-메틸글루카민으로서)

·MEGA-9: 카탈로그 번호 M015, 도진카가쿠겐큐쇼사 사제

(실시예)

·SB10: 카탈로그 번호 D4266, SIGMA-ALDRICH사 제품

·SB12: 카탈로그 번호 A1460, Applichem사 제품

·SB14:카탈로그 번호 A1162, Applichem사 제품

·CHAPS:카탈로그 번호 C008, 도진카가쿠겐큐쇼사 제품

·CHAPSO:카탈로그 번호 C020, 도진카가쿠겐큐쇼사 제품

마이크로플레이트의 각 웰을 400㎕의 PBST로 3회 세정한 후, BSA-PBST로 0.4㎍/㎖로 희석한 비오틴 표지 항가용성 LR11 모노클로날 항체(R14 항체. 비오틴화 시약(PIERCE사 제품)에서 비오틴 표지했다.)를 1웰 당 100㎕ 첨가하고, 실온에서 4시간 정치했다(이하, 이 때의 비오틴 표지 항가용성 LR11 모노클로날 항체(R14 항체)와 1차 반응으로 마이크로플레이트상에 포착된 가용성 LR11와의 반응을 "2차 반응"이라고 하기도 한다). 마이크로플레이트를 PBST로 세정한 후, BSA-PBST로 0.2㎍/㎖로 희석한 퍼옥시다제 표지 스트렙토아비딘(PIERCE사 제품)을 1웰 당 100㎕ 첨가하고, 실온에서 1시간 정치했다. 다시 마이크로플레이트를 PBST로 세정하고, TMB 기질액(0.3mg/㎖　3,3'-5,5'-tetramethyl-benzidine　dihydrochloride(SIGMA사 제품), 12mmol/L　과산화수소를 함유하는 100mmol/L　구연산 완충액(pH 3.7))를 1웰 당 100㎕ 첨가하고, 실온에서 30분간 정치했다. 이어서 1.5N　황산을 1웰 당 100㎕ 첨가하여 발색을 정지하고, 마이크로플레이트 리더로 파장 450nm에서 흡광도를 측정했다.

(3) 결과

SB10, SB12, SB14, CHAPS, CHAPSO의 어느 하나를 사용했을 경우에 있어서도, MEGA-9를 사용하여 얻어진 것과 동일 또는 그 이상의 흡광도가 얻어졌다(도 1. 또, 도 중의 흡광도는 시료 흡광도부터 시약 블랭크 흡광도를 뺀 정미 흡광도로 표시하고 있다). 이상으로부터, 본 발명의 양쪽성 계면활성제는 방해물질의 영향을 회피하여 생물 유래 시료 중의 가용성 LR11의 측정이 가능한 것을 알았다.

실시예 2 (본 발명의 양쪽성 계면활성제의 농도와 측정되는 시료 흡광도와의 관계 검토)

(1) 방법

SB10, SB12, SB14, CHAPS 및 CHAPSO, 각각을 PBS에 가하여 계면활성제의 ㄴ농도가 04%, 0.08%, 0.16%, 0.31%, 0.63%, 1.25%, 2.5%, 또는 5.0%가 되도록 조정하였다. 시료 희석액을 이용하여 시험 혈청을 11배 희석하여 측정 시료액으로 했다 (측정 시료액 중의 각 계면활성제의 농도는 시료 희석액 중의 농도의 10/11배 농도). 1차 반응을 실온에서 16시간으로 하는 것을 포함하여, 실시예 1과 동일하게 조작하여 시료 중의 가용성 LR11의 측정을 행했다.

(2) 결과

SB10 (□)에서는 0.63% 부근의 농도에서 측정된 시료 흡광도와 시약 블랭크 흡광도와의 차이가 명료하고, 1.25% 부근으로부터 5.0%까지, 흡광도가 거의 일정하였다.

SB12 (◇)에서는 0.16% 부근의 농도에서 측정된 시료 흡광도와 시약 블랭크 흡광도와의 차이가 명료하고, 0.63% 부근에서 최대 흡광도에 이르고, 0.63% 부근으로부터 5.0%까지 흡광도가 거의 일정하였다.

SB14 (△)에서는 0.08% 부근의 농도로부터 측정된 시료 흡광도와 시약 블랭크 흡광도와의 차이가 명료하고, 1.25% 부근으로부터 5.0%까지, 흡광도가 거의 일정하였다.

CHAPS (■) 및 CHAPSO (▲)에서는 0.63% 부근의 농도에서 측정된 시료 흡광도와 시약 블랭크 흡광도와의 차이가 명료하고, 2.5% 부근으로부터 5.0%까지 흡광도가 거의 일정하였다 (도 2. 또, 도 중의 흡광도는 시약 블랭크 흡광도를 빼기 전의 흡광도로 표시하고 있다).

이상으로부터, 본 발명의 양쪽성 계면활성제는 모두 넓은 농도 범위에서 가용성 LR11의 면역학적 측정에 사용 가능함을 확인하였다.

실시예 3 (본 발명의 양쪽성 계면활성제의 반응시간단축 효과의 확인)

(1) 방법

실시예 2의 결과로부터, SB10, SB12, SB14, CHAPS, CHAPSO의 각각에 PBS를 첨가하여 각각 1.5%, 0.63%, 3.6%, 5.0%, 5.0%가 되도록 하였다. 시료 희석액을 이용하여 시험 혈청을 11배 희석하여 측정 시료액으로 했다(측정 시료액 중의 각 계면활성제의 농도는 시료 희석액 중의 농도의 10/11배 농도). 1차 반응을 1시간으로 하고, 2차 반응을 2시간으로 한 이외는 실시예 1과 동일하게 하여 가용성 LR11의 측정을 행했다. 비교예로서 MEGA-9가 5.0%가 되도록 첨가한 PBS를 시료 희석액으로서 이용하여 상기와 같은 조작으로 가용성 LR11의 측정을 행했다.

(2) 결과

어떠한 양쪽성 계면활성제를 이용했을 경우에서도, MEGA-9를 이용한 비교예의 흡광도보다 큰 흡광도를 나타냈다. 이상으로부터, 본 발명의 양쪽성 계면활성제를 이용하면, 1차 반응을 실온에서 1시간으로 단축했을 경우에도, MEGA-9를 사용하는 종래법과 비교하여, 가용성 LR11를 보다 고감도로 검출하는 것이 가능하다는 것을 알았다(도 3. 또, 도 중의 흡광도는 시료 흡광도부터 시약 블랭크 흡광도를 뺀 넷트(net) 흡광도로 표시하고 있다).

실시예 4 (종래법에 의한 측정결과와의 관계 확인-1)

(1) 방법

SB10, SB12, SB14의 각각을 PBS에 가해 계면활성제의 농도가 1.5%, 0.63%, 3.6%가 되도록 하였다. 희석액으로서 이용하여 5 종류의 사람 혈청(TENNESSEE　BLOOD　SERVICES　INC사부터 구입. MEGA-9를 사용하는 종래법으로 측정한 가용성 LR11 농도는 3.8ng/㎖, 3.9ng/㎖, 5.4ng/㎖, 8.0ng/㎖ 및 9.8ng/㎖)을 11배 희석하여 측정 시료액으로 했다(측정 시료액 중의 각 계면활성제의 농도는 시료 희석액 중의 농도의 10/11배 농도). 1차 반응을 1시간으로 하고, 2차 반응을 2시간으로 한 이외는 실시예 1과 동일한 방법으로 가용성 LR11의 측정을 행했다.

비교예로서 MEGA-9가 5.0%가 되도록 첨가한 PBS를 시료 희석액으로서 이용하여 상기와 동일한 조작에서 가용성 LR11의 측정을 행했다.

실시예 및 비교예의 결과와 MEGA-9(5.0%)를 사용하여 1차 반응을 16시간, 2차 반응을 4시간 측정했을 때의 측정값과의 상관성을 확인했다.

(2) 결과

MEGA-9(비교예) 또는 본 발명의 양쪽성 계면활성제를 이용하여 1차 반응: 1시간, 2차 반응: 2시간으로서 가용성 LR11를 측정한 결과(세로축)와 MEGA-9를 이용해 1차 반응: 16시간, 2차 반응: 4시간으로 한 종래법으로 측정한 결과(횡축)의 상관성을 도 4에 나타냈다. 또, 도 중의 흡광도는 시료 흡광도부터 시약 블랭크 흡광도를 뺀 넷트 흡광도로 표시하고 있다.

비교예인, 5.0%　MEGA-9, 1차 반응: 1시간, 2차 반응: 2시간의 조건(■)에서는 9.8ng/㎖의 시료와 5.4ng/㎖의 시료의 흡광도는 9.8ng/㎖의 쪽이 높기는 했지만 그 차이는 적고, 8.0ng/㎖의 시료의 흡광도는 9.8ng/㎖의 시료의 흡광도보다 높고, 3.8 및 3.9ng/㎖의 시료의 흡광도는 5.4ng/㎖의 시료의 흡광도부터 극단적으로 낮았다.

이것에 대해서, 본 발명의 양쪽성 계면활성제를 이용하여 1차 반응: 1시간, 2차 반응: 2시간으로서 가용성 LR11를 측정한 바, 어느 하나의 양쪽성 계면활성제(SB10(◇), SB12(□), SB14(△))를 이용했을 경우에서도, 측정된 각 혈청 시료의 흡광도는 종래법의 측정값의 고저의 순서로 일치하고 있으며, 농도 의존적인 결과였다(도 4).

실시예 5 (종래법에 의한 측정결과와의 관계 확인-2)

(1) 방법

CHAPS, CHAPSO 각각을, 5.0%가 되도록 첨가한 PBS를 시료 희석액으로서 이용하여 6종류의 사람 혈청(TENNESSEE　BLOOD　SERVICES　INC사부터 구입. MEGA-9를 사용하는 종래법으로 측정한 가용성 LR11 농도는 3.1ng/㎖, 5.2ng/㎖, 6.7ng/㎖, 7.2ng/㎖ 및 8.7ng/㎖, 9.5ng/㎖.)을 11배 희석하여 측정 시료액으로 했다(측정 시료액 중의 각 계면활성제의 농도는 시료 희석액 중의 농도의 10/11배 농도). 1차 반응을 1시간으로 하고, 2차 반응을 2시간으로 한 이외는 실시예 1과 동일한 방법으로 가용성 LR11의 측정을 행했다.

실시예의 결과와 비교예로서 MEGA-9가 5.0%가 되도록 첨가한 PBS를 시료 희석액으로서 이용하여 1차 반응을 16시간, 2차 반응을 4시간으로서 측정했을 때의 측정값과의 상관성을 확인했다.

(2) 결과

MEGA-9(비교예) 또는 본 발명의 양쪽성 계면활성제를 이용하여 1차 반응: 1시간, 2차 반응: 2시간으로서 가용성 LR11를 측정한 결과(세로축)와 MEGA-9를 이용하여 1차 반응: 16시간, 2차 반응: 4시간으로 한 종래법으로 측정한 결과(횡축)의 상관성을 도 5에 나타냈다. 또, 도 중의 흡광도는 시료 흡광도부터 시약 블랭크 흡광도를 뺀 정미 흡광도로 표시하고 있다.

본 발명의 양쪽성 계면활성제를 이용하여 1차 반응: 1시간, 2차 반응: 2시간으로서 가용성 LR11를 측정한 바, 어느 하나의 양쪽성 계면활성제(CHAPS(◆), CHAPSO(□))를 이용했을 경우에도, 측정된 각 혈청 시료의 흡광도는 종래법의 측정값의 고저의 순서에 일치하고 있으며, 농도 의존적인 결과였다(도 5).

실시예 4, 5의 성적으로부터, 본 발명의 양쪽성 계면활성제에 의해 처리한 시료를 이용하여, 면역학적 측정을 행하면, 특허문헌 3에 기재의 N-아실-N-메틸글루카민 등과 동일하게 시료 중의 방해물질의 영향을 회피하고, 그 위에 더욱이 1차 반응의 반응시간을, 실온, 1시간에 단축했을 경우에도, 종래법으로 측정된 시료 사이의 상대 관계에 영향을 주지 않고, 가용성 LR11 농도에 의존한 측정결과를 얻을 수 있는 것이 확인되었다.

Claims

생물 유래 시료 중의 가용성 LR11의 면역학적 측정방법으로, 당해 시료를 술포베타인형 양쪽성 계면활성제 및 아미도술포베타인형 양쪽성 계면활성제로부터 선택되는 1종 이상으로 처리함을 특징으로 하는 가용성 LR11의 면역학적 측정방법.
제1항에 있어서,　술포베타인형 양쪽성 계면활성제 및 아미도술포베타인형 양쪽성 계면활성제가, 각각 하기 일반식(1) 및 (2)

(식중, R¹는 탄소수 6~18의 알킬기 또는 알케닐기를 나타내고, R²CO는 탄소수 6~18의 아실기 또는 콜산 유래 아실기를 나타내며, A는 탄소수 2~5의 알킬렌기 또는 탄소수 2~5의 히드록시 알킬렌기를 나타내고, B는 탄소수 1~5의 알킬렌기를 나타낸다)
로 표시되는 화합물인 면역학적 측정방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 생물 유래 시료가, 혈액, 혈장, 혈청, 골수액 또는 뇨(尿)인 면역학적 측정방법.
제1항 내지 제3항의 어느 한 항에 있어서, 면역학적 측정방법이 항원 인식 부위가 다른, 적어도 2종의 항체를 이용하여 면역 복합체를 형성시키는 공정을 포함하는 것인 면역학적 측정방법.
항가용성 LR11 항체와 술포베타인형 양쪽성 계면활성제 및 아미도술포베타인형 계면활성제로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 가용성 LR11 면역학적 측정용 시약.
제5항에 있어서, 술포베타인형 양쪽성 계면활성제 및 아미도술포베타인형 양쪽성 계면활성제가, 각각 다음 일반식(1) 및 (2)

(식중, R¹는 탄소수 6~18의 알킬기 또는 알케닐기를 나타내고, R²CO는 탄소수 6~18의 아실기 또는 콜산 유래 아실기를 나타내고, A는 탄소수 2~5의 알킬렌기 또는 탄소수 2~5의 히드록시 알킬렌기를 나타내고, B는 탄소수 1~5의 알킬렌기를 나타낸다)
로 표시되는 화합물인 면역학적 측정용 시약.
청구항 5 또는 6 기재의 면역학적 측정용 시약을 포함하는 가용성 LR11의 면역학적 측정용 킷.