JP5052870B2 - 皮膚外用剤及び飲食品 - Google Patents

Description

本発明は、天然由来成分を有効成分とする皮膚外用剤及び飲食品、並びに天然由来成分を有効成分とする抗老化剤、抗酸化剤、抗炎症剤及び脂肪蓄積抑制剤に関する。

皮膚のシワ形成、弾力性低下、荒れ、クスミ等の老化原因としては、種々の原因が考えられる。すなわち、皮膚の真皮及び表皮は、表皮細胞、線維芽細胞およびこれらの細胞の外にあって皮膚構造を支持するエラスチン、コラーゲン、ヒアルロン酸等の細胞外マトリックスによって構成されており、つやがあってみずみずしい状態の皮膚にあっては、これらの皮膚組織の相互作用が恒常性を保つことにより水分保持、柔軟性、弾力性等が確保される。ところが、紫外線、汚染空気、乾燥、過度の皮膚洗浄等の外的因子、及び加齢により、コラーゲンやエラスチンの変性・減少、細胞の損傷、皮膚のターンオーバーを促進するために重要とされる細胞のエネルギーであるATP（アデノシン３リン酸）の減少などが引き起こされる。その結果、皮膚の保護機能や弾力性が低下し、角質が異常剥離を始め、肌はハリやつやを失い、老化症状を呈するようになる。

また、近年、特に生体成分を酸化させる要因として、活性酸素が注目されており、その生体への悪影響が問題となっている。活性酸素は食細胞の殺菌機構において必須であり、ウィルスやガン細胞の除去に重要な働きをしている。しかしながら、活性酸素の過剰な生成は生体内の膜や組織を構成する生体内分子を攻撃し、各種疾患を誘発する。例えば、活性酸素は、コラーゲン等の生体組織を分解したり、油脂類を酸化して細胞に障害を与える過酸化脂質を生成したりすると考えられており、活性酸素によって引き起こされるこれらの障害が、皮膚のシワ形成及び弾力性低下等の老化原因にもなるものと考えられている。

皮膚の炎症性の疾患、例えば、接触性皮膚炎（かぶれ）、乾癬、尋常性天疱瘡、その他肌荒れを伴う各種皮膚疾患等の原因や発症機構は多種多様であるが、ヒアルロニダーゼ、サイクリックＡＭＰホスホジエステラーゼによる血小板凝集及びヒスタミン遊離が一原因として知られている。血小板凝集は、アラキドン酸カスケードのホスホリパーゼＡ２の活性化を招き、それにより放出されたロイコトリエンＢ４やプロスタグランジンＥ２等が炎症反応を引き起こす。

また、近年、過剰な食物の摂取、運動不足、ストレスなどが原因で生じる肥満や高脂血症を始めとする様々な疾患は、社会的に大きな問題となっており、このような肥満や疾患を予防・改善するために、様々な方法が従来から検討されている。例えば、食事制限や運動による方法、食物繊維の摂取、脂肪分解促進剤の利用などが挙げられるが、これらは主に既に体内に蓄積された脂肪を減少させる方法であり、根本的な改善としては不十分であると考えられた。これに対し、生体内での脂肪の蓄積を抑制する方法は、体内での脂肪の蓄積を直接的に抑制するため、肥満や疾患の根本的な改善に優れており、また日常的な予防方法としても効果的である。

なお、サガリバナ科の植物抽出物については、サガリバナ科ホロピキシディウム属植物の抽出物を含有する外用組成物について報告があるものの（特許文献１参照）、サガリバナ科グリアス属の植物抽出物を配合した皮膚外用剤及び飲食品に関する報告はない。
特開２００１―１５１６３４号公報

以上より、細胞活性の賦活化、コラーゲンの産生促進、ＡＴＰの産生促進により、皮膚のシワの形成や弾力性低下等の皮膚の老化を予防・改善できるものと考えられる。さらに、活性酸素の阻害・抑制が有用であり、例えば皮膚の老化を予防・改善できるものと考えられる。また、炎症反応を阻害・抑制するためには、その原因となるヒアルロニダーゼ活性の阻害、ホスホリパーゼＡ２活性の阻害が有用であると考えられる。さらに、脂肪細胞の蓄積の抑制が肥満や高脂血症等の疾患に有用であると考えられる。

そこで、本発明は、第一に、天然物の中から、細胞賦活作用、コラーゲン産生促進作用又はＡＴＰ産生促進作用を有するものを見出し、それを有効成分とした抗老化剤を提供することを目的とする。

また、本発明は、第二に、天然物の中から、活性酸素の阻害・抑制作用を有するものを見出し、それを有効成分とした抗酸化剤を提供することを目的とする。

また、本発明は、第三に、天然物の中から、ヒアルロニダーゼ活性の阻害又はホスホリパーゼＡ２活性の阻害作用を有するものを見出し、それを有効成分とした抗炎症剤を提供することを目的とする。

また、本発明は、第四に、天然物の中から、脂肪蓄積抑制作用を有するものを見出し、それを有効成分とした脂肪蓄積抑制剤を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、第五に、天然物の中から抗老化作用、抗酸化作用、抗炎症作用又は脂肪蓄積抑制作用を有するものを見出し、それを配合した皮膚外用剤を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、第六に、天然物の中から抗老化作用、抗酸化作用、抗炎症作用又は脂肪蓄積抑制作用を有するものを見出し、それを配合した飲食品を提供することを目的とする。

本発明者らは、皮膚外用剤や飲食品に適用可能な天然由来の種々の成分について検討を行った。その結果、サガリバナ科グリアス属の植物であるサチャマンゴ（Grias neuberthii）の抽出物に優れた抗老化作用、抗酸化作用、抗炎症作用及び脂肪蓄積抑制作用を見出し、さらに検討を重ね、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、サチャマンゴの抽出物を有効成分とする抗老化剤、抗酸化剤、抗炎症剤及び脂肪蓄積抑制剤を提供するものである。さらに、サチャマンゴの抽出物を含有する皮膚外用剤及び飲食品を提供するものである。

本発明によれば、優れた効果を有する抗老化剤、抗酸化剤、抗炎症剤及び脂肪蓄積抑制剤が提供される。また、本発明によれば、抗老化作用、抗酸化作用、抗炎症作用及び脂肪蓄積抑制作用を有する皮膚外用剤及び飲食品が提供される。

以下、本発明について詳細に説明する。本発明において、「サチャマンゴの抽出物」としては、サガリバナ科グリアス属の植物であるサチャマンゴ（Grias neuberthii）をそのまま粉砕して使用する場合も含まれるが、サチャマンゴを抽出原料として得られる抽出液、該抽出液の希釈液もしくは濃縮液、該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、またはこれらの粗精製物もしくは精製物が好ましく用いられる。

サガリバナ科は、サガリバナ亜科、パラダイスナットノキ亜科、フォエティディア亜科、ナポレオナエア亜科の4亜科に分けられ、約290種類が知られている。サガリバナ亜科にはサガリバナ（Barringtonia）属が、パラダイスナットノキ亜科にはブラジルナットノキ（Bertholletia）属・パラダイスナットノキ（Lecythis）属・ホウガンノキ（Couroupita）属が、フォエティディア亜科にはフォエティディア（Foetidia）属が、ナポレオナエア亜科にはクラテラントゥス（Crateranthus）属・ナポレオナエア（Napoleonae）属・アステラントス（Asteranthos）属・グリアス（Grias）属などがそれぞれ知られており、サチャマンゴ（Grias neuberthii）として知られる植物はグリアス（Grias）属に属することが知られている。同属の植物としては、Grias peruviana (Sachamangua)・Grias cauliflora (Anchovy pear)・Grias colombiana・Grias fendleri・Grias naughtii・Grias longirachis・Grias multinerviaなどが存在する。

サチャマンゴの抽出物に用いる植物の構成部位は特に限定されるものではなく、例えば葉、根、種子、茎等の構成部位を抽出原料として用いることができる。簡便に利用するには、葉、茎、種子を用いるとよく、有効性の点からは葉や茎を用いるとよい。抽出の際は、生のまま用いてもよいが、抽出効率を考えると、細切、乾燥、粉砕等の処理を行った後に抽出を行うことが好ましい。抽出は、抽出溶媒に浸漬するか、超臨界流体や亜臨界流体を用いた抽出方法でも行うことができる。抽出効率を上げるため、撹拌や抽出溶媒中でホモジナイズしてもよい。抽出温度としては、５℃程度から抽出溶媒の沸点以下の範囲の温度とするのが適切である。抽出時間は抽出溶媒の種類や抽出温度によって異なるが、例えば１時間〜１４日間程度とすることができる。

抽出溶媒として、メタノール、エタノール、プロパノール及びイソプロパノール等の低級アルコール、１、３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール及びグリセリン等の多価アルコール、エチルエーテル及びプロピルエーテル等のエーテル類、酢酸ブチル及び酢酸エチル等のエステル類、アセトン及びエチルメチルケトン等のケトン類、水などの溶媒を用いることができ、これらより１種又は２種以上を選択して用いることができる。また、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等を用いてもよい。さらに、水や二酸化炭素、エチレン、プロピレン、エタノール、メタノール、アンモニアなどの１種又は２種以上の超臨界流体や亜臨界流体を用いてもよい。

サチャマンゴの上記溶媒による抽出物は、そのままでも使用することができるが、濃縮し、又は濃縮乾固し、これを水や極性溶媒に再度溶解して使用することもできる。また、生理作用を損なわない範囲で、抽出物を脱色、脱臭、脱塩等の精製処理やカラムクロマトグラフィー等による分画処理を施し用いてもよい。サチャマンゴの前記抽出物、その処理物及びその分画物は、各処理及び分画後に凍結乾燥し、用時に溶媒に溶解して用いることもできる。

サチャマンゴの抽出物は、優れた抗老化作用、抗酸化作用、抗炎症作用、及び脂肪蓄積抑制作用を有し、抗老化剤、抗酸化剤、抗炎症剤、及び脂肪蓄積抑制剤として使用することができる。サチャマンゴの抽出物の抗老化作用は、例えば、細胞賦活作用、ＡＴＰ産生促進作用、コラーゲン産生促進に基づいて発揮される。また、サチャマンゴ抽出物は、細胞賦活作用、ＡＴＰ産生促進作用、コラーゲン産生促進作用を有しているので、細胞賦活剤、ＡＴＰ産生促進剤またはコラーゲン産生促進剤の有効成分として利用することもできる。

サチャマンゴの抽出物の抗酸化作用は、例えば、活性酸素消去作用及び／又はラジカル消去作用に基づいて発揮される。ただし、サチャマンゴの抽出物の抗酸化作用は上記作用に基づいて発揮される抗酸化作用に限定されるわけではない。ここで、「活性酸素」には、スーパーオキサイド、過酸化水素、ヒドロキシラジカル、一重項酸素等が含まれる。また、「ラジカル」とは、不対電子を一つまたはそれ以上有する分子または原子を意味し、スーパーオキサイド、ヒドロキシラジカル、ＤＰＰＨ等が含まれる。なお、サチャマンゴ抽出物は、活性酸素消去作用、ラジカル消去作用を有しているので、活性酸素消去剤またはラジカル消去剤の有効成分として利用することもできる。

サチャマンゴの抽出物の抗炎症作用は、例えば、ヒアルロニダーゼ阻害作用、ホスホリパーゼＡ２活性阻害作用に基づいて発揮される。また、サチャマンゴ抽出物は、ヒアルロニダーゼ阻害作用、ホスホリパーゼＡ２活性阻害作用を有しているので、ヒアルロニダーゼ阻害剤、ホスホリパーゼＡ２活性阻害剤の有効成分として利用することもできる。

サチャマンゴの抽出物は、皮膚の老化の防止・改善や炎症性疾患の予防・改善に有用であり、抗酸化作用を有し、脂肪蓄積抑制作用を有するとともに、皮膚に適用した場合の使用感と安全性に優れているため、皮膚外用剤に配合するのに好適である。

サチャマンゴの抽出物を配合し得る皮膚外用剤の剤型は特に限定されないが、その具体例としては、ローションなどの可溶化系、クリームや乳液などの乳化系、カラミンローション等の分散系、噴射剤と共に充填したエアゾール、軟膏剤、粉末、顆粒等が挙げられる。皮膚外用剤の具体例としては、ローション、乳液、クリーム、オイル、パックボディーソープまたは浴用剤等が挙げられ、毛髪に適用することも可能であることから、シャンプー、リンス、ヘアートニック、ヘアーリキッド等が挙げられる。

サチャマンゴの抽出物を皮膚外用剤に配合する際の配合量は、皮膚外用剤の種類や使用目的等によって調整することができるが、効果や安定性などの点から、全量に対して０．０００１〜５０．０質量％が好ましく、より好ましくは、０．００１〜２５．０質量％である。

なお、サチャマンゴの抽出物を配合する皮膚外用剤には、サチャマンゴの抽出物の他に、必要に応じて、通常、医薬品、医薬部外品、皮膚化粧料、毛髪用化粧料及び洗浄料に配合される、油性成分、保湿剤、美白剤、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬剤、香料、樹脂、防菌防黴剤、アルコール類等を適宜配合することができる。また、本発明の効果を損なわない範囲において、他の抗老化剤、抗酸化剤、抗炎症剤、脂肪蓄積抑制剤との併用も可能である。

また、サチャマンゴの抽出物を有効成分とする抗老化剤、抗酸化剤、抗炎症剤、脂肪蓄積抑制剤は、皮膚や毛髪に外用するだけではなく、経口摂取も可能であることより、任意の飲食品、または医薬品に応用することも可能である。ここでいう飲食品には、機能性食品及び栄養補助食品も含まれる。

サチャマンゴの抽出物を配合し得る飲食品は特に限定されないが、その具体例としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液および調整用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；そば、うどん、はるさめ、ぎょうざの皮、しゅうまいの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、チューインガム、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂および油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料；スープ、シチュー、サラダ、惣菜、漬物などが挙げられる。

本発明の飲食物を栄養補助食品あるいは機能性食品として用いる場合、その形態は特に限定されないが、例えば蛋白質（蛋白質源としてはアミノ酸バランスのとれた栄養価の高い乳蛋白質、大豆蛋白質、卵アルブミン等の蛋白質が最も広く使用されるが、これらの分解物、卵白のオリゴペプチド、大豆加水分解物等の他、アミノ酸単体の混合物も使用される）、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類、乳化剤、香料等が配合された自然流動食、半消化態栄養食および成分栄養食や、ドリンク剤、カプセル剤等の加工形態であってもよい。スポーツドリンクあるいは栄養ドリンクとして提供する場合は、栄養バランスを整え、かつ摂取時の風味を一層よくするため、易消化性の含水炭素、アミノ酸、ビタミン類、ミネラル類等の栄養的添加物や甘味料、香辛料、香料、色素等を配合することもできる。

本発明の栄養補助食品あるいは機能性食品の形態は、これらに限定されるものではなく、上記の一般の飲食品の形態であってもよいが、できれば単位服用形態にあることが望ましい。

以上説明した本発明の抗老化剤、抗酸化剤、抗炎症剤、脂肪蓄積抑制剤、皮膚外用剤、及び飲食品は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。

以下に、サチャマンゴの抽出物の製造例、各作用を評価するための試験についてさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれによってなんら限定されるものではない。

［製造例１］
サチャマンゴの葉を乾燥させて粉砕し、かかる粉砕物の質量の40倍量の50質量％エタノール水溶液を加え、室温にて攪拌しながら2時間抽出した後、吸引ろ過を行った。ろ過の残物に再度初回と同じ質量の50質量％エタノールを加え、抽出した。2回分のろ液を合わせ、エバポレーターにて減圧濃縮したものを製造例１のサチャマンゴ抽出物として使用した。

［製造例２］
サチャマンゴの葉を乾燥させて粉砕し、かかる粉砕物の質量の9倍量の1,3-ブチレングリコール（BG）を加えて2週間浸漬後、吸引ろ過して得たろ液を製造例２のサチャマンゴ抽出物として使用した。

［作用評価］
１．真皮線維芽細胞賦活作用の評価
真皮線維芽細胞賦活作用の評価は、以下の手順で行った。試料として、製造例２により製造したサチャマンゴ抽出物を用いた。

正常ヒト真皮線維芽細胞を１ウェル当たり２．０×１０^４個となるように９６穴マイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１質量％のウシ胎児血清を添加したものを用いた。２４時間培養後、表１記載の各濃度の試料を添加した試験培地に交換し、さらに４８時間培養した。次いで３−(４,５−ジメチル−２−チアゾリル)−２,５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を４００μｇ／ｍＬ含有する培地に交換して２時間培養し、テトラゾリウム環の開環により生じるフォルマザンを２−プロパノールにて抽出し、マイクロプレートリーダーにて５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両測定値の差により細胞賦活作用を評価した。評価結果を、試料無添加のコントロールにおける細胞賦活作用を１００とした相対値にて表１に示す。かかる評価についてｔ検定を行った。その結果についても表１に示す。

表１より明らかなように、サチャマンゴ抽出物を添加した培地を用いた場合、コントロールと比較して有意な真皮線維芽細胞賦活作用が認められた。このことから、サチャマンゴ抽出物は、優れた真皮線維芽細胞賦活作用を有すること、ひいては抗老化作用を有することが明らかとなった。

２．真皮線維芽細胞を用いたATP産生促進作用の評価
サチャマンゴ抽出物のヒト真皮繊維芽細胞ATP産生促進作用の評価を以下に示す方法により行った。試料として、製造例１により製造したサチャマンゴ抽出物を用いた。

正常ヒト真皮線維芽細胞を1ウェル当り4.0×10^４個となるように48ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）にウシ胎児血清（FBS）を1質量%加えたものを用いた。24時間後、試料溶液を0.125ｍｇ／ｍＬとなるように添加した1質量%FBS添加DMEM培地に交換し、さらに24時間培養した。細胞上清を除去して洗浄し、細胞を超音波処理して細胞中のATPを溶出した。その際に細胞内にあるATP分解酵素の溶出を防ぐため、超音波処理する際に使用するバッファーにATP分解酵素阻害剤（和光純薬社製のCellstein Hoechst33342）を添加した。作製した細胞溶解液を試験管に分注し、ルシフェラーゼおよびルシフェリン試薬を添加し、化学発光を測定した。発光強度はヤマト社製のコンパクトルミVS501を使用して測定した。測定結果を試料溶液無添加の培地を用いたコントロールにおけるATP産生能を100とした相対値にて表２に示す。かかる評価についてｔ検定を行った。その結果についても表２に示す。

表２より明らかなように、サチャマンゴ抽出物を含む培地を用いた場合、コントロールと比較して有意な真皮線維芽細胞ATP産生能の上昇が認められた。このことから、サチャマンゴ抽出物は、優れた真皮線維芽細胞ATP産生能を有すること、ひいては抗老化作用を有することが明らかとなった。

３．ヒト皮膚角化細胞を用いたＩＶ型コラーゲン産生促進作用の評価
サチャマンゴ抽出物のコラーゲン産生促進作用の評価を以下に示す方法にて行った。試料として、製造例２により製造したサチャマンゴ抽出物を用いた。

ヒト皮膚角化細胞を1ウェル当り2.0×10^４個となるように96ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）にウシ胎児血清（FBS）を5質量%加えたものを用いた。24時間後、試料溶液を表３の各濃度となるように添加した5質量%FBS添加DMEM培地に交換し、さらに5日間培養した。培養終了後、培養上清を採取し、ＩＶ型コラーゲンに対するモノクローナル抗体（認識部位：α2鎖）およびビオチン化ポリクローナル抗体を用いたサンドイッチELISA法を行い、アビジン化ホースラディッシュペルオキシダーゼを添加し、3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジンにより発色させ、マイクロプレートリーダーで650nmの吸収波長を測定し、上清中に産生されたＩＶ型コラーゲン量を定量した。また、BCA Protein Assay Kitにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのＩＶ型コラーゲン産生量を求めた。コントロール（試料添加なし）の値を100とした時の相対値より、ＩＶ型コラーゲン産生促進能を評価した結果を表３に示す。かかる評価についてｔ検定を行った。その結果についても表３に示す。

表３から明らかなように、サチャマンゴ抽出物を含む培地を用いた場合、コントロールと比較して有意なコラーゲン産生促進作用が認められた。このことから、サチャマンゴ抽出物は、優れたコラーゲン産生促進作用を有すること、ひいては抗老化作用を有することが明らかとなった。

４．SOD（スーパーオキサイドアニオン）消去能の評価
サチャマンゴ抽出物のスーパーオキサイドアニオン消去能の評価を以下に示す方法にて行った。試料として、製造例２により製造したサチャマンゴ抽出物を用いた。

0.25 mM WST-1及び 1 mM Hypoxanthineを含むHANK’S（＋）溶液 75μLに、HANK’S（＋）溶液にて表４の各濃度に調製した試料溶液25 μLを添加した。更に、Xanthine Oxidase 25μL（0.0075Units）を添加し、37℃で15分間反応後、450 nmの吸光度を測定した。試料溶液にかえてHANK’S（＋）のみを添加した場合の吸光度を（A）、試料溶液を添加した場合の吸光度を（B）としたとき、スーパーオキサイドアニオン消去率は次式によって求められる。

消去率（%）＝｛1−（B）／（A）｝×100
上式によって求めたスーパーオキサイドアニオン消去率を表４に示す。また、かかる消去率についてｔ検定を行った結果を表４に示す。

表４より明らかなように、サチャマンゴ抽出物は濃度依存的にスーパーオキサイドアニオン消去作用を有すること、ひいては抗酸化作用を有するということが分かった。

５．ヒアルロニダーゼ活性阻害作用の評価
サチャマンゴ抽出物のヒアルロニダーゼ活性阻害作用の評価を以下に示す方法にて行った。試料として、製造例１により製造したサチャマンゴ抽出物を用いた。

市販のヒアルロン酸カリウム塩（ヒト臍の緒由来）を0.9 mg/mLになるように、0.1M リン酸緩衝液（pH 7.0）に溶解し、基質溶液とした。市販のヒアルロニダーゼ（ウシ精巣由来）を5,300 unit/mLとなるように、0.1M リン酸緩衝液（pH 7.0）に溶解し、酵素溶液とした。酵素溶液は用事調製とした。試験管に緩衝液で表５の各濃度に調製した試料溶液0.1mL、及び酵素溶液0.03mLを試験管にとり、37℃で20分間反応させた。次に活性化剤を0.06mL加え、37℃で20分間反応させた。さらに基質溶液を0.15mL加え、37℃で1時間反応させた。0.4N NaOH 0.06mLを加え反応を停止させた後すぐに氷冷し、ホウ酸緩衝液（pH9.1）を0.06 mL添加し、3分間煮沸した後さらに氷冷した。p -DABA溶液を2.0 mL 添加し、37℃で20分間反応させた後、各試験管から96ウェルマイクロプレートに移しかえ、マイクロプレートリーダーを用いて585nmにおける吸光度を測定した。コントロールには、試料を溶かすのに用いた緩衝溶液のみを加えたものを用いた。ヒアルロニダーゼの活性が阻害されると分解産物であるN-Acetylglucosamin (GlcNAc)が減少し、p -DABAによる吸光度が低くなる。このことを利用し、阻害活性は次式より求められる。

阻害率 (%)= ｛(コントロール吸光度―サンプル吸光度)/コントロール吸光度｝×100
上式によって求めたヒアルロニダーゼ活性阻害率を表５に示す。また、かかる阻害率についてｔ検定を行った結果を表５に示す。

表５より明らかなように、サチャマンゴ抽出物は有意なヒアルロニダーゼ活性阻害作用を有し、ひいては抗炎症作用を有することが分かった。

６．ホスホリパーゼA2活性阻害作用の評価
サチャマンゴ抽出物のホスホリパーゼA2活性阻害作用の評価を以下に示す方法にて行った。試料として、製造例１により製造したサチャマンゴ抽出物を用いた。

終濃度20ng/mLとなるよう調製したPhospholipase A2（PLA2）と、表６の各濃度に調製した試料溶液と、終濃度3.3mM となるよう調製したDTNB（5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid )）とを混合し、室温で10分間静置した。さらに基質として1.66mM のDiheptanoyl Thio-PCを添加し、室温で45分間反応させ、414nmの吸光度を測定した。また、PLA2溶液にかえてバッファーのみを添加した場合の吸光度を測り、両測定値の差を求めた。コントロールの値を（A）、サンプル添加時の値を（B）とした時、PLA2酵素阻害率は次式によって求められる。

阻害率（%）＝｛1−（B）／（A）｝×100
上式によって求めたPLA2酵素阻害率を表６に示す。また、かかる阻害率についてｔ検定を行った結果を表６に示す。

表６より明らかなように、サチャマンゴ抽出物は有意なPLA2阻害活性作用を有し、ひいては抗炎症作用を有することが分かった。

７．正常ヒト前駆脂肪細胞を用いた中性脂肪蓄積抑制作用の評価
サチャマンゴ抽出物の中性脂肪蓄積抑制作用の評価を以下に示す方法にて行った。試料として、製造例１により製造したサチャマンゴ抽出物を用いた。

皮下脂肪由来正常ヒト前駆脂肪細胞Cryo HPRAD-SQ（三光純薬株式会社製）を1ウェ ル当り1.0×10^４個となるように96ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはＰＧＭ培地（10質量%FBS，2ｍＭ Ｌ-グルタミン，100単位/mL ペニシリン，100μg/mL ストレプトマイシン含有）を用いた。細胞がコンフルエントになる直前に、0.125mg/mLとなるように試料を添加したPGM-分化用培地（10μg/mL インシュリン，1μM デキサメタゾン，200μM インドメタシン，500μM イソブチル-メチルキサンチン含有）に交換し、脂肪細胞への分化誘導を行った。分化誘導開始後、コントロール群（試料添加せず）が成熟して細胞内に多数の脂肪滴が蓄積されるまで、10日〜14日間培養した。細胞を回収後、10質量%中性緩衝ホルムアルデヒド液を用いて細胞を固定した。PBS(-)にて洗浄の後、0.5w/v%オイルレッドO溶液を添加し、37℃で2時間培養した。PBS(-)にて洗浄の後、メタノールを添加し、色素を抽出した。マイクロプレートリーダーにて550nmの吸光度を測定した。同時に濁度として650nmの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて中性脂肪蓄積量を評価した。評価ではコントロール群における蓄積脂肪量を100とした時の相対値を求めて行った。表７にその結果を示す。また、かかる蓄積脂肪量についてｔ検定を行った結果を表７に示す。

表７より明らかなように、サチャマンゴ抽出物によると、有意に中性脂肪の蓄積が抑制されることがわかった。したがって、サチャマンゴ抽出物は、抗肥満作用、痩身作用に寄与しうる。

続いて、本発明に係るサチャマンゴ抽出物を配合した皮膚外用剤の処方例を示す。以下の処方例において、各成分の配合量を質量％で表す。

＜処方例１：皮膚用ローション＞
（１）グリセリン10.0、（２）乳酸ナトリウム0.5、（３）ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（60E.O.）0.2、（４）サチャマンゴ抽出物（製造例1による抽出物）0.2、（５）精製水 残余
（製法）（１）〜（４）の成分を混合し、均一化した後、（５）を加え均一に撹拌し、皮膚用ローションを得た。

＜処方例２：皮膚用ローション＞
（１）エタノール10.0、（２）1質量％ヒドロキシエチルセルロース水溶液20.0、（３）サチャマンゴ抽出物（製造例1による抽出物）0.1、（４）グリセリン7.0、（５）グアイアズレンスルホン酸ナトリウム0.5、（６）精製水 残余
（製法）（１）〜（６）を混合した後、均一とし皮膚用ローションを得た。

＜処方例３：美容液＞
油相成分：（１）スクワラン5.0、（２）白色ワセリン2.0、（３）ミツロウ0.5、（４）ソルビタンセスキオレート0.8、（５）ポリオキシエチレンオレイルエーテル（20E.O.）1.2、
水相成分：（６）プロピレングリコール5.0、（７）精製水 全体を100とした残余、（８）1質量％カルボキシビニルポリマー水溶液20.0、（９）サチャマンゴ抽出物（製造例1による抽出物）0.5、（１０）10質量％水酸化カリウム水溶液1.0、（１１）エタノール5.0、（１２）香料0.2
（製法）（１）〜（５）の油相成分を混合し、７５℃に加熱して溶解、均一化した。一方、（６）〜（８）の水相成分を混合、溶解して７５℃に加熱し、前記油相成分を添加して予備乳化し、（１０）を加えてｐＨを調整した後、ホモミキサーにて乳化した。冷却後４０℃にて（１１）、（９）及び（１２）を添加、混合して美容液を得た。

＜処方例４：皮膚用乳剤＞
油相成分：（１）ステアリン酸0.2、（２）セタノール1.5、（３）ワセリン3.0、（４）流動パラフィン7.0、（５）ポリオキシエチレン（10E.O.）モノオレイン酸エステル1.5、（６）乳酸菌抽出物0.5
水相成分：（７）グリセリン5.0、（８）トリエタノールアミン0.1、（９）サチャマンゴ抽出物（製造例１による抽出物）0.3、（１０）精製水 残余
（製法）（１）〜（６）の油相成分を混合、加熱して均一に溶解し、７０℃に保った。一方、（７）〜（８）、（１０）の水相成分を混合、加熱して均一とし、７０℃とした。この水相成分に前記油相成分を撹拌しながら徐々に添加して乳化し、冷却後４５℃で（９）を加え皮膚用乳液を得た。

＜処方例５：皮膚用ゲル剤＞
（１）1質量％カルボキシビニルポリマー水溶液50.0、（２）ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（50E.O.）0.5、（３）サチャマンゴ抽出物（製造例２による抽出物）0.5、（４）ジプロピレングリコール8.0、（５）10質量％水酸化カリウム水溶液1.0、（６）精製水 残余
（製法）（１）に（２）〜（４）を均一に溶解したものを加え均一に撹拌した。これに（５）を（６）に溶解した水溶液を添加し、増粘させて皮膚用ゲル剤を得た。

＜処方例６：皮膚用クリーム＞
油相成分：（１）ミツロウ6.0、（２）セタノール1.5、（３）還元ラノリン8.0、（４）スクワラン29.5、（５）親油型モノステアリン酸グリセリド4.0、（６）モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（20E.O.）5.0
水相成分：（７）プロピレングリコール5.0、（８）サチャマンゴ抽出物（製造例２による抽出物）0.5、（９）精製水 残余
（製法）（１）〜（６）の油相成分を混合、溶解して７５℃に加熱した。一方、（７）、（９）の水相成分を混合、溶解して７５℃に加熱した。次いで、上記水相成分に油相成分を添加して予備乳化した後、ホモミキサーにて均一に乳化し冷却後４５℃にして（８）を添加し、皮膚用クリームを得た。

＜処方例７：水中油型乳剤性軟膏＞
油相成分：（１）白色ワセリン25.0、（２）ステアリルアルコール25.0、（３）グリセリン10.0、（４）ラウリル硫酸ナトリウム1.0
水相成分：（５）サチャマンゴ抽出物（製造例２による抽出物）0.5、（６）精製水 残余
（製法）（１）〜（４）の油相成分を混合、溶解して均一とし、７５℃に加熱する。そして、７５℃に加熱した（６）に前記油相成分を添加して乳化し、冷却後４５℃にして（５）を添加して、水中油型乳剤性軟膏を得た。

＜処方例８：化粧水＞
（１）エタノール10.0、（２）１，３−ブチレングリコール5.0、（３）サチャマンゴ抽出物（製造例２による抽出物）10.0、（４）グリチルリチン酸ジカリウム0.5、（５）香料0.1、（６）ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（60E.O.）0.2、（７）精製水 残余
（製法）（１）、（２）、（６）、（５）を均一に溶解し、その後（４）を溶解した（７）を加え、（３）を添加して均一に混合、溶解し化粧水を得た。

＜処方例９：メイクアップベースクリーム＞
油相成分：（１）ステアリン酸1.2、（２）セタノール2.0、（３）トリ−２−エチルヘキサン酸グリセリル2.5、（４）自己乳化型モノステアリン酸グリセリド2.0
水相成分：（５）プロピレングリコール10.0、（６）10質量％水酸化カリウム水溶液1.5、（７）サチャマンゴ抽出物（製造例２による抽出物）0.3、（８）精製水 全体を100とした残余
顔料成分等：（９）酸化チタン1.0、（１０）ベンガラ0.1、（１１）黄酸化鉄0.4、（１２）香料0.1
（製法）（１）〜（４）の油相成分を混合し、７５℃に加熱して均一とした。一方、（５）、（６）、（８）の成分を混合し、７５℃に加熱、溶解して均一とし、これに（９）〜（１１）の顔料を添加し、ホモミキサーにて均一に分散させて水相成分とした。この水相成分に前記油相成分を添加し、ホモミキサーにて乳化した後冷却し、４０℃にて（１２）、（７）の成分を添加、混合しメイクアップベースクリームを得た。

＜処方例１０：乳液状ファンデーション＞
油相成分：（１）ステアリン酸2.0、（２）スクワラン5.0、（３）ミリスチン酸オクチルドデシル5.0、（４）セタノール1.0、（５）モノステアリン酸グリセリド1.0
水相成分：（６）１，３−ブチレングリコール8.0、（７）10質量％水酸化カリウム水溶液1.0、（８）サチャマンゴ抽出物（製造例１による抽出物）0.3、（９）精製水 全体を100とした残余
顔料成分等：（１０）酸化チタン9.0、（１１）タルク7.4、（１２）ベンガラ0.5、（１３）黄酸化鉄1.1、（１４）黒酸化鉄0.1、（１５）香料0.1
（製法）（１）〜（５）の油相成分を混合し、７５℃に加熱して均一とした。一方、（６）、（７）、（９）の水相成分を混合し、７５℃に加熱、溶解して均一とし、これに（１０）〜（１４）の顔料を添加し、ホモミキサーにて均一に分散させた後冷却し、４０℃にて（１５）及び（８）を加え乳液状ファンデーションを得た。

＜処方例１１：ハンドクリーム＞
油相成分：セタノール1.5、（２）ワセリン2.0、（３）流動パラフィン10.0、（４）モノステアリン酸グリセリド1.5、（５）イソステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル（60E.O.）2.5、（６）酢酸トコフェロール0.5
水相成分：（７）グリセリン20.0、（８）パラオキシ安息香酸メチル0.1、（９）サチャマンゴ抽出物（製造例２による抽出物）0.5、（１０）精製水 残余
（製法）（１）〜（６）の油相成分を混合、溶解して７５℃に加熱した。一方、（７）、（８）、（１０）の水相成分を混合、溶解して７５℃に加熱した。ついで、水相成分に油相成分を添加して予備乳化した後、ホモミキサーにて均一に乳化し、その後４０℃まで冷却し、（９）を加え、ハンドクリームを得た。

＜処方例１２：ヘアローション＞
（１）ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（50E.O.）0.2、（２）サチャマンゴ抽出物（製造例２による抽出物）5.0、（３）香料0.1、（４）エタノール50.0、（５）パンテノール0.5、（６）１，３−ブチレングリコール5.0、（７）精製水 残余
（製法）（１）に（２）、（３）を溶解した後、（４）を加え均一に溶解する。これに、（５）〜（７）の成分を均一にしたものを加え、均一になるまで撹拌し、ヘアローションを得た。

＜処方例１３：マッサージゲル＞
（１）ジプロピレングリコール7.0、（２）グリセリン8.0、（３）ポリオキシエチレン（15E.O.）オレイルエーテル0.5、（４）1質量％カルボキシビニルポリマー水溶液40.0、（５）1質量％メチルセルロース水溶液20.0、（６）サチャマンゴ抽出物（製造例１による抽出物）0.3、（７）10質量％水酸化カリウム水溶液1.0、（８）精製水 残余
（製法）（１）、（２）、（３）、（６）を均一に溶解後、（４）、（５）を加え均一にする。その後、（８）を加え均一化後、（７）を加えて増粘させてマッサージゲルを得た。

本発明の抗老化剤、抗酸化剤、抗炎症剤及び脂肪蓄積抑制剤は、皮膚化粧料、毛髪用化粧料又は洗浄料等の皮膚外用剤、飲食品、医薬品、医薬部外品に配合して用いるのに有用である。また、本発明に係るサチャマンゴ抽出物は、天然由来の成分であることから、安全性が高いことが容易に考えられ、皮膚外用剤及び飲食物の素材としての意義も大きく、したがって本発明は、新たな皮膚外用剤及び飲食物として有用である。

Claims (1)

1. サチャマンゴ抽出物を有効成分とする脂肪蓄積抑制剤。