JP5040777B2 - マイクロアレイ用プラスチック基板 - Google Patents

Description

本発明は、主にＤＮＡや蛋白など生体由来物を表面に固定し、これら生体由来物質の測定に用いるマイクロアレイ特にＤＮＡマイクロアレイに用いるマイクロアレイ用基板に関する。

ゲノムの解析が進み、遺伝子の発現状況を一度に観る方法として、スライドガラス状基
板に高密度にＤＮＡ断片を配列点着し、このＤＮＡ断片と検体からのＤＮＡ断片とをハイブリダイズさせて遺伝子の発現をみるＤＮＡマイクロアレイが用いられるようになった。

ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子の発現をみる操作として、検体となるＤＮＡに蛍光標識を施し、このＤＮＡ溶液をＤＮＡマイクロアレイに接触させ、ＤＮＡマイクロアレイ上に固定されているＤＮＡ鎖とハイブリダイズさせ、蛍光標識されたＤＮＡのハイブリダイズの状況を見ることによって、それぞれの遺伝子の発現状況をみるという操作が行なわれる。この蛍光における測定にて必要なことは、操作における測定誤差を小さくすることである。現在ＤＮＡマイクロアレイでの遺伝子の発現状状況の測定での測定結果のばらつきの要因の一つは、ハイブリダイズにおけるばらつきに起因している。ハイブリダイズにおけるばらつきは操作上の不適格によるものが多い。ハイブリダイズ操作において重要なことは、ＤＮＡが固定されているエリアに均一に検体となるＤＮＡ溶液を接触させることである。そのためには、ＤＮＡが固定されているエリアが明確に判る必要がある。そのため、従来からＤＮＡマイクロアレイには、基板上のＤＮＡ固定エリアの判別がし易いように、基板上に枠が印刷されているものが多数市販されている。

ハイブリダイズにおけるばらつきの大きな要因は、検体となるＤＮＡ溶液の、不均一さに起因する。不均一さとは、検体となるＤＮＡ溶液の厚みの不均一性であり、濃度の不均一性である。ＤＮＡマイクロアレイでのハイブリダイズ操作は、ＤＮＡが固定されているエリア内に検体となるＤＮＡ溶液を滴下しその上にカバーガラスを覆うことにより、ＤＮＡが固定されているエリア全体に検体となるＤＮＡ溶液を行き渡らせる。この際ＤＮＡ溶液の厚みに偏りが生じ、ＤＮＡのハイブリダイズ反応量がＤＮＡエリア内で偏ることとなる。このようなＤＮＡ溶液の厚みを均一化するために、カバーガラスに下駄の歯のように突起部を設け、ＤＮＡマイクロアレイのＤＮＡ固定化表面との間隙を一定にする、ハイブリダイゼーション用カバーガラスが市販されている。しかし、このようなカバーガラスを用いた場合でも、操作中にカバーガラスがずれてしまうという不都合が生じる。
また、このようなカバーガラスはカバーガラスに下駄の歯状にガラスを貼りあわせて作製される。ガラスは割れ易く薄いカバーガラスにガラスを貼りあわせる作業は大変な手間である。

そこで、プラスチックの成形によりこのようなカバーを作製するということが考えられるが、プラスチックは軽く、ＤＮＡ溶液上にカバーが浮いてしまうためカバーがずれやすく、ＤＮＡマイクロアレイに用いるハイブリダイゼーション用プラスチック製のカバーの実現は困難であった。

特許文献１には、これら問題点を解決するために、凸部を有した基板と凸部を有したカバーを嵌合させることによって、ハイブリダイゼーションの不均一性を解消している。ただしこの方法では嵌合が不十分なため、ハイブリダイゼーション時に振とうを伴う場合にはカバーが容易に外れてしまう問題点がある。
特開２００４−１７７３４５号公報

本発明が解決しようとする課題は、従来のガラス製マイクロアレイ用基板でみられる、ハイブリダイゼーションにおけるＤＮＡ溶液の厚みの不均一を解消し、ハイブリダイゼーションにおける信頼性と再現性を確保することである。

本発明は以下の通りである。
（１）生物由来物を捕獲する物質を点着固定した検体捕獲部を形成し、検体捕獲部に検体となる溶液を接触させ、検出目的とする生物由来物を捕獲してその有無又は量を判定するマイクロアレイの作製に用いるプラスチック製の基板であって、
基板本体とカバーから成り、
前記基板本体は前記基板本体の表面中央部に凹状となった検体捕獲部を有し、かつ、前記検体捕獲部の外縁部に第一溝部が形成され、
前記カバーは表面から突出した凸部を有し、かつ、前記カバーの前記凸部が形成された面の周縁部に第二溝部が形成され、
前記第一溝部及び前記第二溝部には硬化性物質が充填され、
前記基板本体の前記検体捕獲部と前記カバーの前記凸部は、前記基板本体の前記検体捕獲部の表面と前記カバーとの間に一定の大きさの間隙を形成し、かつ、前記第一溝部及び前記第二溝部が対向するように嵌合することを特徴とするマイクロアレイ用プラスチック基板。
（２）前記基板本体と前記カバーとを嵌合させ、生物由来物を捕獲した後に、前記基板本体から前記カバーを取り外せることが可能である請求項１記載のマイクロアレイ用プラスチック基板。
（３）前記カバーにおいて、前記凸部よりも中心側に１個以上の貫通孔を有し、前記基板本体と前記カバーを嵌合させた後、前記貫通孔を介して前記基板本体の前記検体捕獲部の表面と前記カバーとの間隙に検体を注入することができる請求項１又は２記載のマイクロアレイ用プラスチック基板。
（４）前記第二溝部に１個以上の貫通孔を有する請求項３記載のマイクロアレイ用プラスチック基板。
（５）生物由来物を捕獲後に、前記基板本体から前記カバーを機械的に取り外せることが可能である請求項４記載のマイクロアレイ用プラスチック基板。
（６）前記硬化性物質が熱硬化性物質である請求項１ないし５のいずれか一項に記載のマイクロアレイ用プラスチック基板。
（７）前記熱硬化性物質がシリコーン樹脂である請求項６記載のマイクロアレイ用プラスチック基板。
（８）請求項１〜７いずれか記載のマイクロアレイ用プラスチック基板の前記検体捕獲部に生物由来物を捕獲する物質を点着固定したマイクロアレイ。

本発明に従うと、マイクロアレイでの検体溶液との接触作業、特にＤＮＡマイクロアレ
イでのハイブリダイゼーションにおける検体となるＤＮＡ溶液の基板との接触が、均一に
かつ確実に行えることにより、ハイブリダイゼーションでのＤＮＡの反応が均一に行える
こととなり再現性の高い検出結果を得ることができる。また、プラスチック化が可能とな
り、従来のガラス製の基板およびカバーに較べて、安いコストでの供給が可能となる。

以下、本発明について詳細に説明する。
まず、本発明のマイクロアレイ用基板本体に使用するプラスチックの材質であるが、ＤＮＡマイクロアレイを初めとして、検体の検出方法には蛍光を用いることが主流となっており、基板自身が蛍光を発すると検出ができなくなるため、自己蛍光を発しないものが好ましい。さらにＤＮＡマイクロアレイでの操作においては沸騰水中に浸漬するなどの加熱操作があることから耐熱性を有する樹脂であることが好ましい。このような樹脂として、環状ポリオレフィン樹脂やＥＴＦＥなどのフッ素樹脂等が挙げられる。

一方、本発明のカバーに用いるプラスチックの材質であるが、検出時はこのカバーを外
すことから検出時の自己蛍光性については考慮する必要はない。しかし中の溶液状態を確認する必要があることから、透明であることが好ましい。このような要求特性を満たすプラスチックとしてはポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、環状ポリオレフィン、ポリカーボネイトなどが挙げられる。

本発明における硬化性物質とは、加熱あるいは光照射などにより化学的変化を起こし硬化する性質を有する物質を指す。また、熱硬化性物質とは、加熱することにより化学的変化を起こし硬化する物質を指し、例としては、シリコーン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリウレタン樹脂、フェノール樹脂、メラニン樹脂などが挙げられる。また、光硬化性物質とは、光照射とくに紫外線照射することにより硬化する物質を指し、例としては、エポキシ樹脂、アクリル樹脂などが挙げられる。
シリコーン樹脂とは、シロキサン結合を骨格とした高分子有機化学物一般を指すが、特に室温で硬化するシリコーン樹脂が好ましい。

次に、本発明のマイクロアレイ用プラスチック基板本体およびカバーの全体の形状について記載する。マイクロアレイ本体であるが、現在ＤＮＡマイクロアレイの読み取りに広く用いられているスキャナーに適合する形としてスライドガラスと同じ形状が好適である。
カバーについては、特に規定はないが、嵌合の対象となるマイクロアレイ本体がスライドグラス状であることから、この形状に合った形が好適であり、形状としては四角形であることが好ましい。

次に、図によりさらに詳細に説明を行なう。
図１は本発明の一実施例となるプラスチック製マイクロアレイ用プラスチック基板の本体とカバーがセットされた状態を表す模式図、図２は本発明の一実施例となるマイクロアレイ用基板本体を表す模式図、図３は本発明の一実施例となるカバーを表す模式図、図４は図１のＩ−ＩＩ方向の断面図である。

マイクロアレイ用プラスチック基板本体（１）には、生物由来物を捕獲する物質としてＤＮＡなどを基板に固定する部位として基板表面中央部に凹状となった検体捕獲部（７）を有する。ＤＮＡの固定は、例えば直径５０〜５００μｍという細いピンの先端にＤＮＡ溶液を付着させ、点着することによって行なわれる。検体捕獲部（７）の形態は四角状であることが好ましい。
検体捕獲部（７）は、基板を射出成形等によって基板表面中央部に凹部を形成させる。

カバー（２）には凸部（６）を設ける。凸部の形状は、基板本体（１）の検体捕獲部（７）と嵌合する形とすることが好ましい。

検体捕獲部（７）の表面とカバー（２）との間隙（８）の大きさは、検体捕獲部（７）
の深さ及びカバー（２）の凸部（６）の高さにより調整される。この間隙の大きさは１５
〜２００μｍであることが好ましい。１５μｍ未満であると検体の溶液量が少なく十分なハ
イブリダイズができず、２００μｍを超えると検体の溶液量が多くなりより多くのサンプ
ルの準備が必要となる。

カバーにおいて、凸部よりも中心側に少なくとも１個の貫通孔（９）を設けることが好ましい。貫通孔（９）の形状は溶液の注入のし易さから円柱状であることが好ましく、その直径は５０〜４００μｍであることが好ましい。

基板本体（１）及び／又はカバー（２）に溝部（４）、（５）を設けることが好ましい。溝部の形状は、幅５０〜５００μｍであることが好ましく、また深さは５０〜５００μｍであることが好ましい。
溝部（４）、（５）に硬化性物質を充填し硬化させることによって、基板本体（１）とカバー（２）との嵌合がより強固になる。

カバー溝部（５）には少なくとも１個の貫通孔（３）を設けることが好ましい。貫通孔（３）は硬化性物質を溝部（４）、（５）に充填する際に用いられる。貫通孔（３）の形状は硬化性物質の注入のし易さから円柱状であることが好ましく、その直径は５０〜４００μｍであることが好ましい。

本発明のマイクロアレイ用プラスチック基板の検体溶液との接触方法についてＤＮＡマ
イクロアレイでのハイブリダイゼーションを例に記載する。
なお、本発明のマイクロアレイ用プラスチック基板の形態、使用方法については以下に記載する限りではない。

まず検体捕獲部（７）にＤＮＡが固定された基板本体（１）とカバー（２）を嵌合させる。次に、カバー溝部の貫通穴（３）から、シリコーン樹脂（信越化学工業(株)製 一液型ＲＴＶゴム）を注入する。シリコーン樹脂は基板本体溝部（４）とカバー溝部（５）の間隙へ充填される。シリコーン樹脂が硬化するまで室温で数時間以上静置させる。カバーの貫通孔（９）から基板本体の検体捕獲部表面とカバーとの間隙にハイブリダイゼーション溶液を注入し充填させる。ハイブリダイゼーション用のケース中に基板を納め、放置しハイブリダイゼーションを行う。この際、必要に応じて振とうさせる。本発明においては、溶液の充填が確実に行え、振とうによってカバーがずれたりすることがないため、確実にハイブリダイゼーションを行うことができる。
ハイブリダイゼーションが終了した後、カバーを外し、洗浄等を行いスキャナーなどの読み取り装置で、ＤＮＡの捕獲状況を確認する。カバーを外す際に、シリコーン樹脂は、基板本体溝部（４）と基板本体（１）との界面で剥離してカバー溝部（５）に残る場合と、カバー溝部（５）とカバー（２）との界面で剥離して基板本体溝部（４）に残る場合とがある。

本発明の一実施例となるプラスチック製マイクロアレイ用プラスチック基板の本体とカバーがセットされた状態を表す模式図。 本発明の一実施例となるマイクロアレイ用基板本体を表す模式図。 本発明の一実施例となるカバーを表す模式図。 図１のＩ−ＩＩ方向の断面図。

符号の説明

１ 基板本体
２ カバー
３ 貫通孔
４ 基板本体溝部
５ カバー溝部
６ カバー凸部
７ 検体捕獲部
８ 間隙
９ 貫通孔

Claims (8)

1. 生物由来物を捕獲する物質を点着固定した検体捕獲部を形成し、検体捕獲部に検体となる溶液を接触させ、検出目的とする生物由来物を捕獲してその有無又は量を判定するマイクロアレイの作製に用いるプラスチック製の基板であって、
   基板本体とカバーから成り、
   前記基板本体は前記基板本体の表面中央部に凹状となった検体捕獲部を有し、かつ、前記検体捕獲部の外縁部に第一溝部が形成され、
   前記カバーは表面から突出した凸部を有し、かつ、前記カバーの前記凸部が形成された面の周縁部に第二溝部が形成され、
   前記第一溝部及び前記第二溝部には硬化性物質が充填され、
   前記基板本体の前記検体捕獲部と前記カバーの前記凸部は、前記基板本体の前記検体捕獲部の表面と前記カバーとの間に一定の大きさの間隙を形成し、かつ、前記第一溝部及び前記第二溝部が対向するように嵌合することを特徴とするマイクロアレイ用プラスチック基板。
2. 前記基板本体と前記カバーとを嵌合させ、生物由来物を捕獲した後に、前記基板本体から前記カバーを取り外せることが可能である請求項１記載のマイクロアレイ用プラスチック基板。
3. 前記カバーにおいて、前記凸部よりも中心側に１個以上の貫通孔を有し、前記基板本体と前記カバーを嵌合させた後、前記貫通孔を介して前記基板本体の前記検体捕獲部の表面と前記カバーとの間隙に検体を注入することができる請求項１又は２記載のマイクロアレイ用プラスチック基板。
4. 前記第二溝部に１個以上の貫通孔を有する請求項３記載のマイクロアレイ用プラスチック基板。
5. 生物由来物を捕獲後に、前記基板本体から前記カバーを機械的に取り外せることが可能である請求項４記載のマイクロアレイ用プラスチック基板。
6. 前記硬化性物質が熱硬化性物質である請求項１ないし５のいずれか一項に記載のマイクロアレイ用プラスチック基板。
7. 前記熱硬化性物質がシリコーン樹脂である請求項６記載のマイクロアレイ用プラスチック基板。
8. 請求項１〜７いずれか記載のマイクロアレイ用プラスチック基板の前記検体捕獲部に生物由来物を捕獲する物質を点着固定したマイクロアレイ。
   

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