JP5036679B2 - タンパク質精製方法 - Google Patents
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Description
本発明はタンパク質の精製方法に関し、さらに詳しくは抗体などの生理活性タンパク質を含有する試料中から夾雑物としてのＤＮＡを除去する方法に関する。
遺伝子組換え技術の発達によって、種々のタンパク質製剤が安定した供給量で提供されるようになった。特に、近年通常の医薬品に比べて選択性の高い様々な抗体医薬品が遺伝子組換え技術によって開発されており、臨床試験に入っている。
このような遺伝子組換え技術によって産生された生理活性タンパク質を含有する製剤においては、宿主ＤＮＡやウイルスの汚染によるＤＮＡ夾雑物を除去する必要がある。現在、バイオ医薬品におけるＤＮＡの許容量は１００ｐｇＤＮＡ／一投与量以下であることが世界保健機構（ＷＨＯ）により示されている。この基準を満たすために、一般には、宿主細胞から得られる生理活性タンパク質を含有する水性培地を陰イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、もしくはこれらの組合せで処理することによりＤＮＡを除去している。
特に、生理活性タンパク質が哺乳動物細胞を宿主として得られた抗体であるときには、プロテインＡもしくはプロテインＧがＩｇＧのＦｃ鎖に結合する性質を利用して、プロテインＡもしくはプロテインＧのアフィニティカラムクロマトグラフィー処理を行った後に種々のクロマトグラフィーで精製している。
例えば、特許文献１では、哺乳動物細胞培養から得られた抗体含有水性培地をプロテインＡもしくはプロテインＧカラムクロマトグラフィーに適用して抗体をカラムに吸収させ、次いで酸性溶液（濃度約０．１Ｍのクエン酸、ｐＨ３．０−３．５）を用いて抗体を溶出させ、得られる酸性溶出液をイオン交換カラムクロマトグラフィー、サイズ排除カラムクロマトグラフィーに順次適用して精製している。
しかし、これらの各種クロマトグラフィー工程やその組合せは時間、労力、コストがかかり、煩雑であり、また効果も安定していない。
従って、より簡単な方法で、確実にＤＮＡ夾雑物を除去でき、しかも生理活性タンパク質の損失が少なく、かつ実施コストの低い生理活性タンパク質、特に抗体の精製方法が求められている。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、驚くべきことに、生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性水溶液状態とし、緩衝液を添加してｐＨを中性域に上昇させ、生じた粒子をフィルター濾過することにより、煩雑なクロマトグラフィー工程を行わずにＤＮＡ夾雑物を効率よく除去できることを見い出して本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
（１）以下の段階：
１）生理活性タンパク質含有試料をｐＨが中性域の低伝導度水溶液状態とし；
２）生じる粒子を除去する、
を含む、生理活性タンパク質含有試料中のＤＮＡ夾雑物を除去する方法。
（１）以下の段階：
１）生理活性タンパク質含有試料をｐＨが中性域の低伝導度水溶液状態とし；
２）生じる粒子を除去する、
を含む、生理活性タンパク質含有試料中のＤＮＡ夾雑物を除去する方法。
（２）以下の段階：
１）生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性またはアルカリ性水溶液状態とし；
２）得られる試料のｐＨを中性域に調整し；
３）生じる粒子を除去する、
を含む、生理活性タンパク質含有試料中のＤＮＡ夾雑物を除去する方法。
１）生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性またはアルカリ性水溶液状態とし；
２）得られる試料のｐＨを中性域に調整し；
３）生じる粒子を除去する、
を含む、生理活性タンパク質含有試料中のＤＮＡ夾雑物を除去する方法。
（３）以下の段階：
１）抗体含有試料をプロテインＡもしくはプロテインＧのアフィニティクロマトグラフィーに適用して、低伝導度の酸性水溶液で溶出し；
２）得られる溶出液に緩衝液を添加してｐＨを中性域に上昇させ；
３）生じる粒子を除去する、
を含む、抗体含有試料中のＤＮＡ夾雑物を除去する方法。
１）抗体含有試料をプロテインＡもしくはプロテインＧのアフィニティクロマトグラフィーに適用して、低伝導度の酸性水溶液で溶出し；
２）得られる溶出液に緩衝液を添加してｐＨを中性域に上昇させ；
３）生じる粒子を除去する、
を含む、抗体含有試料中のＤＮＡ夾雑物を除去する方法。
（４）低伝導度の酸性水溶液の伝導度が、０〜１００ｍＭのモル濃度である前記（２）又は（３）に記載の方法。
（５）低伝導度の酸性水溶液のイオン強度が、０〜０．２である前記（２）又は（３）に記載の方法。
（６）低伝導度の酸性水溶液の導電率が、０〜３００ｍＳ／ｍである前記（２）又は（３）に記載の方法。
（５）低伝導度の酸性水溶液のイオン強度が、０〜０．２である前記（２）又は（３）に記載の方法。
（６）低伝導度の酸性水溶液の導電率が、０〜３００ｍＳ／ｍである前記（２）又は（３）に記載の方法。
（７）酸性水溶液が塩酸、クエン酸、酢酸の水溶液から選択される前記（２）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）酸性水溶液のｐＨが１．５〜３．９である前記（７）に記載の方法。
（９）処理後の生理活性タンパク質含有試料中のＤＮＡ夾雑物がＤＮＡ濃度２２．５ｐｇ／ｍｌ以下である前記（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（８）酸性水溶液のｐＨが１．５〜３．９である前記（７）に記載の方法。
（９）処理後の生理活性タンパク質含有試料中のＤＮＡ夾雑物がＤＮＡ濃度２２．５ｐｇ／ｍｌ以下である前記（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（１０）緩衝液がＴｒｉｓ水溶液である前記（３）に記載の方法。
（１１）緩衝液を添加してｐＨを４．３〜７．５に上昇させる前記（３）に記載の方法。（１２）生理活性タンパク質が抗体である前記（１）又は（２）に記載の方法。
（１１）緩衝液を添加してｐＨを４．３〜７．５に上昇させる前記（３）に記載の方法。（１２）生理活性タンパク質が抗体である前記（１）又は（２）に記載の方法。
（１３）抗体がヒト型化モノクローナル抗体である前記（３）又は（１２）に記載の方法。
（１４）抗体がヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体である前記（１３）に記載の方法。
（１５）抗体がヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体である前記（１３）に記載の方法。
（１４）抗体がヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体である前記（１３）に記載の方法。
（１５）抗体がヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体である前記（１３）に記載の方法。
（１６）抗体がヒト型化抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体（抗ＰＴＨｒＰ抗体）である前記（１３）に記載の方法。
（１７）抗体がヒト型化抗組織因子抗体である前記（１３）に記載の方法。
（１８）粒子をフィルター濾過によって除去する前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（１７）抗体がヒト型化抗組織因子抗体である前記（１３）に記載の方法。
（１８）粒子をフィルター濾過によって除去する前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（１９）前記（１）又は（２）に記載の方法によって得られる精製生理活性タンパク質。（２０）前記（３）に記載の方法によって得られる精製抗体。
（２１）ｐＨが中性域の低伝導度水溶液中で抗体−ＤＮＡ複合体を実質的に含まない精製抗体。
（２２）精製抗体中のＤＮＡ濃度が２２．５ｐｇ／ｍｌ以下である精製抗体。
（２１）ｐＨが中性域の低伝導度水溶液中で抗体−ＤＮＡ複合体を実質的に含まない精製抗体。
（２２）精製抗体中のＤＮＡ濃度が２２．５ｐｇ／ｍｌ以下である精製抗体。
本発明の方法で精製する生理活性タンパク質含有試料に含まれる生理活性タンパク質は、例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)、エリスロポエチン(ＥＰＯ)、トロンボポエチン等の造血因子、インターフェロン、ＩＬ−１やＩＬ−６等のサイトカイン、モノクローナル抗体、組織プラスミノーゲン活性化因子(ｔＰＡ)、ウロキナーゼ、血清アルブミン、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、レプチン、インシュリン、幹細胞成長因子(ＳＣＦ)などを含むが、これらに限定されない。タンパク質の中でも、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、モノクローナル抗体等の抗体が好ましく、さらに好ましくはモノクローナル抗体である。プロテインＡもしくはプロテインＧアフィニティクロマトグラフィーを用いて実施する本発明の態様では、モノクローナル抗体が好ましい。
生理活性タンパク質とは、哺乳動物、特にヒトの生理活性タンパク質と実質的に同じ生物学的活性を有するものであり、天然由来のもの、および遺伝子組換え法により得られたものを含むが、好ましいのは遺伝子組換え法により得られたものである。遺伝子組換え法によって得られるタンパク質には天然タンパク質とアミノ酸配列が同じであるもの、あるいは該アミノ酸配列の１又は複数を欠失、置換、付加したもので前記生物学的活性を有するものを含む。さらには、生理活性タンパク質はＰＥＧ等により化学修飾されたものも含む。
生理活性タンパク質が糖鎖を有するタンパク質である場合、糖鎖の由来としては、特に制限はないが、哺乳動物細胞に付加される糖鎖が好ましい。哺乳動物細胞には、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、ヒト由来の細胞等があるが、この中でも、ＣＨＯ細胞が最も好ましい。
生理活性タンパク質がＥＰＯである場合には、ＥＰＯはいかなる方法で製造されたものでもよく、ヒト尿より種々の方法で抽出し、分離精製したもの、遺伝子工学的手法（例えば特許文献２）によりチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、ヒト由来の細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。さらには、ＰＥＧ等により化学修飾されたＥＰＯも含む（特許文献３参照）。さらに、糖鎖のついていないＥＰＯをＰＥＧ等により化学修飾したものも含む。また、ＥＰＯのアミノ酸配列中のＮ−結合炭水化物鎖結合部位もしくはＯ−結合炭水化物鎖結合部位において、１以上のグリコシル化部位の数を増加させるように改変したＥＰＯ類似体も含む（例えば、特許文献４、特許文献５参照）。さらには、糖鎖結合部位の数は変化させずに、シアル酸等の含量を増加させることにより糖鎖の量を増加させたものであってもよい。
生理活性タンパク質がＧ−ＣＳＦである場合には、Ｇ−ＣＳＦは高純度に精製されたＧ−ＣＳＦであれば全て使用できる。本発明におけるＧ−ＣＳＦは、いかなる方法で製造されたものでもよく、ヒト腫瘍細胞の細胞株を培養し、これから種々の方法で抽出し分離精製したもの、あるいは遺伝子工学的手法により大腸菌などの細菌類；イースト菌；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＯＳ細胞などの動物由来の培養細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。好ましくは大腸菌、イースト菌又はＣＨＯ細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。最も好ましくはＣＨＯ細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。さらには、ＰＥＧ等により化学修飾されたＧ−ＣＳＦも含む（特許文献３参照）。
生理活性タンパク質がモノクローナル抗体である場合には、モノクローナル抗体はいかなる方法で製造されたものでもよい。モノクローナル抗体は、基本的には公知技術を使用し、感作抗原を通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作成できる。さらに、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体に限られるものではなく、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変されたキメラ抗体を含む。あるいは再構成（reshaped）したヒト型化抗体を本発明に用いることもできる。これはヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域によりヒト抗体の相補性決定領域を置換したものであり、その一般的な遺伝子組換手法も知られている。その既知方法を用いて、再構成ヒト型化抗体を得ることができる。
なお、必要に応じ、再構成ヒト型化抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク（ＦＲ）領域のアミノ酸を置換してもよい（非特許文献１）。このような再構成ヒト型化抗体としてヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体（ｈＰＭ−１）が好ましく例示される（特許文献６を参照）。また、ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体（特許文献７を参照）、ヒト型化抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体（抗ＰＴＨｒＰ抗体）（特許文献８を参照）、ヒト型化抗組織因子抗体（特許文献９を参照）なども本発明で使用する好ましい抗体である。
さらに、トランスジェニック動物やファージディスプレイ等によって作製されたヒト抗体も好ましい。
本発明では、生理活性タンパク質含有試料もしくは抗体含有試料とは、好ましくは、培養により得られた生理活性タンパク質もしくは抗体を含むＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞の培養培地、あるいはこれに部分的精製などの一定の処理を施したものをいう。
本発明の好ましい態様では、以下の段階：
１）生理活性タンパク質含有試料をｐＨが中性域の低伝導度水溶液状態とし；
２）生じる粒子を除去する、
を含む方法によって、生理活性タンパク質含有試料中のＤＮＡ夾雑物を除去する。
１）生理活性タンパク質含有試料をｐＨが中性域の低伝導度水溶液状態とし；
２）生じる粒子を除去する、
を含む方法によって、生理活性タンパク質含有試料中のＤＮＡ夾雑物を除去する。
本発明において、ｐＨが中性域の低伝導度水溶液とは、通常、モル濃度が０〜１００ｍＭ、好ましくは０〜５０ｍＭ、さらに好ましくは０〜３０ｍＭの水溶液または、イオン強度が０〜０．２、好ましくは０〜０．１２の水溶液または、導電率が０〜３００ｍＳ／ｍ、好ましくは０〜２００ｍＳ／ｍ、さらに好ましくは０〜１５０ｍＳ／ｍの水溶液であって、ｐＨ４〜８、好ましくはｐＨ４．５〜７．５の水溶液をいう。
本発明の別の好ましい態様では、以下の段階：
１）生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性またはアルカリ性水溶液状態とし；
２）得られる試料のｐＨを中性域に調整し；
３）生じる粒子を除去する、
を含む方法によって、生理活性タンパク質含有試料中のＤＮＡ夾雑物を除去する。
１）生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性またはアルカリ性水溶液状態とし；
２）得られる試料のｐＨを中性域に調整し；
３）生じる粒子を除去する、
を含む方法によって、生理活性タンパク質含有試料中のＤＮＡ夾雑物を除去する。
本発明の別の好ましい態様では、生理活性タンパク質が抗体であるときに極めて有用であり、以下の段階：
１）抗体含有試料をプロテインＡもしくはプロテインＧのアフィニティクロマトグラフィーに適用して、低伝導度の酸性水溶液で溶出し；
２）得られる溶出液に緩衝液を添加してｐＨを中性域に上昇させ；
３）生じる粒子を除去する、
を含む方法によって、抗体含有試料中のＤＮＡ夾雑物を除去する。
１）抗体含有試料をプロテインＡもしくはプロテインＧのアフィニティクロマトグラフィーに適用して、低伝導度の酸性水溶液で溶出し；
２）得られる溶出液に緩衝液を添加してｐＨを中性域に上昇させ；
３）生じる粒子を除去する、
を含む方法によって、抗体含有試料中のＤＮＡ夾雑物を除去する。
本発明の方法では、生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性水溶液状態とし、好ましくはプロテインＡもしくはプロテインＧアフィニティクロマトグラフィーを低伝導度の酸性水溶液で溶出させることによって低伝導度の酸性水溶液状態とする。本発明における低伝導度の酸性水溶液とは、通常、モル濃度が０〜１００ｍＭ、好ましくは０〜５０ｍＭ、さらに好ましくは０〜３０ｍＭの水溶液または、イオン強度が０〜０．２、好ましくは０〜０．１２の水溶液または、導電率が０〜３００ｍＳ／ｍ、好ましくは０〜２００ｍＳ／ｍ、さらに好ましくは０〜１５０ｍＳ／ｍの水溶液であって、ｐＨ１．５〜３．９、好ましくはｐＨ２．０〜３．９、さらに好ましくはｐＨ２．０〜３．０の水溶液をいう。酸性水溶液は、塩酸、クエン酸、酢酸などの水溶液から選択してよい。精製しようとする生理活性タンパク質、抗体の種類により、使用する低伝導度の酸性水溶液の種類、伝導度、ｐＨはそれぞれ異なっており、当業者は本明細書に記載の方法に従って予備試験を行うことにより、これらの最適条件を容易に設定できる。
本発明の方法では、生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性水溶液状態とした後、得られる試料に緩衝液を添加してｐＨを中性域に上昇させる。あるいは、抗体含有試料をプロテインＡもしくはプロテインＧのアフィニティクロマトグラフィーに適用して、低伝導度の酸性水溶液で溶出し、得られる溶出液に緩衝液を添加してｐＨを中性域に上昇させる。この段階で添加する緩衝液は、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、リン酸緩衝液などを含み、更にはＴｒｉｓ水溶液、Ｎａ２ＨＰＯ４水溶液、ＮａＯＨ水溶液などをも含むものである。中性域とは精製しようとする生理活性タンパク質、抗体の種類により、それぞれ異なっており、一般的にはｐＨ４〜８、好ましくはｐＨ４．３〜７．５、さらに好ましくはｐＨ４．５〜７．５である。使用する緩衝液の種類、中性域のｐＨについては、当業者は本明細書に記載の方法に従って予備試験を行うことにより、最適条件を容易に設定できる。
また、本発明の方法で使用する低伝導度のアルカリ性水溶液とは、通常、モル濃度が０〜１００ｍＭ、好ましくは０〜５０ｍＭ、さらに好ましくは０〜３０ｍＭの水溶液または、イオン強度が０〜０．２、好ましくは０〜０．１２の水溶液または、導電率が０〜３００ｍＳ／ｍ、好ましくは０〜２００ｍＳ／ｍ、さらに好ましくは０〜１５０ｍＳ／ｍの水溶液であって、一般にはｐＨ７．５〜１３である（ｐＨは精製しようとする生理活性タンパク質、抗体の種類により、それぞれ異なっている）。
本発明の方法では、上記段階で中性域になった溶液は粒子（白濁）を生じる。この粒子をフィルター濾過によって除去することによってＤＮＡ夾雑物を効率よく除去することができる。濾過に用いるフィルターは、例えば、１．０〜０．２μｍのCellulose Acetate Filter System（Corning製）もしくはＴＦＦなどを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
また、上記粒子を除去するための方法としては遠心分離操作等も考えられ、粒子を効率的の除去できる手法であればよく、フィルター濾過に限定されるものではない。
本発明者らは特別の理論に拘束されるものではないが、この粒子は生理活性タンパク質とＤＮＡとによって形成される複合体であると推定している。粒子をフィルター除去することによってＤＮＡ−生理活性タンパク質複合体中に含まれる生理活性タンパク質が少量ロスとなるが、生理活性タンパク質の全体からすると数％であり、後述する実施例に記載するように、生理活性タンパク質の約９０％を回収することができた。
また、このＤＮＡ−生理活性タンパク質複合体が樹脂上で生じるためにプロテインＡもしくはプロテインＧカラムクロマトグラフィー単独ではＤＮＡ夾雑物とタンパク質の分離が効果的に行えないのではないか、と推測している。
本発明の方法により精製された生理活性タンパク質は、さらに陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、もしくはこれらの組合せなどにより精製して医薬製剤に用いることができる。
ＤＮＡ定量法としてはスレッシュホールド総ＤＮＡ定量法により測定し、測定に先だってＤＮＡ抽出操作を実施するが、これらに限定されるものではない。
本発明の方法により、ＤＮＡ夾雑物を極めて簡単な方法で、ＤＮＡ濃度を極めて低濃度まで（例えば２２．５ｐｇ／ｍｌ）効率よく除去することが可能となり、生理活性タンパク質、特に抗体の精製がはるかに効果的となった。また、本発明の方法によりコストを低減することができ、格別の技術的意義を有するものである。
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。本発明の記載に基づき種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。
ｈＰＭ−１（ヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体）精製におけるプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーの緩衝液組成の検討
（１）検討材料（抗体含有試料）
ｈＰＭ−１抗体（ヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体）産生ＣＨＯ細胞培養上清液（以下ＣＭと略す）（細胞遠心除去済み：−８０℃保存）含有試料は、上記ＣＭを０．２２μｍ Cellulose Acetate（ＣＡと略す）Filter System（CORNING）を用いて濾過し、精製検討に使用した。なお、ｈＰＭ−１抗体は、特許文献６の実施例１０に記載されたヒトエロンゲーションファクターＩαプロモーターを利用し、特許文献１０の参考例２に記載された方法に準じて作製した。
（１）検討材料（抗体含有試料）
ｈＰＭ−１抗体（ヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体）産生ＣＨＯ細胞培養上清液（以下ＣＭと略す）（細胞遠心除去済み：−８０℃保存）含有試料は、上記ＣＭを０．２２μｍ Cellulose Acetate（ＣＡと略す）Filter System（CORNING）を用いて濾過し、精製検討に使用した。なお、ｈＰＭ−１抗体は、特許文献６の実施例１０に記載されたヒトエロンゲーションファクターＩαプロモーターを利用し、特許文献１０の参考例２に記載された方法に準じて作製した。
（２）使用機器
塩酸溶出検討時
HPLC：L-6200 Intelligent Pump（HITACHI）
L-4200 UV-VIS Detector（HITACHI）
D-2500 Chromato-Integrator（HITACHI）
カラム：HR5/2（Pharmacia社）、5mmI.D.×20mmH
Media：POROS 50A（PerSeptive社）、0.4ml
Lot; A250-039、Code; SPECIAL
粒子検討時
HPLC：Waters PrepLC4000 System（Waters）
Waters2000 System Controller（Waters）
Waters486 Tunable Absorbance Detector（Waters）
Waters741 Data Module（Waters）
分光光度計：U-2000（HITACHI）
カラム：XK26（Pharmacia社）、26mmI.D.×100mmH
Media：POROS 50A（PerSeptive社）、53ml
Lot; A250-039、Code; SPECIAL
塩酸溶出検討時
HPLC：L-6200 Intelligent Pump（HITACHI）
L-4200 UV-VIS Detector（HITACHI）
D-2500 Chromato-Integrator（HITACHI）
カラム：HR5/2（Pharmacia社）、5mmI.D.×20mmH
Media：POROS 50A（PerSeptive社）、0.4ml
Lot; A250-039、Code; SPECIAL
粒子検討時
HPLC：Waters PrepLC4000 System（Waters）
Waters2000 System Controller（Waters）
Waters486 Tunable Absorbance Detector（Waters）
Waters741 Data Module（Waters）
分光光度計：U-2000（HITACHI）
カラム：XK26（Pharmacia社）、26mmI.D.×100mmH
Media：POROS 50A（PerSeptive社）、53ml
Lot; A250-039、Code; SPECIAL
（３）分析、定量法
ｈＰＭ−１定量法：直線濃度勾配法によるＰＬＲＰ−Ｓカラム（ポリマーラボラトリーズ社）を用いる逆相ＨＰＬＣにより定量する。
ＤＮＡ量測定法：スレッシュホールド総ＤＮＡ定量法により測定する。測定に先だってＤＮＡ抽出操作（ＤＮＡエキストラクターキット＜和光純薬＞等）を実施する。また、測定にはスレッシュホールド総ＤＮＡ定量キット（モレキュラーデバイス社製）を用いる。
濁度測定法：粒子形成の状況をモニターするために測定サンプルを分光光度計Ｕ−２０００（ＨＩＴＡＣＨＩ）に供し、６６０ｎｍにおける吸収を測定する。
ｈＰＭ−１定量法：直線濃度勾配法によるＰＬＲＰ−Ｓカラム（ポリマーラボラトリーズ社）を用いる逆相ＨＰＬＣにより定量する。
ＤＮＡ量測定法：スレッシュホールド総ＤＮＡ定量法により測定する。測定に先だってＤＮＡ抽出操作（ＤＮＡエキストラクターキット＜和光純薬＞等）を実施する。また、測定にはスレッシュホールド総ＤＮＡ定量キット（モレキュラーデバイス社製）を用いる。
濁度測定法：粒子形成の状況をモニターするために測定サンプルを分光光度計Ｕ−２０００（ＨＩＴＡＣＨＩ）に供し、６６０ｎｍにおける吸収を測定する。
（１）溶出条件の検討
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにおいて溶出液として用いる緩衝液組成を変更した検討を行い、ｈＰＭ−１回収率及び溶出液によるＤＮＡ除去状況を確認した。上記抗体含有試料を以下の表１に示す条件でカラムにかけた。表１に示す平衡化緩衝液にてプロテインＡ樹脂を平衡化し、続いて上記抗体含有試料負荷その後、洗浄１、洗浄２、溶出と実施する。溶出プロファイルをＡ２８０ｎｍで監視し、タンパク質のピークを単離した。なお、表中Ｃ−Ｐ Ｂｕｆｆｅｒはクエン酸−リン酸緩衝液を示す。
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにおいて溶出液として用いる緩衝液組成を変更した検討を行い、ｈＰＭ−１回収率及び溶出液によるＤＮＡ除去状況を確認した。上記抗体含有試料を以下の表１に示す条件でカラムにかけた。表１に示す平衡化緩衝液にてプロテインＡ樹脂を平衡化し、続いて上記抗体含有試料負荷その後、洗浄１、洗浄２、溶出と実施する。溶出プロファイルをＡ２８０ｎｍで監視し、タンパク質のピークを単離した。なお、表中Ｃ−Ｐ Ｂｕｆｆｅｒはクエン酸−リン酸緩衝液を示す。
溶出法１、２、３において、クロマトグラム上で差異は確認されなかった。
また、各溶出画分を３００ｍＭ Ｔｒｉｓ溶液でｐＨ７．０に調整したところ、塩酸溶出画分（溶出法２、溶出法３）では粒子が生じた。更に、粒子形成とｈＰＭ−１回収率及び残存ＤＮＡ量との相関を求める検討をも行った。
また、各溶出画分を３００ｍＭ Ｔｒｉｓ溶液でｐＨ７．０に調整したところ、塩酸溶出画分（溶出法２、溶出法３）では粒子が生じた。更に、粒子形成とｈＰＭ−１回収率及び残存ＤＮＡ量との相関を求める検討をも行った。
粒子相関検討として、溶出法２における溶出液塩酸中にＮａＣｌを添加し、添加ＮａＣｌ濃度（０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ）と各種要因との相関を求めた。添加ＮａＣｌ濃度と各種要因との相関検討として、それぞれのＮａＣｌ添加によるＰｒｏｔｅｉｎ Ａ溶出画分を３００ｍＭ Ｔｒｉｓ溶液でｐＨ７．０に調整したサンプルを濾過前、そのｐＨ調整後サンプルを０．２２μｍ ＣＡ Ｆｉｌｔｅｒにて濾過したサンプルを濾過後とした。濾過前及び濾過後サンプルを上記測定法でｈＰＭ−１回収率（濾過後のみ）を測定し、残存ＤＮＡ量を測定した。
回収率
各溶出条件におけるｈＰＭ−１回収率を測定した。その結果、溶出法１における回収率は９８．６％と良好であった。また溶出法２における回収率では８３．８％〜９７．１％、溶出法３における回収率では８３．５％〜９３．７％とばらつきが生じたが、検討スケールが小さい要因（樹脂量：０．４ｍｌ）から生じるばらつきであると推測された。そこで、精製スケールをアップした検討（溶出法２）では安定してｈＰＭ−１回収率９０％以上を示す事を確認した。従って、塩酸溶出の場合であっても、ｈＰＭ−１の回収率は良好であることが判明した。
溶出液塩酸中の添加ＮａＣｌ濃度と各種要因相関
溶出液塩酸中の添加ＮａＣｌ濃度と各種要因相関を調べた結果を表２に示す。
各溶出条件におけるｈＰＭ−１回収率を測定した。その結果、溶出法１における回収率は９８．６％と良好であった。また溶出法２における回収率では８３．８％〜９７．１％、溶出法３における回収率では８３．５％〜９３．７％とばらつきが生じたが、検討スケールが小さい要因（樹脂量：０．４ｍｌ）から生じるばらつきであると推測された。そこで、精製スケールをアップした検討（溶出法２）では安定してｈＰＭ−１回収率９０％以上を示す事を確認した。従って、塩酸溶出の場合であっても、ｈＰＭ−１の回収率は良好であることが判明した。
溶出液塩酸中の添加ＮａＣｌ濃度と各種要因相関
溶出液塩酸中の添加ＮａＣｌ濃度と各種要因相関を調べた結果を表２に示す。
濾過後のｈＰＭ−１回収率は１００ｍＭ ＮａＣｌ添加サンプルで８８％を示し、順に５０ｍＭ ＮａＣｌ添加の８６％、０ｍＭ ＮａＣｌ添加の８１％であった。残存ＤＮＡ量に関しては、濾過前後のサンプルでともに、０ｍＭ ＮａＣｌ添加サンプルが低値を示し、特に濾過後の０ｍＭ ＮａＣｌ添加サンプルでは１１ｐｇ ＤＮＡ／ｍｇ ｈＰＭ−１と極めて低値であった。
また、ｐＨ調整後サンプルにおいて濁度の高値なサンプル程、濾過後のｈＰＭ−１回収率及び残存ＤＮＡ量が低値を示している。この結果は、粒子形成にｈＰＭ−１及びＤＮＡが関与している可能性が高い事を示すものである。おそらくｐＨを７．０に調整する事によりｈＰＭ−１とＤＮＡが相互作用し粒子を生じると推測される。ｈＰＭ−１回収率を高くするという点からは、添加ＮａＣｌ濃度を増加させることが好ましく、逆に残存ＤＮＡ量減少を重視するという点からは、溶出液塩酸中にＮａＣｌを無添加とすることが望ましい。
ヒト型化抗ＰＴＨｒＰ抗体の精製
ヒト型化抗ＰＴＨｒＰ抗体含有試料（ＣＨＯ細胞で培養した培養上清を０．４５＋０．２μｍ ＣＡ ＳＡＲＴＯＢＲＡＮ Ｐフィルター（sartorius）で濾過したもの）をプロテインＡアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いる方法で以下の条件により精製した。なお、抗ＰＴＨｒＰ抗体は、特許文献８に記載の方法によって作製した。
ヒト型化抗ＰＴＨｒＰ抗体含有試料（ＣＨＯ細胞で培養した培養上清を０．４５＋０．２μｍ ＣＡ ＳＡＲＴＯＢＲＡＮ Ｐフィルター（sartorius）で濾過したもの）をプロテインＡアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いる方法で以下の条件により精製した。なお、抗ＰＴＨｒＰ抗体は、特許文献８に記載の方法によって作製した。
実験条件
精製装置：AKTA explorer（Amersham Pharmacia Biotech）
カラム：HR5/5、C10、XK-26（Amersham Pharmacia Biotech）
樹脂：rProtein A Sepharose Fast Flow
負荷：培養上清直接負荷（ｐＨ６．６−７．５）
溶出画分調整：１Ｍ Ｔｒｉｓ水溶液により各種ｐＨに調整し、０．２μｍ Cellulose Acetate（以下ＣＡと略す）フィルター濾過によりＤＮＡを除去（以下の（１）において条件を検討）。
精製装置：AKTA explorer（Amersham Pharmacia Biotech）
カラム：HR5/5、C10、XK-26（Amersham Pharmacia Biotech）
樹脂：rProtein A Sepharose Fast Flow
負荷：培養上清直接負荷（ｐＨ６．６−７．５）
溶出画分調整：１Ｍ Ｔｒｉｓ水溶液により各種ｐＨに調整し、０．２μｍ Cellulose Acetate（以下ＣＡと略す）フィルター濾過によりＤＮＡを除去（以下の（１）において条件を検討）。
プロテインＡカラムを１５０ｍＭ ＮａＣｌ入りクエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ７．５で
十分に平衡化した後、上記抗体含有ＣＭを負荷した。続いて結合していない不純物を１５０ｍＭ ＮａＣｌ入りクエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ７．５で洗浄、更に導電率を下げる目
的でクエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ７．５で洗浄を行い、その後２０ｍＭクエン酸水溶液にて溶出を実施した。溶出プロファイルをＡ２８０ｎｍで監視し、タンパク質ピークを分取した。このプロテインＡ溶出画分を用いて以下の条件検討を実施した。
十分に平衡化した後、上記抗体含有ＣＭを負荷した。続いて結合していない不純物を１５０ｍＭ ＮａＣｌ入りクエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ７．５で洗浄、更に導電率を下げる目
的でクエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ７．５で洗浄を行い、その後２０ｍＭクエン酸水溶液にて溶出を実施した。溶出プロファイルをＡ２８０ｎｍで監視し、タンパク質ピークを分取した。このプロテインＡ溶出画分を用いて以下の条件検討を実施した。
（１）溶出後の残存ＤＮＡ除去条件検討
残存ＤＮＡを効率的に除去するために、フィルター濾過時の最適ｐＨ条件を設定する検討を行った。プロテインＡ溶出画分を、１．０Ｍ Ｔｒｉｓ水溶液により以下の各検討ｐＨ（未調整（２．７）、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５）に調整した。その後、一定時間放置し、０．２２μｍ ＣＡフィルター濾過処理を行った。その後１．０Ｍ Ｔｒｉｓ水溶液によりｐＨ７に調整し、ＤＮＡ定量を行った。表３に各検討ｐＨ及び放置時間と残存ＤＮＡの結果示す。
残存ＤＮＡを効率的に除去するために、フィルター濾過時の最適ｐＨ条件を設定する検討を行った。プロテインＡ溶出画分を、１．０Ｍ Ｔｒｉｓ水溶液により以下の各検討ｐＨ（未調整（２．７）、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５）に調整した。その後、一定時間放置し、０．２２μｍ ＣＡフィルター濾過処理を行った。その後１．０Ｍ Ｔｒｉｓ水溶液によりｐＨ７に調整し、ＤＮＡ定量を行った。表３に各検討ｐＨ及び放置時間と残存ＤＮＡの結果示す。
表から明らかなように、ｐＨ５．５、６．０における０、６、２４時間放置すべてにおいてＤＮＡが検出限界以下となった。またＤＮＡ除去状況に関してはｐＨ５．５、６．０を中心としてｐＨが高く、又は低くなるにつれてＤＮＡ除去の効率が悪くなることが観察された。
ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体の精製
ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体含有試料（ＣＨＯ細胞で培養した培養上清）をプロテインＡアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いる方法で以下の表４に記載の条件により精製した。なお、抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体は、特許文献７に記載の方法によって作製した。
ヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体含有試料（ＣＨＯ細胞で培養した培養上清）をプロテインＡアフィニティーカラムクロマトグラフィーを用いる方法で以下の表４に記載の条件により精製した。なお、抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体は、特許文献７に記載の方法によって作製した。
実験条件
カラム：rProtein A FF、5 mL（16 mmID × 25 mmH）
流速 ：5 mL/min（150 cm/h）
サンプル：培養上清直接負荷
カラム：rProtein A FF、5 mL（16 mmID × 25 mmH）
流速 ：5 mL/min（150 cm/h）
サンプル：培養上清直接負荷
プロテインＡカラムを１５０ｍＭ ＮａＣｌ入りクエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ７．５で十分に平衡化した後、上記抗体含有ＣＭを負荷した。続いて結合していない不純物を１５０ｍＭ ＮａＣｌ入りクエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ７．５で洗浄、更に導電率を下げる目的でクエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ７．５で洗浄を行い、その後２０ｍＭクエン酸水溶液にて溶出を実施した。溶出プロファイルをＡ２８０ｎｍで監視し、タンパク質ピークを分取した。このプロテインＡ溶出画分を用いて以下の条件検討を実施した。
残存ＤＮＡを効率的に除去するために、フィルター濾過時の最適ｐＨ条件を設定する検討を行った。プロテインＡ溶出画分を、１．０Ｍ Ｔｒｉｓ水溶液により以下の各検討ｐＨ（ｐＨ＝４．５−７．５）に調整した。その後、一定時間放置し、０．２２μｍ ＣＡフィルター濾過処理を行った。その後１．０Ｍ Ｔｒｉｓ水溶液によりｐＨ７に調整し、ＤＮＡ定量及び逆相カラムによるヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体の定量を行った。表５にＤＮＡ量の測定結果を、また表６にヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体の収量測定の結果を示す。
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィー精製した後のサンプルにおいては大量のＤＮＡが存在していたが、実験１ではｐＨ７．５、６．５、５．５とｐＨの低下に従ってＤＮＡ量が減少しており、また時間は０時間の方がＤＮＡ除去率が高い傾向があった。実験２ではｐＨ＝４．５、５．０、５．５の条件で同様の実験を行ったが、この間においてはｐＨおよび時間に関係なく十分にＤＮＡが同程度に除去されていた。更に回収量の計算からヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体はほとんど消失していないことが判明した。
エリスロポエチン（ＥＰＯ）の精製
ＥＰＯ含有試料（ＣＨＯ細胞で培養：中外製薬製）を用いて以下の条件検討を実施する。
ＥＰＯ含有試料（ＣＨＯ細胞で培養：中外製薬製）を用いて以下の条件検討を実施する。
ＥＰＯ含有試料組成（１ｍＭリン酸緩衝液）；
残存ＤＮＡを効率的に除去するために、フィルター濾過時の最適ｐＨ条件を設定する検討を行う。ＥＰＯ含有試料に低伝導度の酸性溶液（２．５ｍＭ ＨＣｌ水溶液）を添加し、更に２０％塩酸を用いて低伝導度の酸性水溶液状態とし、更に試料ＤＮＡを添加する。１．０Ｍ Ｔｒｉｓ水溶液により以下の各検討ｐＨ（ｐＨ＝５．０又は６．６）に調整し、続いて０．２２μｍ ＣＡフィルター濾過処理を行う。その後、ろ過前後の画分のＤＮＡ定量を行う。以上の検討によりＤＮＡを多量に含んだＥＰＯ含有試料からＤＮＡ量が効率的に減少するのを確認する。
残存ＤＮＡを効率的に除去するために、フィルター濾過時の最適ｐＨ条件を設定する検討を行う。ＥＰＯ含有試料に低伝導度の酸性溶液（２．５ｍＭ ＨＣｌ水溶液）を添加し、更に２０％塩酸を用いて低伝導度の酸性水溶液状態とし、更に試料ＤＮＡを添加する。１．０Ｍ Ｔｒｉｓ水溶液により以下の各検討ｐＨ（ｐＨ＝５．０又は６．６）に調整し、続いて０．２２μｍ ＣＡフィルター濾過処理を行う。その後、ろ過前後の画分のＤＮＡ定量を行う。以上の検討によりＤＮＡを多量に含んだＥＰＯ含有試料からＤＮＡ量が効率的に減少するのを確認する。
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の精製
Ｇ−ＣＳＦ含有試料（ＣＨＯ細胞で培養：中外製薬製）を用いて以下の条件検討を実施する。
Ｇ−ＣＳＦ含有試料（ＣＨＯ細胞で培養：中外製薬製）を用いて以下の条件検討を実施する。
Ｇ−ＣＳＦ含有試料組成（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液）；
残存ＤＮＡを効率的に除去するために、フィルター濾過時の最適ｐＨ条件を設定する検討を行う。Ｇ−ＣＳＦ含有試料に低伝導度の酸性溶液（２．５ｍＭ ＨＣｌ水溶液）を添加し、更に２０％塩酸を用いて低伝導度の酸性水溶液状態とし、更に試料ＤＮＡを添加する。１．０Ｍ Ｔｒｉｓ水溶液により以下の各検討ｐＨ（ｐＨ＝４．３又は６．６）に調整し、続いて０．２２μｍ ＣＡフィルター濾過処理を行う。その後、ろ過前後の画分のＤＮＡ定量を行う。以上の検討によりＤＮＡを多量に含んだＧ−ＣＳＦ含有試料からＤＮＡ量が効率的に減少するのを確認する。
残存ＤＮＡを効率的に除去するために、フィルター濾過時の最適ｐＨ条件を設定する検討を行う。Ｇ−ＣＳＦ含有試料に低伝導度の酸性溶液（２．５ｍＭ ＨＣｌ水溶液）を添加し、更に２０％塩酸を用いて低伝導度の酸性水溶液状態とし、更に試料ＤＮＡを添加する。１．０Ｍ Ｔｒｉｓ水溶液により以下の各検討ｐＨ（ｐＨ＝４．３又は６．６）に調整し、続いて０．２２μｍ ＣＡフィルター濾過処理を行う。その後、ろ過前後の画分のＤＮＡ定量を行う。以上の検討によりＤＮＡを多量に含んだＧ−ＣＳＦ含有試料からＤＮＡ量が効率的に減少するのを確認する。
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の精製
ＢＳＡ含有試料を用いて以下の条件検討を実施する。
残存ＤＮＡを効率的に除去するために、フィルター濾過時の最適ｐＨ条件を設定する検討を行う。ＢＳＡ含有試料に低伝導度の酸性溶液（２．５ｍＭ ＨＣｌ水溶液）を添加し、更に２０％塩酸を用いて低伝導度の酸性水溶液状態とし、更に試料ＤＮＡを添加する。１．０Ｍ Ｔｒｉｓ水溶液により以下の各検討ｐＨ（ｐＨ＝４．９又は７．５）に調整し、続いて０．２２μｍ ＣＡフィルター濾過処理を行う。その後、ろ過前後の画分のＤＮＡ定量を行う。以上の検討によりＤＮＡを多量に含んだＢＳＡ含有試料からＤＮＡ量が効率的に減少するのを確認する。
ＢＳＡ含有試料を用いて以下の条件検討を実施する。
残存ＤＮＡを効率的に除去するために、フィルター濾過時の最適ｐＨ条件を設定する検討を行う。ＢＳＡ含有試料に低伝導度の酸性溶液（２．５ｍＭ ＨＣｌ水溶液）を添加し、更に２０％塩酸を用いて低伝導度の酸性水溶液状態とし、更に試料ＤＮＡを添加する。１．０Ｍ Ｔｒｉｓ水溶液により以下の各検討ｐＨ（ｐＨ＝４．９又は７．５）に調整し、続いて０．２２μｍ ＣＡフィルター濾過処理を行う。その後、ろ過前後の画分のＤＮＡ定量を行う。以上の検討によりＤＮＡを多量に含んだＢＳＡ含有試料からＤＮＡ量が効率的に減少するのを確認する。
Claims (15)
- 以下の段階：
１）抗体含有試料をプロテインＡもしくはプロテインＧのアフィニティクロマトグラフィーに適用すること、
２）モル濃度が０〜１００ｍＭであり、イオン強度が０〜０．２であり、且つ導電率が０〜３００ｍＳ／ｍである低伝導度の酸性水溶液で溶出すること、
３）得られる溶出液に緩衝液を添加してｐＨを中性域に上昇させ、モル濃度が０〜１００ｍＭであり、イオン強度が０〜０．２であり、且つ導電率が０〜３００ｍＳ／ｍである中性域の低伝導度水溶液状態とすること、及び
４）生じる粒子を除去すること、
を含む、抗体含有試料中のＤＮＡ夾雑物を除去する方法。 - 酸性水溶液が塩酸、クエン酸、酢酸の水溶液から選択される、請求項１に記載の方法。
- 酸性水溶液のｐＨが１．５〜３．９である請求項２に記載の方法。
- 処理後の抗体含有試料中のＤＮＡ夾雑物がＤＮＡ濃度２２．５ｐｇ／ｍｌ以下である請求項１または２に記載の方法。
- 緩衝液がＴｒｉｓ水溶液である請求項１に記載の方法。
- 緩衝液を添加してｐＨを４．３〜７．５に上昇させる請求項１に記載の方法。
- 抗体がヒト型化モノクローナル抗体である請求項１に記載の方法。
- 抗体がヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体である請求項７に記載の方法。
- 抗体がヒト型化抗ＨＭ１．２４抗原モノクローナル抗体である請求項７に記載の方法。
- 抗体がヒト型化抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体（抗ＰＴＨｒＰ抗体）である請求項７に記載の方法。
- 抗体がヒト型化抗組織因子抗体である請求項７に記載の方法。
- 粒子をフィルター濾過によって除去する請求項１に記載の方法。
- 請求項１に記載の方法の工程を含む、精製抗体の製造方法。
- 請求項１３に記載の方法で製造した精製抗体を含有する医薬品の製造方法。
- 抗体含有試料をプロテインＡもしくはプロテインＧのアフィニティクロマトグラフィーに適用した後、且つ、モル濃度が０〜１００ｍＭであり、イオン強度が０〜０．２であり、且つ導電率が０〜３００ｍＳ／ｍである低伝導度の酸性水溶液で溶出する前に、モル濃度が０〜１００ｍＭであり、イオン強度が０〜０．２であり、且つ導電率が０〜３００ｍＳ／ｍである低伝導度の水溶液でカラムを洗浄すること、を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
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