JP5025015B2 - タンパク質の糖化度の評価方法及びタンパク質の糖化抑制・改善剤の評価方法 - Google Patents
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Description
そのため、糖化タンパク質の測定は糖尿病の治療や診断の一つとして従来利用されてきた。糖尿病の治療ないし診断の手段として汎用されている糖化タンパク質の測定方法は、尿ないし血液を検体として用いた方法が主である。これらの測定方法は病気の診断を主眼としたものであるため、患者からの尿や血液の採取をはじめ、煩雑な処理や精密な測定を要する。
これらの知見から、毛髪ケラチンの糖化度を評価することは、従来のように糖尿病の治療及び診断に寄与するだけでなく、基礎的な加齢研究、ないしは広く行なわれているアンチエイジングに関する評価に極めて貢献し得ると考えられる。
しかしながら、前記測定法においても、毛髪に数段階の前処理を施すことが必要とされ、毛髪におけるタンパク質の糖化度をより容易に評価する方法は、未だ開発されていない。
毛髪のタンパク質を人工的に糖化する手段として、例えば、非特許文献1に、毛髪をグルコース溶液で処理することが報告されている。また、一般的に五炭糖が高いタンパク質糖化作用を有することが知られている。
しかしながら、グルコース等を用いて毛髪を糖化するには10日以上に及ぶ長期間の処理を要するため、検体の準備を含めて簡易的に糖化度及び薬剤作用の評価を実施することは困難であった。
また、毛髪の糖化程度には個体差があるため、特に薬剤の効果を精密に評価するには多数の検体について試験を行うことが必須とされていた。
Nissimov et al., Journal of Immunological Methods, 320 (2007) p. 1-17
すなわち、本発明にかかるタンパク質糖化度の評価方法は、毛髪を蛋白質変性剤および還元剤により溶解させた毛髪ケラチン蛋白質溶液と、展開用溶液とを接触させ、乾燥させた後に得られるケラチンフィルムを用いることを特徴とする。
前記方法において、下記工程を備えることが好適である。
(I)ケラチンフィルムをリボース溶液中に12時間〜10日間浸漬する。
(II)ケラチンフィルムの可視光領域における吸光度を測定する。
また、本発明にかかる毛髪損傷度の評価方法は、前記方法によるタンパク質糖化度の評価を指標とすることを特徴とする。
前期方法において、下記(1)〜(3)のケラチンフィルムの可視領域における吸光度を比較測定することが好適である。
(1)リボース溶液中に12時間〜10日間浸漬したケラチンフィルム。
(2)評価薬剤を添加したリボース溶液中に12時間〜10日間浸漬したケラチンフィルム。
(3)未処理のケラチンフィルム。
本発明は従来操作が煩雑で長時間を要していたタンパク質糖化度の評価を容易にすることから、糖尿病の治療・診断をはじめ、加齢に伴うタンパク質の糖化の研究や、タンパク質の糖化予防・抑制剤の開発において高い貢献が期待できる。
以下、本発明をその手順に沿って説明する。
まず、毛髪からケラチンフィルムを調製する方法について説明する。
毛髪から、それを構成するケラチンタンパク質群を抽出するために、タンパク質変性剤を用いる。タンパク質変性剤としては、尿素系の化合物が好ましく、例えば、尿素、チオ尿素、およびこれらの誘導体等が挙げられる。これらの尿素系タンパク質変性剤の1種または2種以上を混合して用いることが好ましい。より好ましくは、尿素とチオ尿素を混合して用いることである。尿素とチオ尿素を混合して用いる場合には、混合質量比が5:1〜1:2であることが好ましい。チオ尿素の混合比が前記範囲より少ないとタンパク質の変成作用が劣る場合があり、また前記範囲を超えると、ケラチンタンパク質群の抽出率が低下する傾向がある。
前述のようにタンパク質変性剤を用いることにより、温和な条件で効率よくケラチンタンパク質群を毛髪から溶解させて抽出することが可能となる。
還元剤を前記タンパク質変性剤と併用することにより、ケラチンタンパク質群の抽出率をさらに向上させることができる。これは、強固なケラチン繊維構造をタンパク質変性剤が変性させ、続いて還元剤がケラチンタンパク質間の強固なS−S結合を効率よく解離させ、さらに毛髪サンプル処理液中での再結合が起こりにくくするためと考えられる。
還元剤の濃度が0.5質量%未満であると、ケラチンタンパク質感の強固なS−S結合の還元切断が十分に行なわれない傾向があり、また、40質量%の濃度を超えて使用すると毛髪処理液中でのケラチンタンパク質群の溶解性が悪くなる場合がある。
また、毛髪サンプルと毛髪サンプル処理液の比は、1〜100mg毛髪サンプル/ml毛髪サンプル処理液であることが好ましい。
毛髪サンプル処理液は、ケラチンタンパク質が十分に抽出された後、ろ過により未抽出毛髪を除き、毛髪ケラチンタンパク質溶液を得ることができる。
展開用溶液としては、例えば、トリクロロ酢酸、グアニジン塩酸、過塩素酸、およびそれらの誘導体等の変性剤と、水、生理食塩水、低級アルコール等の溶媒を混合して得られる変性剤溶液、塩酸、硫酸、酢酸、リン酸およびそれらの塩等の酸性物質からなる賛成溶液が挙げられる。これらの1種または2種以上を用いることができる。本発明で用い得るケラチンフィルムの調製においては、展開溶液として過塩素酸溶液、グアニジン塩酸溶液、酢酸溶液、酢酸緩衝液から選択される1種または2種以上であることが好ましい。特に好ましくは、酢酸溶液または酢酸緩衝液(pH4.0)である。
前記展開用溶液は、前記毛髪ケラチンタンパク質溶液のイオン強度を下げる作用を有し、これにより、毛髪サンプル処理液中のタンパク質変性剤、還元剤の溶解性の低下を招く。その結果、ケラチンタンパク質群の溶解性が低下、それに伴いケラチンタンパク質間のS−S結合が解離して−SH状態であったものが、再びS−S結合が再形成されて、短時間にケラチンタンパク質の固体化が進行することになる。
Post−cast法としては、シャーレ等の容器に予め前記展開用溶媒を満たしておき、これに毛髪ケラチンタンパク質溶液をキャストする方法(フォワード法)、または毛髪ケラチンタンパク質溶液を予め添加したシャーレ等の容器に、展開用溶液をキャストする方法(リバース法)が挙げられる。
Pre−cast法とは、予め毛髪ケラチンタンパク質に展開用溶媒を混合し、水を張ったシャーレ等の容器へ前記混合用液をキャストする方法である。
本発明においては、前記Post−cast法及びPre−cast法のいずれの適用によっても、本発明にかかるタンパク質糖化度ないしは糖化抑制・改善剤の評価方法に適した均一性に優れたケラチンフィルムを調製することができる。
特に、Pre−cast法に用いる展開用溶媒としては、酢酸溶液が好適に使用され得る。Post−cast法においては、酢酸緩衝液が展開用溶媒として好適である。
また、還元剤としては、2−メルカプトエタノールがPost−cast法での使用に適し、ジチオスレイトールがPre−cast法での使用に適している。
展開用溶液は、毛髪ケラチンタンパク質溶液に対し10〜10000倍の質量比で用いることが好ましい。前記範囲内で展開用溶液を毛髪ケラチンタンパク質溶液に接触させることにより、適度な薄さを呈する薄膜を調製することができる。
したがって、同一個体におけるタンパク質糖化度を評価することは勿論のこと、混合毛髪のフィルムを用いることで個体差によるデータのぶれを初めから排除し、薬剤の糖化抑制・改善作用を容易に評価することができる。
ケラチンフィルムの糖化処理は、特定条件下においてケラチンフィルムを糖類溶液に浸漬することによって為し得る。糖類溶液には五炭糖を用いることが好ましく、特にリボース、さらにはD−リボースの使用が好ましい。糖類溶液にリボースを適用することにより、タンパク質の糖化に汎用されるグルコース等に比べ、糖化に要する処理時間を著しく短縮することができる。
前記リボース溶液に浸漬された毛髪サンプルは、pH 7.0〜8.0、温度30〜50℃の条件下において12時間〜10日間インキュベートする。
前記濃度範囲のリボース溶液を用い、且つ前記pH及び温度条件を適用することにより、従来数日から数週間を要していた毛髪タンパク質の十分な糖化をほぼ1日で達成することが可能となる。
インキュベート終了後は、ケラチンフィルムを滅菌水等で十分に洗浄して付着したリボース溶液を完全に除去し、必要に応じて乾燥させて前記吸光度の測定に供する。
(I)ケラチンフィルムをリボース溶液中に12時間〜10日間浸漬する。
(II)ケラチンフィルムの可視領域における吸光度を測定する。
また、本発明者らの検討により、正常な毛髪は糖化度合が高くなる程損傷を受け、強度が低下する傾向にあることが明らかとなった。したがって、ケラチンフィルムの糖化度を指標として毛髪損傷度を評価することができると考えられる。
まず、同じ毛髪構混合物から得たケラチンフィルムについて、次の(1)〜(3)のサンプルを用意する。
(1)リボース溶液中に12時間〜10日間浸漬したケラチンフィルム。
(2)評価薬剤を添加したリボース溶液中に12時間〜10日間浸漬したケラチンフィルム。
(3)未処理のケラチンフィルム。
上記各サンプルの可視光領域(400〜800nm)における吸光度を測定し、(3)に対する(1)の糖化度合を指標に(2)の糖化度を評価することにより、評価薬剤のタンパク質糖化抑制・改善効果を計ることができる。
また、単に(1)及び(2)の糖化度を比較することで、薬剤の効果を評価してもよい。
評価薬剤は1つのサンプルに2種以上を添加してもよく、薬剤の種類や濃度を変えて(2)のサンプルを複数作成し、各々評価することも可能である。なお、(1)及び(2)におけるリボース溶液への浸漬は、前述の糖化処理条件に準じて行うことができる。
<ケラチンフィルムによる糖化度の評価>
下記方法により、毛髪由来のケラチンフィルムについて、吸光度とタンパク質の糖化における関係を試験した。
まず、本実施例において使用したケラチンフィルムの調製例を示す。
ケラチンフィルムの調製例1:Pre-cast
毛髪サンプル600mgを、尿素及びチオ尿素、還元剤、25mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.5)8mlを含む混合液に浸漬し、これを50℃にて4日間保持して毛髪ケラチンタンパク質溶解液を得た。この溶解液からろ過により未抽出毛髪を取り除き、毛髪ケラチンタンパク質溶液とした。このタンパク質溶液3.5mgへ、展開用溶媒6mlを添加、混合し、この混合用液を蒸留水を満たしたシャーレ(直径35mm)へ静かにキャストした。固体化した後、蒸留水を含む展開用溶液を数回交換して、ゲル中の溶液を蒸留水に置換した。最後に蒸留水を除き、シリカゲルを含む箱内で十分に乾燥し、目的のケラチンフィルムを得た。
毛髪サンプル600mgを、尿素及びチオ尿素、還元剤、25mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.5)8mlを含む混合液に浸漬し、これを50℃にて4日間保持して、毛髪ケラチンタンパク質溶解液を得た。この溶解液からろ過により未抽出毛髪を取り除き、毛髪ケラチンタンパク質溶液とした。このタンパク質溶液3.5mgを、展開用溶媒6mlを満たしたシャーレ(直径35mm)へ静かにキャストした。固体化した後、蒸留水を含む展開用溶液を数回交換して、ゲル中の溶液を蒸留水に置換した。最後に蒸留水を除き、シリカゲルを含む箱内で十分に乾燥し、目的のケラチンフィルムを得た。
上記で得たケラチンフィルムの一部を30mMのD−リボースを溶解したリン酸緩衝生理食塩水(pH7.4)へ浸漬し、これを37℃で振とう(30〜40rpm)しながら24時間インキュベートした。
その後、ケラチンフィルムを滅菌水に24時間浸けて洗浄し、インキュベーター内で乾燥させて糖化したケラチンフィルムを得た。なお、前記洗浄中、滅菌水の交換を3回行なった。
上記で得た糖化したケラチンフィルムと、未糖化処理のケラチンフィルムとを、それぞれシャーレに入れ、吸光光度計(POWERSCAN HT、大日本製薬社製)にて200〜800nmにおける吸光度を測定した。なお、コントロールとして、シャーレのみの吸光度についても測定を行なった。結果を図1に示す。また、可視光領域(400〜800nm)における糖化及び未糖化ケラチンフィルムの吸光度をそれぞれ積算した結果を図2に示す。
以上のことから、毛髪由来のケラチンフィルムの可視光領域における吸光度を測定することにより、毛髪タンパク質の糖化度を評価することができる。また、前記ケラチンフィルムをリボースで処理することによって、容易にタンパク質の糖化サンプルが得られることが明らかである。
次の方法により加齢と毛髪の糖化における関係を試験した。
10〜60代の男性被験者84名から毛髪を10本ずつ採取し、各毛髪の根元から3mmを混合したものをサンプルとした。各サンプルを特開平06−30791号公報に記載の方法に準じてヒドラジン処理後、発色試薬と反応させ、糖化タンパク質の比色定量を行った。年代ごとに糖化度の平均値(相対値)と標準偏差を算出した結果を図3に示す。
被験者3名から毛髪(先端2cm)をそれぞれ採取し、を30mMのD−リボースを溶解したリン酸緩衝生理食塩水(pH7.4)へ浸漬し、これを37℃で振とう(30〜40rpm)しながら72時間インキュベートした。その後、毛髪を滅菌水に24時間浸けて洗浄を行ない、乾燥させて糖化毛髪を得た(洗浄中、滅菌水は3回交換した)。
前記糖化毛髪と、同一被験者から得た未糖化毛髪とを、それぞれ水中における引っ張り試験(KES-G1-SH, カトーテック社製)に供し、両者の破断までに要する積算荷重(gf/P・mm2)を比較した。結果を図4に示す(P<0.005)。
以上の試験結果に鑑みると、加齢と毛髪損傷の関係、あるいは加齢または毛髪損傷それぞれの検討において、糖化度はその指標として広く用い得るものと認められる。
下記各評価方法により、L−アルギニンのタンパク質糖化抑制効果を検討した。評価方法は次のとおりである。
実施例1
上記調製方法により得たケラチンフィルム12枚を、下記表1に示す構成の溶液へそれぞれ浸漬した。各サンプルは37℃で振とう(30〜40rpm)しながら24時間インキュベートした。
インキュベート後、ケラチンフィルムを滅菌水に24時間浸け、洗浄を行なった(洗浄中、滅菌水を3回交換した)。
洗浄後、各ケラチンフィルムをデシケーター内で乾燥し、可視光領域(400〜800nm)の吸光度を測定した。吸光度に基づく糖化度の評価結果を図5に示す。なお、図5における糖化量は、糖液及び薬剤処理を行ったサンプル4〜6(L−アルギニン未添加)、サンプル7〜9(L−アルギニン0.1%添加)、サンプル10〜12(L−アルギニン1%添加)それぞれの可視光領域の吸光度積算値から、未処理サンプル(サンプル1〜3)の可視光領域の吸光度積算値を引いた差を示す。
実施例2
上記実施例1と同様の方法を用い、表1のL−アルギニンをL−リシン塩酸塩に替えて評価を行なった。結果を図5に示す。
また、この結果から、アルギニン及びリジンが毛髪タンパク質の糖化抑制効果を有することが分かった。さらに詳細な検討を行った結果、アルギニン及び/またはリジンを毛髪化粧料に配合する場合、その配合量は、化粧料に対しそれぞれ0.0001〜10質量%、好ましくは0.001〜1質量%、より好ましくは0.01〜0.1質量%であることが明らかになった。
処方例1〜4の毛髪化粧料は全て、毛髪ケラチンフィルムによる本発明にかかる評価方法により、優れたタンパク質の糖化抑制作用を有することが示された。
(配合成分) (質量%)
L−アルギニン 0.1
エタノール 60
ジプロピレングリコール 2
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 0.5
乳酸 適 量
乳酸ナトリウム液 適 量
グリチルリチン酸モノアンモニウム 0.1
ニコチン酸アミド 0.1
酢酸DL−α−トコフェロール 0.1
L−メントール 0.2
色素 適 量
精製水 残 余
香料 適 量
(配合成分) (質量%)
塩酸L−リジン 0.1
揮発性イソパラフィン 14
ジメチルポリシロキサン 8
エタノール 適 量
精製水 2
高重合ジメチルシロキサン・メチル(アミノプロピル)シロキサン共重合体
4
ポリ(オキシエチレン・オキシプロピレン)・メチルポリシロキサン共重合体
4
香料 適 量
(製造方法)
上記原液を噴射剤と共に容器へ充填し(原液/噴射剤=40/60(L.P.G. 0.115MPa))、スプレー形態の頭髪用化粧料を得た。
(配合成分) (質量%)
L−アルギニン 0.01
流動パラフィン 6
ジメチルポリシロキサン 5
グリセリン 8
プロピレングリコール 8
ブチルエチルプロパンジオール 0.5
ホホバ油 1
カルナウバロウ 5
イソステアリン酸 0.5
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 0.5
ポリオキシエチレンベヘニルエーテル 5
2−アルキル−N−カルボキシメチル−N−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン
8
フェノキシエタノール 0.5
高重合ジメチルポリシロキサン 0.5
精製水 残 余
香料 適 量
(製造方法)
上記原液を噴射剤と共に容器へ充填し(原液/噴射剤=90/10(L.P.G. 0.43MPa))、スプレー形態の頭髪用化粧料を得た。
(配合成分) (質量%)
塩酸L−リジン 0.01
ジステアリン酸エチレングリコール 1.5
ヤシ油脂肪酸エタノールアミド 5.5
ヤシ油脂肪酸メチルタウリンナトリウム 8
ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン 5
ポリマーJR−400(ユニオンカーバイド社製) 0.5
クエン酸 0.5
塩化ナトリウム 1.2
ビワ葉エキス 0.1
フェノキシエタノール 0.1
安息香酸ナトリウム 適 量
エデト酸2ナトリウム 適 量
精製水 残 余
香料 適 量
Claims (5)
- 毛髪を蛋白質変性剤および還元剤により溶解させた毛髪ケラチン蛋白質溶液と、展開用溶液とを接触させ、乾燥させた後に得られるケラチンフィルムを用いた、タンパク質糖化度の評価方法。
- 下記工程を備えることを特徴とする請求項1に記載のタンパク質糖化度の評価方法。
(I)ケラチンフィルムをリボース溶液中に12時間〜10日間浸漬する。
(II)ケラチンフィルムの可視光領域における吸光度を測定する。 - 請求項1または2に記載の方法によるタンパク質糖化度の評価を指標とすることを特徴とする毛髪損傷度の評価方法。
- 毛髪を蛋白質変性剤および還元剤により溶解させた毛髪ケラチン蛋白質溶液と、展開用溶液とを接触させ、乾燥させた後に得られるケラチンフィルムを用いた、タンパク質の糖化抑制・改善剤の評価方法。
- 下記(1)〜(3)のケラチンフィルムの可視領域における吸光度を比較測定することを特徴とする請求項4に記載のタンパク質の糖化抑制・改善剤の評価方法。
(1)リボース溶液中に12時間〜10日間浸漬したケラチンフィルム。
(2)評価薬剤を添加したリボース溶液中に12時間〜10日間浸漬したケラチンフィルム。
(3)未処理のケラチンフィルム。
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