JP5013348B2 - スフィンゴ脂質の取得方法 - Google Patents

Description

この発明は、そのまま化粧品や健康食品用としても利用することもできる、遊離セラミド含有量の多いスフィンゴ脂質の取得方法に関するものである。
より詳しくは、自然界の素材である発酵粕から抽出等の手段を用いて、遊離セラミド含有量の多いスフィンゴ脂質を取得する方法に関するものであって、取得されたスフィンゴ脂質は、さらなる精製によってグルコシルセラミドと遊離セラミドに分離して、前者を食品用、後者を化粧品用として利用することをも可能とする、自然界では極めて希少な遊離セラミド、特に、ヒト型の遊離セラミド含有量の多いスフィンゴ脂質の取得方法に関するものである。

麹や酵母を用いた酒、焼酎、ビール、醤油など日本の伝統醗酵食品は、その製造において、副産物として多量の醗酵粕が副生する。
この醗酵粕は、例えば、焼酎に関して言えば、焼酎粕は年間６０万トン以上副生していると言われ、その処理が海洋汚染の防止のため、海洋投棄が禁止されているため、その処分について問題となっている。

そのため、従前から醗酵粕を、肥料や飼料などとして有効利用するための手段が種々提案されている。
その提案の中には、例えば、醗酵粕中の機能性成分に注目して、その成分を活用する特許第４０７１０６２号公報（特許文献１）がある。

特許文献１に記載の発明は、悪性黒色腫である腫瘍の予防又は治療用組成物に関するものである。
この悪性黒色腫である腫瘍の予防又は治療用組成物は、焼酎蒸留粕から分離した液状物を乾燥して得た固形分のエタノール抽出残さ、又は焼酎蒸留粕から分離した液状物を乾燥して得た固形分のエタノール抽出物を含有することを特徴とするものである。

特許文献１の発明においては、具体的な成分については明らかにされていないが、特開２００７−８２４２７号公報（特許文献２）には、ビール粕から抽出によりグリコシルセラミドが得られたことを明らかにし、当該グリコシルセラミドが、健康食品や保湿剤の成分として有効であることを明らかにしている。

さらに、特開２０００−８０３９４号公報（特許文献３）には、醤油粕から有機溶剤でスフィンゴ脂質を抽出するというスフィンゴ脂質の製造法が開示され、得られたスフィンゴ脂質は、化粧品の原料として用いられることが示されている。

前記スフィンゴ脂質とは、長鎖塩基であるスフィンゴイド塩基に長鎖脂肪酸が酸アミド結合したセラミドを共通構造とし、それに糖がグリコシド結合したグリコシルセラミドを含むスフィンゴ糖脂質と、燐酸および塩基が結合したスフィンゴ燐脂質に分類される種々の化合物の総称である。

それらの化合物の中に、生理活性を有するものがあることは、従来から種々知られている。
例えば、特許第３０６８９１０号公報（特許文献４）には、海綿動物から取り出した特定構造のスフィンゴ糖脂質が、抗腫瘍剤や免疫賦活剤として有効であることが示されている。

また、特開２００４−１３１４８１号公報（特許文献５）には、特定構造のグリコシルセラミド又はその塩が、ＮＫＴ細胞活性化剤、自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス、全身性強皮症、潰瘍性大腸炎、脳脊髄炎、多発性硬化症、およびヒトＩ型糖尿病等）の治療剤、および堕胎剤として有効であることが示されている。

さらに、このスフィンゴ脂質、特にセラミドは、皮膚の角質層からの水分蒸発を防ぐ保湿成分として働いている。
この角質を構成するセラミドは、表皮細胞のグルコセレブロシターゼやスフィンゴミエリナーゼの作用によって、グルコシルセラミドとスフィンゴミエリンが分解されることによって生成する。
しかしながら、その生成量は、加齢に伴い減少し、年と共に皮膚の乾燥化やシワの発生が進行することや、アトピー性皮膚炎等の原因とされているため、皮膚におけるスフィンゴ脂質の減少を防ぐために、特許文献３に示されるように、クリームや軟膏等に配合され皮膚の保湿剤として利用されている。

特許第４０７１０６２号公報（特許請求の範囲） 特開２００７−８２４２７号公報（特許請求の範囲、発明の効果） 特開２０００−８０３９４公報（特許請求の範囲） 特許第３０６８９１０号公報（特許請求の範囲） 特開２００４−１３１４８１号公報（特許請求の範囲）

特許文献１においては、焼酎蒸留粕には、穀物類から由来する繊維質、タンパク質、灰分、脂肪、一部未醗酵の糖分、醗酵微生物、有機酸やビタミンなどの各種成分が含まれていることが開示されている。
また、この焼酎蒸留粕から分離した液状物のエタノール残さ又はエタノール抽出物を含有する悪性黒色腫である腫瘍の予防又は治療用組成物が開示されている。
しかしながら、前記焼酎蒸留粕に、他の成分が含まれているか否か、含まれている他の成分がどのような効果を有するかについては全く開示がない。

特許文献２においては、ビール等の製造工程で得られるビール粕から、効率的に植物性セラミド関連物質を効率よく製造する方法と、当該方法によって得られる植物性セラミド関連物質（セラミド、セレブロシド）を含む製品に関して開示されている。
しかしながら、ビール粕から得られた植物性セラミド関連物質が、他にいかなる物質を含んでいるのか否かについては何ら開示されていない。

特許文献３においては、従来、ウシ脳などの神経組織から抽出されていたスフィンゴ脂質を、醤油の副産物である醤油油あるいは醤油粕からヘキサンなどの有機溶剤で抽出することが開示されている。
しかしながら、当該スフィンゴ脂質が他にいかなる物質を含有し、それらがどのように作用するかについてはなんら開示されていない。

さらに、特許文献４では、前記スフィンゴ糖脂質を海綿動物から抽出することが、特許文献５では、グリコシルセラミドが、特定の治療薬および堕胎剤として有効であることが開示されているに過ぎない。

発明者はかかる現状に鑑み、酒や焼酎、醤油、ビールなどの製造の際に副生し、その処理について種々検討されている醗酵粕には、機能性成分としてのスフィンゴ脂質が存在し、当該スフィンゴ脂質が、種々の製品、医薬、健康食品さらには化粧料などに、幅広く応用できることを踏まえ、麹や酵母を必須とする前記醗酵粕中の機能性成分としてのスフィンゴ脂質について、分析と同定を行なうことによって、前記醗酵粕をさらに有効利用することができるとの予測のもとに研究を行った。

その結果、発明者は、各種醗酵製品のアルコール系溶媒による抽出物について、その成分を同定したところ、酒、焼酎、さらには醤油などの麹を用いた醗酵食品製造の際の副産物である醗酵粕のアルコール系溶媒による抽出物には、スフィンゴ脂質が大量に含まれるとともに、遊離セラミドが含まれていることを見出した。
また、複数回の抽出と精製という簡単な操作によって、スフィンゴ脂質中の遊離セラミドの含有量を高めることができることも見出した。
さらに、健康食品、特に保湿剤として化粧品あるいはアトピー性皮膚炎などの治癒に有用な皮膚外用剤の成分として有効なヒト型遊離セラミド、あるいは自然界では極めて希少な遊離セラミドを、しかもヒト型の遊離セラミドが多く含有される、遊離セラミド含有量の多いスフィンゴ脂質の提供が可能となることを見出し、この発明を完成させたものである。

すなわち、この発明の請求項１に記載の発明は、
麹を用いた醗酵製品製造の際に生ずる副産物の醗酵粕を、メタノール又はエタノールもしくはそれらを主要成分とするアルコール系溶媒で抽出し、
得られた抽出物を、遊離セラミドの非溶媒であるアセトン又はヘキサンを用いて洗浄し不純物を除去する洗浄工程と、
洗浄後の抽出物を、前記アルコール系溶媒で再抽出して得た再抽出物のアルコール系溶液に、水を添加して析出させる工程
からなる精製によって、遊離セラミド含有量の増大したスフィンゴ脂質を取得すること
を特徴とするスフィンゴ脂質の取得方法である。

この発明の請求項２に記載の発明は、
請求項１に記載のスフィンゴ脂質の取得方法において、
前記スフィンゴ脂質の遊離セラミドの含有量は、
グリコシルセラミドと遊離セラミドの総和量の５０％以上であること
を特徴とするものである。

この発明の請求項３に記載の発明は、
請求項１又は２に記載のスフィンゴ脂質の取得方法において、
前記アルコール系溶媒は、
エタノールであって、前記非溶媒がアセトンを主体とするものであること
を特徴とするものである。

この発明の請求項４に記載の発明は、
請求項１〜３のいずれかに記載のスフィンゴ脂質の取得方法において、
前記非溶媒による洗浄工程は、
水の添加による析出成分の分離取得工程の後にも行われること
を特徴とするものである。

この発明の請求項５に記載の発明は、
請求項１〜４のいずれかに記載のスフィンゴ脂質の取得方法において、
前記非溶媒による洗浄工程は、
複数回行うこと
を特徴とするものである。

この発明の請求項６に記載の発明は、
請求項１又は２に記載のスフィンゴ脂質の取得方法において、
前記水の添加は、
前記アルコール系溶液と等容量の水の添加であること
を特徴とするものである。

この発明の請求項７に記載の発明は、
請求項１又は２に記載のスフィンゴ脂質の取得方法において、
前記精製は、
前記洗浄工程後の抽出物を前記アルコール系溶媒に溶解させ、活性炭及び／又は陰イオン交換樹脂による不純物吸着工程をも有するものであること
を特徴とするものである。

この発明におけるスフィンゴ脂質の取得方法は、麹を用いた発酵食品製造の際に生ずる副産物である発酵粕からアルコール系溶媒により抽出した抽出物を洗浄し、さらに精製することによりスフィンゴ脂質を得るものであって、グリコシルセラミドと遊離セラミドの総和量の５０％以上が遊離セラミドであるというスフィンゴ脂質、すなわち、自然界において希少な遊離セラミドが豊富なスフィンゴ脂質を提供できる方法である。

この発明におけるスフィンゴ脂質の取得方法によれば、発酵粕からアルコール系溶媒を用いてスフィンゴ脂質を抽出するに際し、得られた抽出物を遊離セラミドの非溶媒を用いて洗浄し、不純物を除去する工程と、洗浄後の抽出物をアルコール含有溶媒で再抽出して得たアルコール系溶液に、水を添加して析出させる工程を行うという簡便な精製手段によって、遊離セラミドの含有量を増加したスフィンゴ脂質を簡単に得ることができる。

特に、この発明のスフィンゴ脂質の取得方法は、その取得に際し、全て食品添加物のみを用いて取得することが可能であるので、皮膚塗布用を始めとして、毒性が心配される原料の取得方法として、特に有効なものである。
また、得られる遊離セラミドは、ヒト型もしくはヒト型類似が主体であるため、食品、健康食品の原料としても容易に有効利用できる、遊離セラミドの含有量が多いスフィンゴ脂質の大量取得を可能とするものである。

この発明で取得される遊離セラミドとは、Ｊ．Ａ．Ｂｏｕｗｓｔｒａらにより、皮膚の保護機能とともに紹介されている、９種類のヒト型セラミド（セラミド１〜セラミド９）と同一構造もしくは近似構造を有するものである。
これらヒト型セラミドであるセラミド１〜セラミド９には、光学異性体であるＬ−体、幾何異性体であるシス異性体が含まれず、それぞれ以下のような特性を有するとされているものである（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １７５８（２００６）２０８０−２０９５）。
したがって、この発明の取得方法で得られた遊離セラミドも、同等の性能を有すると見做されるものである。

因みに、セラミド１は、角質細胞の多層ラメラ構造の細胞間脂質の結合を強化し、不足により、角化症、魚鱗症、アトピー性皮膚炎に関係するといわれている。
さらに、皮膚外科用剤としては、皮膚の弾力や細胞間の結合性の改善効果があると云われ、老化肌、乾燥肌に向いている。

セラミド２（ステアリン酸−スフィンゴシン結合型）は、皮膚や毛髪に存在するセラミドと同じ構造を持ち、特異臭を持つ白から灰色の粉末であって、セラミドの中では、特に保水の役割をし、高保湿、肌荒れ対策に向いている。

セラミド３（ステアリン酸−フィトスフィンゴシン結合型）は、皮膚に存在するセラミドと同じ構造を持ち、特異臭を持つ白から淡黄色の粉末であって、バリア機能を回復し、長時間、水分保持機能を持続させる。痛んだ毛髪を改善する目的でも使用される。

セラミド４、セラミド５、およびセラミド６は、角質剥離作用促進し、皮膚を滑らかにする。

これら遊離セラミドは、角質層には殆ど存在しない脂質である、グルコシルセラミドとは異なり、皮膚に存在する、すなわちヒト型であるため、塗布した際の保湿作用等において優れているものである。

この発明によれば、自然界では極めて希少な遊離セラミド、しかもヒト型の遊離セラミドの含有量が多いスフィンゴ脂質、すなわち、グリコシルセラミドとの総和量の少なくても５０％以上あるいは９０％以上の遊離セラミドを含有するスフィンゴ脂質が得られる。
しかも、得られた遊離セラミドの含有量が多いスフィンゴ脂質は、化粧品あるいは皮膚外用剤としての原料として、以上の特徴に応じて使用され、優れた機能を発揮するので、それらの原料成分として、有効に利用されるものである。

さらに、この発明により取得されるスフィンゴ脂質は、多くのヒト型の遊離セラミドを含有しているため、そのまま化粧品や健康食品用として利用しても、優れた機能を発揮することが期待され、さらにグルコシル型と遊離型とを分離して、前者を食品用、後者を化粧品用として利用することをも可能とするものであって、利用方法が多岐に亘る、優れたものである。

図１は醤油粕全脂質のケイ酸ＴＬＣ分析の結果を示す図である。 図２は醤油粕極性脂質および大豆アルカリ安定脂質のＨＰＬＣ分析の結果を示す図であって、図中Ａは醤油粕の分析結果を、Ｂは大豆の分析結果を示す。 図３は芋焼酎、醤油粕、清酒粕及び黒酢もろみ粕中のセラミドの構成を示す図である。 図４は醤油粕抽出精製物のケイ酸ＴＬＣ分析の結果を示す図である。 図５は醤油粕抽出精製物と清酒粕抽出精製物の比較のためのケイ酸ＴＬＣ分析結果を示す図である。 図６は醤油粕に存在する主要セラミドの構造を示す図である。

この発明において、スフィンゴ脂質の抽出に用いられる発酵粕としては、好ましいものとして、醤油粕が挙げられる。
なお、以下の実施例でも明らかなように、焼酎粕、清酒粕、黒酢もろみ粕などからも抽出されているように、その他の発酵粕、すなわち、酢もろみ粕、味噌、泡盛粕などもこの発明に適用可能である。
さらに、外国の酒（紹興酒やマッコリ等）も、麹を用いたものであれば適用することが可能である。

前記の醗酵粕からのスフィンゴ脂質の抽出は、アルコール系溶媒、特にはエタノールを用いることでよい。
前記スフィンゴ脂質中の、遊離セラミド以外の不純物を除去するための溶媒（遊離セラミドの含有量が多いスフィンゴ脂質を取得するために用いられ溶媒）としては、遊離セラミドを溶解しない溶媒、すなわち、遊離セラミドの非溶媒であれば各種のものが用いられる。
好ましい溶媒としては、ヘキサン及び／又はアセトンを挙げることができる。

その他の条件、すなわち、スフィンゴ脂質抽出、分離、精製、同定などには、格別な条件は存在せず、通常の操作が幅広く適用される。
例えば、精製には、カラムクロマトなどを用いて行うことが可能であるが、大量生産するためには、格別な手段が求められる。
そのため、以下の実施例４で詳細に説明する発酵粕のアルコール系抽出物を、遊離セラミドの非溶媒を用いて洗浄し、不純物を除去する工程と、洗浄後の抽出物を、アルコール系溶媒に溶解させたのち、同溶液に水を添加することによって析出させる工程とを、順次行う方法が挙げられる。

以下、具体的な実施例に基づいて、この発明のスフィンゴ脂質の取得方法について説明する。
なお、用いた醗酵粕は、大豆を原料とする醤油の醗酵粕と、黄薩摩芋および紫薩摩芋を原料とする焼酎の醗酵粕である。

＜醤油粕のスフィンゴ脂質分析＞
常法により製造された醤油の副産物である圧搾粕（水分２８％）１００ｇに、クロロホルム／メタノール（２：１、容量比）を３００ｍｌ添加し、室温で１時間撹拌して抽出した。
その後、前記抽出液をろ過して、溶液と固形部とに分別した。
この操作をさらに２回繰り返し、それらの溶液を合わせて全抽出液とし、クロロホルム／メタノール／水（８：４：３、容量比）の比率になるように蒸留水２２５ｍＬを添加して、分液ロートを用い室温で激しく２０回程度撹拌して混合させたのち、静置した。
前記混合液が２層に分離したことを確認し、下層を、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮乾固して秤量した。全脂質量は、１３．４ｇであった。

全脂質を、ケイ酸薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ，０．２５ｍｍ、メルク社製）で分析した結果を図1に示す。
展開溶媒はクロロホルム／メタノール：水（９０：１０：１）で、検出は５０％硫酸噴霧後加熱で行った。
図１に示されるように、この脂質には、大豆原料に由来するトリグリセリドの他に、脂質の分解物である遊離脂肪酸が多量に含まれている。
点線で極性脂質画分を拡大すると、大豆に多く含まれるステロール配糖体とグルコシルセラミドの他に、大豆にはほとんど存在しない脂質である遊離セラミドのスポットが大きく検出された。

つぎに、全脂質のケイ酸カラムクロマトグラフィーを行い、中性脂質（ＮＬ）と極性脂質画分（ＰＬ）とに分画した。
すなわち、全脂質１００ｍｇを乾固後、少量のクロロホルムに溶解し、Ｓｅｐ−Ｐａｋシリカカートリッジ（ウオーターズ社製）に供した。
まず、クロロホルム５０ｍＬで中性脂質を溶出し、ついで、メタノール３０ｍＬで極性脂質を溶出した。
両画分をロータリーエバポレーターで濃縮乾固して秤量すると、全脂質には中性脂質画分が８９．５％、極性脂質画分が１０．５％含まれることがわかった。

つぎに、極性脂質画分をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）分析に供し、スフィンゴ脂質を定量した。
分離は２液グラジエント溶出で、検出は蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ，島津製作所製）で行った。

＜移動相＞
Ａ液：ヘキサン／イソプロパノール／酢酸（８２：１７：１）
Ｂ液：イソプロパノール／水／酢酸／トリエチルアミン（８５：１４：１：０．２）
醤油粕の分析結果を図２Ａに、大豆の分析結果を図２Ｂに示す。

大豆の分析は、上記と同様に調製された全脂質を、０．４Ｍエタノール性ＫＯＨでアルカリ分解したアルカリ安定性の脂質画分について行ったものである。

図２Ａ、Ｂから明らかなように、醤油粕では４分付近に大ピークが見られ、これは元の大豆には存在しない。

セラミド標準品（Ｃ１６セラミド：Ｍａｔｒｅｙａ社）との保持時間の比較、ＴＬＣ分取分析およびＧＣ−ＭＳ分析（スフィンゴイド塩基の検出）の結果から、このピークは、遊離セラミドであることが確認された。

標準セラミドおよび標準グルコシルセラミド（ｌｏｗｅｒ ｓｐｏｔ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ｂｒａｉｎ；Ｓｉｇｍａ社）の検量線から定量した遊離セラミドとグルコシルセラミド量は、図３に示すように、それぞれ乾燥重量１００ｇあたり、３８０ｍｇと８０ｍｇであり、両者の割合では、遊離セラミドが８２．６％であった。

なお、醤油粕から得られたセラミド精製物のＴＬＣ分析の結果を図４に、清酒粕由来の遊離セラミドとの比較を図５に示す。

＜薩摩芋焼酎粕のスフィンゴ脂質分析＞
実施例1と同様に、黄薩摩芋及び紫薩摩芋を原料として、焼酎粕の脂質分析を行った。
原料は、焼酎廃液を固液分離装置により分離して得た固形部（以下、黄粕と紫粕と表記）を用いた。
黄粕（水分６２％）と紫粕（水分６９％）の脂質含量は、それぞれ２．０と１．８ｇ／１００ｇ（新鮮重量あたり）であった。
これを実施例1と同様に、スフィンゴ脂質を定量すると、図３に示すように、乾燥重量あたり、黄粕の遊離セラミドは２０４ｍｇ／１００ｇ、グルコシルセラミドは１６９ｍｇ／１００ｇ、紫粕の遊離セラミドは２７５ｍｇ／１００ｇ、グルコシルセラミドは１７７ｍｇ／１００ｇであった。
それぞれの遊離セラミドの割合は５４．７％と６０．８％であった（図３）。
なお、図３に示したその他の植物の分析値は、Ｔａｋａｋｕｗａら（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、 ９６、１０８９−９２、２００５）の分析値である。

醤油粕および焼酎粕ともに、既に市場で広く認知されている、機能性素材のグルコシルセラミド（通称植物セラミド）を多量に含有する。
Ｔａｋａｋｕｗａらは、図３に示すように、様々な植物性食品や残渣のグルコシルセラミド量を測定し、りんご果肉（ａｐｐｌｅ ｐｕｌｐ）中には、やや多いことを報告している。
しかしながら、発明者の測定した焼酎粕中のグルコシルセラミド量は、これらを遥かに上回り、醤油粕においても、りんご果肉（ａｐｐｌｅ ｐｕｌｐ）とは同等であるが、他のものよりは優位にある。
さらに特筆すべきは、原料大豆や薩摩芋、その他天然物にはほとんど含まれない遊離セラミドが、これら発酵粕中に多量に含まれていた。

＜セラミドの構成分分析＞
醤油粕から取得した遊離セラミドとグルコシルセラミドを、上記と同様の条件のケイ酸ＴＬＣで分離し、それぞれ１ｍｇを、１Ｍメタノール性ＨＣＬ １ｍｌ中、温度７０℃で１８時間反応させた。
反応後、ヘキサンを２ｍｌ添加して、撹拌抽出を３回繰り返し、脂肪酸を抽出した。
下層（メタノール層）は、４ＭＫＯＨでｐＨ１０に調整し、１ｍＬの水を添加してから、２ｍＬのジエチルエーテルで３回抽出した。
集めたジエチルエーテル層は、蒸留水で３回水洗し、その後、有機層を窒素ガスで乾固してスフィンゴイド塩基画分を得た。
得られたスフィンゴイド塩基画分は、トリメチルシリル誘導体としてＧＣ−ＭＳ分析（島津製作所製 ＱＰ２０１０）に供した。
カラム：ＵＬＢＯＮ ＨＲ−１（５０ｍ、０．２５ｍｍ ｉ．ｄ．、０．２５μｍ）
先の１８時間反応後のヘキサン層は、乾固後、無水５％メタノール性ＨＣＬでメチル化し、脂肪酸メチルエステルとして同様にＧＣ−ＭＳ分析に供した。
脂肪酸およびスフィンゴイド塩基の分析結果を、表１に示す。

表１に示されるように、グルコシルセラミドの脂肪酸は、全てα−ヒドロキシ脂肪酸であった。
大豆に特徴的な１６ｈ：０、２２ｈ：０、２４ｈ：０が検出された。
また、麦に特徴的な２０ｈ：０が、麹菌に特徴的な１８ｈ：０と１８ｈ：１がそれぞれ検出された。
さらに、醤油粕は、特異的なグルコシルセラミドを含有していることが分かる。
なお、前記１６ｈ：０などの表記において、「１６」などの数字は炭素数、ｈはα−ヒドロキシル基、最後の数字（０など）は二重結合数を意味する。
これはスフィンゴイド塩基でも同様で、麹菌や酵母などの真菌にのみ存在する９メチル型のスフィンガジエニン（ｄ１９：２）が検出された。
なお、前記「ｄ」はジヒドロキシ塩基の略である。
遊離セラミドの構成脂肪酸は、８５％がα−ヒドロキシ脂肪酸で、残り１５％はｎｏｎ−ヒドロキシ脂肪酸であった。
ヒドロキシ脂肪酸としては、２４と２２といった超長鎖脂肪酸が多く検出された。
また、２、３ジヒドロキシ脂肪酸（２４ｈ_２：０）も検出され、これは麹菌由来であると考えられる。
これらの分析結果から、醤油粕中に含まれるセラミドの主要構造を図６にまとめた。
なお、図６において、Ｘ型としたものは、先の９種類に含まれないが、植物および真菌セラミドの構成の一部として知られていたもので、初めて遊離体の取得に成功したものである。
また、セラミドＸは水酸基を多く有しており、保湿効果の高い素材として期待されるものである。
なお、図６及び表１から明らかなように、この発明で得られるスフィンゴ脂質中の遊離セラミドは、シス異性体を含む他の天然セラミドと異なり、殆どがトランス型であった。
この点からも、この発明で得られるスフィンゴ脂質中の遊離セラミドは、ヒト型セラミド、あるいはそれに近似したセラミドと見做されるものである。

図６に示されるように、醤油粕から分離精製され、表１の結果から求めたスフィンゴ脂質は、主な成分として４種類の遊離セラミドと、３種のグルコシルセラミドが含有されていることが判明した。
また、醤油粕にはセラミド６と７が多く、清酒粕にはセラミド３が多いことが判明し、それぞれから得られたヒト型遊離セラミドは、各自特有の性能を有するものであると判断されるものである。

＜遊離セラミドの大量抽出分離法＞
醤油粕に含まれるセラミド類の大量抽出と精製を、以下のように行なった。
醤油粕１ｋｇ（水分２８％）にエタノール３Ｌを添加して、温度４０℃で３時間撹拌し抽出を行なった。
前記エタノール溶液からなる抽出液をロータリーエバポレーターで濃縮乾固し、９５ｇの抽出物が得られた。（抽出工程）
得た抽出物にアセトン１Ｌを添加して撹拌洗浄後、温度４℃で冷却遠心分離した。
前記遠心分離によって沈殿物として得られた洗浄された抽出物に再度、アセトン５００ｍＬを添加し、１分間の撹拌と冷却遠心分離を２回繰り返し洗浄した。（洗浄工程）
沈殿物として得られた抽出物にエタノール５００ｍＬを添加して、温度４０℃で１５分の撹拌・遠心分離を３回繰り返し、再抽出を行なった。（再抽出工程）
再抽出を行なったエタノール溶液は、活性炭、ついで陰イオン交換樹脂を用い脱色し、濃縮乾固した。（不純物除去工程）
前記の濃縮乾固により得られた不純物の除去された再抽出物を、エタノール１００ｍＬに溶解して回収し、等容の水を添加して析出させ、温度４℃で冷却遠心分離した。（析出工程）
沈殿として得られた再抽出物に１００ｍＬのアセトンを添加して、１分間撹拌洗浄し、１５分の冷却遠心分離を行った。
沈殿物として得られた再抽出物に再度アセトン１００ｍＬ添加して同様に処理し、さらに、沈殿物にヘキサン５０ｍＬとアセトン５０ｍＬを添加して同様に処理し、洗浄を行った。（洗浄工程）
沈殿物として得られた再抽出物を、２時間真空デシケーター内で乾燥した。（乾燥工程）
かくして、得られた乾燥物はセラミド粉末（グルコシル型も含有）で、その質量は４．３ｇであった。

この発明で取得されるスフィンゴ脂質は、自然界では希少な遊離セラミド、特にヒト型遊離セラミドを多く含有するものである。
また、醗酵粕から多量取得されるので、これまでに、健康食品や化粧料あるいは皮膚外用剤の原料として、今まで以上の効用を有するものとして、それらを扱う業界で、幅広く利用される可能性を有するものである。
さらに、醗酵粕から多量取得されるものであるので、これまでに、健康食品や化粧料あるいは皮膚外用剤の原料として使用されていた化学合成品に代わり、天然物から得られた毒性の認められない安全な新素材として、かつ、今まで以上の効用を有するものとして、健康食品や化粧料あるいは皮膚外用剤を扱う業界で、幅広く利用される可能性を有するものである。

Claims (7)

1. 麹を用いた醗酵製品製造の際に生ずる副産物の醗酵粕を、メタノール又はエタノールもしくはそれらを主要成分とするアルコール系溶媒で抽出し、
   得られた抽出物を、遊離セラミドの非溶媒であるアセトン又はヘキサンを用いて洗浄し不純物を除去する洗浄工程と、
   洗浄後の抽出物を、前記アルコール系溶媒で再抽出して得た再抽出物のアルコール系溶液に、水を添加して析出させる工程
   からなる精製によって、遊離セラミド含有量の増大したスフィンゴ脂質を取得すること
   を特徴とするスフィンゴ脂質の取得方法。
2. 前記スフィンゴ脂質の遊離セラミドの含有量は、
   グリコシルセラミドと遊離セラミドの総和量の５０％以上であること
   を特徴とする請求項１に記載のスフィンゴ脂質の取得方法。
3. 前記アルコール系溶媒は、
   エタノールであって、前記非溶媒がアセトンを主体とするものであること
   を特徴とする請求項１又は２に記載のスフィンゴ脂質の取得方法。
4. 前記非溶媒による洗浄工程は、
   水の添加による析出成分の分離取得工程の後にも行われること
   を特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のスフィンゴ脂質の取得方法。
5. 前記非溶媒による洗浄工程は、
   複数回行うこと
   を特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のスフィンゴ脂質の取得方法。
6. 前記水の添加は、
   前記アルコール系溶液と等容量の水の添加であること
   を特徴とする請求項１又は２に記載のスフィンゴ脂質の取得方法。
7. 前記精製は、
   前記洗浄工程後の抽出物を前記アルコール系溶媒に溶解させ、活性炭及び／又は陰イオン交換樹脂による不純物吸着工程をも有するものであること
   を特徴とする請求項１又は２に記載のスフィンゴ脂質の取得方法。