JP4984926B2 - 顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は顕微鏡に関するものである。

顕微鏡による生きた細胞（＝生細胞）を観察する手法として、タイムラプスと呼ばれる手法がある。これはシャーレを培地で満たし、その中で細胞を生かしながら、ある時間間隔毎に画像を取得し、細胞の経時変化をみるものである。一般的に生細胞はシャーレの底に貼り付いているので、倒立顕微鏡とカメラおよびその両者を制御するソフトウェアおよびＰＣより構成される顕微鏡システムがあれば実現可能である。取得した画像を連続的に再生すれば長時間の細胞の変化を短時間で見ることができる。

一般的には撮影ポイントは１箇所であるが、昨今では撮影ポイントを複数とする、いわゆる多点タイムラプスという手法も実施されるようになってきた。これと区別するために前者を単点タイムラプスと呼ぶこともある。

単点タイムラプスではＸＹ座標（本明細書に置いては、顕微鏡の光軸方向をＺ軸とする３次元直交座標系を前提とする）は固定であるからステージを動かす必要がないが、多点タイムラプスでは撮影ポイントが複数あるので電動ステージを使って、撮影位置のＸ、Ｙ、Ｚ座標を移動する必要がある。多点タイムラプスにおいては、まず観察者が標本上で撮影ポイントを探索する。ステージをＸＹＺに動かして撮影したいポイントが見つかったら、その位置で座標を登録する。複数のポイントたとえば撮影ポイントａ、ｂ、ｃを順次登録し、タイムラプス撮影を開始する。電動ステージを含む顕微鏡システムは、「撮影ポイントをａからｂ、ｂからｃ、ｃからａと順次移動させて、撮影ポイントａ、ｂ、ｃの画像を撮影する」という動作を観察者が予め設定した時間間隔毎に繰り返し、観察者が予め設定した回数の撮影を終了すると、タイムラプス撮影終了となる。撮影した画像を見るときは、撮影ポイント毎に順番に画像を再生すれば、選んだ領域の経時変化を確認することができる。
特開２００２−２７７７５４号公報

多点タイムラプスは、標本上の複数のポイントの状態を時間毎に撮影して記録できるので、単点タイムラプスよりも効率的な手法である一方、使用するステージに高い位置決め精度が要求されるという問題点がある。位置決め精度が悪いと時間毎に撮影した際の座標位置がずれてしまい、撮影終了後に連続的に再生したときに像がブレて不自然な映像になってしまう。

リニアエンコーダを内蔵し、フィードバックによる位置決め制御を行うステージを用いれば、位置決め精度が良く、ブレを最小限にすることができるが、ステージが大きくなる、コストが高い、位置決めに時間がかかる、といった問題がある。

本発明はこのような問題に鑑みてなされたものであり、フィードバック制御を行わない位置決め機構でも、多点タイムラプスを高精度で実施する顕微鏡を提供することを課題とする。

本発明の第１の参考形態は、試料を観察する観察光学系と、前記観察光学系を介した前記試料の像を撮像する撮像手段と、前記撮影手段の撮影位置を決めるため前記観察光学系と前記撮像手段との相対的な位置関係を調整する２次元又が３次元位置決め装置を有する顕微鏡において、前記撮像手段の撮影位置が前記試料上の各撮影ポイントに位置決めされる際に、当該撮影ポイントから予め決められた方向および距離に位置するプリポイントを経由して、前記撮影ポイントに位置決め停止する機能を有することを特徴とする顕微鏡である。

本発明の第２の参考形態は、前記第１の参考形態において、前記２次元又が３次元位置決め装置は、駆動手段のバックラッシュを除去するための付勢機構を有し、前記プリポイントから前記撮影ポイントへの位置決めのための機構の動きは、必ず前記付勢機構の付勢力に対向する方向の動きとされていることを特徴とするものである。

前記課題を解決するための第１の手段は、試料を観察する観察光学系と、前記観察光学系を介した前記試料の像を撮像する撮像手段と、前記撮像手段の撮影位置を決めるため前記観察光学系と前記撮像手段との相対的な位置関係を調整する２次元又は３次元位置決め装置と、前記撮像手段および前記２次元又は３次元位置決め装置を制御して前記試料上の複数の撮影ポイントを順次繰り返し撮影し、所定時間間隔ごとに繰り返すタイムラプス撮影を行うタイムラプス撮影手段と、前記試料上に前記撮影ポイントが指定されると、前記２次元又は３次元位置決め装置を制御して以下の（１）〜（４）の撮影ポイント登録動作を行うものであって、
（１）一旦、前記撮影位置が、前記撮影ポイントに移動し、その位置を登録撮影ポイントとして登録し、
（２）その後、前記登録撮影ポイントから予め決められた方向および距離の位置に移動し、その位置を登録時プリポイントとして登録し、
（３）（２）で移動した移動量だけ逆方向に移動して停止し、
（４）登録取消し入力があったとき、前記登録撮影ポイントをリセットして、再び（１）に戻って（３）までの動作を繰り返し、登録確認入力があったとき、前記登録撮影ポイント及び前記登録時プリポイントの登録を確定し、前記登録撮影ポイント登録動作を終了する撮影ポイント登録手段と、前記タイムラプス撮影手段の動作中の前記撮影ポイントに位置決め制御するため、前記登録時プリポイントを経由して前記登録撮影ポイントを目標として位置決め停止する駆動制御手段とを有することを特徴とする顕微鏡である。

前記課題を解決するための第２の手段は、前記第１の手段であって、前記２次元又は３次元位置決め装置は、自身のバックラッシュを除去するための付勢機構を有し、前記撮影ポイント登録手段は、前記登録時プリポイントの位置を前記付勢機構の付勢力に対向する方向に設定し、前記（3）での移動、および前記タイムラプス撮影実行の際の前記登録時プリポイントから前記登録撮影ポイントへの移動のための機構の動きが、必ず前記付勢機構の付勢力に対向する方向の動きとされていることを特徴とするものである。

前記課題を解決するための第３の手段は、試料を観察する観察光学系と、前記観察光学系を介した前記試料の像を撮像する撮像手段と、前記撮像手段の撮影位置を決めるため前記観察光学系と前記撮像手段との相対的な位置関係を調整する２次元又は３次元位置決め装置と、前記撮像手段および前記２次元又は３次元位置決め装置を制御して前記試料上の複数の撮影ポイントを順次繰り返し撮影し、所定時間間隔ごとに繰り返すタイムラプス撮影を行うタイムラプス撮影手段と、前記試料上に前記撮影ポイントが指定されると、前記２次元又は３次元位置決め装置を制御して以下の（１）〜（４）の撮影ポイント登録動作を行うものであって、
（１）一旦、前記撮影位置が、前記撮影ポイントに移動し、その位置を登録撮影ポイントとして登録し、
（２）その後、前記登録撮影ポイントから予め決められた方向および距離の位置に移動し、その位置を登録時プリポイントとして登録し、
（３）（２）で移動した移動量だけ逆方向に移動して、
（４）登録取消し入力があったとき、前記登録撮影ポイントをリセットして、再び（１）に戻って（３）までの動作を繰り返し、登録確認入力があったとき、前記登録撮影ポイント及び前記登録時プリポイントの登録を確定し、登録撮影ポイント登録動作を終了する撮影ポイント登録手段と、前記タイムラプス撮影手段の動作中の前記撮影ポイントに位置決め制御するため、前記登録時プリポイントと前記登録撮影ポイントとを結ぶ線上の点であるプリポイントを経由して前記登録撮影ポイントを目標として位置決め停止する駆動制御手段とを有することを特徴とする顕微鏡である。

前記課題を解決するための第４の手段は、前記第３の手段であって、前記２次元又は３次元位置決め装置は、バックラッシュを除去するための付勢機構を有し、前記撮影ポイント登録手段は、前記プリポイントの位置を前記付勢機構の付勢力に対向する方向に設定し、前記（３）での移動、およびタイムラプス撮影実行の際の前記プリポイントから前記登録撮影ポイントへの移動のための機構の動きは、必ず前記付勢機構の付勢力に対向する方向の動きとされていることを特徴とするものである。

本発明によれば、フィードバック制御を行わない位置決め機構でも、多点タイムラプスを高精度で実施する顕微鏡を提供することができる。

（第一実施形態）
以下、本発明の実施の形態の例を、図を用いて説明する。図１は、本発明の実施の形態の１例である顕微鏡システムの概要を示す図である。この顕微鏡システムは、顕微鏡本体１０、カメラ２０、電動ステージ３０、モニタ４０、ＰＣ本体５０、マウス６０等により構成される。

顕微鏡本体１０には複数の対物レンズ１２が装着可能な電動レボルバ１１が取り付けられている。電動レボルバ１１の各対物レンズ取付穴には番地が割り当てられており、あらかじめ入力されたテーブルにより光軸上に配置されている対物レンズ１２の倍率を検出することができる。カメラ２０には撮像素子としてＣＣＤが内蔵されている。モニタ４０には撮像素子上に結像した観察像が映し出される。電動ステージ３０は被測定対象物が入ったシャーレ１３をＸＹ方向に移動させることができる。駆動源としてステッピングモータを備えており、モータの回転運動はリードねじによって直線運動に変換されステージを駆動する。電動ステージ３０はステージコントローラ３１と接続されている。顕微鏡本体１０、カメラ２０、ステージコントローラ３１、モニタ４０およびマウス６０、はＰＣ本体５０に接続されている。

本実施の形態においては、Ｚ軸方向の移動は、電動ステージ３０では行わず、電動レボルバ１１の上下方向移動により行うようになっているが、電動ステージ３０で行うようにしてもよい。電動ステージ３０のＸ軸、Ｙ軸方向の位置制御、及び電動レボルバ１１のＺ軸方向の位置制御は、パルスモータを用いたオープンループ制御により行われている。電動ステージ３０のＸ軸方向、Ｙ軸方向駆動装置には、バネ等の付勢装置が設けられており、各軸毎に１方向に付勢力をかけてバックラッシュを除去するようになっている。電動レボルバ１１においては、それ自身の自重が付勢力として働き、バックラッシュを除去するようになっている。被測定対象物は、透過照明装置７０、落射照明装置８０により照明される。

一般に、電動ステージ３０のオープンループ制御により、試料の観察ポイントＡ点を、対物レンズ12の光軸上に位置決めをする場合、任意の点を起点としてＡ点への位置決めを行うより、観察ポイントＢ点を起点としてＡ点への位置決めを行う方が位置決め精度がよい。よって、本実施の形態においては、観察ポイントＡ点への位置決めを行う場合、Ａ点から予め決められた方向および距離に位置するプリポイントであるＢ点を経由してＡ点への位置決めを行うようにしている。

さらに、位置決め機構にバックラッシュを除去するための付勢機構を設けると共に、プリポイントＢからＡ点への位置決めを行う際の機構の動きが、必ず付勢機構の付勢力に対向する方向の動きとされているようにする。このようにすると、相対的な付勢力が強まるので、バックラッシュに起因する位置決め誤差を大幅に少なくすることができる。

以下、一例として次のような条件で多点タイムラプスを行うこととして、多点タイムラプスの手順を示す
・撮影ポイント：ａ、ｂ、ｃの３点
・撮影時間間隔：１０分
・タイムラプス継続時間：６０分
・各撮影ポイントにおける撮影枚数：７枚
はじめに撮影ポイントを登録する。観察者は電動ステージ３０をＸＹ移動させつつ、シャーレ１３内にある試料を観察し、所望の位置で、撮影ポイントを順次ａ、ｂ、ｃとして設定する。モニタ４０上のＧＵＩをマウス６０でクリックすることにより撮影時間間隔、タイムラプス継続時間、を入力し、その他の諸条件を入力した後、ＧＵＩによりタイムラプス開始を指令すると、ＰＣ本体５０は顕微鏡本体１０、電動ステージ３０、カメラ２０に次々と指令を出し、入力された条件に従って以下のタイムラプスの一連のシーケンスを自動的に実行する。

すなわち経過時間０で、電動ステージ３０を駆動し撮影ポイントａ点を光軸Ｌ上に移動して画像取得、ただちに撮影ポイントｂ点を光軸上に移動して画像取得、さらに撮影ポイントｃ点を光軸上に移動して画像取得する。さらに、撮影時間間隔をおいて、撮影ポイントａ点に戻って、上記の動作をタイムラプス継続時間中繰り返す。

以下、本発明の実施の形態における位置決め方法を、電動ステージ３０を例として、図２を用いて説明する。まず、観察者が電動ステージを駆動させて試料上の所望、撮影ポイントａ点を光軸上に移動させて、そのポイントａ点をパルスモータのカウンタ値として登録する。続いて、電動ステージ３０を、予め定められた移動量（ｘ方向のカウンタ値ｘ_０、ｙ方向のカウンタ値ｙ_０）だけ、ａ点から離れた位置にあるａ’点に移動させる。このときの停止位置ａ’点（そのときのパルスモータのｘ及びｙカウンタ値）をプリポイントとして登録する。続いて、電動ステージ３０を移動量（カウンタ値（−ｘ_０）、カウンタ値（−ｙ_０））だけ移動させる。すると、撮影位置はａ”点で停止する。この位置ａ”点で、試料の像を観察し、当初の撮影ポイントａ点にほぼ戻っていることを確認し、満足のいくものであれば、登録確認の入力を行い、満足のいかないものであれば、登録取消しの入力を行う。登録確認の入力があれば、撮影ポイントａ点における全ての登録動作は終了し、登録取消し入力があれば、以上の動作を繰り返す。以下、撮影ポイントｂ点、ｃ点についても同じ動作を行う。より好ましくは、各撮影ポイントとそのプリポイントとの距離は、すべての撮影ポイントにおいて同一に設定されているのが良い。

この際、前述のような理由により、位置決め機構がバックラッシュを除去するための付勢機構を有し、ａ’点からａ”点への移動の際には、その移動の方向が付勢機構の付勢力に対向するような方向となるように（ｘ方向のカウンタ値ｘ_０、ｙ方向のカウンタ値ｙ_０）の移動量を決定することが好ましい。

以上の手順を図３に示す。

ステップＳ１１： 撮影ポイントの登録指令が出される。

ステップＳ１２： 観察者が電動ステージ３０を駆動させて試料上の所望の撮影ポイントａ点を光軸上に移動させる。

ステップＳ１３： このカウント値（ｘ方向のカウンタ値ｘａ、ｙ方向のカウンタ値ｙｂ）を、撮影ポイントａとして登録する。

ステップＳ１４： その後、予め設定された移動量（ｘ方向のカウンタ値ｘ_０、ｙ方向のカウンタ値ｙ_０）だけ電動ステージ３０をＸＹ方向に移動する。これにより、電動ステージ３０は、プリポイントａ’点に移動する。

ステップＳ１５： さらに電動ステージ３０を移動量（カウンタ値（−ｘ_０）、カウンタ値（−ｙ_０））だけ移動させる。この位置ａ”点で、試料の像を観察し、当初の撮影ポイントａ点にほぼ戻っていることを確認する。

ステップＳ１６： ここで、モニタ４０の表示画像が満足なものであるかどうかを判定する。

ステップＳ１７： 不満足であれば、登録取消し入力を行う。そうすると、登録された撮影ポイントａのカウント値（ｘ方向のカウンタ値ｘａ、ｙ方向のカウンタ値ｙｂ）をリセットし、ステップＳ１２に戻る。

ステップＳ１８： 満足できるものであれば、撮影ポイントａの登録を終了する。

同様に、各撮影ポイントｂ、ｃについても同様に登録する。

このようにして、各撮影ポイントの登録が終わった後、多点タイムラプスの撮影は、図４に示すように行われる。このシーケンスを図５のフローチャートに基づき説明する。

ステップ２１： 多点タイムラプスの撮影を開始した際には、最初の撮影ポイントａ点に移動する工程において、まず、任意の位置（多点タイムラプスの撮影ポイント登録後の電動ステージ３０の任意の位置）からプリポイントａ’点へのカウント値を算出する。

ステップＳ２２： 算出されたカウント値に基づき、任意の位置からプリポイントａ’点へ電動ステージ３０を駆動する。

ステップＳ２３： プリポイントａ’点から撮影ポイントａ点へ、予め設定された量（ｘ方向のカウンタ値―ｘ_０、ｙ方向のカウンタ値―ｙ_０）だけ移動させて、撮影ポイントａで停止させる。

ステップＳ２４： 撮影ポイントａ点において試料をＣＣＤカメラ２０で撮影し、画像を保存して、モニタ４０に表示する。

ステップＳ２５： 撮影ポイントａ点での撮影終了後に、撮影ポイントａからプリポイントｂ’までのカウンタ量を算出し、プリポイントｂ’へ移動する。上記の撮影ポイントａ点の撮影までのシーケンス（ステップＳ２３、Ｓ２４）と同様に、撮影ポイントｂに移動し、試料を撮影する。

ステップＳ２６： 撮影ポイントｂ点での撮影終了後に、撮影ポイントｂからプリポイントｃ’までのカウンタ量を算出し、プリポイントｃ’へ移動する。上記の撮影ポイントａ点の撮影までのシーケンス（ステップＳ２３、Ｓ２４）と同様に、撮影ポイントｃに移動し、試料を撮影する。

ステップＳ２７： 設定された多点の撮影ポイントａ、ｂ、ｃの撮影が終了すると、
所定の撮影枚数に到達したかどうかを判定する。現時点では各撮影ポイントにおける撮影枚数は１である。本例では所定の撮影枚数は７なので、Nと判定されステップS２８へ進む。

ステップS２８：所定の撮影時間間隔（インターバル）、本例では１０分間待機し、その
後ステップ２２へ進む。フローチャートにしたがって、再び、撮影ポイントａ、ｂ、ｃを順次、撮影し、さらに所定の撮影枚数に達するまで、試料の多点の撮影ポイントａ、ｂ、ｃを繰り返し撮影する。

ステップS２７：撮影枚数が所定の枚数（本例では７枚）に到達するとステップS２７で、この方式によれば、撮影ポイントに至る前に、必ず予め登録されたプリポイントを経由して移動が行われるので、位置決め精度が向上する。

さらに、前述のように、位置決め機構がバックラッシュを除去するための付勢機構を有し、登録時プリポイントから実際の登録撮影ポイントへの移動の際には、その移動の方向が付勢機構の付勢力に対向するような方向となるようにしておけば、バックラッシュによる誤差を低減することができる。

本発明を利用することで、多点タイムラプス撮影における、登録時の撮影ポイントの位置とタイムラプス実行して撮影する際の位置との誤差を小さくすることができる。

（第二の実施形態）
図６は、登録時プリポイントと実行時プリポイントがある例を示しており、次に第一実施形態との異なる点について説明する。なお、図６において、登録時プリポイントは、ａ’、ｂ’、ｃ’は、第一実施形態で説明した方法により行われる。

実行時プリポイントｋは、登録時プリポイントa’と撮影ポイントａとを結ぶ線上の任意の位置に設定される。あるいは、前記結ぶ線上になくても少しずれた位置でもよい。

図６において、登録時プリポイントは、ａ’、ｂ’、ｃ’であるが、撮像ポイントは、実行時プリポイントｋ→実際の登録時撮像ポイントａ→実行時プリポイントｍ→実際の登録時撮像ポイントｂ→実行時プリポイントｎ→実際の登録時撮像ポイントｃのように移動する。

このようにしても、登録時プリポイントに向かう際の起点が定点となるので、位置誤差を低減することができる。

以上は、電動ステージ３０のｘｙ方向の二次元の制御に関する説明であったが、電動レボルバ１１によるＺ軸方向の移動制御も含めて、３次元の位置制御についても、制御が一次元増えるだけで、考え方は変わらない。なお、電動レボルバ１１によるＺ軸方向位置制御においては、登録時プリポイントと登録時撮像ポイントの間の移動を複数回（１０回程度）繰り返えし、最終的に登録時撮像ポイント位置にすると、位置制御精度が向上する傾向にある。

本発明の実施の形態の１例である顕微鏡システムの概要を示す図である。 本発明の実施の形態における位置決め方法を説明するための図である。 ポイントの登録の手順を示すフローチャートである。 多点タイムラプス実行時の位置決めの様子を示す図である。 登録撮影ポイントへの移動のシーケンスを示すフローチャートである。 多点タイムラプス実行時の位置決めの他の例の様子を示す図である。

符号の説明

１０…顕微鏡本体、１１…電動レボルバ、１２…対物レンズ、１３…シャーレ、２０…カメラ、３０…電動ステージ、３１…ステージコントローラ、４０…モニタ、５０…ＰＣ本体、６０…マウス、置７０…透過照明装置、８０…落射照明装置

Claims (4)

1. 試料を観察する観察光学系と、
   前記観察光学系を介した前記試料の像を撮像する撮像手段と、
   前記撮像手段の撮影位置を決めるため前記観察光学系と前記撮像手段との相対的な位置関係を調整する２次元又は３次元位置決め装置と、
   前記撮像手段および前記２次元又は３次元位置決め装置を制御して前記試料上の複数の撮影ポイントを順次繰り返し撮影し、所定時間間隔ごとに繰り返すタイムラプス撮影を行うタイムラプス撮影手段と、
   前記試料上に前記撮影ポイントが指定されると、前記２次元又は３次元位置決め装置を制御して以下の（１）〜（４）の撮影ポイント登録動作を行うものであって、
   （１）一旦、前記撮影位置が、前記撮影ポイントに移動し、その位置を登録撮影ポイントとして登録し、
   （２）その後、前記登録撮影ポイントから予め決められた方向および距離の位置に移動し、その位置を登録時プリポイントとして登録し、
   （３）（２）で移動した移動量だけ逆方向に移動して停止し、
   （４）登録取消し入力があったとき、前記登録撮影ポイントをリセットして、再び（１）に戻って（３）までの動作を繰り返し、登録確認入力があったとき、前記登録撮影ポイント及び前記登録時プリポイントの登録を確定し、前記登録撮影ポイント登録動作を終了する撮影ポイント登録手段と、
   前記タイムラプス撮影手段の動作中の前記撮影ポイントに位置決め制御するため、前記登録時プリポイントを経由して前記登録撮影ポイントを目標として位置決め停止する駆動制御手段と
   を有することを特徴とする顕微鏡。
2. 請求項１に記載の顕微鏡において、
   前記２次元又は３次元位置決め装置は、自身のバックラッシュを除去するための付勢機構を有し、
   前記撮影ポイント登録手段は、前記登録時プリポイントの位置を前記付勢機構の付勢力に対向する方向に設定し、前記（3）での移動、および前記タイムラプス撮影実行の際の前記登録時プリポイントから前記登録撮影ポイントへの移動のための機構の動きが、必ず前記付勢機構の付勢力に対向する方向の動きとされていることを特徴とする顕微鏡。
3. 試料を観察する観察光学系と、
   前記観察光学系を介した前記試料の像を撮像する撮像手段と、
   前記撮像手段の撮影位置を決めるため前記観察光学系と前記撮像手段との相対的な位置関係を調整する２次元又は３次元位置決め装置と、
   前記撮像手段および前記２次元又は３次元位置決め装置を制御して前記試料上の複数の撮影ポイントを順次繰り返し撮影し、所定時間間隔ごとに繰り返すタイムラプス撮影を行うタイムラプス撮影手段と、
   前記試料上に前記撮影ポイントが指定されると、前記２次元又は３次元位置決め装置を制御して以下の（１）〜（４）の撮影ポイント登録動作を行うものであって、
   （１）一旦、前記撮影位置が、前記撮影ポイントに移動し、その位置を登録撮影ポイントとして登録し、
   （２）その後、前記登録撮影ポイントから予め決められた方向および距離の位置に移動し、その位置を登録時プリポイントとして登録し、
   （３）（２）で移動した移動量だけ逆方向に移動して、
   （４）登録取消し入力があったとき、前記登録撮影ポイントをリセットして、再び（１）に戻って（３）までの動作を繰り返し、登録確認入力があったとき、前記登録撮影ポイントを登録撮影ポイント及び前記登録時プリポイントを確定し、登録撮影ポイント登録動作を終了する撮影ポイント登録手段と、
   前記タイムラプス撮影手段の動作中の前記撮影ポイントに位置決め制御するため、前記登録時プリポイントと前記登録撮影ポイントとを結ぶ線上の点であるプリポイントを経由して前記登録撮影ポイントを目標として位置決め停止する駆動制御手段とを有することを特徴とする顕微鏡。
4. 請求項３に記載の顕微鏡において、
   前記２次元又は３次元位置決め装置は、バックラッシュを除去するための付勢機構を有し、
   前記撮影ポイント登録手段は、前記プリポイントの位置を前記付勢機構の付勢力に対向する方向に設定し、前記（３）での移動、およびタイムラプス撮影実行の際の前記プリポイントから前記登録撮影ポイントへの移動のための機構の動きは、必ず前記付勢機構の付勢力に対向する方向の動きとされていることを特徴とする顕微鏡。

Images