JP4960101B2 - 足場依存性細胞を培養するための固形支持体を再生利用する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、タンパク質の工業生産において使用するための方法に関連する。詳細には、本発明は、足場依存性細胞を培養するための固形支持体、例えば、マイクロキャリアー及びFibra-Cell(登録商標)を再生利用する方法を提供する。本発明の方法によって再生利用される固形支持体は、非再生利用固形支持体により獲得される生産レベルよりも高い生産レベルにおいてタンパク質を獲得することを可能にする。
哺乳類発現系において生産される治療用タンパク質に対し高まりつつある要請は、過去30年でin vitro細胞培養、スケールアップ、発現ベクター及び培地開発の分野において、有意な進展をもたらした。
本発明は、in situで足場依存性細胞を培養するための固形支持体を再生利用する方法を提供する。本発明の方法は、非再生利用支持体により得られるタンパク質生産性レベルに匹敵するタンパク質生産レベルを維持することを可能にする。本発明の方法は、コストの観点及び全体効率の観点の両方からタンパク質生産性を向上させる。
a)前記系の液体を空にし;
b)当該系を水性溶液で洗浄し;
c)当該系を水酸化ナトリウム溶液で洗浄し;そして
d)当該系を水性溶液で洗浄する、
段階を含んで成る、細胞培養のための系内に位置した足場依存性細胞の培養のための固形支持体を再生利用する方法に関する。
本発明は、in situで足場依存性細胞を培養するための固形支持体を再生利用する方法の発見に基づく。実施例3に示されるように、前記方法は、タンパク質生産レベルを非再生利用支持体により得られるタンパク質生産性レベルに維持することを可能にする。
a)前記系の液体を空にし;
b)当該系を水性溶液で洗浄し;
c)当該系を水酸化ナトリウム溶液で洗浄し;そして
d)当該系を水性溶液で洗浄する、
段階を含んで成る、細胞培養のための系内に位置した足場依存性細胞を培養するための固形支持体を再生利用する方法に関連する。
(i)デバイスに液体を充填し;
(ii)当該液体を前記デバイス中でインキュベートし;そして
(iii)前記デバイスの液体を空にする、
段階を含んで成る方法に言及される。
(i)約100mmbar〜約900mmbar;
(ii)約200mmbar〜約800mmbar;
(iii)約300mmbar〜約700mmbar;
(iv)約400mmbar〜約600mmbar;
から成る群から選択された範囲内の温度で行われている。
(i)約100mmbar〜約900mmbar;
(ii)約200mmbar〜約800mmbar;
(iii)約300mmbar〜約700mmbar;及び
(iv)約400mmbar〜約600mmbar;
から成る群から選択された範囲内の加圧下で行われる。
a)細胞培養のための系から固形支持体を除去し;
b)当該固形支持体を水性溶液で洗浄し;
c)当該固形支持体を水酸化ナトリウム溶液で洗浄し;
d)当該固形支持体を水性溶液で洗浄する、
段階を含んで成る方法においてex situで再生利用されて良い。
1.1.設備
全ての実験を、外部カラムに連結したバイオリアクターを含んで成る系で行った。バイオリアクターの形態は、MBRによって製造された40L Free-Standing Laboratoryバイオリアクターの形態に類似した。使用したバイオリアクター及びカラムの体積を下の表1に要約した。
1.2.1細胞系統
全ての実験をp55TNFレセプター(Swiss ProtアクセスNo.P19438)の可溶性細胞外部分に対応するタンパク質を生産するCHO細胞系統で行った。r-hTBP-1と命名された生産されたタンパク質は、Swiss Prot Accession No.P19438のアミノ酸41〜201を含んで成る。
細胞培養のために使用した培地はSigma C1850培地であった。
「ラン」にも言及される培養方法は、接種段階、増殖フェーズ及び生産フェーズを含んで成る。
実施例3を行う場合、1.6×109個の生r-hTBP-1生産細胞/kgのFibra-Calをバイオリアクターに移し、そして実施例4行う場合、2.7×109個以上を移した。接種の間のポンプ循環をし、細胞を自然にFibra-Cel(登録商標)ディスクへ結合させる。
−温度:37.0℃
−溶存酸素(DO):50%空気飽和
−pH:7.00
−バイオリアクター加圧:0.2bar
−実施例3を行う場合:撹拌:20rpm
増殖フェーズの間、バイオリアクターを2日目までバッチモードで操作し、そして希釈率を最大値の100Lの灌流培地/日/kgのFibra-Cal(登録商標)ディスク(100L日-1kg-1のFibra-Cel(登録商標))の値まで増加させた。ポンプ循環フローを漸進的に150l.h-1→350l.h-1へ実施例3を行う場合に漸進的に増加させ且つ150l.h-1→800l.h-1kg-1へ実施例4を行う場合に漸進的に増加させた。第7日目に、溶存酸素(DO)設定ポイントを70%空気飽和へと高めた。
一度グルコース消費率(GCR)がFibra-Cel(登録商標)の150g日-1kg-1を越えれば、灌流レベルを18Lの灌流培地/日(30L日-1kg-1のFibra-Cel(登録商標))へ実施例3を行う場合に下げ、そして10Lの灌流培地/日(30L日-1kg-1のFibra-Cel(登録商標)以上)へ実施例4を行う場合に下げた。生産フェーズは60日続いた。
2.1全有機炭素(TOC)の測定
全有機炭素(TOC)は、炭素として測定した医薬水中に存在する有機分子の間接測定値である。TOCは、通常、精製及び分配系を含んで成る単位操作の性能をモニタリングすることに寄与するプロセス制御として使用されている。TOCは、全有機分子がクリーニングの後に除去されたかどうかを特定可能にする。TOCを分析するための多くの方法が存在する(例えば、Europiean Pharmacopeia 第4版、2002年、第2.2.44章を参照のこと)。
カブトガニアメーバ状細胞(LAL)試験は、試験されるサンプル中又はサンプル上に存在しうる細菌内毒素を検出又は定量化する試験である。それは、LAL試薬として使用するために調製され且つ特性決定されているカブトガニ(Limulus polyohemus 又はTachypleus tridentaus)の循環するアメーバ状細胞の水性抽出物から獲得されたカブトガニアメーバ状細胞を使用する(例えば、Pharmacopeia United States of America,第26版、第85章を参照のこと)。
バイオバーデンとは、サンプル中又はサンプル上に存在する生育可能微生物の量の基準である。バイオバーデンは「全生育可能好気計測」にも言及される。バイオバーデンを測定するための多くの方法が使用可能である(例えば、European Pharmacopea 第4版、2002年、第2.6.12章を参照のこと)。
−トリプカーゼ-ソヤアガー;
−トリプカーゼ-ソヤアガー+0.07%レクチン+0.5%Tween80;又は
−トリプカーゼ-ソヤアガー+5%ヒツジ血液。
r-hTBP-1(g)/Fibra-Cal(登録商標)(kg)として表した累積生産性(CP)を次のように計算した:CP=(前日のCP)+(日々のr-hTBP-1タイター×灌流/Fibra-Cel(登録商標)の質量(Kg))/1000×(前日〜当日間の時間(時間))。
消費されたグルコース(g)/日/Fibra-Cel(登録商標)(kg)で表したグルコース消費率(GCR)を次のように計算した:GCR=(((Gin-Gバイオリアクター)×灌流)+(Gバイオリアクター前日−Gバイオリアクター当日)×((有効体積(L)/前日と当日の時間間隔(h))/Fibra-Celの質量)
3.1再生利用
この系は、実施例1.1に記載のように、5.5Lの外部カラムへ連結した15Lのバイオリアクターからなった。
後に続くランを、3回洗浄した再生利用Fibra-Cel(登録商標)ディスクで行った。洗浄の後日、再生利用Fibra-Cel(登録商標)ディスクを含むカラムを滅菌し、そして新しいランをスタートするまで無菌状態を維持した。かかる後のランの間に測定した累積生産性及びグルコース消費率を、図1及び2にそれぞれ示している。非再生利用Fibra-Cel(登録商標)によるこのランの間に測定した累積生産性及びグルコース消費率も報じている。
この系は、実施例1.1に記載のように、外部カラムに連結した40L又は350Lバイオリアクターを含んで成る。
Claims (25)
- 細胞培養のための系内に位置した足場依存性細胞を培養するための固形支持体を再生利用する方法であって:
a)当該系の液体を空にし;
b)当該系を水性溶液で洗浄し;
c)当該系を水酸化ナトリウム溶液で洗浄し;そして
d)当該系を水性溶液で洗浄する、
段階を含み、
該固形支持体は、ポリプロピレンメッシュのシートへ結合した不織布ポリエステルからできたディスクである、方法。 - 前記水性溶液が水である、請求項1に記載の方法。
- 前記水酸化ナトリウム溶液が:
a)1%〜3%の範囲内の水酸化ナトリウム;
b)1.5%〜2.5%の範囲内の水酸化ナトリウム;及び
c)2%の水酸化ナトリウム
からなる群から選択された濃度における、請求項1又は2に記載の方法。 - 段階(d)を3回以上行う、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 段階(d)を3回行う、請求項4に記載の方法。
- 段階(d)を5回行う、請求項4に記載の方法。
- 前記段階(b)における水性溶液が注射のための溶液(WFI)である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記段階(d)における水性溶液が注射のための溶液(WFI)である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記段階(d)を、注射のための溶液(WFI)で行う段階(d)の最後の繰り返し以外は、精製水(PW)で行う、請求項4〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記系がバイオリアクターを含んで成る、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記系が更に、前記バイオリアクターに連結した外部カラムを含んで成る、請求項10に記載の方法。
- 前記バイオリアクターが内部カラムを含んで成る、請求項10に記載の方法。
- 前記固形支持体が前記カラム内に位置する、請求項11又は12に記載の方法。
- 前記系を段階(d)を行う後に滅菌する、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記外部カラムを段階(d)を行う後に滅菌する、請求項11に記載の方法。
- 前記段階(d)を:
a)500l.h-1.kg-1〜700l.h-1.kg-1の範囲内;
b)550l.h-1.kg-1〜650l.h-1.kg-1の範囲内;及び
c)583l.h-1.kg-1
からなる群から選択される循環ループ流により行う、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。 - 前記段階(d)を周囲温度で行う、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記段階(d)を:
a)100mmbar〜900mmbarの範囲内;
b)300mmbar〜700mmbarの範囲内;及び
c)500mmbar、
からなる群から選択される加圧下で行う、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。 - 前記段階(d)を:
a)5分〜30分の範囲内;
b)5分〜20分の範囲内;及び
c)10分
の群から選択される継続時間に渡り行う、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。 - 前記段階(c)を:
a)500l.h-1.kg-1〜700l.h-1.kg-1の範囲内;
b)550l.h-1.kg-1〜650l.h-1.kg-1の範囲内;及び
c)583l.h-1.kg-1
からなる群から選択される値における循環ループ流の組により行う、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。 - 前記段階(c)を:
a)20分〜40分の範囲内;
b)25分〜35分の範囲内;及び
c)30分
の群から選択される継続時間に渡り行う、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。 - 前記段階(c)を:
a)50℃〜70℃の範囲内;
b)55℃〜65℃の範囲内;及び
c)60℃
からなる群から選択される温度において行う、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。 - 前記段階(b)を:
a)50℃〜70℃の範囲内;
b)55℃〜65℃の範囲内;及び
c)60℃
からなる群から選択される温度において行う、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。 - 前記段階(d)を:
a)100mmbar〜900mmbarの範囲内;
b)300mmbar〜700mmbarの範囲内;及び
c)500mmbar、
からなる群から選択される加圧下で行う、請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。 - 前記段階(b)を:
a)5分〜30分の範囲内;
b)5分〜20分の範囲内;及び
c)10分
の群から選択される継続時間に渡り行う、請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法。
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