JP4895504B2 - 集中マイクロ流体デバイス(ea) - Google Patents
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Description
本発明は、触媒システムの成分の特性化のための高度集中アッセイに使用される小型化方法およびマイクロ流体デバイスに関する。
引用される特許および特許出願は、全体的な出典明示により本明細書の一部とする。
Anal. Chem. 73 (2001) 2648-2655 (Gao等)は、微小透析サブユニットを有する電気スプレーユニットにシリカ毛管を介して連結される、プロテアーゼ反応器を記載している。反応器は、ポリジメチルシロキサン(PDMS)内に閉じ込められ、そしてそれにプロテアーゼが固定化されるフッ化ポリビニリデン膜を含有する。
本発明の一般的な目的は、高い処理能力および工程数に関して高度の集中化をもって多数の同様な小型化触媒アッセイを並行して実施するために使用されることができる、方法およびマイクロ流体デバイスを提供することである。
・第一の副目的は、主目的を可能にして、デバイスを使い捨てとして使用し得るような低コストで大量生産され得る、マイクロ流体デバイスを提供することである。
・第二の副目的は、生産物の高収率を保持しながら、高精度、高感度等ならびに触媒反応をスピードアップすることに関して高多様性を持つ触媒アッセイを可能にする、方法ならびにデバイスである。
・第四の副目的は、対応する触媒システムの効率に悪影響を与えること無しに、即ち、効率が均一型の対応するシステムに本質的に同じかもしくはより良い、触媒システムの成分の固定化のための方法である。
・第五の副目的は、室温(=25℃±5℃)で行うことができる触媒アッセイ方法である。
・第七の副目的は、高精度でサブ‐μlの容積の取り扱いを可能にするデバイスである。
これらの副目的は、以下で考察される生体触媒に特に適用される。
図1a〜bは、CD版のディスクの形式での適当なマイクロ流体デバイスを図示する。図2は、実験の部で用いられてきたマイクロチャネル構造を概略する。構造を、図1a〜bに示されるのと同様な様式でディスク上に置くことができる。
本発明は、複数(n)の等しいもしくは異なる触媒システムCS1,CS2....CSnの、それぞれで、成分An1,An2....Ann(アナライト)の非特性化側面の特性化のための方法である。それぞれの触媒システムは、成分C1 k,C2 k....Cm kを含み、その一つはAnkである。
kは、特定の触媒システムもしくはアッセイ(CSk)を指す指標であり、それ故に革新的な方法においては1からnに至る。それぞれの触媒システムは、別々のマイクロチャネル構造で使用され、これは、kはまたその中で触媒システムCSkが使用されるマイクロチャネル構造を指す指標であることを意味する。
mは<2であり、そして方法で利用されるそれぞれの触媒システムの成分数である。
i) nは>2の整数であり、そしてそれぞれのマイクロチャネル構造が下流方向に
(a)少なくとも一つの注入口を持つ入口配列IAk;
(b)触媒システムCSkの固定化成分Cimを含む触媒マイクロキャビティーMC1k;
および
(c)検出ゾーン(DZk);
を含む、少なくともn個、好ましくはn個以上、の本質的に同一なマイクロチャネル構造を含む、マイクロ流体デバイスを提供すること;
ii) それぞれのCS1,CS2....CSnの残存する成分を、それぞれ、MC11,MC12....MC1nへ、
a)C1 imを除いてC1 1,C1 2....C1 mをIA1へ;
C2 imを除いてC2 1,C2 2....C2 mをIA2へ;
Cn imを除いてCn 1,Cn 2....Cn mをIAnへ分注すること;および
b)CS1の分注された成分をMC11へ;
CS2をMC12へ;
....CSnをMC1nへ輸送すること;
により分配すること;
iii) それぞれの触媒システムの成分をそれぞれのMC11、MC12....MC1nの中でインキュベートすること;
iv) 工程(iii)で生成した生産物を、DZは対応するMC1と合致しないという条件で、MC11、MC12....MC1nから下流に、それぞれ、DZ1、DZ2....DZnへ輸送すること;
v) それぞれ、DZ1、DZ2....DZnにおけるそれぞれの触媒システムCS1,CS2....CSnの反応の結果を測定して、そして特性化すること;および
vi) 工程(v)の結果からAn1,An2....Annの非特性化側面をそれぞれのマイクロチャネル構造について特性化すること;
の工程より成ることを特徴とする。
固定化された成分Cim kは一つ、二つもしくはそれ以上の異なる分子要素を含み得る。
触媒システム(CS)は、生体触媒システム、例えば、活性タンパク質およびその合成変異体に基づく酵素システム、を主として意図する。特異的にデザインされたものは、例えば、合成変異体として使用され得る。触媒システムの成分を、触媒、基質、補基質、補因子、補触媒、阻害剤、促進剤、活性化剤等で例示することができる。酵素システムについては、これは、酵素、基質、補基質、補酵素、補因子等に対応する。触媒システムにおける成分の数(m)は、異なるシステムの間で変わり、そしてまた革命的方法で何が特性化されるかに依存して変わり得る。整数のmは少なくとも2であるが、また3、4、5、6等であり得る。大抵の場合には、それは、6以下のように、10以下である。
個別のマイクロチャネル構造内での反応物の輸送は、デバイスの中もしくは外のどちらかに存在する特異な手段により駆動され得る液流による。かくして、液流は、電気浸透、マイクロポンプ、拡張ガス等により創造され得る。もう一つの代法は、毛管力および/もしくは液体を駆動するための遠心力を含む慣性力のような力、即ち、マイクロ流体デバイスの上でいかなる手段を必要としない力、を使用することである。
μl−容積およびより小容積のための外部分注手段は典型的に、注射筒ポンプ、インク・ジェット型分注器、ピンもしくは注射針を利用する。流通形の適当なインク・ジェット型分注器は、US 6,192,768(Gyros AB)に記載されている。PCT/SE02/01888(Gyros AB)をまた参照されたい。ピンおよび注射針を利用するシステムは、US 5,957,167(Pharmacopea)およびWO 01/19518(Aclara)に記載されている。
この工程はMC1中で起こる。インキュベーションは、1秒から10時間までの間隔内に典型的に実施されるが、また数日および数週間、例えば10週間まで、であり得る。典型的にインキュベーションは室温においてであるが、また他の温度が、温度サイクルをまた含んで、使用され得る。魅力的な加熱方式は、WO 02/41997(Gyros AB)およびWO 02/41998(Gyros AB)に記載されるように、パターン化加熱区域を利用する。加熱は、例えば、光のような照射の吸収により、電気等により、パターン化区域中で創造される。
マイクロ流体デバイスは異なる幾何学的形を持ち得る。我々の好ましいデバイスは、pが、2および∞の間の整数、好ましくは6、7、8およびそれより大、例えば∞、である、p−数個の対称軸(Cp)を有し、そして/もしくはディスクの形状にある。ディスクの形状のデバイスは典型的に、従来のCD版に似たサイズおよび/もしくは形状、即ち、従来のCD−半径の10%から300%までの幅での半径を持つ円形ディスクと同じ範囲にあるサイズ、を含む。円形以外のディスク形状、例えば、四角のような角形、ならびに卵形、ヌードル形状形等がまた可能である。ディスクについては、言及した対称軸は、ディスクの面に典型的に直角である。円形、円筒形、球状、円錐形等の対称を持つデバイスは、C∞−数の対称軸を持つデバイスの例である。
a)少なくとも一つの注入口を持つ入口配列IA,
b)その一つがCimであるn成分(C1,C2....Cn)を有する触媒システムCSの固定化成分Cimを含む、触媒マイクロキャビティー、および
c)検出ゾーン(DZ)
を含む、流路である。
上で考察したように、マイクロチャネル構造のMC1中のCimは、触媒システムの一つもしくはそれ以上の異なる分子要素もしくは成分を含み得る。
適当な入口配列は、WO 02/074438(Gyros AB)、WO 02/075775(Gyros AB)、WO 98/58245(Gyros AB)、WO 01/87486(Gamera)等に記載されている。また図1aおよびbを参照されたい。
a)数個のマイクロチャネル構造(1002)もしくは触媒マイクロキャビティー(MC1)(1016)に関連する注入口(1004)、および
b)マイクロチャネル構造/触媒マイクロキャビティー(MC1)当り一つの容積規定ユニット(1018)を含む、共通の分布マニホールド(1017)
を含む。
a)容積計量マイクロキャビティー;
b)オーバーフローマイクロチャネル;
c)液体用入口マイクロ導管;および
d)計量マイクロキャビティーの下部に弁機能を持つ出口マイクロ導管;
を含む。
オーバーフローマイクロチャネルは好ましくは、容積計量マイクロキャビティーの出口より低いレベルにおいて弁を有する。例えば、μl−範囲でおよび特にnl−範囲での、さらに小さい容積については、好ましくは、注入口および容積計量マイクロキャビティーへの入口の間に、例えば、オーバーフローマイクロチャネルとのその交差点のすぐ上流に、入口マイクロ導管中に抗吸上げ手段がある。抗吸上げ手段は、化学的表面特性(水性液体については疎水性表面切れ目)および/もしくは幾何学的表面特性(主としてぎざぎざ)の局所変化の形式であり得る。容積計量キャビティーは典型的に、入口マイクロ導管およびオーバーフローマイクロチャネルより大きい横断面区域(寸法)を有する。この種および抗吸上げ手段の適当なユニットはWO 02/074438(Gyros AB)のユニット7、11および12に記載される他のものの中にある。
触媒マイクロキャビティー(MC1)の幾何学的形およびサイズは、見出し“マイクロ流体デバイス”の下に上で概略された如くである。
a)MC1の内壁の表面;
b)MC1の内部を全体的にもしくは部分的に占める多孔性モノリスの内表面;
c)MC1内で床に充填される多孔性のもしくは非多孔性の粒子の集団;
であり得る。
多孔性モノリスとしては、多孔性プラグおよび膜が挙げられる。固相が粒子より成る場合には、MC1の下流末端に関与する保持手段があるべきである。そのような手段は、好ましくは、狭窄の形で、例えば、粒子がMC1から離れるのを防止する、物理的バリアーの形で、ある。次いで、粒子の直径/サイズは、狭窄における最大の開口部と本質的に同じサイズもしくはより大きくなければならない。もう一つの種類の保持手段は、磁気粒子を組合せた外部に適用された磁場である。
多孔性モノリスは、一片の材料の中に組み立て得るかもしくはお互いに付着した粒子より成り得る。
粒子は球状もしくは非球状であり得る。非球状の粒子については、直径およびサイズとは“流体力学的”直径を指す。
インキュベーション工程に続いて、反応混合液を工程(v)での測定を可能にする外部手段へのインターフェースを提供する、検出ゾーン(DZ)へ液流により輸送し得る。もしDZがMC1と重複するかもしくは合致するならば、DZの輸送は全く必要でない。
(a)リガンドおよび結合されるべき要素が反対の電荷を有することを典型的に必要とする、静電気相互作用;
(b)リガンドおよび結合されるべき要素が疎水性基を含むことを典型的に必要とする、疎水性相互作用;
(c)リガンドおよび結合されるべき要素が電子受容および電子供与の基を、それぞれ、もしくは逆に、有することを典型的に必要とする、電子−供与受容相互作用;
(d)その中で相互作用が異なる種類の相互作用および/もしくは基の混合物に典型的に関与する、複雑な性格を持つ生体親和結合;
で例示されることができる。
MC2中の過剰の基質、生成物もしくは汚染物の捕獲は非流動もしくは流動条件下で起こり得る。
過剰の基質および/もしくは生成物の捕獲および放出は典型的に濃縮を意味する。濃度の増加は、例えば、101〜104のように、101〜106の幅で、>100の因子を持ってである。
質量分光測定原理は、表面からのエネルギー脱着イオン化(EDI)、マイクロチャネルの先端を介する電気スプレーイオン化(ESI)等を含み、そしてインターフェースは検出マイクロキャビティーの上に開口部を含むことを典型的に意味する。
マイクロ流体デバイスおよび質量分光計の間のインターフェースは、WO 02/075775(Gyros AB)およびWO 02/075776(Gyros AB)ならびにその中で引用された出版物に記載されている。
マイクロチャネル構造はまた、
(1)注入口を介して導入された液体アリコートからの異物および汚染物の分離;
(2)保持マイクロキャビティーMC2について記載されたように親和性のもしくは可逆的な共有付着を介して可溶性の固相に結合するより他の原理に従う可溶性成分の分離;
(3)例えば、反応マイクロキャビティーの上流に親和性複合体の形成のための、混合;
ならびに
(4)例えば、MC1の上流で元の試料を加工するための、またはMC1の下流で基質および/もしくは生成物をさらに加工するための、さらに別の触媒反応;
を可能にする別のもしくは組合せた機能ユニットを含み得る。
異物の分離のためのユニットは、容積規定ユニットの上流に典型的に位置するか、もしくは二つのユニットが共通ユニットに組合される。
可溶性成分の分離のためのユニットは、上の2項で規定されるように、サイズ排除分離媒体を含有する保持マイクロキャビティーであり得る。
a)機械的ミキサー(例えば、WO 97/21090、Gamera);
b)二つの流入する液流によりマイクロキャビティー中に乱流の創造(例えば、WO 98/53311、Gamera);
c)マイクロチャネルの中心および壁との間の流速の差(WO 02/074438、Gyros AB)等による、マイクロ導管中での輸送の間の拡散による、マイクロ導管の入口末端中にラミナーフローならびに攪拌の創造(例えば、US 5,637,469、Wilding & Kricka);
に基づき得る。
遠心基礎システムで有利である分離ユニットおよび混合ユニットはWO 02/074438(Gyros AB)に記されている。他の変異体は、WO 02/074438(Gyros AB)に引用された出版物に記載されている。
ユニット1〜4の存在は、発明方法のプロトコルが、
・液体から異材の分離のための工程;
・共有結合もしくは親和性吸着以外の原理に基づく、可溶性材料の分離のための工程;
・異なる成分を含有する液体アリコートの予混合、希釈等を含む、混合工程、ならびに
・さらに別の触媒反応を実施するためのインキュベーション工程;
から選択される少なくとも一つのさらに別の工程を含み得ることを意味する。
混合工程は、もしあれば、容積計量工程の典型的に下流にあって、例えば触媒マイクロキャビティーMC1の中で、触媒反応工程に先行する。
弁の二つの範疇は:
1.弁機能の位置においてマイクロチャネル中の移動可能な機械的部分に基づく、機械的弁、
2.下記で規定するような内部弁
である。
機械的弁は典型的に、機械的部分(能動的弁)によりマイクロ導管を物理的に開閉することを含む。
(a)材質へのエネルギー入力(能動的弁)を変更することにより弁位置でのマイクロ導管中で横断面区域の変化。刺激反応高分子を利用する、WO 01/02737(Gyros AB)、ならびに非平衡高分子構造および融解可能なワックスプラグの緩和を示唆する、WO 97/21090(Gamera)を参照されたい。
(b)通過‐流動液体アリコートおよび弁位置でのマイクロ導管(毛管のもしくは受動弁)の内部表面の間の相互作用エネルギーの局所的増加。弁でのマイクロチャネルは、たとえ液体が通過し得ない(停止された)としても、開かれる。通過流動は、液体の駆動力を増加することにより簡単に達成される。チャネル中で表面湿潤性の局部的増加は弁として作用するであろうことを記載する、WO 99/58245(Gyros AB)およびWO 01/85602(Gyros AB)ならびにマイクロチャネルの側方寸法の急な増加に基づく受動弁を記載する、WO 96/15576(David Sanoff Res Inst)、EP 305210(Biotrack)、WO 98/07019(Gamera)を参照されたい。
に基づき得る。
吸収することは、液体輸送がマイクロチャネルの二つの内壁の間の交差点として規定される端で開始されることを意味する。吸収することは、もしマイクロキャビティーに直接連結された長さが伸びる端を有するマイクロチャネルがあるならば、長期間の間に望ましいマイクロキャビティー中に規定された微容積の液体を保持することを困難にする。もしマイクロチャネルが、例えば注入口を介して、外気に連結されるならば、吸収することは、予め分注された液体容積の蒸発および不可逆的損失を助長するであろう。一つのマイクロキャビティーから端における液体の潜動は吸上げと呼ばれる。吸上げを相殺する表面修飾(幾何学的なならびに化学的な)は抗吸上げ手段と呼ばれる。二つの長さが伸びる端の間の疎水性表面切れ目の形式の抗吸上げ手段は、WO 99/58245(Gyros AB)に以前に記載されている。WO 02/074438(Gyros AB)は、マイクロチャネルの長さが伸びる端の中で幾何学的なならびに化学的な表面特色の変化の組み合わせを利用する改良された抗吸上げ手段を発表する。変化は典型的に局所的である。水性液体については、マイクロチャネルの表面は本質的に親水性であり、そして圧入の形式での幾何学的な表面特色の変化は、疎水性もしくは非湿潤性への化学的な表面特色の変化である。両方の種類の変化は、主として端に位置すべきである。化学的な表面特色の変化の形式での受動性弁は、抗吸上げ手段としてまた作用するであろう。
これらの図は、液体輸送に遠心力、即ち、スピニング、を利用する円形デバイスの好ましい実施態様を図示する。液体は主として水性である。マイクロチャネル構造のそれぞれは、単に検出マイクロキャビティー(MC3)として、または組合せた保持/検出マイクロキャビティー(MC2/MC3)もしくは組合せた触媒/保持/検出マイクロキャビティー(MC1/MC2/MC3)として使用され得る、排出口を有する。排出口(MS‐口)をMALDI質量分光計とインターフェースすることができる。WO 02/075775(Gyros AB)およびまた下の実験の部を参照されたい。
構造の中に液体を指向するための局所的疎水性表面切れ目(1030、1031、直角)は、入口開口部(1007、1008)に存在する。
疎水性表面切れ目(1026、1027、1030、1031)は、上部基板(蓋)が開放型でマイクロチャネル構造を含む底部基板の表面へ積層された前に取り付けられた。疎水性表面切れ目(1032)は、積層および金スパッタリングの後で取り付けられた。
蓋の中の開口部(10011、1012)は、校正物質のための校正区域である。円形内の表面は底部の最上部である。それらの一つ(1012)は、MS‐口(1006)の広げ溝(1022)を模倣する凹み(1033)を含む。
マイクロチャネル構造の深度は入口開口部(1007、1008)から二重の深部(1021)まで同じ(100μm)でかつ一定である。
共通の注入口(1004)を通じる容積規定ユニット(1018)を含む分布マニホールド(1017)の充填はもっぱら毛管力による。
方法および機器
マイクロ流体デバイスを取り扱うための機器
実験を実施するための機器は、CDマイクロラボラトリ−(Gyrolab Workstation, Gyros AB, Uppsala、スウェーデン)であった。この機器は、応用‐特異的ソフトウエアーにより制御された完全に自動化されたロボットシステムである。試料もしくは試薬を含有するマイクロプレートは、システム内でカローセルの中に保存される。高精度ロボットが試料をマイクロプレートもしくは容器からCDの微小世界の中に移入する。CDは、試料および試薬の添加のためにスピニングステーションへ移動される。ソフトウエアー内の応用‐特異的方法は、精密に制御された速度でスピニングを制御し、応用が進むにつれて、マイクロ構造を通る液体の移動を制御する。CDは、分析および同定のためにMALDI質量分光計へ移入される。
一般的な配置は、個別のマイクロチャネル構造が図2で概略されたことを除けば、図1のディスクと本質的に同じである。ディスクは、そこでは覆われていない構造がプラスチック材料(Zenor[登録商標])を成形することにより複製されてきた、底部基板から構築された。構造を覆うためにWO 01/54810(Gyros AB)に従う蓋を熱積層化することに先立って、マイクロ構造を含有する表面がO2−プラズマ化されていた(WO 00/56808、Gyros AB)。
トリプシン(Sigma, St. Louis, MO、TRCK処理されていない)を、マイクロチャネル構造の内壁の上に固定化した。トリプシンの重炭酸アンモニウム緩衝液(50mM、pH7.8)中の溶液(7mg/ml)をマイクロチャネル構造の非共通入口(2005)の中に注入して、触媒マイクロキャビティー(500nl)(MC1)(2016)の中へ通過させた。トリプシンを、室温で30分間溶液で満たした容積(2016)の表面に吸着させた。引き続いて、トリプシン溶液を注入口(2005)に真空を充てることにより除去し、そして構造を3容量の重炭酸アンモニウム緩衝液ですすぎ洗いした。対照として、裸のO2−プラズマ処理したマイクロ構造を研究した。
カゼインBodipy[登録商標] TR−Xの原液(1mg/ml)(Molecular Probes, Portland, OR)を重炭酸ナトリウム緩衝液pH8.3)中に溶解した。基質を重炭酸アンモニウム緩衝液(50mM、pH7.8)中で10および100μg/mlに希釈して、トリプシンで被膜したおよび裸のO2−プラズマで処理したマイクロチャネル構造(2016)へ注入した。
マイクロキャビティー(2016)の中のカゼインBodipy TR−Xのトリプシン消化を、Texas Redフィルター(励起:530〜585nm;発光:605〜680nm)を装備した蛍光顕微鏡(Nikon Eclipse TE300)を使用して検出した。顕微鏡を、水銀ランプ、励起および発光フィルター、拡大レンズならびに検出用CCDカメラで装備した。発光した光を入射励起光(エピ蛍光)と同じ側のディスクから測定した。かくして、発光した光をディスクの底部から測定した。シャッタースピードを全ての露出で2秒にセットした。画像分析のために、ソフトウエアーMeta Morphを使用した。
ウシ血清アルブミン(BSA)(Sigma, St. Louis, MO;99%;A−0281)(10nmol)を重炭酸アンモニウム緩衝液(980μl、50mM)中に溶解した。ジチオトレイトール(10μl、45mM)を加えて、溶液を50℃で15分間インキュベートした。ヨードアセタミド(10μl、100mM)を加えて、混合液を室温で15分間インキュベートした。還元化およびアルキル化されたBSAを含有する得られた溶液を、図2のマイクロチャネル構造で実施された消化実験のために適切な濃度に引き続いて希釈した。
Source 15−RPC粒子のナノカラム(2019)を二重の深部(2021)に対してマイクロチャネル構造の中に充填した。粒子を30〜40%EtOHの中に懸濁し、そして共通投入口を介して負荷して、出口マイクロ導管(2020)の下部の二重の深部(2021)に対して下部(2019)へマニホールド(2017)を介して分布した。カラムをベンチトップ遠心分離機を使用して充填した。負荷用チャネルおよび充填されたカラムを30〜40%EtOH溶液ですすぎ洗いした。カラムを共通チャネルを通して洗浄して、50%(v/v)アセトニトリルおよび0.1%(v/v)トリフルオロ酢酸(TFA)で平衡化した。詳細な試料負荷手順および使用されたスピン配列は付録1に記されている。ペプチド質量をBruker MALDI−TOF二曲がり機器を使用して測定した。試料を、MALDIイオン源の中に導入されたマイクロ流体デバイスの上で直接に分析した。
マイクロ流体構造のデザインおよびトリプシンの固定化
トリプシン消化を実施するために用いたマイクロ流体構造を図2に示す。蓋をかぶせる前に表面の酸素プラズマ処理は、毛管力をマイクロ構造の中への迅速かつ効果的な試料の導入に使用するように強要させる。しかしながら、この処置は、中性および塩基性条件において正味の負電荷を保持する表面を創造する。この性質は、大抵の応用で抑制されるべきである、非特異的タンパク質吸着に表面を受けやすくする。我々は、プラズマ処理した表面の荷電した性質を代りに、中性および塩基性条件において正味の正電荷を保有するトリプシン分子のような荷電した成分を付着させるために活用し得ると仮定した。プラズマ処理したマイクロ構造のトリプシン被膜はかくして,CDの中に触媒的に活性な表面の導入のために便利な一工程手順を可能にして、同時に表面のタンパク質結合能を飽和させて、表面への非特異的吸着に因る試料の減少した損失の危険性に至る。
マイクロチャネル構造の中で保持された触媒機能と共に成功裏に我々がトリプシンを固定化してきたかを決定するために、我々は蛍光体で標識化したカゼイン基質を用いた。カゼインBodipy TR−Xを赤色蛍光性BODIPY TR−X染料で標識化して、結合体の蛍光のほとんど全体の消失をもたらす。トリプシン媒触の加水分解はこの消失を解除して、明るい赤色蛍光性ペプチドを生成する。マイクロチャネル構造中でのトリプシン消化を蛍光顕微鏡を使用して検出した。トリプシンで被膜した構造は、酸素プラズマ処理の参照構造に比較して、顕著な酵素活性を示した。消化実験を異なる基質濃度で実施した(表1)。より低い基質濃度(10μg/ml)では、弱いが顕著なシグナルがバックグラウンドの上に検出された。トリプシンで被膜したマイクロ構造中で記録されたシグナルは、消化を溶液中で過剰(3.5mg/ml)のトリプシンを持つ溶液の中で実施した、構造に比較してごくわずかに低いだけであった。
その中で内壁がO2−プラズマ処理されているだけの参照マイクロチャネル構造においては、本質的に何も蛍光が検出され得なかった。
マイクロ流体デバイス中で集中タンパク質消化を実施するための二つの代替技術溶液を検討した。
RPC床からのペプチドの溶出についてのさらなる詳細はWO 02/075775(Gyros AB)に記されている。
Claims (17)
- 複数の等しいもしくは異なる触媒システムCS1,CS2....CSnの、それぞれで、成分An1,An2....Ann(アナライト)の非特性化側面を特性化するための方法であって、
i) それぞれのマイクロチャネル構造が、下流方向に、
(a)少なくとも一つの注入口を持つ入口配列IA;
(b)マイクロチャネル構造の中で用いられる触媒システムCSの固定化成分Cim であって、非多孔性のもしくは多孔性の粒子の充填床であるマトリックスを含む固定化成分C im を含む、触媒マイクロキャビティーMC1;および
(c)I)吸着媒体を含む、保持マイクロキャビティーMC2、および、
II)MC2の下流にあって底部および壁が金膜を含む検出マイクロキャビティーMC3、
を含む、触媒マイクロキャビティーMC1と合致しない検出ゾーン(DZ);
を含む、複数(n)の本質的に同一なマイクロチャネル構造を含む、マイクロ流体デバイスを提供すること;
ii) マイクロチャネル構造の中で用いられるCSのC im 以外の成分をそれぞれのマイクロチャネル構造のMC1へ、
a)それぞれのマイクロチャネル構造の入口配列IAへ当該成分を分注すること;および
b)それぞれのマイクロチャネル構造の中のMC1に負荷するためにマイクロチャネル構造に対して対応する成分を並行して輸送すること
により分配すること;
iii) それぞれのマイクロチャネル構造のMC1の中で触媒反応を実施すること;
iv) 工程(iii)で生成した生産物をMC2中の吸着媒体に吸着させるために、該生産物をそれぞれのマイクロチャネル構造のMC1からMC2へ並行して輸送すること;
v)吸着させた生産物をMC2から並行して溶出し、それぞれのマイクロチャネル構造中のMC3に該生産物を輸送すること;
vi) それぞれのマイクロチャネル構造について、MC3において、MC1の中で実施された触媒反応の結果を検出して、そして特性化すること;および
vii) 工程(vi)の結果からAn1,An2....Annの非特性化側面をそれぞれのマイクロチャネル構造について特性化すること;
の工程より成ることを特徴とする、方法。 - マイクロ流体デバイスがプラスチック材料で作製されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 請求項1〜2のいずれか1項に記載の方法であって、触媒システムが生体触媒システムの中から例えばa)少なくとも一つの成分がタンパク質および/もしくはタンパク質酵素を模倣する合成変異体である酵素システム、ならびに/またはb)ポリヌクレオチド基礎の触媒システムの中から選択されることを特徴とする、方法。
- 触媒システムが酵素システムであることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法であって、触媒システムが加水分解酵素(エステラーゼ、炭水化物分解酵素、プロテアーゼ等)、ホスホリラーゼ、酸化還元酵素(脱水素酵素、酸化酵素等)、転移酵素、脱炭酸酵素、加水酵素、異性化酵素等の中から選択される酵素システムであることを特徴とする、方法。
- 固定化成分C im が触媒、基質、補基質、補触媒、補因子、補触媒等から選択されることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法であって、MC3がMC1の中で起こる触媒反応の結果の分光分析を許容するインターフェースを含むことおよび工程(vi)が触媒反応の結果を反映するスペクトルをMC3の中で記録することを含むことを特徴とする、方法。
- 請求項7に記載の方法であって、インターフェースがMC1の中での触媒反応の結果の質量分光分析を許容することおよび工程(vi)がMC3の中で生成物の質量スペクトルを記録することを含むことを特徴とする、方法。
- 請求項7に記載の方法であって、インターフェースが触媒反応の結果の分光光度分析を許容することおよび工程(vi)が触媒反応の結果を反映する分光光度スペクトルの関連部分を、特に蛍光もしくは化学ルミネセンスとして、記録することを含むことを特徴とする、方法。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法であって、
a)CSの成分の一つが蛍光性または蛍光原性である、または発光性または発光原性である、基質であり、そして
b)MC3は触媒生成物もしくは基質の中で蛍光またはルミネセンスの増減を検出するためのインターフェースを含み、ならびに
c)工程(vi)が反応生成物および/もしくは基質からの蛍光またはルミネセンスを記録することを含む
ことを特徴とする、方法。 - 請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法であって、マイクロキャビティー、特にMC1、MC2およびMC3の少なくとも一つへ、もしくはそれから通ずるマイクロ導管が抗吸上げ手段を含むことを特徴とする、方法。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法であって、水性液体がマイクロチャネル構造内で成分を輸送するために使用されることおよび内壁がこの液体に湿潤性であることを特徴とする、方法。
- マイクロチャネル構造の内部表面の水接触角が、使用温度において、<50°もしくは<30°であることを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- 請求項12〜13のいずれか1項に記載の方法であって、デバイスが対称軸を有することおよびそれぞれのマイクロチャネル構造の少なくとも一部における液体輸送がその対称軸の周りでデバイスを回転することにより創造される遠心力により駆動されることを特徴とする、方法。
- デバイスがディスクの形状であって、そして、もし存在すれば、当該対称軸がディスクの面に垂直であることを特徴とする、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法であって、触媒マイクロキャビティーの出口にならびに/またはもし保持マイクロキャビティーおよび/もしくは検出マイクロキャビティーが存在すればこれらのマイクロキャビティーのそれぞれの出口にまた関連して受動弁があることを特徴とする、方法。
- MC1、MC2およびMC3の少なくとも一つがnl範囲の容積を有することを特徴とする、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
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