JP4891256B2 - ケト酸が存在する状態での酵素反応 - Google Patents

Description

発明の分野
この発明は、ある特定の反応強化化合物が存在する状態でＸ−ＧｌｙをＸ−α−ヒドロキシ−ＧｌｙまたはＸ−ＮＨ₂（Ｘは、ペプチド、またはグリシン基が共有結合され得るカルボニル基を有する任意の化学的化合物である）に酵素変換することに関する。好ましい実施の形態では、これらの反応強化化合物はケト酸（またはその塩類またはそのエステル）であり、ケト酸は、アミド化反応などのこれらのタイプの先行技術の酵素反応の典型的な成分であるカタラーゼの代わりに有益に使用され得る。

関連技術の説明
多数の人間のホルモン、成長因子、サイトカイン、神経伝達物質によって誘導体化された脂肪酸、および他の重要な生体化合物は、それらの分子構造の実質的な部分としてアミノ酸またはペプチドを有する。多くの疾病は、患者の中のこれらの生体化合物のレベルを上げることに陽性の反応を示す。治療上有効な量のこのような生物学的に関連がある化合物は様々な方法で患者に投与され得る。したがって、このような化合物のための効率的な、費用対効果の高い製造プロセスが非常に重要である。これは、投与の他のモードと比べて生物学的利用能がより低いにもかかわらず通常は投与の好ましいモードである経口デリバリ用に生体化合物を剤形で調製するときには、特に当てはまる。

哺乳類細胞および他の真核生物はある特定の翻訳後プロセシング手順を行なうことができるのに対して、原核生物はできない。大腸菌（E.coli）などのある特定の原核生物は、組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）技術による哺乳類タンパク質の生成のための宿主として広く利用される。なぜなら、回分発酵手順で容易にそれらを育てることができるためであり、それらは遺伝学的によく特徴づけられるためである。しかしながら、多くの哺乳類タンパク質には何らかのタイプの翻訳後プロセシングが必要である。これらのタンパク質がたとえば大腸菌の遺伝子操作によって生成される場合、大規模生成の用途では法外な費用がかかる複雑な、生体外での化学的手順を使用して、翻訳後プロセシングを遂行しなければならないことが多い。哺乳類宿主を使用してペプチドが組換えによって生成されるときでさえ、すぐ後にさらなる修飾を被る前駆体を効率的に生成することがしばしば望ましい。

このようなさらなるプロセシング行為の一タイプは、ペプチドまたはタンパク質のカルボキシ末端アミノ酸の特有のアミド化を伴う。多くの天然ホルモンおよびペプチドがこのような修飾を含んでおり、このような修飾は、タンパク質が生物学的に活性であるようにする場合には不可欠であることが多い。例はカルシトニンであり、元の形のアミド化されたプロリンの代わりにアミド化されていないプロリン残基を用いることによって、生物活性が非常に大幅に低減される結果となる。十分な活性を得るために翻訳後アミド化を必要とする他の生物学的ペプチドは、成長ホルモン放出因子、他のカルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、セクレチン、ペプチドＹＹなどを含むが、それらに限定されない。

タンパク質のカルボキシ末端アミノ酸の特有のアミド化は頻繁に、α−アミド化酵素によって触媒作用を受ける。最大の効力を得るためにアミド化を必要とする多くの重要な生物学的タンパク質のためのポリペプチド配列は、たとえば遺伝子操作技術によって製造され得る。しかしながら、重要で、時には不可欠なカルボキシ末端アミド化はしばしば生体外で行なわれなければならない。高価で扱いにくい化学的なアミド化技術をこの時点で回避することが望ましく、したがってアミド化酵素を利用して特有のアミド化を行なうこと
が望ましい。

ペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼ（peptidylglycineα-amidating monooxygenase）（ＰＡＭ）は、アミド化されたペプチド生成物へのペプチド基質の変換に触媒作用を及ぼす。その変換は二段階反応である。ＰＡＭは２つの触媒ドメインを有する。２つの触媒ドメインとは、ステップ１（中間体への基質の変換）に触媒作用を及ぼすペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼ（peptidylglycineα-hydroxylating monooxygenase）（ＰＨＭ）およびステップ２（生成物への中間体の変換）に触媒作用を及ぼすペプチジルグリシンα−ヒドロキシグリシンα−アミド化リアーゼ（peptidylglycineα-hydroxyglycineα-amidating lyase）（ＰＡＬ）である。フルレングスのＰＡＭは両方のステップに触媒作用を及ぼす。

自然界において、ペプチドホルモンおよび神経伝達物質の約５０％は先の態様でＰＡＭによってアミド化される。ＰＡＭ活性は多数の多様な種において認識されており、ラット、雌牛およびカエルと同様に多様な種の中で著しい構造的相同性を有する傾向がある。ＰＡＭの官能基、基質および補助因子は種全体にわたって類似している（頻繁に同一である）ことも公知である。基質は化合物であり、遊離型のカルボキシル基を備えたグリシン残基を有するペプチドであることが多い。ＰＡＭ触媒アミド化反応は、当該技術分野において周知である。たとえば、米国特許第６，１０３，４９５号に詳細に記載されるものであり、そこでは、ペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼは、そのＣ末端でアミド化される（すなわち、前駆体のＣ末端グリシンの代わりにアミノ基を有する）本物のサケカルシトニンへのグリシン増量サケカルシトニン前駆体の変換に触媒作用を及ぼすために使用される。

ＰＡＭの活性は、酵素が不活性化されるために、アミド化反応中に急速に減少する。このような不活性化を防ぐために、先行技術の酵素アミド化反応は典型的には、優れた変換および反応収率を得るために第２の酵素（たとえば、カタラーゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）を必要とする。しかしながら、これはプロセスのコストおよび効率にマイナスの影響を及ぼし、規制の観点からも望ましくない。たとえば、カタラーゼは、精製が困難であり、かつアミド化反応中に生成物、前駆体および／または酵素のうちのいずれかを攻撃し得る望ましくないプロテアーゼによって汚染される可能性がある巨大タンパク質である。カタラーゼで共同精製するタンパク質は、医薬品の場合には規制水準を越えて最終生成物を汚染する可能性もある。さらに、カタラーゼが動物性であるとき、または動物性成分がカタラーゼの製造に使用されるときには、伝染性の海綿状脳症を回避するために特別に注意しなければならない。

発明の概要
したがって、この発明の目的は、先行技術と比べてカタラーゼまたは他の酵素スカベンジャを実質的に低減でき、好ましくは全く無くすことができる、効率的で、収率が高く、低コストの酵素アミド化反応を提供することである。別の目的は、先の反応方法に従って製造されるアミド化された生体化合物を提供することである。

一局面では、この発明はアミド化された生成物の生体外での生成のための方法を提供し、上記方法は、（Ａ）ペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼおよび（Ｂ）α−ケト酸またはその塩またはそのエステルである反応強化化合物が存在する状態で、遊離酸の形でカルボニル基に結合されるグリシン残基を有する前駆体を反応させることを備え、上記α−ケト酸は分子構造ＲＣ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）ＯＨを有し、Ｒは、アリール、Ｃ１−
Ｃ４炭化水素部分、ハロゲン化またはヒドロキシル化されたＣ１−Ｃ４炭化水素部分、およびＣ１−Ｃ４カルボン酸からなる群から選択される。

別の局面では、この発明はアミド化された生成物の生体外での生成のための方法を提供し、上記方法は、（ｉ）ペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼおよび（ｉｉ）α−ケト酸またはその塩またはそのエステルである反応強化化合物が存在する状態で、遊離酸の形でカルボニル基に結合されるグリシン残基を有する前駆体を反応させることによって、ヒドロキシル化された中間体を形成することを備え、上記α−ケト酸は分子構造ＲＣ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）ＯＨを有し、Ｒは、アリール、Ｃ１−Ｃ４炭化水素部分、ハロゲン化またはヒドロキシル化されたＣ１−Ｃ４炭化水素部分、およびＣ１−Ｃ４カルボン酸からなる群から選択され、上記方法はさらに、ルイス塩基またはペプチジルα−ヒドロキシグリシンα−アミド化リアーゼのいずれかが存在する状態で上記中間体を同時にまたは続いて反応させることを備える。

別の実施の形態では、この発明はペプチド製薬剤の生物学的利用能を高めるための方法を提供し、上記薬剤は自然にアミド化されない部位でアミド化され、上記非自然的なアミド化は、（Ａ）ペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼおよび（Ｂ）α−ケト酸またはその塩またはそのエステルである反応強化化合物が存在する状態で、アミド化が所望である位置において、遊離酸の形でグリシン残基を有する前駆体を反応させることによって遂行され、上記α−ケト酸は分子構造ＲＣ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）ＯＨを有し、Ｒは、アリール、Ｃ１−Ｃ４炭化水素部分、ハロゲン化またはヒドロキシル化されたＣ１−Ｃ４炭化水素部分、およびＣ１−Ｃ４カルボン酸からなる群から選択される。

別の局面では、この発明はペプチド製薬剤の生物学的利用能を高めるための方法を提供し、上記薬剤は自然にアミド化されない部位でアミド化され、上記非自然的なアミド化は、（Ａ）（ｉ）ペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼおよび（ｉｉ）α−ケト酸またはその塩またはそのエステルである反応強化化合物が存在する状態で、アミド化が所望である位置において、遊離酸の形でカルボニル基に結合されるグリシン残基を有する前駆体を反応させることによって遂行され、上記α−ケト酸は分子構造ＲＣ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）ＯＨを有し、Ｒは、アリール、Ｃ１−Ｃ４炭化水素部分、ハロゲン化またはヒドロキシル化されたＣ１−Ｃ４炭化水素部分、およびＣ１−Ｃ４カルボン酸からなる群から選択され、したがってヒドロキシル化された中間体を形成し、上記非自然的なアミド化はさらに、（Ｂ）ルイス塩基またはペプチジルα−ヒドロキシグリシンα−アミド化リアーゼのいずれかで上記中間体を同時にまたは続いて反応させることによって遂行される。

上の方法の一実施の形態では、反応強化化合物はα−ケト酸塩である。別の実施の形態では、反応強化化合物はα−ケト酸エステルである。さらに別の実施の形態では、反応強化化合物はα−ケト酸である。

一実施の形態では、（反応強化化合物の分子構造中の）Ｒはアリール（好ましくはフェニル）である。別の実施の形態では、ＲはＣ１−Ｃ４炭化水素、好ましくはＣ１−Ｃ４アルキルである。直鎖状Ｒ基は、対応する分枝鎖状Ｒ基よりもわずかに有効であるだろう。

この発明は、本明細書に記載される方法のいずれかに従って調製された、アミド化された生成物も提供する。

発明の詳細な説明
この発明は、アミド基を有することが望ましいいかなる化合物の製造にも適用可能であ
る。本明細書に記載される酵素がグリシン残基を有するペプチドを認識するので、それらが非天然もしくは修飾アミノ酸、または保護基などのアミノ酸誘導体を他の部位に含むより大きな分子の一部であるときでさえ、この発明はこのような構造のアミド化に有用である。本明細書において利用される酵素によって認識できるグリシンがある限り、分子構造の一部として非ペプチド領域を有する化合物でさえもこの発明から利益を得るはずである。

本明細書における反応に触媒作用を及ぼす酵素は、遊離酸の形であり（すなわち、遊離型のカルボキシル基を有し）かつカルボニル基に結合されるグリシン残基を有するいかなる前駆体基質も認識すると考えられている。たとえば、マークラー（Merkler）らのアーカイブズ・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Archives of Biochemistry and Biophysics）１９６６年、第３３０巻、Ｎｏ．２、４３０−４３４（グリシン増量脂肪酸基質）および米国特許第６，１０３，４９５号（サケカルシトニンへのアミド化のために基質として使用される、天然サケカルシトニンの中でアミド形成アミノ基の位置にＣ末端グリシンを備えるサケカルシトニン）を参照されたい。したがって、本明細書に記載されるアミド化酵素を利用するいかなる基質のいかなる酵素アミド化も、先行技術のカタラーゼ（または除去酵素などの先行技術の他の反応強化化合物）の代用品でその酵素アミド化を強化するこの発明から利益を得ることができると期待される。同じことはＰＨＭ触媒反応に当てはまるはずであり、ＰＨＭはＰＡＭの機能ドメインのうちの１つである。

天然ホルモンおよび神経伝達物質だけでなく、薬剤活性トランケート（truncate）およびその修飾物、または誘導体化された脂肪酸も含む多数の製薬剤があり、それらは、アミド化されるとき、より生物学的に活性である。生物活性が必ずしも増大しないときでさえ、製薬剤をアミド化することによって、遊離酸の形でその薬剤を利用することと比べて経口生物学的利用能は望ましく増加し得る。２００４年１０月７日に公開された米国特許公開番号第２００４０１９７３２３号（メータ（Mehta）らによる米国特許出願連続番号第１０／７６１，４８１号の公開）を参照されたい。その開示は、引用によって本明細書に援用される。当業者は、本明細書において教示されるペプチドまたは他の化合物をアミド化するための他の理由を理解できる。この発明は、基質がＰＡＭまたはＰＨＭによって認識される基質である限り、選択された生成物または基質にかかわらず、ＰＡＭ触媒反応およびＰＨＭ触媒反応を強化すると考えられている。

ペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼ（ＰＡＭ）ならびにその２つの触媒ドメイン、すなわちペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼ（ＰＨＭ）およびペプチジルグリシンα−ヒドロキシグリシンα−アミド化リアーゼ（ＰＡＬ）が本明細書において報告される。当該技術分野は、好ましい反応条件、補助因子なども報告している。アミド化およびアミド化された生成物の精製の１つの特定の例が、本明細書において報告される。この発明の主要な改善点は、先行技術のアミド化で一般に使用されるカタラーゼをここである特定のα−ケト酸（またはその塩類またはそのエステル）と置替えることができるというものである。

理論に制約されることを意図せずに、本明細書に記載される酵素反応は、酵素反応および／または復元可能な生成物の収率にマイナスの影響を及ぼし得る副生成物として過酸化水素を望ましくなく生成すると考えられている。先行技術では、形成されるいかなる過酸化水素のマイナスの影響も最小限にするように、カタラーゼが過酸化物スカベンジャの役割を果たしたかもしれないと考えられている。

やはり理論に制約されることを意図せずに、この発明のα―ケト酸（またはその塩類またはそのエステル）は、カタラーゼまたは他の除去酵素の必要なく過酸化物スカベンジャ
のその役割を事実上演じると考えられている。たとえば、α―ケト酸は以下の態様で過酸化水素と反応し得るであろうと考えられている。

Ｒ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ＋Ｈ₂Ｏ₂→Ｒ Ｃ（Ｏ）ＯＨ＋ＣＯ_2＋Ｈ₂Ｏ
ピルビン酸がα−ケト酸として使用されるとき、ピルビン酸は過酸化水素と反応して、酢酸、水および二酸化炭素を生成すると仮定される。

Ｒ基がこの反応の際に変化しないので、多数のＲ部分が考えられる。出願人は、いくつかのケト酸（または対応するそのエステルまたはその塩類）を試験し、（ＰＴＨの最初の３１アミノ酸の後にＣ末端グリシンが続く）組換えヒト副甲状腺ホルモントランケートのアミド化についてのケト酸の効力を以下の表１で報告している。カタラーゼを使用するアミド化についても、表１への脚注で報告する。異なる濃度の反応強化ケト酸（またはその塩類またはそのエステル）が利用されるので、アミド化された生成物への変換は表１の中では直接に比較できない。好ましい濃度が、各化合物ごとに選択された。さらに、したがって、各化合物の性能がその対応する対照と比較されるように、表１における試験された化合物の各々に対して別個の対照が使用される。示されるように、試験された化合物のうち３つは対応する対照より性能が優れていなかった。表１の中で説明される対照値とは、この発明の反応強化化合物がない状態でのｒｈＰＴＨ（１−３１）Ｇｌｙ３２−ＯＨのアミド化の典型的な観測値である。

α−ケト酸／エステルでのアミド化反応
様々なケト酸（またはその塩類またはそのエステル）の効力を試験するために行なわれた反応の詳細のうちいくつかについて以下で説明する。

以下の表１における情報を確定するために、すべての試薬の原液を水溶液の状態で準備した。アミド化は以下の条件下で行なわれた。その条件とは、ｒｈＰＴＨ（１−３１）Ｇｌｙ３２−ＯＨを４ｍｇ／ｍＬ、２−モルホリノエタンスルホン酸（2-morpholinoethanesulfonic acid）（ＭＥＳ） ｐＨ［６．３−６．５］を３０ｍＭ、硫酸銅を０．５μＭ、ヨウ化カリウムを５ｍＭ、アスコルビン酸塩を２ｍＭ、［０−１％］エタノール、およびＰＡＭを１５，０００Ｕ／ｍＬである。すべての反応物は３７℃で４時間インキュベートした。ｒｈＰＴＨ（１−３１）Ｇｌｙ３２−ＯＨ、水、ＭＥＳ、ヨウ化カリウム、エタノール、硫酸銅、α−ケト酸またはエステル、アスコルビン酸塩、およびＰＡＭの順に試薬を加えた。すべての反応物を６％のトリフルオロ酢酸でｐＨ２．０に酸性化し、ＣＥＸ−ＨＰＬＣ（面積％）によって分析して、所望の生成物ｒｈＰＴＨ（１−３１）ＮＨ₂の構成を検出した。結果は、以下の表１のとおりであった。

表１に示されるように、α−ケト酸の塩類およびエステルは、対応するα−ケト酸と同様に機能する傾向があった。より大きなＲ基は、より小さなＲ基（Ｃ１−Ｃ４が好ましい）と同様に、芳香族基が電子求引位置に位置する時に十分に機能する傾向がある以外は機能しない傾向があった。直鎖状化合物は、対応する分枝状化合物よりも少しよく機能する傾向があった。炭化水素部分が、機能を著しく損なうことなくハロゲン化または水素化され得ることが期待される。示されるように、有効な化合物は相当によく機能し、したがって先行技術のカタラーゼの好適な選択肢であり、したがって上述のカタラーゼの欠点を回避する。

この発明に従って基質をアミド化し、結果として生じる生成物を精製するためのいくつかの詳細なプロセスステップについて以下で説明する。

実施例１：ペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼを使用する、アミド化された相当物への、グリシン増量副甲状腺ホルモンフラグメントの変換
ピルビン酸塩を使用するｒｈＰＴＨ（１−３４）Ｇｌｙ３５−ＯＨのアミド化
ｒｈＰＴＨ（１−３４）Ｇｌｙ３５−ＯＨのアミド化のために使用される成分および最終濃度が表２に示されている。アミド化について簡単に説明する。

・２５ｍＭ ＭＥＳ、２００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ６．０の１，９００ｍＬ中、約１２．４グラムのｒｈＰＴＨ（１−３４）Ｇｌｙ３５−ＯＨを、攪拌器およびガススパージャ付きのガラス容器の中に装填した。

・この溶液に以下の成分を列挙される順に加えた：水を３，０２５ｍＬ、２５０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．３を７４１ｍＬ、３ｍＭ 硫酸銅を１．０３ｍＬ、ヨウ化カリウムを１２４ｍＬ、１９０プルーフのエタノールを６２ｍＬ、４００ｍＭ ピルビン酸ナトリウムを１２４ｍＬ、および１００ｍＭ アスコルビン酸ナトリウムをｌ２４ｍＬ。

・反応容器を水浴の中に置き、かき混ぜることで反応混合物を２５〜２７℃に加熱した。

・２１ｍＬの２Ｍ ＨＣｌで反応混合物のｐＨを５．８まで調整した。酸素散布を開始した。反応混合物の過度の発泡を回避するために散布率を調整した。

・４７ｍＬのＰＡＭを加え、反応混合物は２５〜２７℃で４時間３５分インキュベートした（インキュベーション期間全体を通じて酸素散布を行なった）。

・７４ｍＬの２Ｍ ＨＣｌで反応混合物をｐＨ２．４に酸性化した。
ＰＡＭ酵素は、ミラー（Miller）らのＡＢＢ ２９８：３８０−３８８（１９９２）、米国特許第４，７０８，９３４号、ヨーロッパ公報第０ ３０８ ０６７号および第０ ３８２ ４０３号、ならびにバイオテクノロジー（Biotechnology）第ＩＩ巻（１９９３）６４−７０頁に記載されるように得られることができ、これらの開示は引用によって本明細書に援用される。ＰＡＭ酵素は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（Budapest Treaty on the International Recognition of Deposits of Microorganisms for Purposes of Patent Procedure）に準じて、米国２０１１０−２２
０９バージニア州マナッサス（Manassas）ユニバーシティ・ブルバード１０８０１のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（ＡＴＣＣ）にＡＴＣＣ受入れ番号ＰＴＡ−６７８４として寄託された、ＰＡＭ発現細胞株内部指定ＵＧＬ ７３−２６／Ｍ ＭＷＣＢ ００からも得られることができる。この寄託された細胞株は、この条約下で発布された規制を受け、試料はその時点で、この条約によって定められた条件下で、条約調印国の特許法および規制に従って、入手可能になる。たとえば、この出願またはその優先権を主張するもしくはこの出願を参照する他の米国出願に基づいて米国特許を発行する際、寄託された材料の入手可能性に対するすべての制約は、ブダペスト条約によってまたは米国特許法第１１２条によって定められた範囲で変更不可の形で排除されることになる。

グリシン増量前駆体は、米国特許第６，１０３，４９５号の実施例１〜２に記載されるものと似た態様で発酵によって生成されることができ、アミド化に先立って米国特許第６，１０３，４９５号の実施例３に記載されるように精製されることができる。グリシン増量前駆体は、米国特許公報Ｕ．Ｓ．２００５／０２２１４４２（米国出願番号第１１／０７６，２６０号）に従って生成されることもできる。先の開示は、引用によって本明細書に援用される。

アミド化のために使用される酵素がペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼ（ＰＨＭ）である場合には、ＰＡＭの代わりにＰＨＭを用いて、上述のものと同一の反応混合物が使用される。さらに、４時間から６時間のインキュベーション期間の終わりに、塩基を加えることによって反応混合物のｐＨを８から９の間にまで増やす。反応の終了に先立って、さらに４時間から８時間反応混合物を攪拌する。ＰＨＭは、（最初の４０ｋＤａに関して）ＰＡＭのＮ末端部だけを発現させることによって得られることができる。たとえばミズノ（Mizuno）らのＢＢＲＣ第１４８巻、Ｎｏ．２、５４６−５２頁（１９８７）を参照されたい。（ミズノの「ＡＥ １」に関連する）この開示は、引用によって本明細書に援用される。カエルの皮膚はＰＨＭを自然に発現させることが知られている。

実施例２：アミド化後の精製
陽イオン交換（cation exchange）（ＣＥＸ）クロマトグラフィ
残余のｒｈＰＴＨ（１−３４）Ｇｌｙ３５−ＯＨからｒｈＰＴＨ（１−３４）−ＮＨ₂を精製することは、ＣＥＸクロマトグラフィを使用して達成された。ＣＥＸクロマトグラフィ方法の簡単な説明が以下に記載される。酸性化されたアミド化産出物を９ｃｍ×１９ｃｍのトヨパール（Toyopearl） ＳＰ６５０Ｍ（東ソーバイオサイエンスＬＬＣ）カラムに充填し、２５ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．５で平衡化した。カラムを１８０ｃｍ／ｈｒで操作し、カラム流出液のＵＶ吸収度を２８０ｎｍでモニターした。カラム流出液ｐＨのｐＨが６．５に戻るまで、２５ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．５でカラムを洗浄した。洗浄ピークが完全に溶出され、安定したＵＶベースラインが達成されるまで、２５ｍＭ ＭＥＳ、８０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ６．５でカラムを洗浄した。２５ｍＭ ＭＥＳ、２００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ６．５で、生成物、すなわちｒＰＴＨ（１−３４）−ＮＨ₂をカラムから溶出した。全ＵＶピークを収集し、一部は、プーリングの基準を決定するためにＲＰ−ＨＰＬＣによって選別された。

逆相（reversed-phase）（ＲＰ）クロマトグラフィ
ＲＰクロマトグラフィは、ペプチドの塩の形態を塩化物から酢酸塩に交換するために利用された。ＲＰクロマトグラフィは、ペプチドの境界の精製をもたらす。ＣＥＸクロマトグラフィ産出物を、３容量の３３３ｍＭ 酢酸ナトリウムで希釈し、完全に混合した。混合物は、充填に先立って、７５分という室温に置く時間が与えられた。酢酸塩で希釈された試料を６ｃｍ×１７ｃｍのアンバークロム（Amberchrom） ＣＧ３００ Ｍ（東ソーバ
イオサイエンスＬＬＣ）カラムに充填し、２５０ｍＭ 酢酸ナトリウム ｐＨ７．５で平衡化した。カラムを１８０ｃｍ／ｈｒで操作し、カラム流出液のＵＶ吸収度を２８０ｎｍでモニターした。２５０ｍＭ 酢酸ナトリウム ｐＨ７．５でカラムを６０分間洗浄した。０．１％の酢酸中でカラムを平衡化した。０．１％の酢酸、４０％のエタノールで、生成物、すなわちｒｈＰＴＨ（１−３４）−ＮＨ₂をカラムから溶出した。全ＵＶピークを収集した。

ｒｈＰＴＨ（１−３４）−ＮＨ₂の特性
ＲＰクロマトグラフィ産出物は凍結乾燥によって白い綿状の粉末に濃縮され、１１．８グラム（アミド化からの全収率９５％）のｒｈＰＴＨ（１−３４）−ＮＨ₂をもたらした。ｒｈＰＴＨ（１−３４）−ＮＨ₂の分子量は、エレクトロスプレーイオン化質量分析法（electrospray ionization mass spectrometry）（ＥＳＩ−ＭＳ）によって４，１１６．９Ｄａであることが求められた。これは４，１１６．８Ｄａの計算された平均分子量と一致していた。

この発明はその特定の実施の形態に関して記載されてきたが、他の多くの変形および変更、ならびに他の用途が当業者に明白であろう。したがって、この発明は、本明細書における具体的な開示によって限定されるのではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。

Claims (36)

1. アミド化された生成物の生体外での生成のための方法であって、前記方法は、（Ａ）ペプチジルグリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼおよび（Ｂ）α−ケト酸またはその塩またはそのエステルである反応強化化合物が存在する状態で、遊離酸の形でカルボニル基に結合されるグリシン残基を有する前駆体を反応させることを備え、前記α−ケト酸は分子構造ＲＣ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）ＯＨを有し、Ｒは、アリール、Ｃ１−Ｃ４炭化水素部分、ハロゲン化またはヒドロキシル化されたＣ１−Ｃ４炭化水素部分、およびＣ１−Ｃ４カルボン酸からなる群から選択される、方法。
2. 前記反応強化化合物は、α−ケト酸塩である、請求項１に記載の方法。
3. 前記反応強化化合物は、α−ケト酸エステルである、請求項１に記載の方法。
4. 前記反応強化化合物は、α−ケト酸である、請求項１に記載の方法。
5. Ｒはアリールである、請求項１に記載の方法。
6. Ｒはフェニルである、請求項５に記載の方法。
7. ＲはＣ１−Ｃ４炭化水素である、請求項１に記載の方法。
8. ＲはＣ１−Ｃ４アルキルである、請求項１に記載の方法。
9. 前記反応強化化合物は、ピルビン酸エチル、ピルビン酸またはその塩、ピルビン酸メチル、ベンゾイルギ酸またはその塩、２−ケト酪酸またはその塩、３−メチル−２−オキソブタン酸またはその塩、および２−ケトグルタル酸またはその塩からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
10. 前記反応強化化合物は、ピルビン酸およびピルビン酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
11. アミド化された生成物の生体外での生成のための方法であって、前記方法は、
    （Ａ）（ｉ）ペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼおよび（ｉｉ）α−ケト酸またはその塩またはそのエステルである反応強化化合物が存在する状態で、遊離酸の形でカルボニル基に結合されるグリシン残基を有する前駆体を反応させることによって、ヒドロキシル化された中間体を形成することを備え、前記α−ケト酸は分子構造ＲＣ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）ＯＨを有し、Ｒは、アリール、Ｃ１−Ｃ４炭化水素部分、ハロゲン化またはヒドロキシル化されたＣ１−Ｃ４炭化水素部分、およびＣ１−Ｃ４カルボン酸からなる群から選択され、前記方法はさらに、
    （Ｂ）ルイス塩基またはペプチジルα−ヒドロキシグリシンα−アミド化リアーゼのいずれかで前記中間体を同時にまたは続いて反応させることを備える、方法。
12. 前記反応強化化合物は、α−ケト酸塩である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記反応強化化合物は、α−ケト酸エステルである、請求項１１に記載の方法。
14. 前記反応強化化合物は、α−ケト酸である、請求項１１に記載の方法。
15. Ｒはアリールである、請求項１１に記載の方法。
16. Ｒはフェニルである、請求項１５に記載の方法。
17. ＲはＣ１−Ｃ４炭化水素である、請求項１１に記載の方法。
18. ＲはＣ１−Ｃ４アルキルである、請求項１１に記載の方法。
19. 前記反応強化化合物は、ピルビン酸エチル、ピルビン酸またはその塩、ピルビン酸メチル、ベンゾイルギ酸またはその塩、２−ケト酪酸またはその塩、３−メチル−２−オキソブタン酸またはその塩、および２−ケトグルタル酸またはその塩からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
20. 前記反応強化化合物は、ピルビン酸およびピルビン酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
21. 前記生成物は、自然にアミド化されない天然ペプチドのアミド化された類似物である、請求項１に記載の方法。
22. 前記生成物は、自然にアミド化されない天然ペプチドのアミド化された類似物である、請求項１１に記載の方法。
23. 前記生成物は、前記天然ペプチドがアミド化されない部位でさらにアミド化される、自然にアミド化されたペプチドの類似物である、請求項１に記載の方法。
24. 前記生成物は、前記天然ペプチドがアミド化されない部位でさらにアミド化される、自然にアミド化されたペプチドの類似物である、請求項１１に記載の方法。
25. 前記生成物はペプチドである、請求項１に記載の方法。
26. 前記生成物はペプチドである、請求項１１に記載の方法。
27. α−ヒドロキシ−グリシン生成物の生体外での生成のための方法であって、前記方法は、（ｉ）ペプチジルグリシンα−ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼおよび（ｉｉ）α−ケト酸またはその塩またはそのエステルである反応強化化合物が存在する状態で、遊離酸の形でカルボニル基に結合されるグリシン残基を有する前駆体を反応させることを備え、前記α−ケト酸は分子構造ＲＣ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）ＯＨを有し、Ｒは、アリール、Ｃ１−Ｃ４炭化水素部分、ハロゲン化またはヒドロキシル化されたＣ１−Ｃ４炭化水素部分、およびＣ１−Ｃ４カルボン酸からなる群から選択される、方法。
28. 前記反応強化化合物は、α−ケト酸塩である、請求項２７に記載の方法。
29. 前記反応強化化合物は、α−ケト酸エステルである、請求項２７に記載の方法。
30. 前記反応強化化合物は、α−ケト酸である、請求項２７に記載の方法。
31. Ｒはアリールである、請求項２７に記載の方法。
32. Ｒはフェニルである、請求項３１に記載の方法。
33. ＲはＣ１−Ｃ４炭化水素である、請求項２７に記載の方法。
34. ＲはＣ１−Ｃ４アルキルである、請求項２７に記載の方法。
35. 前記反応強化化合物は、ピルビン酸エチル、ピルビン酸またはその塩、ピルビン酸メチル、ベンゾイルギ酸またはその塩、２−ケト酪酸またはその塩、３−メチル−２−オキソブタン酸またはその塩、および２−ケトグルタル酸またはその塩からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
36. 前記反応強化化合物は、ピルビン酸およびピルビン酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。