JP4869243B2 - リソバクチンフラグメントの特異的製造方法 - Google Patents
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- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
Description
好ましいのは、パラジウム触媒、例えばパラジウム/炭素(5−30%)であり、特に好ましいのはパラジウム/炭素(10%)である。
メタロプロテアーゼは、例えば、サーモリシンまたはミコリシン(mycolysin)である。
システインプロテアーゼは、例えば、パパイン、ブロメラインまたはフィシン(ficin)である。
特に好ましくは、酵素的切断は、30℃ないし37℃の温度範囲で行う。
反応媒体中のアルコール濃度は、0%ないし40%、好ましくは10%ないし15%である。
酵素の基質(ジヒドロリソバクチンおよび/またはオクタヒドロリソバクチン)に対する比は、1:1ないし1:4000、好ましくは1:25ないし1:100である。
これらのリソバクチン誘導体は、リソバクチンの環系の1個またはそれ以上のアミノ酸が置換されている誘導体である。
Rは、水素またはC1−C4−アルキル、好ましくはエチルまたはメチル、特に好ましくはメチルを表し、
D−Xは、D配置の天然または合成α−アミノ酸を表し、
そして、Yは、L配置の天然または合成α−アミノ酸を表す。
図1:キモトリプシンによる分取的酵素的切断(実施例11)の時間経過。ジヒドロ−およびオクタヒドロリソバクチンの混合物のキモトリプシンによる分取的酵素的切断のHPLC図の重ね書き。分離条件は、実施例30の説明で報告する通りである(UV検出210nm)。
図2:キモトリプシンによるオクタヒドロリソバクチンの酵素的切断(実施例5)の時間経過。オクタヒドロリソバクチンのキモトリプシンによる酵素的切断のCZE図の重ね書き。分離条件は、実施例31の説明で報告する通りである(UV検出210nm)。
ジヒドロリソバクチン:D−Leu−Leu−Phe−Leu(OH)−Leu−D−Arg−Ile−アロ−Thr−Gly−Asn(OH)−Ser
オクタヒドロリソバクチン:D−Leu−Leu−Ala(3−シクロヘキシル)−Leu(OH)−Leu−D−Arg−Ile−アロ−Thr−Gly−Asn(OH)−Ser
リソバクチンフラグメント4−11:Leu(OH)−Leu−D−Arg−Ile−アロ−Thr−Gly−Asn(OH)−Ser
リソバクチンフラグメント1−3:D−Leu−Leu−PheまたはD−Leu−Leu−Ala(3−シクロヘキシル)
ペプチドおよびシクロデプシペプチドの命名法について、以下を参照:
1. A Guide to IUPAC Nomenclature of Organic Compounds (Recommendations 1993), 1993, Blackwell Scientific publications.
2. Nomenclature and symbolism for amino acids and peptides. Recommendations 1983. IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature, UK. Biochemical Journal 1984, 219, 345-373, 並びに引用文献。
方法1(LC−MS):装置タイプMS:Micromass ZQ;装置タイプHPLC:HP 1100 series; UV DAD;カラム:Phenomenex Synergi 2μ Hydro-RP Mercury 20 mm x 4 mm;溶離剤A:水1l+50%ギ酸0.5ml、溶離剤B:アセトニトリル1l+50%ギ酸0.5ml;グラジエント:0.0分90%A→2.5分30%A→3.0分5%A→4.5分5%A;流速:0.0分1ml/分、2.5分/3.0分/4.5分2ml/分;オーブン:50℃;UV検出:210nm。
装置
Applied Biosystems のタンパク質配列決定装置 Procise(商標)を使用して、配列解析を実施する。標準的配列決定プログラムを使用する。配列決定装置、様々な配列決定プログラム並びにPTH検出システムは、操作用手引き書である User's Manual Set, Protein Sequencing System Procise(商標)(1994), Applied Biosystems Forster City, CA 94404, U.S.A に詳細に記載されている。
配列決定装置を操作するための試薬およびPTH検出用のHPLCカラムは、Applied Biosystems から入手する。
使用する試薬は、HPLC品質のものであり、Merck (D-Darmstadt)から入手する。
使用する試薬は、生化学品質のものであり、Merck (D-Darmstadt) または Sigma (D-Deisenhofen)から入手する。
使用する試薬は、生化学品質のものであり、Merck (D-Darmstadt)、Fluka (D-Neu-Ulm) または Sigma (D-Deisenhofen)から入手する。
使用する酵素および化学物質は、生化学品質のものであり、Fluka, Calbiochem (D-Heidelberg) および Sigma から入手する。
本発明の目的上好ましい塩は、本発明により製造できるか、または使用可能である化合物の、生理的に許容し得る塩である。しかしながら、それら自体は医薬適用に適さないが、例えば本発明により製造できるか、または使用可能である化合物の単離または精製に使用できる塩または混合塩も含まれる。
D−ロイシル−N1−{(3S,6S,12S,15S,18R,21S,24S,27S,28R)−6[(1S)−2−アミノ−1−ヒドロキシ−2−オキソエチル]−18−(3−{[アミノ(イミノ)メチル]アミノ}プロピル)−12−[(1S)−1−ヒドロキシエチル]−3(ヒドロキシメチル)−24−[(1R)−1−ヒドロキシ−2−メチルプロピル]−21−イソブチル−15−[(1S)−1−メチルプロピル]−2,5,8,11,14,17,20,23,26−ノナオキソ−28−フェニル−1−オキサ−4,7,10,13,16,19,22,25−オクタアザシクロオクタコサン−27−イル}−L−ロイシンアミドビストリフルオロアセテート
{D−ロイシル−L−ロイシル−[(3R)−3ヒドロキシ−L−フェニルアラニル)]−[(3R)−3−ヒドロキシ−L−ロイシル]−L−ロイシル−D−アルギニル−L−イソロイシル−L−アロスレオニル−グリシル−[(3S)−3−ヒドロキシ−L−アスパラギニル]−L−セリン−C1.11−O3.3−ラクトンビストリフルオロアセテート}(リソバクチン)
培養培地:
YM:酵母−麦芽寒天:D−グルコース(4g/l)、酵母抽出物(4g/l)、麦芽抽出物(10g/l)、Lewatit 水1l。滅菌(20分間、121℃)前に、pHを7.2に調節する。
HPM:マンニトール(5.4g/l)、酵母抽出物(5g/l)、肉ペプトン(3g/l)。
作業用一時保存物:凍結乾燥系統(ATCC53042)を、YM培地50ml中で増殖させる。
18.5時間後、17000rpmで主培養の培養ブロスを上清と沈降物に分離する。
上清(183l)を濃トリフルオロ酢酸または水酸化ナトリウム溶液を使用してpH6.5−7に調節し、Lewapol カラム (OC 1064、60l容量)に負荷する。続いて、純水、水/メタノール1:1および続いて純粋なメタノール(0.1%トリフルオロ酢酸を含有する)で溶出を実施する。この有機相を真空で濃縮し、水性残留物11.5lを残す。
この方法により、2250mgの実施例1を得る。
この方法により447mgの実施例1を得る。
MS (ESIpos): m/z = 1277 [M + H]+
1H NMR (500.13 MHz, d6-DMSO): δ = 0.75 (d, 3H), 0.78 (d, 6H), 0.80 (t, 3H), 0.82 (d, 3H), 0.90 (d, 3H), 0.91 (d, 3H), 0.92 (d, 3H), 0.95 (d, 3H), 0.96 (d, 3H), 1.05 (m, 1H), 1.19 (d, 3H), 1.25 (m, 2H), 1.50 (m, 4H), 1.51 (m, 2H), 1.55 (m, 1H), 1.61 (m, 1H), 1.65 (m, 1H), 1.84 (m, 1H), 1.85 (m, 1H), 1.86 (m, 1H), 1.89 (m, 1H), 1.95 (m, 1H), 2.75 (m, 2H), 3.40 (m, 1H), 3.52 (m, 2H), 3.53 (dd, 1H), 3.64 (m, 2H), 3.66 (m, 1H), 3.68 (dd, 1H), 3.73 (m, 2H), 4.00 (dd, 1H), 4.02 (br., 1H), 4.13 (br., 1H), 4.32 (dd, 1H), 4.39 (t, 1H), 4.55 (m, 1H), 4.75 (dd, 1H), 5.19 (t, 1H), 5.29 (d, 1H), 5.30 (br., 1H), 5.58 (m, 2H), 6.68 (m, 3H), 6.89 (d, 1H), 6.93 (m, 3H), 6.94 (br., 1H), 6.98 (d, 1H), 7.12 (br., 1H), 7.20 (br., 2H), 7.23 (m, 2H), 7.42 (m, 2H), 7.54 (d, 1H), 7.58 (d, 1H), 8.32 (br., 1H), 9.18 (br., 1H), 9.20 (m, 2H), 9.50 (br., 1H).
シグナルの割当ては、文献に記載の割当てに従い実施した (T. Kato, H. Hinoo, Y. Terui, J. Antibiot., 1988, 61, 719-725)。
D−Leu−Leu−Phe−[(3R)−Leu(3−OH)]−Leu−D−Arg−Ile−aThr−Gly−[(3S)−3−Asn(3−OH)]−Ser−トリフルオロアセテート(ジヒドロリソバクチン)および
D−Leu−Leu−Ala(3−シクロヘキシル)−[(3R)−Leu(3−OH)]−Leu−D−Arg−Ile−aThr−Gly−[(3S)−3−Asn(3−OH)]−Ser−トリフルオロアセテート(オクタヒドロリソバクチン)
実施例1の化合物(リソバクチン、250mg、170μmol)を、イソプロパノール/水(2:1、60ml)に溶解し、1atmの水素下、Pd(10%、炭素上)200mgの存在下で水素化する。LC−MS(方法1)を利用して反応過程を追跡する。実質的に完全な変換の後(>95%)、触媒を濾過し、イソプロパノールで洗浄し、濾液を凍結乾燥する。この粗生成物中、LC−MSによると、生成物は以下の通りに分布している:ジヒドロリソバクチン約74%、オクタヒドロリソバクチン約12%。残渣をHPLC(方法2)により精製する。適する画分の凍結乾燥後、純粋な化合物実施例2を得る(81.5mg、理論値の31%)。
LC-MS: (方法 1): Rt = 1.56 分 ES+: m/z = 1279 [M + H]+, 640.1 [M + 2H]2+; ES-: m/z = 1277 [M - H]-, 638.1 [M - 2H]2-.
ヒドロリソバクチンのペプチド配列について、表1参照。
水素圧3atm下の水素化により、それ以外は水素化方法1と同一の方法で、LC−MSにより測定される粗生成物中の以下の分布が得られる:ジヒドロリソバクチン約80%、オクタヒドロリソバクチン約17%。HPLC精製(方法2)の後、純粋な化合物実施例2を得る(86mg、理論値の33%)。
3bar水素での水素化期間を延長して、またはより高い圧力(80bar水素圧まで)を使用して、割合的により多くのオクタヒドロリソバクチンを得ることができる。殆どの場合、ジヒドロ−およびオクタヒドロリソバクチンの粗製混合物を分離せず、直接酵素的切断に使用する。
以下の場合でも、化合物オクタヒドロリソバクチンは純粋な形態で単離される:
リソバクチン(実施例1、1.04g、0.69mmol)を、イソプロパノール/水(2:1、90ml)に溶解し、3atm水素下、7日間、Pd(10%、炭素上)200mgの存在下で水素化する。触媒を濾過し、イソプロパノールで洗浄し、濾液からイソプロパノールをロータリーエバポレーターで除き、次いで凍結乾燥する。この粗生成物中、生成物はLC−MS(方法1)によると以下の通りに分布している:ジヒドロリソバクチン約65%、オクタヒドロリソバクチン約35%。残渣をHPLC(方法2、続いて方法3)により精製する。ジヒドロリソバクチン(実施例2)(280mg、理論値の27%)およびオクタヒドロリソバクチン(実施例3)(212mg、理論値の20%)を得る。
LC-MS: (方法 1): Rt = 1.63 分 ESIpos.: m/z = 643.3 (100) [M + 2H]2+; ESIneg.: m/z = 1283 [M - H]-, 641.2 [M - 2H]2-.
高圧の水素下での水素化の実施例として、40℃、50bar水素で4日後、LC−MS(方法1)によると以下の粗製混合物を得る:ジヒドロリソバクチン45%およびオクタヒドロリソバクチン45%。
リソバクチンビストリフルオロアセテート(実施例1、500mg、0.33mmol)を、イソプロパノール/水2:1(30ml)に溶解する。アルゴン保護気体雰囲気下、10パーセントパラジウム/炭素(100mg)を添加する。反応混合物を、圧力オートクレーブ中、80−70bar水素および室温で、48時間撹拌する(脱気後)。10%パラジウム/炭素(100mg)を再度この反応に添加する。反応混合物を、再度、圧力オートクレーブ中、80−70bar水素および室温で、48時間撹拌する(脱気後)。ここで、HPLC(例えば方法4)を利用して、リソバクチンは全く検出できない。反応混合物をガラスフリット(孔サイズ2または3)を通して濾過し、真空で濃縮し、再度メタノール/0.2%氷酢酸に取り、シリンジフィルター(Biotage, PTFE)を通して濾過し、真空で濃縮し、高真空下に乾燥させる。生成物(ジヒドロリソバクチン80%、オクタヒドロリソバクチン20%)496mg(定量的)を得る。
リソバクチンモノトリフルオロアセテートモノアセテート(5mg、3.45μmol)を、イソプロパノール(2ml)、水(0.25ml)および酢酸(0.05ml)の混合物中で、二酸化白金(20mg)の存在下、80barおよび50℃で水素化する。17時間後、圧力を緩和し、システムをアルゴンで換気し、マイクロフィルターを利用して懸濁液から触媒を除く。濾液(方法4)のLC−MS分析は、理論値の7%のオクタヒドロリソバクチン(Rt=1.54分、方法4)を示す。
リソバクチンビストリフルオロアセテート(実施例1A、10g、6.65mmol)を、イソプロパノール/水9:2(110ml)に溶解する。アルゴン保護気体雰囲気下、パラジウム/炭素(10%;5g)を添加する。反応混合物(脱気後)を、圧力オートクレーブ中、水素圧80−70bar、40℃で、12時間撹拌する。パラジウム/炭素(10%;5g)をこの反応に再度添加する。反応混合物(脱気後)を、圧力オートクレーブ中、水素圧80−70bar、40℃で、12時間再度撹拌する。反応混合物(脱気後)を、圧力オートクレーブ中、水素圧80−70bar、40℃で、12時間もう一度撹拌する。ここで、分析用HPLC(方法10)を利用してリソバクチンはもはや検出できない。珪藻土を通して反応混合物を濾過し、真空で濃縮し、高真空下で乾燥させる。生成物(ジヒドロリソバクチン60%、オクタヒドロリソバクチン40%)9.17g(理論値の99%)を得る。
リソバクチンビストリフルオロアセテート(実施例1A、5g、3.32mmol)を、イソプロパノール/水9:2(110ml)に溶解する。アルゴン保護気体雰囲気下、パラジウム/炭素(10%;5g)を添加する。反応混合物(脱気後)を、圧力オートクレーブ中、水素圧80bar、40℃で、12時間撹拌する。珪藻土を通して反応混合物を濾過し、真空で濃縮し、高真空下に乾燥させる。各回でリソバクチンビストリフルオロアセテート5.0gを使用して、水素化をさらに3回繰り返す(全部で4回)。合わせた生成物画分として、生成物(ジヒドロリソバクチン:オクタヒドロリソバクチン、約5:4)18.27gを得る。
ジヒドロリソバクチンのキモトリプシン切断、酵素/基質比1:50
ジヒドロリソバクチン200μgを、メタノール10μlに溶解し、次いで切断バッファー(0.1M炭酸水素アンモニウム/0.5M尿素pH8)190μlを添加する。キモトリプシン4μg(1:50)を添加し、反応を37℃で実施する。30μlのアリコートを0、0.5、1、3、6および24時間後に取り、酵素切断をアセトニトリル/1%TFA30μlで停止する。HPLC、キャピラリーゾーン電気泳動、配列解析、アミノ酸分析、またはMS研究による分析まで、サンプルを−20℃で保存する。
キモトリプシン切断生成物のペプチド配列について、表2を参照。
オクタヒドロリソバクチンのキモトリプシン切断、酵素基質比1:50
オクタヒドロリソバクチン200μgを、メタノール10μlに溶解し、次いで切断バッファー(0.1M炭酸水素アンモニウム/0.5M尿素pH8)190μlを添加する。キモトリプシン4μg(1:50)を添加し、反応を37℃で実施する。30μlのアリコートを、0、0.5、1、3、6および24時間後に取り、酵素切断をアセトニトリル/1%TFA30μlで停止する。サンプルを分析するまで−20℃で保存する。
キモトリプシン切断生成物のペプチド配列について、表2を参照。
ジヒドロ−/オクタヒドロリソバクチン混合物の分析的キモトリプシン切断、酵素基質比1:25
ジヒドロ−(59%)およびオクタヒドロリソバクチン(34%)200μgを、メタノール10μlに溶解し、次いで切断バッファー(0.1M炭酸水素アンモニウム/0.5M尿素pH8)190μlを添加する。キモトリプシン8μg(1:25)を添加し、反応を37℃で実施する。30μlのアリコートを、0、0.5、1、3時間後に取り、酵素切断をアセトニトリル/1%TFA30μlで停止する。サンプルを分析するまで−20℃で保存する。
キモトリプシン切断生成物のペプチド配列について、表2を参照。
ジヒドロ−/オクタヒドロリソバクチン混合物の分析的キモトリプシン切断、酵素基質比1:400
ジヒドロ−(59%)およびオクタヒドロリソバクチン(34%)150μgをエタノール15μlに溶解し、次いで切断バッファー(0.1M炭酸水素アンモニウム/0.5M尿素pH8)126μlを添加する。キモトリプシン0.38μg(9μlのキモトリプシン溶液水/エチレングリコール/切断バッファー、0.2mg/ml;1:400)を添加し、反応を37℃で実施する。25μlのアリコートを0、0.5、1、3時間後に取り、酵素切断を30%アセトニトリル/0.1%TFA25μlで停止する。サンプルを分析するまで−20℃で保存する。
キモトリプシン切断生成物のペプチド配列について、表2を参照。
基質濃度6mg/mlのジヒドロ−/オクタヒドロリソバクチン混合物の分析的キモトリプシン切断
ジヒドロ−(59%)およびオクタヒドロリソバクチン(34%)900μgを、メタノール15μlに溶解し、次いで切断バッファー(0.1M炭酸水素アンモニウム/0.5M尿素pH8)99μlを添加する。キモトリプシン36μg(36μlのキモトリプシン溶液水/エチレングリコール1:1、1mg/ml;1:25)を添加し、反応を37℃で実施する。25μlのアリコートを、0、0.5、1、3時間後に取り、酵素切断を30%アセトニトリル/0.1%TFA25μlで停止する。サンプルを分析するまで−20℃で保存する。
キモトリプシン切断生成物のペプチド配列について、表2を参照。
溶媒濃度30%メタノールでのジヒドロ−/オクタヒドロリソバクチン混合物の分析的キモトリプシン切断
ジヒドロ−(59%)およびオクタヒドロリソバクチン(34%)150μgを、メタノール45μlに溶解し、次いで切断バッファー(0.1M炭酸水素アンモニウム/0.5M尿素pH8)99μlを添加する。キモトリプシン6μg(6μlのキモトリプシン溶液水/エチレングリコール1:1、1mg/ml;1:25)を添加し、反応を37℃で実施する。25μlのアリコートを、0、0.5、1、3時間後に取り、酵素切断を30%アセトニトリル/0.1%TFA25μlで停止する。サンプルを分析するまで−20℃で保存する。
キモトリプシン切断生成物のペプチド配列について、表2を参照。
室温で切断するジヒドロ−/オクタヒドロリソバクチン混合物の分析的キモトリプシン切断
ジヒドロ−(59%)およびオクタヒドロリソバクチン(34%)200μgを、メタノール10μlに溶解し、次いで切断バッファー(0.1M炭酸水素アンモニウム/0.5M尿素pH8)190μlを添加する。キモトリプシン8μg(8μlのキモトリプシン溶液水/エチレングリコール1:1、1mg/ml;1:25)を添加し、反応を室温(20−25℃)で実施する。30μlのアリコートを、0、0.5、1、3、6時間後に取り、酵素切断を30%アセトニトリル/1%TFA30μlで停止する。サンプルを分析するまで−20℃で保存する。
キモトリプシン切断生成物のペプチド配列について、表2を参照。
ジヒドロリソバクチン2x80mg(アミノ酸分析により測定される純粋なペプチド35.3μmolおよび33.8μmol)を、メタノール各8mlに溶解し、次いで切断バッファー(0.1M炭酸水素アンモニウム/0.5M尿素pH8)各69mlを添加する。酵素の添加前に、溶液を乾燥キャビネット中で37℃に温める。キモトリプシン3.2mg(3.2mlのキモトリプシン溶液水/エチレングリコール1:1、1mg/ml;1:25;事前に37℃に加熱)を添加し、反応を37℃で実施する。200μlのアリコートを、0.5、1時間後に取り、酵素切断を30%アセトニトリル/0.1%TFA200μlで停止する。サンプルをHPLCにより酵素切断と並行して15分の内に分析する(保持時間:フラグメント4−11約3.6分、フラグメント1−3(LLF)約9.6分、条件:溶媒A0.1%TFA、溶媒B60%アセトニトリル/0.1%TFA、グラジエント:0分30%B、10分80%B、11分100%B、12分30%B、15分30%B;流速0.7ml/分、40℃、UV検出210nm)。約70分後に、アセトニトリル3mlおよびTFA約0.6mlで酵素反応を停止する。溶液のpHは、1ないし2である。溶液を分取的に分離するまで−20℃で保存できる。
切断溶液2x約80mlをフィルター(0.2μm)を通して濾過し、次いで合わせる。溶液を各約38.5mlに4分割し(全部で154ml)、アセトニトリル/TFAグラジエントを使用して、Source 15RPC カラム(3ml)で各々をクロマトグラフィーする。条件:溶媒A0.1%TFA、溶媒B0.1%TFA/アセトニトリル;グラジエント:40分間で0%Bから45%Bへ;流速2ml/分;UV検出210nm。4回の実行を連続的に行い、画分を同じチューブに集める。得られるクロマトグラムは、同一である。
フラグメント4−11(Rt=約15分)および1−3(LLF)(Rt=約25分)を合わせ、水で1:1に希釈し、次いで凍結乾燥する。
アミノ酸分析によると、フラグメント4−11の収量は、68.3μmol(理論値の99%)、フラグメント1−3は67.4μmol(理論値の98%)である。
1mg/mlのジヒドロ/オクタヒドロリソバクチン混合物の分取的キモトリプシン切断
バッチ1
ジヒドロ−(56%)およびオクタヒドロリソバクチン(21%)2x700mg(アミノ酸分析により測定される純粋なペプチドとして存在するジヒドロ−およびオクタヒドロリソバクチン682μmol)を、メタノール各70mlに溶解し、次いで切断バッファー(0.1M炭酸水素アンモニウム/0.5M尿素pH8)各602mlを添加する。酵素の添加前に、溶液を乾燥キャビネット中で37℃に温める。キモトリプシン28mg(28mlのキモトリプシン溶液水/エチレングリコール1:1、1mg/ml;1:25;37℃に事前に加熱)を添加し、反応を37℃で実施する。200μlのアリコートを0.5、1時間後に取り、酵素切断を30%アセトニトリル/0.1%TFA200μlで停止する。サンプルをHPLCにより酵素切断と並行して15分の内に分析する(保持時間:フラグメント4−11約3.6分、フラグメント1−3(LLF)約9.6分、フラグメント1−3(LL(3−シクロヘキシル)A)約11.3分、条件:溶媒A0.1%TFA、溶媒B60%アセトニトリル/0.1%TFA、グラジエント:0分30%B、10分80%B、11分100%B、12分30%B、15分30%B;流速0.7ml/分、40℃、UV検出210nm)。酵素反応を約60分後にアセトニトリル30mlおよびTFA約6mlで停止する。溶液のpHは、1ないし2である。溶液を分取的に分離するまで−20℃で保存できる。
ジヒドロ−(45%)およびオクタヒドロリソバクチン(48%)775mg(アミノ酸分析により測定される純粋なペプチドとして存在するジヒドロ−およびオクタヒドロリソバクチン468μmol)を、メタノール77.5mlに溶解し、次いで切断バッファー(0.1M炭酸水素アンモニウム/0.5M尿素pH8)667mlを添加する。酵素の添加前に、溶液を乾燥キャビネット中で37℃に温める。キモトリプシン31mg(31mlのキモトリプシン溶液水/エチレングリコール1:1、1mg/ml;1:25;37℃に事前に加熱する)を添加し、反応を37℃で実施する。200μlのアリコートを、0.5、1時間後に取り、酵素切断を30%アセトニトリル/0.1%TFA200μlで停止する。サンプルをHPLCにより酵素切断と並行して15分の内に分析する(保持時間:フラグメント4−11約3.6分、フラグメント1−3(LLF)約9.6分、フラグメント1−3(LL(3−シクロヘキシル)A)約11.3分)(溶媒A0.1%TFA、溶媒B60%アセトニトリル/0.1%TFA、グラジエント:0分30%B、10分80%B、11分100%B、12分30%B、15分30%B;流速0.7ml/分、温度:40℃、UV検出210nm)。酵素反応を60分後にアセトニトリル30mlおよびTFA約6mlで停止する。溶液のpHは、1ないし2であろう。溶液を分取的に分離するまで−20℃で保存できる。
切断バッチ1および2を、フィルター(0.2μm)を通して濾過し、次いで合わせる。溶液を数個に分割し、Source 15RPC カラムでアセトニトリル/TFAグラジエントを使用して各々を上記の通りにクロマトグラフィーする。各実行を連続的に行い、画分を同じチューブに集める。得られるクロマトグラムは同一である。
フラグメント4−11(Rt.約15分)を合わせ、1:1に水で希釈し、次いで凍結乾燥する。
フラグメント4−11の凍結乾燥後の収量は、1.1g(1095μmol)である。切断物質の出発量1150μmolに対して、フラグメント4−11の収率は理論値の95%である。
基質濃度3mg/mlのジヒドロ/オクタヒドロリソバクチン混合物の分取的キモトリプシン切断
ジヒドロ−(52%)およびオクタヒドロリソバクチン(37%)の混合物2x0.995gをメタノール各33mlに溶解し、次いで切断バッファー(0.1M炭酸水素アンモニウム/0.5M尿素pH8)各257mlを添加する。酵素の添加前に、溶液を乾燥キャビネット中で37℃に温める。キモトリプシン39.6mg(39.6mlのキモトリプシン溶液水/エチレングリコール1:1、1mg/ml;1:25;37℃に事前に加熱する)を添加し、反応を37℃で実施する。200μlのアリコートを、0.5、1時間後に取り、酵素切断を30%アセトニトリル/0.1%TFA200μlで停止する。サンプルをHPLCにより酵素切断と並行して15分の内に分析する(保持時間:フラグメント4−11約3.6分、フラグメント1−3(LLF)約9.6分、フラグメント1−3(LL(3−シクロヘキシル)A)約11.3分)(溶媒A0.1%TFA、溶媒B60%アセトニトリル/0.1%TFA、グラジエント:0分30%B、10分80%B、11分100%B、12分30%B、15分30%B;流速:0.7ml/分、温度:40℃、UV検出210nm)。酵素反応を60分後にアセトニトリル30mlおよびTFA約2.5mlで各々停止する。溶液のpHは、1ないし2であろう。溶液を分取的に分離するまで−20℃で保存できる。
基質濃度5mg/mlのジヒドロ/オクタヒドロリソバクチン混合物の分取的キモトリプシン切断
ジヒドロ−(約40%)およびオクタヒドロリソバクチン(約60%)10gをメタノール200mlに溶解し、次いで切断バッファー(0.1M炭酸水素アンモニウム/0.5M尿素pH8)1700mlを添加する。酵素の添加前に溶液を乾燥キャビネット中で37℃に温める。キモトリプシン400mg(100mlのキモトリプシン溶液水/エチレングリコール1:1、4mg/ml;1:25;37℃に事前に加熱)を添加し、反応を37℃で実施する。200μlのアリコートを、0.5、1時間後に取り、酵素切断を30%アセトニトリル/0.1%TFA200μlで停止する。サンプルをHPLCにより酵素切断と並行して15分の内に分析する(保持時間フラグメント4−11約3.6分、フラグメント1−3(LLF)約9.6分、フラグメント1−3(LLA(3−シクロヘキシル))約11.3分)(溶媒A0.1%TFA、溶媒B60%アセトニトリル/0.1%TFA、グラジエント0分30%B、10分80%B、11分100%B、12分30%B、15分30%B;流速0.7ml/分、温度:40℃、UV検出210nm)。酵素反応を60分後にアセトニトリル75mlおよびTFA約15mlで停止する。溶液のpHは1ないし2であろう。溶液を分取的に分離するまで−20℃で保存できる。
使用するキモトリプシンバッチの活性(70U/mg)を、タンパク質インターロイキン−4二重変異タンパク質Arg(121)→Asp(121)/Tyr(124)→Asp(124)(BAYER Healthcare AG, D-Wuppertal)を使用する対照の切断により確認する。
ジヒドロリソバクチンのサブチリシン切断
ジヒドロリソバクチン200μgを、メタノール10μlに溶解し、次いで切断バッファー(0.1M炭酸水素アンモニウム/0.5M尿素pH8)190μlを添加する。サブチリシン4μg(1:50)を添加し、反応を37℃で実施する。30μlのアリコートを、0、0.5、1、3、6および24時間後に取り、酵素切断をアセトニトリル/1%TFA30μlで停止する。サンプルを分析するまで−20℃で保存する。
サブチリシン切断生成物のペプチド配列について、表3を参照。
オクタヒドロリソバクチンのサブチリシン切断
オクタヒドロリソバクチン200μgをメタノール10μlに溶解し、次いで切断バッファー(0.1M炭酸水素アンモニウム/0.5M尿素pH8)190μlを添加する。サブチリシン4μg(1:50)を添加し、反応を37℃で実施する。30μlのアリコートを0、0.5、1、3、6および24時間後に取り、酵素切断をアセトニトリル/1%TFA30μlで停止する。サンプルを分析するまで−20℃で保存する。
サブチリシン切断生成物のペプチド配列について、表3を参照。
ジヒドロリソバクチンのサーモリシン切断
ジヒドロリソバクチン200μgをメタノール10μlに溶解し、次いで切断バッファー(0.1Mトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン/5mM塩化カルシウムpH7.45)190μlを添加する。サーモリシン4μg(1:50)を添加し、反応を37℃で実施する。30μlのアリコートを、0、0.5、1、3、6および24時間後に取り、酵素切断をアセトニトリル/1%TFA30μlで停止する。サンプルを分析するまで−20℃で保存する。
サーモリシン切断生成物のペプチド配列について、表4を参照。
オクタヒドロリソバクチンのサーモリシン切断
オクタヒドロリソバクチン200μgをメタノール10μlに溶解し、次いで切断バッファー(0.1M炭酸水素アンモニウム/0.5M尿素pH8)190μlを添加する。サーモリシン4μg(1:50)を添加し、反応を37℃で実施する。30μlのアリコートを、0、0.5、1、3、6および24時間後に取り、酵素切断をアセトニトリル/1%TFA30μlで停止する。サンプルを分析するまで−20℃で保存する。
サーモリシン切断生成物のペプチド配列について、表4を参照。
ジヒドロリソバクチンのパパイン切断
ジヒドロリソバクチン200μgをメタノール10μlに溶解し、次いで切断バッファー(0.1Mリン酸ナトリウム/10mMシステイン、2mM EDTA pH6.5)190μlを添加する。パパイン4μg(1:50)を添加し、反応を37℃で実施する。30μlのアリコートを、0、0.5、1、3、6および24時間後に取り、酵素切断をアセトニトリル/1%TFA30μlで停止する。サンプルを分析するまで−20℃で保存する。
パパイン切断生成物のペプチド配列について、表5を参照。
オクタヒドロリソバクチンのパパイン切断
オクタヒドロリソバクチン200μgをメタノール10μlに溶解し、次いで切断バッファー(0.1Mリン酸ナトリウム/10mMシステイン、2mM EDTA pH6.5)190μlを添加する。パパイン4μg(1:50)を添加し、反応を37℃で実施する。30μlのアリコートを、0、0.5、1、3、6および24時間後に取り、酵素切断をアセトニトリル/1%TFA30μlで停止する。サンプルを分析するまで−20℃で保存する。
パパイン切断生成物のペプチド配列について、表5を参照。
ジヒドロリソバクチンのプロテイナーゼK切断
ジヒドロリソバクチン200μgをメタノール10μlに溶解し、次いで切断バッファー(0.1MナトリウムテトラボレートpH9)190μlを添加する。プロテイナーゼK4μg(1:50)を添加し、反応を37℃で実施する。30μlのアリコートを、0、0.5、1、3、6および24時間後に取り、酵素切断をアセトニトリル/1%TFA30μlで停止する。サンプルを分析するまで−20℃で保存する。
プロテイナーゼK切断生成物のペプチド配列について、表6を参照。
オクタヒドロリソバクチンのプロテイナーゼK切断
オクタヒドロリソバクチン200μgを、メタノール10μlに溶解し、次いで切断バッファー(0.1MナトリウムテトラボレートpH9)190μlを添加する。プロテイナーゼK4μg(1:50)を添加し、反応を37℃で実施する。30μlのアリコートを、0、0.5、1、3、6および24時間後に取り、酵素切断をアセトニトリル/1%TFA30μlで停止する。サンプルを分析するまで−20℃で保存する。
プロテイナーゼK切断生成物のペプチド配列について、表6を参照。
ジヒドロリソバクチンのブロメライン切断
ジヒドロリソバクチン200μgをメタノール10μlに溶解し、次いで切断バッファー(0.1Mリン酸ナトリウム、10mMシステイン、2mM EDTA pH6.5)190μlを添加する。ブロメライン4g(1:50)を添加し、反応を37℃で実施する。30μlのアリコートを、0、0.5、1、3、6および24時間後に取り、酵素切断をアセトニトリル/1%TFA30μlで停止する。サンプルを分析するまで−20℃で保存する。
ブロメライン切断生成物のペプチド配列について、表7を参照。
オクタヒドロリソバクチンのブロメライン切断
オクタヒドロリソバクチン200μgを、メタノール10μlに溶解し、次いで切断バッファー(0.1Mリン酸ナトリウム、10mMシステイン、2mM EDTA pH6.5)190μlを添加する。ブロメライン4μg(1:50)を添加し、反応を37℃で実施する。30μlのアリコートを0、0.5、1、3、6および24時間後に取り、酵素切断をアセトニトリル/1%TFA30μlで停止する。サンプルを分析するまで−20℃で保存する。
ブロメライン切断生成物のペプチド配列について、表7を参照。
キモトリプシンによるジヒドロリソバクチンの酵素的合成
800μgのペプチドLeu−Leu−PheOMeおよび100μgのペプチド4−11を、メタノール200μlに溶解し、次いで合成バッファー(0.1MナトリウムテトラボレートpH9)200μlを添加する。キモトリプシン24μgを添加し、反応を37℃で実施する。30μlのアリコートを、0、0.5、1、3、6および24時間後に取り、合成をアセトニトリル/1%TFA30μlで停止する。サンプルを分析するまで−20℃で保存する。
ジヒドロリソバクチンを、HPLCおよびCZEを使用して検出する。
キモトリプシンによるジヒドロリソバクチン誘導体の酵素的合成
800μgのペプチドBoc−Leu−Leu−PheOMeを、テトラクロロメタン200μlに溶解し、次いで100μgのペプチド4−11を含有する合成バッファー(0.1MナトリウムテトラボレートpH9)200μlを添加する。キモトリプシン24μgを添加し、反応を37℃で実施する。30μlのアリコートを、0、0.5、1、3、6および24時間後に取り、合成をアセトニトリル/1%TFA30μlで停止する。サンプルを分析するまで−20℃で保存する。
ジヒドロリソバクチン誘導体をHPLCおよびCZEにより検出する。
キモトリプシンによるオクタヒドロリソバクチンの酵素的合成
800μgのペプチドLeu−Leu−Ala(3−シクロヘキシル)OMeおよび100μgのペプチド4−11を、メタノール200μlに溶解し、次いで合成バッファー(0.1MナトリウムテトラボレートpH9)200μlを添加する。キモトリプシン24μgを添加し、反応を37℃で実施する。30μlのアリコートを、0、0.5、1、3、6および24時間後に取り、合成をアセトニトリル/1%TFA30μlで停止する。サンプルを分析するまで−20℃で保存する。
オクタヒドロリソバクチンをHPLCおよびCZEにより検出する。
N末端配列解析
3nmolのフラグメントを60%アセトニトリル/0.1%TFAに溶解し、Polybren(登録商標)で事前にインキュベートした配列決定装置のシートに負荷する。通常の配列決定装置のサイクルを使用して、タンパク質を配列決定する。40pmolのPTH標準を使用するオンラインHPLCを利用して、PTH−アミノ酸を同定する。非タンパク質構成アミノ酸を、標準的アミノ酸に対するそれらの相対的位置により同定する。ペプチドの純度を第1PTHサイクルのアミノ酸から見積もる。様々なペプチドを4ないし12の段階で配列決定する。表1ないし7は、決定されたタンパク質配列を示す。
アミノ酸分析
アミノ酸分析は、タンパク質の特徴解析に重要な定性的かつ定量的なパラメーターである。タンパク質含有量に加えて、既知の一次構造の場合、個々のアミノ酸の数が測定される。リソバクチン誘導体およびペプチドフラグメントのアミノ酸分析は、一次構造からの理論値と良好に一致する(表8)。非タンパク質構成アミノ酸は、対応する標準の存在下でのみ定量される。
逆相クロマトグラフィー
化学的に結合した逆相上のタンパク質のHPLCクロマトグラフィーにおいて、使用する相への結合は、タンパク質の疎水性相互作用を介して形成される。固定相へのそれらの結合の強度に応じて、ペプチドは有機溶媒(移動相)により置き換えられる。この理由で、この方法は、ペプチドの純度を評価し、酵素的切断の速度および得られる切断生成物を監視するのに良い基準である。ペプチドのジヒドロリソバクチンおよびオクタヒドロリソバクチンは、RP−18相から約35分および約38分で、フラグメント4−11は約16分で、1−3(LLF)は約31分で、そして1−3(LLA(3−シクロヘキシル))は約37分で溶離する。図1は、キモトリプシンによる分取的酵素的切断(実施例11)の時間経過を示す。
キャピラリーゾーン電気泳動(CZE)
キャピラリー電気泳動は、電場における電荷に基づくペプチドおよびタンパク質の分離を可能にする。分離の質は、使用するバッファー、pH、温度および添加物に依存する。使用するキャピラリーは、内直径50−100μmを有するいわゆる融合シリカカラムである。この方法は、ペプチドの純度の評価および酵素的切断生成物の形成の監視のために非常に良い基準である。ペプチドのジヒドロリソバクチンおよびオクタヒドロリソバクチンは、キャピラリーカラムから約21分で、フラグメント4−11は約18分で、1−3(LLF)は約24分で、1−3(LLA(3−シクロヘキシル))は約22分で、脱アミド形態は2つのピークとして約30分(1−11)および24分(4−11)で溶離する。図2は、オクタヒドロリソバクチンのキモトリプシンによる酵素的切断(実施例5)の時間経過を示す。バッファー中で24時間後に、脱アミド生成物の大幅な増加が明確に見られる。
HPLC−ESI−MSにより決定される分子量
ペプチドおよび酵素的切断の生成物を、RP−18−HPLCクロマトグラフィーにより分離し、電子スプレーイオン化法(ESI)により分子量を決定する。
混合物ジヒドロ/オクタヒドロリソバクチンの分取的キモトリプシン切断
ジヒドロ−およびオクタヒドロリソバクチン(約5:4)18.27gを、メタノール365mlに溶解し、キモトリプシン(731mg)および切断バッファーで3654mlに希釈する。反応を30分間37℃で実施し、次いでTFA20mlおよびアセトニトリル150mlで停止する。酵素の添加前に、溶液を乾燥キャビネット中で37℃に温める。200μlのアリコートを、0および0.5時間後に取り、酵素切断を0.1%TFAを含む30%アセトニトリル/70%水200μlで停止する。サンプルをHPLCにより分析する(保持時間;フラグメント4−11約3.6分、フラグメント1−3(LLF)約9.6分、フラグメント1−3(LL(ヘキサヒドロ)F)約11.3分)(溶離剤A:0.1%TFAを含む水、溶離剤B:0.1%TFAを含む60%アセトニトリル/40%水、グラジエント:0分30%B、10分80%B、11分100%B、12分30%B、15分30%B;流速:0.7ml/分、カラム温度:40℃、検出:210nm)。あるいは、方法11を使用する。溶液を9x500mlの部分に分割し、分取的RP分離まで、−70℃で冷凍する。フラグメント4−11を分取用HPLCにより数回の実行で単離する。
約800mlの切断溶液を、カートリッジ(0.2μm)を通して濾過し、約400mlずつ2つに分けて、メタノール/TFAグラジエントを使用して Source 15 RPC カラム(カラムサイズ:2360ml)でクロマトグラフィーする。溶離剤A:0.1%TFAを含む水、溶離剤B:0.1%TFAを含む100%メタノール;流速:30ml/分;検出215nm。グラジエントをカラム容積に従って実施する:適用後、カラムをカラム体積の3.6倍の溶離剤Aで洗浄し、次いでカラム体積の18倍で45%Bとし、カラム体積の0.67倍で100%Bとし、カラム体積の1.3倍の100%B、0.67倍で0%Bとし、平衡化のためにカラム体積の7倍の溶離剤A。
10.36g(理論値の77%)のフラグメント4−11を、生成物として得る。
HPLC/UV-Vis (方法 4): Rt = 0.5 分
LC-MS (方法 1): Rt = 1.0 分;
MS (ESIpos.): m/z (%) = 453.6 (100) [M + 2H]2+, 906 (10) [M + H]+.
MS (ESIneg.): m/z (%) = 904 (100) [M - H]-.
Claims (6)
- ジヒドロリソバクチンおよび/またはオクタヒドロリソバクチンの製造方法であって、水素化触媒の存在下、溶媒中で、水素を用いる水素化分解的開環により、リソバクチンをジヒドロリソバクチンおよび/またはオクタヒドロリソバクチンに変換することを特徴とする、方法。
- パラジウム触媒を水素化触媒として使用する、請求項1に記載の方法。
- イソプロパノール−水混合物を溶媒として使用する、請求項1または請求項2に記載の方法。
- リソバクチンフラグメント4−11およびリソバクチンフラグメント1−3の製造方法であって、ジヒドロリソバクチンおよび/またはオクタヒドロリソバクチンを真核生物のセリンプロテアーゼまたは微生物のセリンプロテアーゼにより切断してリソバクチンフラグメント4−11およびリソバクチンフラグメント1−3を得ることを特徴とする、方法。
- キモトリプシンをセリンプロテアーゼとして使用する、請求項4に記載の方法。
- リソバクチンフラグメント3−11および/またはリソバクチンフラグメント5−11および/またはリソバクチンフラグメント4−10および/またはリソバクチンフラグメント1−9の製造方法であって、ジヒドロリソバクチンおよび/またはオクタヒドロリソバクチンをメタロプロテアーゼまたはシステインプロテアーゼにより切断してリソバクチンフラグメント3−11および/またはリソバクチンフラグメント5−11および/またはリソバクチンフラグメント4−10および/またはリソバクチンフラグメント1−9を得ることを特徴とする、方法。
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Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61227788A (ja) * | 1985-03-25 | 1986-10-09 | イー・アール・スクイブ・アンド・サンズ・インコーポレイテツド | リソバクター種sc14067から生産される抗生物質 |
WO2004099239A1 (de) * | 2003-05-09 | 2004-11-18 | Bayer Healthcare Ag | Acylierte nonadepsipeptide vom lysobactin-typ |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4065412A (en) * | 1976-05-07 | 1977-12-27 | Durrum Instrument Corporation | Peptide or protein sequencing method and apparatus |
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