CN101098884A - 溶杆菌素片段的特定制备方法 - Google Patents

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CN101098884A CNA2005800448040A CN200580044804A CN101098884A CN 101098884 A CN101098884 A CN 101098884A CN A2005800448040 A CNA2005800448040 A CN A2005800448040A CN 200580044804 A CN200580044804 A CN 200580044804A CN 101098884 A CN101098884 A CN 101098884A
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    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids

Abstract

本发明涉及通过组合化学的和酶促的修饰而靶向生产溶杆菌素衍生物的方法。特别是，本发明涉及通过化学还原和通过胰凝乳蛋白酶裂解所得到的产物而制备溶杆菌素片段4-11的方法。

Description

溶杆菌素片段的特定制备方法
本发明涉及通过组合的化学的和酶促修饰，靶向制备溶杆菌素衍生物的方法。特别是，本发明涉及通过化学还原以及将所得产物用胰凝乳蛋白酶促裂解而制备溶杆菌素片段4-11的方法。
溶杆菌素是环酯肽，其来源于发现新抗生素的筛选程序，在细菌细胞壁的生物合成中起作用。(O′Sullivan J.等.(1988)J.Antibiot.41(12)，1740-1744和Bonner，D.P.等.(1988)J.Antibiot.41(12)，1745-1751；Tymiak，A.A.et al.(1989)J.Org.Chem.54，1149-1157)。它针对革兰氏阳性好氧和厌氧菌显示强活性。不寻常的特征是所述分子中高数量的非-蛋白原氨基酸。除了三种β-羟基氨基酸(2S，3R)-β-羟基亮氨酸、(2S，3R)-β-羟基苯丙氨酸和(2S，3S)-β-羟基天冬酰胺，还存在D-氨基酸D-亮氨酸和D-精氨酸还有异-苏氨酸(allothreonine)。天然产物溶杆菌素的这个复杂性和尺寸是靶向化学修饰的巨大障碍。
因此本发明的一个目的是提供新的和备选的溶杆菌素片段靶向合成用的合成方法，以便可以利用溶杆菌素片段制备新的抗生素。
通过靶向酶促裂解、靶向酶的生产和随后的溶杆菌素片段的连接与化学修饰例如加氢过程组合而提供解决方案。
通过用酶类诸如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和粘膜肽酶水解获得的溶杆菌素和开链形式(“开-链溶杆菌素”；式(I)的化合物)的酶消化实验显示没有(诸如在胃蛋白酶情况下，例如)或仅有不充分的酶消化(R.A.Blackburn等.(1993)Drug Metab.Dispos.21(4)，573-579)。非常缓慢的效率低的溶杆菌素酶裂解仅发生在使用的缓冲液中通过水解的环打开以后。这导致在(2S，3S)-β-羟基天冬酰胺对于侧链脱酰胺基作用所不希望的副反应。即β-羟基天冬酰胺单元转化成β-羟基天冬氨酸盐或酯。
令人意外的是，已经发现，可以利用来自二氢溶杆菌素(式(II)的化合物)和八氢溶杆菌素(式(III)的化合物)以及来自两个组分混合物的胰凝乳蛋白酶，通过酶促裂解高效率地并定量地产生溶杆菌素片段4-11。所述裂解发生如此迅速以致在反应伴侣(底物和酶)的结合以后实际上形成了片段1-3和4-11。在所述氨基酸侧链中不发生不希望的副反应。
Figure A20058004480400051
通过用氢将溶杆菌素氢解打开而获得二氢溶杆菌素和八氢溶杆菌素，由此将(2S，3R)-β-羟基苯丙氨酸单元转化成苯丙氨酸或3-环己基丙氨酸单元。然后将合成的溶杆菌素片段二氢溶杆菌素和八氢溶杆菌素用于酶促消化。
令人意外地是，二氢溶杆菌素和八氢溶杆菌素对于其它酶类也是良好的底物，以致通过所述酶的选择也可以高收率地产生其它片段。
本发明涉及制备二氢溶杆菌素和/或八氢溶杆菌素的方法，其中通过在溶剂中用氢在氢化催化剂存在下的氢解开环(hydrogenolytic ring opening)将溶杆菌素转化成二氢溶杆菌素和/或八氢溶杆菌素。
氢化催化剂是，例如，钯、钌、铑、铱和铂催化剂，或阮内镍。可以将这些催化剂用作盐(例如二氧化铂、氯化铑(III))或用作载体催化剂(例如碳载钯(碳载钯)(5-30％)或碳载铑(rhodium on carbon)(5％))。对于载体催化剂适合的载体材料是，例如，活性炭、硅藻土、硅胶、膨润土、高岭土、浮石、铝硅酸盐或氧化铝。优选的载体材料是活性炭。
还可以使用双金属催化剂或其它多组分催化剂。
优选钯催化剂，例如碳载钯(5-30％)，特别优选碳载钯(10％)。
氢解开环一般发生溶剂中，优选在室温至150℃的温度范围中，优选在室温至80℃的温度范围中，在大气压至200巴的大气压范围中，优选在3至80巴的压力中。
溶剂是，例如，醇类诸如甲醇、乙醇、或异丙醇，或醇与水的混合物，或乙酸或乙酸的水溶液，或THF-水混合物，或二噁烷-水混合物，或其它上述溶剂的三元混合物，例如异丙醇-水-乙酸。优选异丙醇-水混合物。
本发明还涉及制备溶杆菌素片段4-11和溶杆菌素片段1-3的方法，其中将二氢溶杆菌素和/或八氢溶杆菌素是酶法裂解而提供溶杆菌素片段4-11和溶杆菌素片段1-3。
优选二氢溶杆菌素和/或八氢溶杆菌素的酶裂解，其中将真核的丝氨酸蛋白酶或微生物的丝氨酸蛋白酶用作酶。
真核的丝氨酸蛋白酶是，例如，胰凝乳蛋白酶、组织蛋白酶G、糜蛋白酶或其它胰凝乳蛋白酶族的酶类，或其它在芳族氨基酸之后裂解的真核丝氨酸蛋白酶，优选胰凝乳蛋白酶。
微生物丝氨酸蛋白酶是，例如，枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶K、链霉素蛋白酶A或在芳族氨基酸之后裂解的其它酶类，优选枯草杆菌蛋白酶。
本发明还涉及二氢溶杆菌素和/或八氢溶杆菌素的酶裂解以产生较小的溶杆菌素片段的方法。
本发明因此还涉及制备溶杆菌素片段3-11和/或溶杆菌素片段5-11和/或溶杆菌素片段4-10和/或溶杆菌素片段1-9的方法，其特征在于将二氢溶杆菌素和/或八氢溶杆菌素酶裂解而提供溶杆菌素片段3-11和/或溶杆菌素片段5-11和/或溶杆菌素片段4-10和/或溶杆菌素片段1-9。
优选二氢溶杆菌素和/或八氢溶杆菌素的酶促裂解，其中将金属蛋白酶或半胱氨酸蛋白酶用作酶。
金属蛋白酶是，例如，嗜热菌蛋白酶或mycolysin。
半胱氨酸蛋白酶是，例如，木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶或无花果蛋白酶。
所述酶裂解一般发生在加入C1-C4醇或乙腈的水裂解缓冲液中，优选在10℃至40℃的温度范围中，优选在6至9的pH中，在大气压下。
水裂解缓冲液含有，例如，碳酸氢铵和脲，或磷酸钠，半胱氨酸和EDTA，或四硼酸钠，或其它包括pH6至9缓冲范围的添加剂，优选碳酸氢铵和脲。
C1-C4醇是，例如，甲醇、乙醇或异丙醇，优选甲醇。
特别优选，所述酶裂解发生在30℃至37℃的温度范围中。
所述反应介质中的乙醇浓度是0％至40％，优选10％至15％。
酶对底物(二氢溶杆菌素和/或八氢溶杆菌素)的比例是1∶1至1∶4000，优选1∶25至1∶100。
本发明还涉及溶杆菌素片段4-11用于溶杆菌素衍生物的合成。
这些溶杆菌素衍生物是其中将溶杆菌素的环状体系中的一个或多个氨基酸取代的衍生物。
本发明还涉及制备开链溶杆菌素衍生物的方法，其中将溶杆菌素片段4-11与具有C-末端芳族或疏水性氨基酸的三肽在加入C1-4醇的缓冲液介质中反应，其中所述三肽以游离酸或酯的形式存在并且其中C1-4醇在所述反应介质中的浓度大于40％。
所述C1-C4醇是，例如，甲醇、乙醇或异丙醇，优选甲醇。
优选从溶杆菌素片段4-11和三肽H-D-X-Y-Phe-OR或H-D-X-Y-(3-环己基)Ala-OR在加入甲醇的缓冲液介质中酶促合成开链溶杆菌素衍生物的方法，其中在反应介质中的甲醇浓度大于40％，
R表示氢或C1-C4-烷基，优选乙基或甲基，特别优选甲基，
D-X表示天然的或合成的D构型的α-氨基酸
和
Y表示天然的或合成的L构型的α-氨基酸。
特别优选从溶杆菌素片段4-11和三肽H-D-Leu-Leu-Phe-O甲基、H-D-Leu-Leu-Phe-OH、H-D-Leu-Leu-(3-环己基)Ala-O甲基或H-D-Leu-Leu-(3-环己基)Ala-OH酶促合成开链溶杆菌素衍生物的方法，其中将胰凝乳蛋白酶用作加入甲醇的缓冲介质中的酶，在所述反应介质中的甲醇浓度大于40％。
附图说明
图1：用胰凝乳蛋白酶的预备酶促裂解的时间过程(实施例11)。用胰凝乳蛋白酶预备酶促裂解二氢-和八氢溶杆菌素混合物的HPLC图的重叠。分离条件如实施例30下的描述中所报道(UV检测210nm)。
图2：用胰凝乳蛋白酶酶促裂解八氢溶杆菌素的时间过程(实施例5)。
用胰凝乳蛋白酶酶促裂解八氢溶杆菌素的CZE图的重叠。分离条件如实施例31下的描述中所报道(UV检测210nm)。
定义
二氢溶杆菌素：D-Leu-Leu-Phe-Leu(OH)-Leu-D-Arg-Ile-异-Thr-Gly-Asn(OH)-Ser
八氢溶杆菌素：D-Leu-Leu-Ala(3-环己基)-Leu(OH)-Leu-D-Arg-Ile-异-Thr-Gly-Asn(OH)-Ser
溶杆菌素片段4-11：Leu(OH)-Leu-D-Arg-Ile-allo-Thr-Gly-Asn(OH)-Ser
溶杆菌素片段1-3：D-Leu-Leu-Phe or D-Leu-Leu-Ala(3-环己基)
在化学和酶促反应的过程中使用的方法和分析表征在下文列出。
实施例
缩写
aq.             水的
atm             大气压(压力单位)
conc.           浓缩的
CZE             毛细管区带电泳
DCI             直接化学电离(在MS中)
DCM             二氯甲烷
DMSO            二甲基亚砜
EDTA            乙二胺四乙酸
EI              电子碰撞电离(在MS中)
ESI             电喷雾电离(在MS中)
h               小时(小时的复数)
HPLC            高压，高效液相色谱
HR              高分辨率
LC-MS           液相色谱耦合的质谱法
LL(3-环己基)A   D-Leu-Leu-(3-环己基)Ala
LLF             D-Leu-Leu-Phe
min             分钟/分钟的负数
MS              质谱法
neg.            负的
NMR             核磁共振光谱法
Pd              钯
Pd-C            碳载钯
pos.            正的
PTFE            聚四氟乙烯
quant.          定量的
RP-HPLC         反相HPLC
RT              室温
Rt     保留时间(在HPLC中)
TFA    三氟乙酸
TOF    飞行时间
UV     紫外线的
Vis    可见的
参考文献
对于肽和环酯肽的命名法，参考：
1.A Guide to IUPAC Nomenclature of Organic Compounds(Recommendations 1993)，1993，Blackwell Scientific publications.
2.Nomenclature and symbolism for amino acids and peptides.Recommendations 1983.IUPAC-IUB Joint Commission on BiochemicalNomenclature，UK.Biochemical Journal 1984，219，345-373，as well as citedliterature.
一般方法，GC-MS，LC-MS，HR-MS和HPLC
方法1(LC-MS)：仪器类型MS：Micromass ZQ；仪器类型HPLC：HP1100系列；UV DAD；柱：Phenomenex Synergi 2μ Hydro-RP Mercury 20mm×4mm；洗脱液A：11水+0.5ml的50％甲酸，洗脱液B：11乙腈+0.5ml的50％甲酸；梯度：0.0min 90％A→2.5min 30％A→3.0min 5％A→4.5min 5％A；流动：0.0min 1ml/min，2.5min/3.0min/4.5min 2ml/min；炉：50℃；UV检测：210nm。
方法2(制备的HPLC；对称；三氟乙酸)：仪器：Gilson Abimed HPLC；UV检测器210nm；双泵系统；柱：SymmetryPrepTMC18，Waters，7μm；300×19mm；洗脱液A：水中0.05％三氟乙酸，洗脱液B：乙腈中0.05％三氟乙酸；梯度：0-5min 5％B以流速20ml/min，5-30min梯度斜线从5至60％B具有下列流速的增加：从6min的22ml/min，从10min的23ml/min，从15min的24ml/min；30-35min梯度斜线从60％至98％B流速从38min减少到21ml/min；40-45min 10％B。
方法3(通过HPLC的二氢-和八氢-溶杆菌素的制备分离的方法)：柱：SymmetryPrepTMC18，Waters，7μm 300×19mm；流动25ml/min；RT；洗脱液A：水中0.2％TFA，洗脱液B：乙腈，0-10min梯度：80％A，20％B至35％A，65％B；10.01-15min：80％A，20％B；检测210nm。经由LC-MS监控级分(方法1)，在旋转蒸发器上除去乙腈并冷冻干燥。
方法4(分析的HPLC 1100，ZQ2，Phenomenex，Synergi，Hydro-RP)：仪器类型HPLC：HP 1100系列；UV DAD；柱：Phenomenex，MercuryMS，Synergi 2μ Hydro-RP 20×4mm；洗脱液A：水/0.05％甲酸，洗脱液B：乙腈；梯度：0.0-2.5min，90-30％A，流动1-2ml/min，2.5-3.0min，30-5％A，流动2.0ml/min，3.0-4.5min，5％A；炉：50℃；UV检测：210nm。
方法5(TOF-HR-MS)：利用Micromass LCT仪器(毛细管电压：3.2kV，区带电压：42V，源温度：120℃，去溶剂化温度：280℃)记录TOF-HR-MS-ESI+光谱。为此，将注射泵(Harvard Apparatus)用于样品引入。将亮氨酸脑啡肽(Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu)用作标准。
方法6(HPLC)：仪器类型HPLC：HP 1100系列；UV DAD柱：ZorbaxEclipse XBD-C8(Agilent)，150mm×4.6mm，5μm；洗脱液A：5ml的HClO4/l水，洗脱液B：乙腈；梯度：0-1min 10％B，1-4min 10-90％B，4-5min 90％B；流动：2.0ml/min；炉：30℃；UV检测：210 and 254nm.
方法7(HPLC)：柱：Kromasil RP-18，60mm×2mm，3.5μm；洗脱液A：5ml的HClO4/l水，洗脱液B：乙腈；梯度：0min 2％B，0.5min 2％B，4.5min 90％B，9min 90％B；流动：0.75ml/min；炉：30℃；UV检测：210nm。
方法8(HPLC)：柱：Kromasil RP-18，250mm×4mm，5μm；洗脱液A：5ml的HClO4/l水，洗脱液B：乙腈；梯度：0min 5％B，10min 95％B；流动：1ml/min；炉：40℃；UV检测：210nm。
方法9(HPLC)：柱：Kromasil RP-18，250mm×4mm，5μm；洗脱液A：2ml的HClO4/l水，洗脱液B：乙腈；等度：45％B，55％A；流动：1ml/min；炉：40℃；UV检测：210nm。
方法10(HPLC)：仪器：具有DAD(G1315B)，双泵(G1312A)，自动取样器(G1313A)，溶剂除气器(G1379A)和柱恒温器(G1316A)的Agilent 1100；柱：Agilent Eclipse XDB-C8 4.6×150×5mm；柱温：40℃；洗脱液A：水中0.05％的70％高氯酸；洗脱液B：甲醇；流动：2.00ml/min；等度：0-7min5 5％B。
方法11(HPLC)：分析的HPLC方法菠萝蛋白酶/胰凝乳蛋白酶裂解。将约20μg的酶促裂解产物或起始化合物在300SB-C18柱(4.6mm×125mm；3.5μm材料；300 Angstrm孔径)上色谱。作为洗脱液，使用乙腈/TFA梯度。洗脱液A：水中的0.1％TFA，洗脱液B：60％乙腈/40％水中的0.1％TFA；梯度：0min 0％B，2min 10％B，50min 80％B，52min 100％B，55min 0％B，60min 0％B；流动：0.7ml/min；柱温：40℃；检测：210nm。二氢-，八氢溶杆菌素和酶促裂解产物的蛋白质化学表征
仪器
利用来自Applied Biosystems的蛋白质序列分析仪ProciseTM进行序列分析。使用标准的序列测定程序。序列分析仪，多种序列测定程序还有PTH检测系统详细描述在操作手册User’s Manual Set，Protein SequencingSystem ProciseTM(1994)，Applied Biosystems Forster City，CA 94404，U.S.A.中。
从Applied Biosystems获得操作序列分析仪和PTH检测用的HPLC柱的试剂。
利用来自Agilent的HP1100 HPLC系统进行HPLC分析。将来自Agilent(D-Waldbronn)的Zorbax 300SB-C18柱(4.6mm×150mm；3.5μm材料；300Angstrm孔径)用于分离。
使用的试剂是HPLC品质并且是从Merck(D-Darmstadt)获得。
毛细管电泳型号270A-HT是来自Applied Biosystems。一般将样品经过不同时期流体地注入。使用的毛细管柱(50μm直径×72cm长度)是来自Applied Biosystems。分离程序和分析仪的功能充分描述在所述仪器的手册中(User′s manual capillary electrophoresis system model 270A HT；AppliedBiosystems Forster City，CA 94404，U.S.A.；1989)。
使用的试剂是生物化学品质的并且从Merck(D-Darmstadt)或Sigma(D-Deisenhofen)获得。
利用来自Eppendorf/Biotronik的LC3000氨基酸分析仪进行氨基酸分析。使用来自Eppendorf/Biotronik的稍微修改的标准分离程序。分离程序和分析仪的功能充分描述在所述仪器的手册中(Handbuch desAminosureanalysators LC 3000[handbook of the LC 3000 amino acidanalyzer]，Wissenschaftliche Gerte GmbH Biotronik，Maintal，1996)。
使用的试剂是生物化学品质的并且从Merck(D-Darmstadt)，Fluka(D-Neu-Ulm)或Sigma(D-Deisenhofen)获得。
利用来自Micromass(Manchester，UK)的ZQ-1系统测定分子量。由此经由RP-18-HPLC色谱(HP1100 system)分离片段并且通过电喷雾电离(ESI)测定分子量。进行外部校准。在仪器的手册中充分描述了所述系统的校准和机能。
使用的酶和化学品是生物化学品质的并且从Fluka，Calbiochem(D-Heidelberg)和Sigma获得。
制备色谱源15RPC的材料是从Amersham Bioscience(D-Freiburg)获得。利用来自Amersham Bioscience的KTATM系统进行制备分离。
本发明中提到的化合物还可以是盐、溶剂合物或所述盐的溶剂合物的形式。
为了本发明目的优选的盐是所述化合物的生理可接受的盐，可以根据本发明制备或使用所述盐。然而，也包含其自身不适于制药应用但是可以使用的盐，例如，用于所述化合物的离析或纯化，其可以根据本发明制备或使用，或者混盐。
可以根据本发明制备或者使用的化合物的生理可接受的盐包含无机酸、羧酸和磺酸的酸加成盐，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸、马来酸和苯甲酸的盐。
可以根据本发明制备和使用的化合物的生理可接受的盐也包括通常的碱的盐诸如，例如并优选，碱金属盐(例如钠和钾盐)、碱土金属盐(例如钙和镁盐)和从氨或具有1至16个碳原子的有机胺衍生的铵盐，诸如，例如并优选，乙胺、二乙胺、三乙胺、乙基二异丙基胺、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二环己胺、二甲氨基乙醇、普鲁卡因、二苄基胺、N-甲基吗啉、精氨酸、赖氨酸、1，2-乙二胺和N-甲基哌啶。
用于本发明目的的 溶剂合物，指通过与溶剂分子的配位作用以固态或液态形成配合物的根据本发明生产或使用的化合物的那些形式。水合物是特定形式的溶剂合物，其中与水发生所述配位作用。
实施例1
D-亮氨酰-N1-{(3S，6S，12S，15S，18R，21S，24S，27S，28R)-6-[(1S)-2-氨基-1-羟基-2-氧代-乙基]-18-(3-{[氨基-(亚氨基)甲基]氨基}丙基)-12-[(1S)-1-羟乙基]-3-(羟甲基)-24-[(1R)-1-羟基-2-甲基丙基]-21-异丁基-15-[(1S)-1-甲基-丙基]-2，5，8，11，14，17，20，23，26-九氧代-28-苯基-1--4，7，10，13，16，19，22，25-八氮杂-环二十八烷-27-基}-L-亮氨酸酰胺双三氟乙酸盐
{D-亮氨酰-L-亮氨酰-[(3R)-3-羟基-L-苯丙氨酰)]-[(3R)-3-羟基-L-亮氨酰]-L-亮氨酰-D-精氨酰-L-异亮氨酰-L-异苏氨酰-甘氨酰-[(3S)-3-羟基-L-天冬酰胺酰基]-L-丝氨酸-C1.11-O3.3-内酯双三氟乙酸盐}(溶杆菌素)
Figure A20058004480400151
发酵：
培养基：
YM：酵母-麦芽琼脂：D-葡萄糖(4g/l)，酵母提取物(4g/l)，麦芽提取物(10g/l)，1升离子交换水(Lewatit water)。在灭菌(在121℃，20分钟)之前，将pH调节到7.2。
HPM：甘露糖醇(5.4g/l)，酵母提取物(5g/l)，肉蛋白胨(3g/l)。
工作保藏物：将冷冻干燥的菌株(ATCC 53042)生长在50ml的YM培养基中。
烧瓶发酵：将11锥形烧瓶中的150ml的YM培养基或100ml的HPM培养基用2ml的工作保藏物接种，并且在28℃在240rpm的振荡器上进行生长30-48小时。
30 l发酵：将300ml的烧瓶发酵(HPM培养基)用于接种无菌的30l营养培养基溶液(1ml消泡剂SAG 5693/1)。将该培养物在28℃进行生长21小时，300rpm并且用0.3vvm的无菌空气通气。用1 M盐酸将pH在pH＝7.2保持恒定。总之，在培养期间加入880ml的1M盐酸。
主培养(2001)：将15×150ml的1l锥形烧瓶中的YM培养基用2ml的工作保藏物接种并在28℃和240rpm在振荡器上进行生长48小时。将2250ml的该培养物用于接种无菌的200 l营养培养基溶液(YM)(1ml的消泡剂SAG 5693/1)并且将其在28℃、150rpm并用0.3vvm的无菌空气通气而进行生长18.5小时。
进行每小时取样(50ml)以检验发酵过程。将1ml甲醇(0.5％三氟乙酸)加入到2ml的该培养液并且将混合物通过0.45μm过滤器过滤。将30μl的该悬浮液用HPLC分析(方法6和方法7)。
在18.5小时后，将主培养的培养液分离成上清液并在17000rpm沉积。
离析：
利用浓缩的三氟乙酸或氢氧化钠溶液将上清液(183 l)调节到pH6.5-7并且装料到Lewapol柱(OC 1064，60 l容量)。接着用纯水、水/甲醇1∶1并且随后用纯甲醇(含有0.1％三氟乙酸)进行洗脱。将该有机相真空浓缩成11.5 l的残余水残渣。
将残留的水相结合到硅胶C18并分离(MPLC，Biotage Flash 75，75×30cm，KP-C18-WP，15-20μm，流动：30ml；洗脱液：含有0.1％三氟乙酸的乙腈/水；梯度：10％，15％和40％乙腈)。将含有主要量的实施例1A的40％乙腈相真空浓缩并接着冷冻干燥(约13g)。首先在制备的HPLC(方法1)上，接着在Sephadex LH-20(5×70cm，乙腈/是1∶1，每一个情况中含有0.05％三氟乙酸)上通过凝胶过滤和进一步制备的HPLC(方法8)，将固体的混合物分离成1.2g的部分。
该过程得到2250mg的实施例1。
将 沉积物吸收在4l的丙酮/水4∶1，加入2kg的C盐，利用三氟乙酸将所述混合物调节到pH＝6，搅拌并离心。将所述溶剂真空浓缩并将残渣冷冻干燥。将获得的冻干物(89.9g)吸收在甲醇中，过滤，浓缩并在硅胶上分离(方法9)。然后用凝胶过滤(Sephadex LH-20，5x 68cm，水/乙腈9∶1(含有0.05％三氟乙酸)，流动：2.7ml/min，级分大小13.5ml)纯化实施例1A而得到纯的物质。
该过程得到447mg的实施例1。
HPLC(方法6)：Rt＝6.19min
MS(ESIpos)：m/z＝1277[M+H]+
1H NMR(500.13MHz，d6-DMSO)：δ＝0.75(d，3H)，0.78(d，6H)，0.80(t，3H)，0.82(d，3H)，0.90(d，3H)，0.91(d，3H)，0.92(d，3H)，0.95(d，3H)，0.96(d，3H)，1.05(m，1H)，1.19(d，3H)，1.25(m，2H)，1.50(m，4H)，1.51(m，2H)，1.55(m，1H)，1.61(m，1H)，1.65(m，1H)，1.84(m，1H)，1.85(m，1H)，1.86(m，1H)，1.89(m，1H)，1.95(m，1H)，2.75(m，2H)，3.40(m，1H)，3.52(m，2H)，3.53(dd，1H)，3.64(m，2H)，3.66(m，1H)，3.68(dd，1H)，3.73(m，2H)，4.00(dd，1H)，4.02(br.，1H)，4.13(br.，1H)，4.32(dd，1H)，4.39(t，1H)，4.55(m，1H)，4.75(dd，1H)，5.19(t，1H)，5.29(d，1H)，5.30(br.，1H)，5.58(m，2H)，6.68(m，3H)，6.89(d，1H)，6.93(m，3H)，6.94(br.，1H)，6.98(d，1H)，7.12(br.，1H)，7.20(br.，2H)，7.23(m，2H)，7.42(m，2H)，7.54(d，1H)，7.58(d，1H)，8.32(br.，1H)，9.18(br.，1H)，9.20(m，2H)，9.50(br.，1H)。
13C-NMR(125.77MHz，d6-DMSO)：δ＝10.3，15.3，19.0，19.2，19.6，20.0，20.9，22.0，22.4，23.0，23.2，24.3，24.4，25.0，25.4，26.0，27.8，30.9，35.4，39.5，40.8，40.9，41.6，44.1，51.5，52.7，55.9，56.2，56.4，57.9，58.8，60.2，61.1，62.6，70.1，71.6，71.7，75.5，128.1，128.6，136.7，156.8，168.2，170.1，170.4，171.2，171.5，171.9，172.2，172.4，173.7。
根据文献中描述的测定进行信号的测定(T.Kato，H.Hinoo，Y.Terui，J.Antibiot.，1988，61，719-725)。
实施例2和实施例3
D-Leu-Leu-Phe-[(3R)-Leu(3-OH)]-Leu-D-Arg-Ile-aThr-Gly-[(3S)-3-Asn(3-OH)]-Ser-三氟乙酸盐(二氢溶杆菌素)和
D-Leu-Leu-Ala(3-环己基)-[(3R)-Leu(3-OH)]-Leu-D-Arg-Ile-aThr-Gly-[(3S)-3-Asn(3-OH)]-Ser-三氟乙酸盐(八氢溶杆菌素)
二氢溶杆菌素
Figure A20058004480400181
Figure A20058004480400182
氢化方法1：
将来自实施例1的化合物(溶杆菌素，250mg，170μmol)溶解在异丙醇/水(2∶1，60ml)中并且在200 mg的Pd(在碳上10％)存在下在1atm的氢气下氢化。反应过程之后是用LC-MS(方法1)。在实际上实现转化(＞95％)以后，滤去所述催化剂，用异丙醇洗涤并且将滤出液冷冻干燥。在粗产物中，根据LC-MS，将所述产物分布如下：二氢溶杆菌素约74％，八氢溶杆菌素约12％。将残渣通过HPLC纯化(方法2)。在适合级分的冷冻干燥后，获得纯化合物实施例2(81.5mg，理论的31％)。
LC-MS：(方法1)：Rt＝1.56 min ES+：m/z＝1279[M+H]+，640.1[M+2H]2+；ES-：m/z＝1277[M-H]-，638.1[M-2H]2-。
参见氢化溶杆菌素肽序列的表1。
氢化方法2：
通过在3atm的氢气压力的氢化，在其它等同于氢化方法1的方法中，用LC-MS获得粗产物中的下列分布：二氢溶杆菌素约80％，八氢溶杆菌素约17％。在HPLC纯化(方法2)后，获得纯化合物实施例2(86mg，理论的33％)。
氢化方法3：
在3巴氢气下用延长的氢化时期或者利用更高的压力(直到80巴的氢气压力)，可以成比例地获得更多八氢溶杆菌素。在大多数情况中，不分离二氢-和八氢溶杆菌素的粗混合物，而将其直接用在酶促裂解中。
氢化方法4：
在下列情况下，同样以纯形式获得化合物八氢溶杆菌素：
将溶杆菌素(实施例1，1.04g，0.69mmol)溶解在异丙醇/水(2∶1，90ml)中并且在200mg的Pd(碳上的10％)存在下在3atm氢气下氢化7天。滤去催化剂，用异丙醇洗涤并且将滤出液在旋转蒸发器上除去异丙醇并且然后冷冻干燥。在该粗产物中，产物按照LC-MS(方法1)分布如下：二氢溶杆菌素约65％，八氢溶杆菌素约35％。将残渣用HPLC(方法2，接着是方法3)纯化。获得二氢溶杆菌素(实施例2)(280mg，理论的27％)和八氢溶杆菌素(实施例3)(212mg，理论的20％)。
LC-MS：(方法1)：Rt＝1.63min ESIpos.：m/z＝643.3(100)[M+2H]2+；ESIneg.：m/z＝1283[M-H]-，641.2[M-2H]2-。
氢化方法5：
作为在高压氢气下氢化的实施例，在40℃和50巴氢气的4天后，根据LC-MS(方法1)获得下列粗混合物：45％二氢溶杆菌素和45％八氢溶杆菌素。
氢化方法6：
将溶杆菌素双三氟乙酸盐(实施例1，500mg，0.33mmol)溶解在异丙醇/水2∶1(30ml)中。在氩气保护气氛下，加入10个百分比的碳载钯(100mg)。将所述反应混合物(在脱气后)在压力高压釜中在80-70巴氢气和RT下搅拌48h。将10％碳载钯(100mg)再次加入到所述反应。将反应混合物(脱气后)再次在压力高压釜中在80-70巴氢气和RT下搅拌48h。现在通过HPLC(例如方法4)不再检测到溶杆菌素。将反应混合物通过玻璃粉过滤(孔径2或3)，真空浓缩，再次吸收在甲醇/0.2％冰乙酸中，通过注射过滤器过滤(Biotage，PTFE)，真空浓缩并在高真空下干燥。获得496mg(定量的)的产物(80％二氢溶杆菌素，20％八氢溶杆菌素)。
氢化方法7：
将溶杆菌素单三氟乙酸盐单乙酸盐(5mg，3.45μmol)在异丙醇(2ml)，水(0.25ml)和乙酸(0.05ml)的混合物中在二氧化铂(20mg)存在下在80钯和50℃氢化。17h后，释放压力，将系统用氩气通风并且通过微滤器使悬浮液清除出催化剂。滤出液的LC-MS分析(方法4)显示理论的7％的八氢溶杆菌素(Rt＝1.54min，方法4)。
氢化方法8：
将溶杆菌素双三氟乙酸盐(实施例1A，10g，6.65mmol)溶解在异丙醇/水9∶2(110ml)中。在氩气保护气氛下，加入碳载钯(10％；5g)。将反应混合物(脱气后)在压力高压釜中在80-70巴氢气压力和40℃搅拌12h。将碳载钯(10％；5g)再次加入到所述反应。将反应混合物(脱气后)再次在压力高压釜中在80-70巴氢气压力和40℃搅拌12h。将反应混合物(脱气后)再一次在80-70巴氢气压力和40℃搅拌12h。现在通过分析的HPLC(方法10)不再检测到溶杆菌素。将反应混合物通过硅藻土过滤，真空浓缩并在高真空下干燥。获得9.17g(理论的99％)的产物(60％二氢溶杆菌素，40％八氢溶杆菌素)。
氢化方法9：
将溶杆菌素双三氟乙酸盐(实施例1A，5g，3.32mmol)溶解在异丙醇/水9∶2(110ml)中。在氩气保护气氛下，加入碳载钯(10％；5g)。将反应混合物(脱气后)在压力高压釜中在80巴氢气压力和40℃搅拌12h。将反应混合物通过硅藻土过滤，真空浓缩并在高真空下干燥。将氢化再重复三次，每次使用5.0g的溶杆菌素双三氟乙酸盐(总共：4轮)。作为合并的级分，获得18.27g的产物(二氢溶杆菌素∶八氢溶杆菌素，约5∶4)。
实施例4
二氢溶杆菌素的胰凝乳蛋白酶裂解，酶/底物比是1∶50
将200μg的二氢溶杆菌素溶解在10μl甲醇中并然后加入190μl的裂解缓冲液(0.1 M碳酸氢铵/0.5 M脲pH 8)。加入4μg胰凝乳蛋白酶(1∶50)并且在37℃进行所述反应。在0，0.5，1，3，6和24h后取30μl的等分部分并用30μl的乙腈/1％TFA终止酶裂解。将样品储存在-20℃直到用HPLC，毛细管区带电泳，序列分析，氨基酸分析，或MS研究进行分析。
关于胰凝乳蛋白酶裂解产物的肽序列参见表2。
实施例5
八氢溶杆菌素的胰凝乳蛋白酶裂解，酶底物比1∶50
将200μg八氢溶杆菌素溶解在10μl甲醇中并然后加入190μl裂解缓冲液(0.1M碳酸氢铵/0.5M脲pH 8)。加入4μg胰凝乳蛋白酶(1∶50)并且在37℃进行所述反应。在0，0.5，1，3，6和24 h后取30μl的等分部分并用30μl的乙腈/1％TFA终止酶裂解。将样品储存在-20℃直到分析。
关于胰凝乳蛋白酶裂解产物的肽序列参见表2。
实施例6
二氢-/八氢-溶杆菌素混合物的分析的胰凝乳蛋白酶裂解，酶底物比1∶25
将200μg二氢-(59％)和八氢溶杆菌素(34％)溶解在10μl甲醇中并且然后加入190μl的裂解缓冲液(0.1M碳酸氢铵/0.5M脲pH 8)。加入8μg胰凝乳蛋白酶(1∶25)并且在37℃进行所述反应。在0，0.5，1，3h后取30μl的等分部分并用30μl的乙腈/1％TFA终止酶裂解。将样品储存在-20℃直到分析。
关于胰凝乳蛋白酶裂解产物的肽序列参见表2。
实施例7
二氢-/八氢溶杆菌素混合物的分析的胰凝乳蛋白酶裂解，酶底物比1∶400
将150μg二氢-(59％)和八氢溶杆菌素(34％)溶解在15μl乙醇中并且然后加入126μl的裂解缓冲液(0.1M碳酸氢铵/0.5M脲pH 8)。加入0.38μg胰凝乳蛋白酶(9μl胰凝乳蛋白酶溶液水/乙二醇/裂解缓冲液，0.2mg/ml；1∶400)并且在37℃进行所述反应。在0，0.5，1，3h后取25μl的等分部分并用25μl的30％乙腈/0.1％TFA终止酶裂解。将样品储存在-20℃直到分析。
关于胰凝乳蛋白酶裂解产物的肽序列参见表2。
实施例8
二氢-/八氢溶杆菌素混合物的分析的胰凝乳蛋白酶裂解底物浓度6mg/ml
将900μg二氢-(59％)和八氢溶杆菌素(34％)溶解在15μl甲醇中并且然后加入99μl的裂解缓冲液(0.1M碳酸氢铵/0.5 M脲pH 8)。加入36μg胰凝乳蛋白酶(36μl胰凝乳蛋白酶溶液水/乙二醇1∶1，1mg/ml；1∶25)并且在37℃进行所述反应。在0，0.5，1，3h后取25μl的等分部分并用25μl的30％乙腈/0.1％TFA终止酶裂解。将样品储存在-20℃直到分析。
关于胰凝乳蛋白酶裂解产物的肽序列参见表2。
实施例9
二氢-/八氢溶杆菌素混合物的分析的胰凝乳蛋白酶裂解溶剂浓度30％甲醇
将150μg二氢-(59％)和八氢溶杆菌素(34％)溶解在45μl甲醇中并且然后加入99μl的裂解缓冲液(0.1M碳酸氢铵/0.5 M脲pH 8)。加入6μg胰凝乳蛋白酶(6μl胰凝乳蛋白酶溶液水/乙二醇1∶1，1mg/ml；1∶25)并且在37℃进行所述反应。在0，0.5，1，3h后取25μl的等分部分并用25μl的30％乙腈/0.1％TFA终止酶裂解。将样品储存在-20℃直到分析。
关于胰凝乳蛋白酶裂解产物的肽序列参见表2。
实施例10
二氢-/八氢溶杆菌素混合物的分析的胰凝乳蛋白酶裂解在室温裂解
将200μg二氢-(59％)和八氢溶杆菌素(34％)溶解在10μl甲醇中并且然后加入190μl的裂解缓冲液(0.1M碳酸氢铵/0.5 M脲pH 8)。加入8μg胰凝乳蛋白酶(8μl胰凝乳蛋白酶溶液水/乙二醇1∶1，1mg/ml；1∶25)并且在室温(20-25℃)进行所述反应。在0，0.5，1，3，6h后取30μl的等分部分并用30μl的30％乙腈/0.1％TFA终止酶裂解。将样品储存在-20℃直到分析。
关于胰凝乳蛋白酶裂解产物的肽序列参见表2。
实施例11
片段4-11
[(3R)-Leu(3-OH)]-Leu-D-Arg-Ile-aThr-Gly-[(3S)-3-Asn(3-OH)]-Ser三氟乙酸盐
Figure A20058004480400231
二氢溶杆菌素的制备的裂解底物浓度1mg/ml
将2×80mg二氢溶杆菌素(通过氨基酸分析测定的35.3μmol和33.8μmol纯肽)各自溶解在8ml甲醇并且然后各自加入69ml裂解缓冲液(0.1M碳酸氢铵/0.5 M脲pH 8)。在加入酶之前，将所述溶液在干燥箱中温热到37℃。加入3.2mg胰凝乳蛋白酶(3.2ml胰凝乳蛋白酶溶液水/乙二醇1∶1，1mg/ml；1∶25；预热至37℃)并且在37℃进行所述反应。在0.5，1h后取200μl的等分部分并用200μl的30％乙腈/0.1％TFA终止所述酶裂解。将所述样品在15min内用HPLC平行于酶裂解而分析(保留时间片段4-11约3.6min，片段1-3(LLF)约9.6min，条件：溶剂A 0.1％TFA，溶剂B 60％乙腈/0.1％TFA，梯度：0min 30％B，10min 80％B，11min 100％B，12min30％B，15min 30％B；流动0.7ml/min，40℃，UV检测210nm)。在大约70min后用3ml乙腈和约0.6 ml的TFA终止酶反应。溶液的pH在1和2之间。将溶液储存在-20℃直到制备的分离。
片段1-3和4-11的制备分离
将2×约80ml的裂解溶液通过过滤器(0.2μm)过滤并然后合并。将所述溶液分成4部分，每一部分约38.5ml(总共154ml)并且将每一个在Source 15RPC柱(3ml)上利用乙腈/TFA梯度进行层析。条件：溶剂A 0.1％TFA，溶剂B 0.1％TFA/乙腈；梯度：40min中的0％B至45％B；流动2ml/min；UV检测210nm。顺序进行四个运行，并且将级分收集在相同的管中。得到的层析谱是相同的。
将片段4-11(Rt＝约15min)和1-3(LLF)(Rt＝约25min)合并，用水1∶1稀释并然后冷冻干燥。
将200μl等分部分的各自池单独冷冻干燥用于氨基酸分析、分析的HPLC、毛细管区带电泳(CZE)、序列分析和质谱法。
根据氨基酸分析的片段4-11的收率是68.3μmol(理论的99％)以及片段1-3的收率是67.4μmol(理论的98％)。
实施例12
二氢/八氢溶杆菌素混合物的制备的胰凝乳蛋白酶裂解1mg/ml
批次1
将2×700mg二氢-(56％)和八氢溶杆菌素(21％)(682μmol二氢-和八氢溶杆菌素，通过氨基酸分析测定作为纯肽提供)各自溶解在70ml甲醇中并且然后各自加入602ml裂解缓冲液(0.1M碳酸氢铵/0.5M脲pH 8)。在加入酶之前，将所述溶液在干燥箱中温热到37℃。加入28mg胰凝乳蛋白酶(28ml胰凝乳蛋白酶溶液水/乙二醇1∶1，1mg/ml；1∶25；37℃预热的)并且在37℃进行反应。在0.5，1h后取200μl的等分部分并且用200μl的30％乙腈/0.1％TFA终止酶裂解。在15min内平行于酶裂解用HPLC分析所述样品(保留时间片段4-11约3.6min，片段1-3(LLF)约9.6min，片段1-3(LL(3-环己基)A)约11.3min，条件：溶剂A 0.1％TFA，溶剂B 60％乙腈/0.1％TFA，梯度：0min 30％B，10min 80％B，11min 100％B，12min30％B，15min 30％B；流动0.7ml/min，40℃，UV检测210nm)。在约60min后用30ml乙腈和约6ml的TFA终止酶反应。溶液的pH在1和2之间。可以将所述溶液保存在-20℃直到制备的分离。
批次2
将750mg二氢-(45％)和八氢溶杆菌素(48％)(468μmol二氢-和八氢溶杆菌素，通过氨基酸分析测定作为纯肽提供)溶解在77.5ml甲醇中并且然后加入667ml裂解缓冲液(0.1M碳酸氢铵/0.5M脲pH 8)。在加入酶之前，将所述溶液在干燥箱中温热到37℃。加入31mg胰凝乳蛋白酶(31ml胰凝乳蛋白酶溶液水/乙二醇1∶1，1mg/ml；1∶25；37℃预热的)并且在37℃进行反应。在0.5，1h后取200μl的等分部分并且用200μl的30％乙腈/0.1％TFA终止酶裂解。在15min内平行于酶裂解用HPLC分析所述样品(保留时间片段4-11约3.6min，片段1-3(LLF)约9.6min，片段1-3(LL(3-环己基)A)约11.3min)(溶剂A 0.1％TFA，溶剂B 60％乙腈/0.1％TFA，梯度：0min 30％B，10min 80％B，11min 100％B，12min 30％B，15min 30％B；流动0.7ml/min，温度40℃，UV检测210nm)。在60min后用30ml乙腈和约6ml的TFA终止酶反应。溶液的pH应当在1和2之间。可以将所述溶液保存在-20℃直到制备的分离。
片段1-3和4-11的制备分离
将裂解批次1和2通过过滤器(0.2μm)过滤并且然后合并。将所述溶液分成数份，并且将每一个在Source 15RPC柱上利用如上所述的乙腈/TFA梯度层析。顺序地进行所述运行并且将级分收集在相同的管中。得到的层析谱是相同的。
将片段4-11(Rt.约15min)合并，用水1∶1稀释并然后冷冻干燥。
冷冻干燥后片段4-11的收率是1.1g(1095μmol)。对于起始量的1150μmol可裂解物料，片段4-11的收率是理论的95％。
实施例13
二氢/八氢溶杆菌素混合物的制备的胰凝乳蛋白酶裂解底物浓度3mg/ml
将2×0.995g二氢-(52％)和八氢溶杆菌素(37％)各自溶解在33ml甲醇中并且然后各自加入257ml裂解缓冲液(0.1M碳酸氢铵/0.5 M脲pH 8)。在加入酶之前，将所述溶液在干燥箱中温热到37℃。加入39.6mg胰凝乳蛋白酶(39.6ml胰凝乳蛋白酶溶液水/乙二醇1∶1，1mg/ml；1∶25；37℃预热的)并且在37℃进行反应。在0.5，1h后取200μl的等分部分并且用200μl的30％乙腈/0.1％TFA终止酶裂解。在15min内平行于酶裂解用HPLC分析所述样品(保留时间片段4-11约3.6min，片段1-3(LLF)约9.6min，片段1-3(LL(3-环己基)A)约11.3min)(溶剂A 0.1％TFA，溶剂B 60％乙腈/0.1％TFA，梯度：0min 30％B，10min 80％B，11min 100％B，12min 30％B，15min 30％B；流动0.7ml/min，温度40℃，UV检测210nm)。在约60min后用30ml乙腈和约2.5ml的TFA各自终止酶反应。溶液的pH应当在1和2之间。可以将所述溶液保存在-20℃直到制备的分离。
实施例14
二氢/八氢溶杆菌素混合物的制备的胰凝乳蛋白酶裂解  底物浓度5mg/ml
将10g二氢-(约40％)和八氢溶杆菌素(约60％)溶解在200ml甲醇并且然后加入1700ml裂解缓冲液(0.1M碳酸氢铵/0.5M脲pH 8)。在酶的加入之前，将溶液在干燥箱中温热至37℃。加入400mg胰凝乳蛋白酶(100ml胰凝乳蛋白酶溶液水/乙二醇1∶1，4mg/ml；1∶25；37℃预热的)并且将所述反应在37℃进行。在0.5，1h后取200μl的等分部分并且用200μl的30％乙腈/0.1％TFA终止酶裂解。在15min内平行于酶裂解用HPLC分析所述样品(保留时间片段4-11约3.6min，片段1-3(LLF)约9.6min，片段1-3(LL(3-环己基)A)约11.3min)(溶剂A 0.1％TFA，溶剂B 60％乙腈/0.1％TFA，梯度：0min 30％B，10min 80％B，11min 100％B，12min 30％B，15min 30％B；流动0.7ml/min，温度40℃，UV检测210nm)。在约60min后用75ml乙腈和约15ml的TFA终止酶反应。溶液的pH应当在1和2之间。可以将所述溶液保存在-20℃直到制备的分离。
如上所述通过制备的HPLC在数个运行中离析片段4-11。
利用蛋白质白介素-4双突变蛋白Arg(121)→ Asp(121)/Tyr(124)→Asp(124)(BAYER Healthcare AG，D-Wuppertal)通过对照裂解检验所使用的胰凝乳蛋白酶批次的活性(70U/mg)。
实施例15
二氢溶杆菌素的枯草杆菌蛋白酶裂解
将200μg二氢溶杆菌素溶解在10μl甲醇中并且然后加入190μl裂解缓冲液(0.1M碳酸氢铵/0.5 M脲pH 8)。加入4μg枯草杆菌蛋白酶(1∶50)并且在37℃进行所述反应。在0，0.5，1，3，6和24h后取30μl等分部分并用30μl乙腈/1％TFA终止酶裂解。将所述样品保存在-20℃直到分析。
对于枯草杆菌蛋白酶裂解产物的肽序列参见表3。
实施例16
八氢溶杆菌素的枯草杆菌蛋白酶裂解
将200μg八氢溶杆菌素溶解在10μl甲醇中并且然后加入190μl裂解缓冲液(0.1 M碳酸氢铵/0.5 M脲pH 8)。加入4μg枯草杆菌蛋白酶(1∶50)并且在37℃进行所述反应。在0，0.5，1，3，6和24h后取30μl等分部分并用30μl乙腈/1％TFA终止酶裂解。将所述样品保存在-20℃直到分析。
对于枯草杆菌蛋白酶裂解产物的肽序列参见表3。
利用蛋白质白介素-4双突变蛋白Arg(121)→Asp(121)/Tyr(124)→Asp(124)(BAYER Healthcare AG，D-Wuppertal)通过对照裂解检验所使用的枯草杆菌蛋白酶批次的活性(约12U/mg)。
实施例17
二氢溶杆菌素的嗜热菌蛋白酶裂解
将200μg二氢溶杆菌素溶解在10μl甲醇中并且然后加入190μl裂解缓冲液(0.1 M三(羟甲基)氨基甲烷/5mM氯化钙pH 7.45)。加入4μg嗜热菌蛋白酶(1∶50)并且在37℃进行所述反应。在0，0.5，1，3，6和24h后取30μl等分部分并用30μl乙腈/1％TFA终止酶裂解。将所述样品保存在-20℃直到分析。
对于嗜热菌蛋白酶裂解产物的肽序列参见表4。
实施例18
八氢溶杆菌素的嗜热菌蛋白酶裂解
将200μg八氢溶杆菌素溶解在10μl甲醇中并且然后加入190μl裂解缓冲液(0.1M碳酸氢铵/0.5M脲pH 8)。加入4μg嗜热菌蛋白酶(1∶50)并且在37℃进行所述反应。在0，0.5，1，3，6和24h后取30μl等分部分并用30μl乙腈/1％TFA终止酶裂解。将所述样品保存在-20℃直到分析。
对于嗜热菌蛋白酶裂解产物的肽序列参见表4。
利用蛋白质白介素-4双突变蛋白Arg(121)→Asp(121)/Tyr(124)→Asp(124)(BAYER Healthcare AG，D-Wuppertal)通过对照裂解检验所使用的嗜热菌蛋白酶批次的活性(约55U/mg)。
实施例19
二氢溶杆菌素的木瓜蛋白酶裂解
将200μg二氢溶杆菌素溶解在10μl甲醇中并且然后加入190μl裂解缓冲液(0.1 M磷酸钠/10mM半胱氨酸，2mM EDTA pH 6.5)。加入4μg木瓜蛋白酶(1∶50)并且在37℃进行所述反应。在0，0.5，1，3，6和24h后取30μl等分部分并用30μl乙腈/1％TFA终止酶裂解。将所述样品保存在-20℃直到分析。
对于木瓜蛋白酶裂解产物的肽序列参见表5。
实施例20
八氢溶杆菌素的木瓜蛋白酶裂解
将200μg八氢溶杆菌素溶解在10μl甲醇中并且然后加入190μl裂解缓冲液(0.1M磷酸钠/10mM半胱氨酸，2mM EDTA pH 6.5)。加入4μg木瓜蛋白酶(1∶50)并且在37℃进行所述反应。在0，0.5，1，3，6和24 h后取30μl等分部分并用30μl乙腈/1％TFA终止酶裂解。将所述样品保存在-20℃直到分析。
对于木瓜蛋白酶裂解产物的肽序列参见表5。
利用蛋白质白介素-4双突变蛋白Arg(121)→ Asp(121)/Tyr(124)→Asp(124)(BAYER Healthcare AG，D-Wuppertal)通过对照裂解检验所使用的木瓜蛋白酶批次的活性(约11U/mg)。
实施例21
二氢溶杆菌素的蛋白酶K裂解
将200μg二氢溶杆菌素溶解在10μl甲醇中并且然后加入190μl裂解缓冲液(0.1 M四硼酸钠pH 9)。加入4μg蛋白酶K(1∶50)并且在37℃进行所述反应。在0，0.5，1，3，6和24h后取30μl等分部分并用30μl乙腈/1％TFA终止酶裂解。将所述样品保存在-20℃直到分析。
对于蛋白酶K裂解产物的肽序列参见表6。
实施例22
八氢溶杆菌素的蛋白酶K裂解
将200μg八氢溶杆菌素溶解在10μl甲醇中并且然后加入190μl裂解缓冲液(0.1 M四硼酸钠pH 9)。加入4μg蛋白酶K(1∶50)并且在37℃进行所述反应。在0，0.5，1，3，6和24h后取30μl等分部分并用30μl乙腈/1％TFA终止酶裂解。将所述样品保存在-20℃直到分析。
对于蛋白酶K裂解产物的肽序列参见表6。
利用蛋白质白介素-4双突变蛋白Arg(121)→Asp(121)/Tyr(124)→Asp(124)(BAYER Healthcare AG，D-Wuppertal)通过对照裂解检验所使用的蛋白酶K批次的活性(约30U/mg)。
实施例23
二氢溶杆菌素的菠萝蛋白酶裂解
将200μg二氢溶杆菌素溶解在10μl甲醇中并且然后加入190μl裂解缓冲液(0.1 M磷酸钠，10mM半胱氨酸，2mM EDTA pH 6.5)。加入4μg菠萝蛋白酶(1∶50)并且在37℃进行所述反应。在0，0.5，1，3，6和24h后取30μl等分部分并用30μl乙腈/1％TFA终止酶裂解。将所述样品保存在-20℃直到分析。
对于菠萝蛋白酶裂解产物的肽序列参见表7。
实施例24
八氢溶杆菌素的菠萝蛋白酶裂解
将200μg八氢溶杆菌素溶解在10μl甲醇中并且然后加入190μl裂解缓冲液(0.1 M磷酸钠，10mM半胱氨酸，2mM EDTA pH 6.5)。加入4μg菠萝蛋白酶(1∶50)并且在37℃进行所述反应。在0，0.5，1，3，6和24h后取30μl等分部分并用30μl乙腈/1％TFA终止酶裂解。将所述样品保存在-20℃直到分析。
对于菠萝蛋白酶裂解产物的肽序列参见表7。
利用蛋白质白介素-4双突变蛋白Arg(121)→Asp(121)/Tyr(124)→Asp(124)(BAYER Healthcare AG，D-Wuppertal)通过对照裂解检验所使用的菠萝蛋白酶批次的活性(约4U/mg)。
实施例25
用胰凝乳蛋白酶酶促合成二氢溶杆菌素
将800μg肽Leu-Leu-PheOMe和100μg肽4-11溶解在200μl甲醇并然后加入200μl合成缓冲液(0.1M四硼酸钠pH 9)。加入24μg胰凝乳蛋白酶并且在37℃进行所述反应。在0，0.5，1，3，6和24h后取30μl等分部分并用30μl乙腈/1％TFA终止所述合成。将样品保存在-20℃直到分析。
利用HPLC和CZE检测二氢溶杆菌素。
实施例26
用胰凝乳蛋白酶酶促合成二氢溶杆菌素衍生物
将800μg的肽Boc-Leu-Leu-PheOMe溶解在200μl四氯化碳并然后加入200μl含有100μg肽4-11的合成缓冲液(0.1 M四硼酸钠pH 9)。加入24μg胰凝乳蛋白酶并在37℃进行所述反应。在0，0.5，1，3，6和24h后取30μl等分部分并用30μl乙腈/1％TFA终止合成。将所述样品保存在-20℃直到分析。
用HPLC和CZE检测二氢溶杆菌素衍生物。
实施例27
用胰凝乳蛋白酶酶促合成八氢溶杆菌素
将800μg肽Leu-Leu-Ala(3-环己基)OMe和100μg肽4-11溶解在200μl甲醇并然后加入200μl合成缓冲液(0.1M四硼酸钠pH 9)。加入24μg胰凝乳蛋白酶并在37℃进行所述反应。在0，0.5，1，3，6和24 h后取30μl等分部分并用30μl乙腈/1％TFA终止合成。将样品保存在-20℃直到合成。
用HPLC和CZE检测八氢溶杆菌素衍生物。
实施例28
N-末端序列分析
将3nmol溶解在60％乙腈/0.1％TFA中的片段加载到用PolybrenR预培养的序列分析仪片上。利用通常的序列分析仪循环测定所述蛋白质序列。经由在线HPLC利用40pmol PTH标准识别PTH-氨基酸。通过它们对于标准氨基酸的相对位置识别非蛋白原的氨基酸。从第一PTH循环的氨基酸估计所述肽的纯度。将不同的肽序列测定4至12阶段。表1至7显示了测定的蛋白质序列。
表1：底物的肽序列
 肽 所述底物的测定的肽序列
 1.二氢-溶杆菌素 Leu-Leu-Phe-Leu(OH)-Leu-Arg-Ile-(异)Thr-Gly-Asn(OH)-Ser
 2.八氢-溶杆菌素 Leu-Leu-PTHAla(3-环己基)*-Leu(OH)-Leu-Arg-Ile-(异)Thr-Gly-Asn(OH)-Ser
表2：胰凝乳蛋白酶裂解不同的肽(1-3)或肽片段(1-3)的序列分析
 肽  胰凝乳蛋白酶裂解产物的测定的肽序列
 1.肽4-11  Leu(OH)-Leu-Arg-Ile-(异)Thr-Gly-Asn(OH)-Ser
 2.肽1-3  Leu-Leu-Phe
 3.肽1-3  Leu-Leu-PTHAla(3-环己基)*
*用所用的PTH系统，PTHAla(3-环己基)不可作为峰被检测。
表3：二氢-和八氢溶杆菌素(1-4)的枯草杆菌蛋白酶的不同的肽和肽片段的序列分析。裂解产物4-10仅在24小时后形成到更大程度。
    肽  枯草杆菌蛋白酶裂解产物的测定的肽序列
    1.肽4-11  Leu(OH)-Leu-Arg-Ile-(异)Thr-Gly-Asn(OH)-Ser
    2.肽4-10  Leu(OH)-Leu-Arg-Ile-(异)Thr-Gly-Asn(OH)-Ser
    3.肽1-3  Leu-Leu-Phe
    4.肽1-3  Leu-Leu-PTHAla(3-环己基)*
*用所用的PTH系统，PTHAla(3-环己基)不可作为峰被检测。
表4：二氢-和八氢溶杆菌素(1-3)的嗜热菌蛋白酶裂解的不同肽和肽片段的序列分析。
    肽  嗜热菌蛋白酶裂解产物的测定的肽序列
    1.肽3-11  Phe-Leu(OH)-Leu-Arg-Ile-(异)Thr-Gly-Asn(OH)-Ser
    2.肽3-11  PTHAla(3-环己基)*-Leu(OH)-Leu-Arg-Ile-(异)Thr-Gly-Asn(OH)
    3.肽1-2  Leu-Leu
*用所用的PTH系统，PTHAla(3-环己基)不可作为峰被检测。
表5：二氢-(1，2，3，4)和八氢溶杆菌素(1，2，3，5)的木瓜蛋白酶裂解的不同肽和肽片段的序列分析。裂解产物4-10仅在24h后形成到更大程度。
    Peptides     木瓜蛋白酶裂解产物的测定的肽序列
    1.肽5-11     Leu-Arg-Ile-(异)Thr-Gly-Asn(OH)-Ser
    2.肽5-9     Leu-Arg-Ile-(异)Thr-Gly
    3.肽10-11     Asn(OH)-Ser
    4.肽1-4     Leu-Leu-Phe-Leu(OH)
    5.肽1-4     Leu-Leu-PTHAla(3-环己基)*-Leu(OH)
*用所用的PTH系统，PTHAla(3-环己基)不可作为峰被检测。
表6：二氢-(1，2)和八氢溶杆菌素(3，4)的蛋白酶K裂解的不同肽和肽片段的序列分析
    Peptides     测定的肽序列of the proteinase K裂解产物
    1.肽4-11     Leu(OH)-Leu-Arg-Ile-(异)Thr-Gly-Asn(OH)-Ser
    2.肽5-11     Leu-Arg-Ile-(异)Thr-Gly-Asn(OH)-Ser
    4.肽4-10     Leu(OH)-Leu-Arg-Ile-(异)Thr-Gly-Asn(OH)
    5.肽5-10     Leu-Arg-Ile-(异)Thr-Gly-Asn(OH)
    6.肽1-2     Leu-Leu
表7：开链溶杆菌素(1，4)，二氢-(2，4)和八氢溶杆菌素(3，4)的菠萝蛋白酶裂解的不同肽和肽片段的序列分析。
    肽     菠萝蛋白酶裂解产物的测定的肽序列
    2.肽1-9     Leu-Leu-Phe-Leu(OH)-Leu-Arg-Ile-(异)Thr-Gly
    3.肽1-9     Leu-Leu-PTHAla(3-环己基)*-Leu(OH)-Leu-Arg-Ile-(异)Thr-Gly
    4.肽10-11     Asn(OH)-Ser
*用所用的PTH系统，PTHAla(3-环己基)不可作为峰被检测。
实施例29
氨基酸分析
氨基酸分析是表征蛋白质的重要定性和定量参数。除了蛋白质含量，在已知一级结构的情况下，测定单独的氨基酸的数目。溶杆菌素衍生物和肽片段的氨基酸分析与来自一级结构(表8)的理论值符合好。仅在相应标准存在下定量非蛋白原的氨基酸。
将100μg溶杆菌素衍生物和肽片段溶解在200μl的6 N盐酸中并在166℃水解1h。将约5nmol样品引入氨基酸分析仪中。经由4nmol氨基酸标准测定氨基酸的量。
表8：二氢-，八氢溶杆菌素，二氢-+八氢溶杆菌素，片段4-11和1-3的氨基酸分析。整数是基于Ile＝1或Leu＝2。
氨基酸 肽1-3 理论数目 肽4-11 理论数目 二氢-+八氢溶杆菌素 二氢溶杆菌素 八氢溶杆菌素 理论数目
Asx(OH) 未检测到 1 未检测到 未检测到 未检测到 1
Asx
异THR 1.04 1 0.91 1.11 1.01 1
Ser 0.59 1 0.89 0.99 0.90 1
Glx
Gly 1.11 1 1.15 1.17 1.12 1
Ala
Val
Met
Ile* 1.00 1 1.00 1.00 1.00 1
Leu* 2.00 2 1.04 1 2.93 2.33 2.53 3
Tyr
Phe 1.01 1 0.55 1.08 1
Ala(3-环己基) 未检测到 未检测到 1
Leu(OH) 未检测到 1 未检测到 未检测到 未检测到 1
Lvs
Arg 1.06 1 1.05 1.18 1.15 1
Phe(OH) 1
总AS 3.01 3 5.83 8 9.39 8.85 7.71
实施例30
反相色谱
在化学结合的反相上的蛋白质的HPLC色谱中，经由蛋白质的疏水相互作用形成所使用的对所述相的结合。根据它们结合到固定相的力，将所述肽用有机溶剂(流动相)取代所述肽。为此原因，该方法是评价肽纯度并监控酶促裂解速率和得到的裂解产物的良好标准。所述肽二氢溶杆菌素和八氢溶杆菌素从RP-18相在约35min和约38min洗脱，片段4-11在约16min，1-3(LLF)在约31min和1-3(LLA(3-环己基))在约37min。图1显示用胰凝乳蛋白酶的制备的酶促裂解的时间进程(实施例11)。
将约20μg酶促裂解产物和起始化合物二氢溶杆菌素和八氢溶杆菌素或混合物在Zorbax 300SB-C18柱(4.6mm×150mm；3.5μm材料；300angstrm孔径)上色谱。使用的洗脱液是乙腈/TFA梯度。条件：溶剂A 0.1％TFA，溶剂B 60％乙腈/0.1％TFA；流动0.7ml/min，柱温度40℃，UV检测210nm，溶剂A 0.1％TFA，溶剂B 0.1％TFA/60％乙腈；梯度：0min 0％B，2min 10％B，50min 80％B，52min 100％B，55min 0％B，60min 0％B。
实施例31
毛细管区带电泳(CZE)
毛细管电泳可以在它们的电场改变的基础上分离肽和蛋白质。分离的品质取决于使用的缓冲液、pH、温度和添加剂。使用的毛细管被称为内径为50-100μm的熔融石英柱。该方法对于评价肽的纯度以及对于监控酶促裂解产物的形成是非常好的判据。肽二氢溶杆菌素和八氢溶杆菌素在约21min从毛细管柱洗脱，片段4-11在约18min，1-3(LLF)在约24min，1-3(LLA(3-环己基))在约22min，作为双峰的脱去酰氨基的形式在约30min(1-11)和24min(4-11)。图2显示用胰凝乳蛋白酶的酶促裂解的时间进程(实施例5)。缓冲液中在24h后脱去酰氨基的产物的巨大增加可以清楚地看到。
将约4ng酶促裂解产物或起始化合物二氢溶杆菌素和八氢溶杆菌素、或混合物经由毛细管电泳在玻璃柱(长度72cm，内径50μm)上研究。条件：电流90μA，柱温25℃，100mM磷酸盐缓冲液pH 3.0，UV检测210nm，压力下装料3秒。
实施例32
通过HPLC-ESI-MS测定的分子量
通过RP-18-HPLC色谱分离肽和酶促裂解产物并且通过电喷雾电离(ESI)测定分子量。
将约100μg二氢溶杆菌素和八氢溶杆菌素的混合物的胰凝乳蛋白酶裂解用Zorbax C18-HPLC柱在下列条件下分离：溶剂A 0.1％TFA，溶剂B60％乙腈/0.1％TFA；流动0.7ml/min，柱温40℃，UV检测210nm，溶剂A0.1％TFA，溶剂B 0.1％TFA/60％乙腈；梯度：0min 0％B，2min 10％B，50min 80％B，52min 100％B，55min 0％B，60min 0％B。将所述肽转移到质谱仪的大气压离子源并且在那里电离。从那里，将所述离子转移到质谱仪的高真空区域并检测。表9显示测定的分子量。
表9：二氢溶杆菌素，八氢溶杆菌素和酶促裂解产物的分子量以道尔顿形式与理论分子量(MW)比较。
 Peptides 分子量，Da  理论分子量，Da
 1.二氢溶杆菌素 1279  1278.5
 2.八氢溶杆菌素 1285  1284.6
 3.肽4-1 1 905  905
 4.肽1-3(LLF) 391  391
 5.肽1-3(LLA(3-环己基)) 397  397
 6.肽1-9 1062  1061.5
 7.肽1-9(A(3-环己基)) 1068  1067.6
实施例33
二氢/八氢溶杆菌素混合物的制备的胰凝乳蛋白酶裂解
将18.27g二氢-和八氢溶杆菌素(约5∶4)溶解在365ml甲醇中并用胰凝乳蛋白酶(731mg)和裂解缓冲液稀释到3654ml。将所述反应在37℃进行30min并且然后用20ml的TFA和150ml乙腈终止。在加入酶之前，将溶液在干燥箱中温热至37℃。在0和0.5h后取200μl的等分部分并用200μl的30％乙腈/70％水中的0.1％TFA终止所述酶裂解。用HPLC(保留时间片段4-11约3.6min.，片段1-3(LLF)约9.6min.，片段1-3(LL(六氢)F)约11.3min.)(洗脱液A：水中0.1％TFA，洗脱液B：60％乙腈/40％水中0.1％TFA，梯度：0min 30％B，10min 80％B，11min 100％B，12min 30％B，15min 30％B；流动：0.7ml/min，柱温：40℃，检测：210nm)分析所述样品。备选地，使用方法11。将溶液分成9×500ml部分并在-70℃冷冻直到制备的RP分离。将片段4-11用制备的HPLC在数个运行中离析。
片段1-3和4-11的制备分离：
将约800ml裂解溶液通过滤筒(0.2μm)过滤并以两部分约400ml在Source 15RPC柱(column size：2360ml)上利用甲醇/TFA梯度色谱。洗脱液A：水中0.1％TFA，洗脱液B：100％甲醇中0.1％TFA；流动：30ml/min.；检测215nm。根据柱体积运行所述梯度：在应用后，将所述柱用3.6柱体积的洗脱液A洗涤，然后以18柱体积到45％B，以0.67柱体积到100％B，1.3柱体积100％B，以0.67到0％B，7柱体积的洗脱液A用于平衡。
获得了作为产物的10.36g(理论的77％)的片段4-11。
HPLC/UV-Vis(方法4)：Rt＝0.5min。
LC-MS(方法1)：Rt＝1.0min；
MS(ESIpos.)：m/z(％)＝453.6(100)[M+2H]2+，906(10)[M+H]+.
MS(ESIneg.)：m/z(％)＝904(100)[M-H]-.

Claims (11)

1.制备二氢溶杆菌素和/或八氢溶杆菌素的方法，其特征在于通过用氢在氢化催化剂存在下在溶剂中将溶杆菌素通过氢解开环转化成二氢溶杆菌素和/或八氢溶杆菌素。
2.根据权利要求1的方法，其中将钯催化剂用作氢化催化剂。
3.根据权利要求1或2的方法，其中将异丙醇-水混合物用作溶剂。
4.制备溶杆菌素片段4-11和溶杆菌素片段1-3的方法，其特征在于将二氢溶杆菌素和/或八氢溶杆菌素酶促裂解而产生溶杆菌素片段4-11和溶杆菌素片段1-3。
5.根据权利要求4的方法，其中将真核的丝氨酸蛋白酶或微生物的丝氨酸蛋白酶用作酶。
6.根据权利要求4或5的方法，其中将胰凝乳蛋白酶用作丝氨酸蛋白酶。
7.制备溶杆菌素片段3-11和/或溶杆菌素片段5-11和/或溶杆菌素片段4-10和/或溶杆菌素片段1-9的方法，其特征在于将二氢溶杆菌素和/或八氢溶杆菌素酶促裂解而产生溶杆菌素片段3-11和/或溶杆菌素片段5-11和/或溶杆菌素片段4-10和/或溶杆菌素片段1-9。
8.根据权利要求7的方法，其中将金属蛋白酶或半胱氨酸蛋白酶用作酶。
9.溶杆菌素片段4-11用于合成溶杆菌素衍生物的用途。
10.制备开链溶杆菌素衍生物的方法，其特征在于将溶杆菌素片段4-11与具有C-末端芳族或疏水性氨基酸的三肽在加入C1-4醇的缓冲液介质中反应，其中所述三肽以游离酸或酯的形式存在并且其中C1-4醇在所述反应介质中的浓度大于40％。
11.根据权利要求10的方法，其特征在于将甲醇用作C1-4醇。
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