ES2340783T3 - Procedimiento para la preparacion selectiva de fragmentos de lisobactina. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la preparación de fragmentos de lisobactina que presenta las siguientes etapas, concretamente - apertura de anillo hidrogenolítica de lisobactina usando hidrógeno en presencia de un catalizador de hidrogenación en un disolvente para la formación de dihidro-lisobactina y/u octahidro-lisobactina, - disociación enzimática de la dihidro-lisobactina y/u octahidro-lisobactina.
Description
Procedimiento para la preparación selectiva de
fragmentos de lisobactina.
La invención se refiere a procedimientos para la
preparación selectiva de derivados de lisobactina mediante
modificaciones químicas y enzimáticas combinadas. Especialmente, la
invención se refiere a un procedimiento para la preparación del
fragmento de lisobactina 4-11 mediante reducción
química y disociación de los productos formados mediante
quimotripsina.
La lisobactina es un depsipéptido cíclico que
procede de un programa de cribado para encontrar nuevos antibióticos
que intervienen en la biosíntesis de paredes celulares bacterianas
(O'Sullivan J. y col. (1988) J. Antibiot. 41 (12),
1740-1744 y Bonner, D. P. y col. (1988) J. Antibiot.
41 (12), 1745-1751; Tymiak, A. A. y col. (1989) J.
Org. Chem. 54, 1149-1157). Muestra una alta eficacia
frente a bacterias aerobias y anaerobias
Gram-positivas. Es poco común el alto número de
aminoácidos no proteinógenos en la molécula. Además de los tres
\beta-hidroxiaminoácidos
(2S,3R)-\beta-hidroxi-leucina,
(2S,3R)-\beta-hidroxi-fenilalanina
y
(2S,3S)-\beta-hidroxi-asparagina,
también se presentan los D-aminoácidos
D-leucina y D-arginina, así como
alo-treonina. Esta complejidad y el tamaño de la
sustancia natural lisobactina representan una gran dificultad para
modificaciones químicas selectivas.
Por tanto, un objetivo de la presente invención
es poner a disposición procedimientos de síntesis nuevos y
alternativos para la síntesis selectiva de fragmentos de lisobactina
para la preparación de nuevos antibióticos usando fragmentos de
lisobactina.
Una solución la ofrece la disociación enzimática
selectiva, la preparación enzimática selectiva y la posterior unión
de fragmentos de lisobactina en combinación con etapas de
modificación química, por ejemplo, la hidrogenación.
Los experimentos de digestión enzimática de
lisobactina y de la forma de cadena abierta obtenida mediante
hidrólisis ("lisobactina de cadena abierta"; compuesto de
fórmula (I)) con enzimas como pepsina, tripsina, quimotripsina y
peptidasa mucosa no mostraron ninguna digestión (como, por ejemplo,
en pepsina) o sólo una digestión enzimática insuficiente (R. A.
Blackburn y col. (1993) Drug Metab. Dispos. 21(4),
573-579). Una disociación enzimática ineficiente muy
lenta de la lisobactina sólo se produce después de la apertura del
anillo mediante hidrólisis en el tampón usado. Esto conduce como
reacción secundaria no deseada a una desamidación de las cadenas
laterales en
(2S,3S)-\beta-hidroxi-asparagina.
Es decir, la unidad de
\beta-hidroxi-asparagina se
convierte en una unidad de
\beta-hidroxi-aspartato.
Se encontró sorprendentemente que el fragmento
de lisobactina 4-11 puede prepararse con alta
eficiencia y cuantitativamente mediante disociación enzimática con
quimotripsina a partir de dihidro-lisobactina
(compuesto de fórmula (II)) y octahidro-lisobactina
(compuesto de fórmula (III)), así como a partir de una mezcla de
ambos componentes. La disociación tiene lugar tan rápidamente que
los fragmentos 1-3 y 4-11 se forman
prácticamente después de la mezcla de los correactantes (sustrato y
enzima). No tienen lugar reacciones secundarias no deseadas en las
cadenas laterales de aminoácidos.
La dihidro-lisobactina y la
octahidro-lisobactina se obtienen mediante apertura
hidrogenolítica de lisobactina con hidrógeno convirtiéndose la
unidad de
(2S,3R)-\beta-hidroxi-fenilalanina
en una fenilalanina o unidad de 3-ciclohexilalanina.
Los fragmentos de lisobactina formados
dihidro-lisobactina y
octahidro-lisobactina se usan luego para la
digestión enzimática.
Sorprendentemente, la
dihidro-lisobactina y la
octahidro-lisobactina también son buenos sustratos
para otras enzimas de manera que mediante la elección de la enzima
también pueden prepararse otros fragmentos con alto rendimiento.
Es objeto de la invención un procedimiento para
la preparación de dihidro-lisobactina y/u
octahidro-lisobactina en el que la lisobactina se
convierte en dihidro-lisobactina y/u
octahidro-lisobactina mediante apertura de anillo
hidrogenolítica con hidrógeno en presencia de un catalizador de
hidrogenación en un disolvente.
Los catalizadores de hidrogenación son, por
ejemplo, catalizadores de paladio, rutenio, rodio, iridio y platino
o níquel Raney. Estos catalizadores pueden usarse como sales (por
ejemplo, dióxido de platino, cloruro de rodio (III)) o como
catalizadores soportados (por ejemplo, paladio sobre carbón (del
5-30%) o rodio sobre carbón (del 5%)). Los
materiales de soporte adecuados para catalizadores soportados son,
por ejemplo, carbón activo, tierra de infusorios, gel de sílice,
bentonita, caolín, piedra pómez, silicatos de aluminio u óxido de
aluminio. El material de soporte preferido es carbón activo.
También pueden usarse catalizadores bimetálicos
o bien catalizadores multicomponentes.
Se prefieren catalizadores de paladio, por
ejemplo, paladio sobre carbón (del 5-30%), se
prefiere especialmente paladio sobre carbón (del 10%).
La apertura de anillo hidrogenolítica se realiza
en general en un disolvente, preferiblemente en un intervalo de
temperatura de temperatura ambiente a 150ºC, preferiblemente en un
intervalo de temperatura de temperatura ambiente a 80ºC, en un
intervalo de presión normal de presión normal a 200 bar (20 MPa),
preferiblemente en un intervalo de presión de 3 a 80 bar (0,3 a 8
MPa).
Los disolventes son, por ejemplo, alcoholes como
metanol, etanol o isopropanol o mezclas de los alcoholes con agua, o
ácido acético o disoluciones acuosas de ácido acético, o mezclas de
THF-agua, o mezclas de dioxano-agua,
o bien mezclas ternarias de los disolventes previamente mencionados,
por ejemplo, isopropanol-agua-ácido acético. Se
prefiere una mezcla de isopropanol-agua.
Otro objeto de la invención es un procedimiento
para la preparación del fragmento de lisobactina
4-11 y el fragmento de lisobactina
1-3 en el que la
dihidro-lisobactina y/o la
octahidro-lisobactina se disocian enzimáticamente
en el fragmento de lisobactina 4-11 y el fragmento
de lisobactina 1-3.
Se prefiere una disociación enzimática de
dihidro-lisobactina y/u
octahidro-lisobactina usándose como enzima una
serina proteasa eucariota o una serina proteasa microbiana.
Las serina proteasas eucariotas son, por
ejemplo, quimotripsina, catepsina G, quimasa u otras enzimas de la
familia de las quimotripsinas u otras serina proteasas eucariotas
que se disocian después de aminoácidos aromáticos, se prefiere la
quimotripsina.
Las serina proteasas microbianas son, por
ejemplo, subtilisina, proteinasa K, proteasa A de Streptomyces u
otras enzimas que se disocian después de aminoácidos aromáticos, se
prefiere la subtilisina.
La invención comprende además un procedimiento
para la disociación enzimática de
dihidro-lisobactina y/u
octahidro-lisobactina en fragmentos de lisobactina
más pequeños.
Otro objeto de la invención es
correspondientemente un procedimiento para la preparación del
fragmento de lisobactina 3-11 y/o fragmento de
lisobactina 5-11 y/o fragmento de lisobactina
4-10 y/o fragmento de lisobactina 1 -9,
caracterizado porque la dihidro-lisobactina y/o la
octahidro-lisobactina se disocian enzimáticamente
para dar el fragmento de lisobactina 3-11 y/o el
fragmento de lisobactina 5-11 y/o el fragmento de
lisobactina 4-10 y/o el fragmento de lisobactina
1-9.
Se prefiere una disociación enzimática de
dihidro-lisobactina y/u
octahidro-lisobactina usándose como enzima una
metaloproteasa o una cisteína proteasa.
Las metaloproteasas son, por ejemplo,
termolisina o micolisina.
Las cisteína proteasas son, por ejemplo,
papaína, bromelaína o ficina.
La disociación enzimática se realiza en general
en un tampón de disociación acuoso con la adición de un alcohol
C_{1}-C_{4} o acetonitrilo, preferiblemente en
un intervalo de temperatura de 10ºC a 40ºC, preferiblemente en un
intervalo de pH de 6 a 9 a presión normal.
Un tampón de disociación acuoso contiene, por
ejemplo, hidrogenocarbonato de amonio y urea, o fosfato de sodio,
cisteína y EDTA, o tetraborato de sodio, u otros aditivos con los
que se cubre un intervalo de tamponamiento de pH 6 a 9, se prefiere
el hidrogenocarbonato de amonio y la urea.
El alcohol C_{1}-C_{4} es,
por ejemplo, metanol, etanol o isopropanol, se prefiere el
metanol.
La disociación enzimática tiene lugar con
especial preferencia en un intervalo de temperatura de 30ºC a
37ºC.
La concentración de alcohol en el medio de
reacción asciende a del 0% al 40%, preferiblemente del 10% al
15%.
La relación de enzima respecto a sustrato
(dihidro-lisobactina y/u
octahidro-lisobactina) asciende a 1:1 a 1:4000,
preferiblemente a 1:25 a 1:100.
Otro objeto de la invención es un procedimiento
para la preparación de derivados de lisobactina que presenta las
siguientes etapas, concretamente
- -
- apertura de anillo hidrogenolítica de lisobactina con hidrógeno en presencia de un catalizador de hidrogenación en un disolvente para la formación de dihidro-lisobactina y/u octahidro-lisobactina,
- -
- disociación enzimática de la dihidro-lisobactina y/u octahidro-lisobactina,
- -
- unión de los fragmentos de lisobactina.
Fig. 1: Desarrollo temporal de una disociación
enzimática preparativa con quimotripsina (Ejemplo 11). Superposición
de diagramas de HPLC de una disociación enzimática preparativa con
quimotripsina de una mezcla de dihidro- y
octahidro-lisobactina. Las condiciones de separación
son como se especifican en la descripción en el Ejemplo 30
(detección UV 210 nm).
Fig. 2: Desarrollo temporal de una disociación
enzimática de octahidro-lisobactina con
quimotripsina (Ejemplo 5). Superposición de diagramas de CZE de una
disociación enzimática con quimotripsina de
octahidro-lisobactina. Las condiciones de separación
son como se especifican en la descripción en el Ejemplo 31
(detección UV 210 nm).
- Dihidro-lisobactina:
- D-Leu-Leu-Phe-Leu(OH)-Leu-D-Arg-Ile-allo-Thr-Gly-Asn(OH)-Ser
- Octahidro-lisobactina:
- D-Leu-Leu-Ala(3-ciclohexil)-Leu(OH)-Leu-D-Arg-Ile-allo-Thr-Gly-Asn(OH)-Ser
- Fragmento de lisobactina 4-11:
- Leu(OH)-Leu-D-Arg-Ile-allo-Thr-Gly-Asn(OH)-Ser
- Fragmento de lisobactina 1-3:
- D-Leu-Leu-Phe o D-Leu-Leu-Ala(3-ciclohexilo)
A continuación se citan los procedimientos
usados en el desarrollo de las reacciones químicas y enzimáticas y
las caracterizaciones analíticas.
- atm
- atmósfera (unidad de presión)
- Ej.
- ejemplo
- CZE
- electroforesis capilar de zona
- DCI
- ionización química directa (en EM)
- DCM
- diclorometano
- DMSO
- dimetilsulfóxido
- d.t.
- del teórico
- EDTA
- ácido etilendiaminotetraacético (Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)
- El
- ionización por impacto electrónico (en EM)
- ESI
- ionización por electropulverización (en EM)
- empr.
- empresa
- h
- hora(s)
- HPLC
- cromatografía líquida de alta presión, de alta resolución
- HR
- alta resolución (High Resolution)
- conc.
- concentrado
- EM-CL
- espectroscopía de masas acoplada a cromatografía de líquidos
- LLF
- D-Leu-Leu-Phe
- LL(3-ciclohexil)A
- D-Leu-Leu-(3-ciclohexil)Ala
- min
- minuto/minutos
- EM
- espectroscopía de masas
- neg.
- negativa
- RMN
- espectroscopía de resonancia magnética nuclear (nuclear magnetic resonance)
- Pd
- paladio
- Pd-C
- paladio sobre carbón
- pos.
- positiva
- %
- en porcentaje
- PTFE
- politetrafluoroetileno
- cuant.
- cuantitativo
- RP-HPLC
- HPLC en fase inversa
- TA
- temperatura ambiente
- R_{t}
- tiempo de retención (en HPLC)
- TFA
- ácido trifluoroacético
- TOF
- tiempo de vuelo (time of flight)
- UV
- ultravioleta
- Vis
- visible (visible)
- ac.
- acuoso
\vskip1.000000\baselineskip
Para la nomenclatura de péptidos y
ciclodepsipéptidos véanse:
1. A Guide to IUPAC Nomenclature of Organic
Compounds (Recommendations 1993), 1993, Blackwell
Scientific publications.
2. Nomenclature and symbolism for amino acids
and peptides. Recommendations 1983. IUPAC-IUB
Joint Commission on Biochemical Nomenclature, UK. Biochemical
Journal 1984, 219,345-373, así como la
bibliografía citada.
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento 1 (EM-CL):
tipo de instrumento de EM: Micromass ZQ; tipo de instrumento de
HPLC: HP 1100 Series; UV DAD; columna: Phenomenex Synergi 2 \mu
Hydro-RP Mercury 20 mm x 4 mm; eluyente A: 1 l de
agua + 0,5 ml de ácido fórmico al 50%, eluyente B: 1 l de
acetonitrilo + 0,5 ml de ácido fórmico al 50%; gradiente: 0,0 min
90% de A \rightarrow 2,5 min 30% de A \rightarrow 3,0 min 5% de
A \rightarrow 4,5 min 5% de A; flujo: 0,0 min 1 ml/min, 2,5
min/3,0 min/4,5 min 2 ml/min; horno: 50ºC; detección UV: 210 nm.
Procedimiento 2 (HPLC preparativa; Symmetry;
ácido trifluoroacético): instrumento: Gilson Abimed HPLC;
detector UV 210 nm; sistema de bombeo binario; columna:
SymmetryPrep™C_{18}, empresa Waters, 7 \mum; 300 x 19 mm;
eluyente A: 0,05% de ácido trifluoroacético en agua, eluyente B:
0,05% de ácido trifluoroacético en acetonitrilo; gradiente:
0-5 min 5% de B con velocidad de flujo 20 ml/min,
5-30 min rampa de gradiente del 5 al 60% de B con
los siguientes aumentos de la velocidad de flujo: 22 ml/min a partir
de 6 min, 23 ml/min a partir de 10 min, 24 ml/min a partir de 15
min; 30-35 min rampa de gradiente del 60% al 98% de
B con reducción de la velocidad de flujo a 21 ml/min a partir de 38
min; 40-45 min 10% de B.
Procedimiento 3 (procedimiento para la
separación preparativa de dihidro- y
octahidro-lisobactina mediante HPLC): columna:
SymmetryPrep™C_{18}, empresa Waters, 7 \mum 300 x 19 mm; flujo
25 ml/min; TA; eluyente A: 0,2% de TFA en agua, eluyente B:
acetonitrilo, 0-10 min gradiente: 80% de A, 20% de B
al 35% de A, 65% de B; 10,01-15 min: 80% de A, 20%
de B; detección 210 nm. Las fracciones se controlan mediante
EM-CL (Procedimiento 1), se liberan del acetonitrilo
en el rotavapor y se liofilizan.
Procedimiento 4 (HPLC analítica 1100, ZQ2,
Phenomenex, Synergi, Hydro-RP): tipo de
instrumento de HPLC: HP 1100 Series; UV DAD; columna: empresa
Phenomenex, MercuryMS, Synergi 2 \mu Hydro-RP 20 x
4 mm; eluyente A: agua/0,05% de ácido fórmico, eluyente B:
acetonitrilo; gradiente: 0,0-2,5 min,
90-30% de A, flujo 1-2 ml/min,
2,5-3,0 min, 30-5% de A, flujo 2,0
ml/min, 3,0-4,5 min, 5% de A; horno: 50ºC; detección
UV: 210 nm.
Procedimiento 5
(EM-HR-TOF): los espectros de
EM-HR-ESI+-TOF se registran con un
instrumento Micromass LCT (tensión del capilar: 3,2 KV, tensión del
cono: 42 V, temperatura de la fuente: 120ºC, temperatura de
desolvatación: 280ºC). Para esto se usa una bomba de jeringa (empr.
Harvard Apparatus) para la introducción de muestras. Como patrón
sirve leucina-encefalina
(Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu).
Procedimiento 6 (HPLC): tipo de
instrumento de HPLC: HP 1100 Series; columna UV DAD: Zorbax Eclipse
XBD-C8 (Agilent), 150 mm x 4,6 mm, 5 \mum;
eluyente A: 5 ml de HClO_{4}/I de agua, eluyente B: acetonitrilo;
gradiente: 0-1 min 10% de B, 1-4 min
10-90% de B, 4-5 min 90% de B;
flujo: 2,0 ml/min; horno: 30ºC; detección UV: 210 y 254 nm.
Procedimiento 7 (HPLC): columna: Kromasil
RP-18, 60 mm x 2 mm, 3,5 \mum; eluyente A: 5 ml de
HClO_{4}/I de agua, eluyente B: acetonitrilo; gradiente: 0 min 2%
de B, 0,5 min 2% de B, 4,5 min 90% de B, 9 min 90% de B; flujo: 0,75
ml/min; horno: 30ºC; detección UV: 210 nm.
Procedimiento 8 (HPLC): columna: Kromasil
RP-18, 250 mm x 4 mm, 5 \mum; eluyente A: 5 mi de
HClO_{4}/I de agua, eluyente B: acetonitrilo; gradiente: 0 min 5%
de B, 10 min 95% de B; flujo: 1 ml/min; horno: 40ºC; detección UV:
210 nm.
Procedimiento 9 (HPLC): columna: Kromasil
RP-18, 250 mm x 4 mm, 5 \mum; eluyente A: 2 mi de
HClO_{4}/I de agua, eluyente B: acetonitrilo; isocráticamente: 45%
de B, 55% de A; flujo: 1 ml/min; horno: 40ºC; detección UV: 210
nm.
Procedimiento 10 (HPLC): instrumento:
Agilent 1100 con DAD (G1315B), bomba binaria (G1312A), inyector
automático (G1313A), desgasificador de disolvente (G1379A) y
termostato de columna (G1316A); columna: Agilent Eclipse
XDB-C8 4,6 x 150 x 5 mm; temperatura de columna:
40ºC; eluyente A: 0,05% de ácido perclórico al 70% en agua; eluyente
B: metanol; flujo: 2,00 ml/min; isocráticamente: 0-7
min 55% de B.
Procedimiento 11 (HPLC): procedimiento de
HPLC analítica disociación con bromelaína/quimotripsina. Se
cromatografían aproximadamente 20 \mug del producto de disociación
enzimática o de los compuestos de partida en una columna
300SB-C18 (4,6 mm x 125 mm; material de 3,5 \mum;
diámetro de poro de 300 Angström). Como eluyente se usa un gradiente
de acetonitrilo/TFA. Eluyente A: 0,1% de TFA en agua, eluyente B:
0,1% de TFA en 60% de acetonitrilo/40% de agua; gradiente: 0 min 0%
de B, 2 min 10% de B, 50 min 80% de B, 52 min 100% de B, 55 min 0%
de B, 60 min 0% de B; flujo: 0,7 ml/min; temperatura de la columna:
40ºC; detección: 210 nm.
Los análisis de secuencias se realizan con un
secuenciador de proteínas Procise™ de la empr. Applied Biosystems.
Se usa el programa de secuenciación estándar. El secuenciador, los
distintos programas de secuenciación, así como el sistema de
detección de PTH se describen en detalle en el manual de usuario
User's Manual Set, Protein Sequencing System Procise™ (1994),
Applied Biosystems Forster City, CA 94404, EE.UU.
Los reactivos para el funcionamiento del
secuenciador y la columna de HPLC para la detección de PTH se
compran en Applied Biosystems.
Los análisis de HPLC se realizan con un sistema
de HPLC HP1100 de Agilent. Para las separaciones se usa una columna
Zorbax 300SB-C18 (4,6 mm x 150 mm; material de 3,5
\mum; diámetro de poro de 300 Angström) de Agilent
(D-Waldbronn).
Los reactivos usados son de calidad para HPLC y
se compran en Merck (D-Darmstadt).
La electroforesis capilar modelo
270A-HT es de Applied Biosystems. Las muestras se
inyectan generalmente hidrodinámicamente durante distintos
intervalos de tiempo. La columna capilar usada (50 \mum de
diámetro x 72 cm de longitud) es de Applied Biosystems. Los
programas de separación y el funcionamiento del analizador se
describen detalladamente en el manual de usuario del instrumento
(User's manual capillary electrophoresis system model 270A HT;
Applied Biosystems Forster City, CA 94404, EE.UU.; 1989).
Los reactivos usados son de calidad bioquímica y
se compran en Merck (D-Darmstadt) o Sigma
(D-Deisenhofen).
Los análisis de aminoácidos se realizan con un
analizador de aminoácidos LC3000 de Eppendorf/Biotronik. Se usa un
programa de separación estándar ligeramente modificado de
Eppendorf/Biotronik. Los programas de separación y el funcionamiento
del analizador se describen detalladamente en el manual de usuario
del instrumento (Handbuch des Aminosäureanalysators LC 3000,
Wissenschaftliche Geräte GmbH Biotronik, Maintal, 1996).
Los reactivos usados son de calidad bioquímica y
se compran en Merck (D-Darmstadt), Fluka
(D-Neu-Ulm) o Sigma
(D-Deisenhofen).
Los pesos moleculares se determinan con un
sistema ZQ-1 de Micromass (Manchester, RU). Los
fragmentos se separan a este respecto mediante cromatografía
RP-18-HPLC (sistema HP1100) y el
peso molecular se determina mediante ionización por
electropulverización (ESI). Se realiza un calibrado externo. El
calibrado y el funcionamiento del sistema se describen
detalladamente en el manual de usuario del instrumento.
Las enzimas y productos químicos usados son de
calidad bioquímica y se compran en las empresas Fluka, Calbiochem
(D-Heidelberg) y Sigma.
El material para la cromatografía preparativa
Source 15RPC se compra en Amersham Bioscience
(D-Friburgo). La separación preparativa se realiza
con un sistema ÄKTA™ de Amersham Bioscience.
Los compuestos químicos mencionados en la
invención también pueden presentarse en forma de sales, solvatos o
solvatos de las sales.
Como sales se prefieren en el marco de la
presente invención sales fisiológicamente inocuas de los compuestos
que pueden prepararse o usarse según la invención. Pero también
están comprendidas sales que por sí mismas no son adecuadas para
aplicaciones farmacéuticas pero pueden usarse, por ejemplo, para el
aislamiento o la purificación de los compuestos que pueden
prepararse o usarse según la invención o sales mixtas.
Las sales fisiológicamente inocuas de los
compuestos que pueden prepararse o usarse según la invención
comprenden sales de adición de ácido de ácidos minerales, ácidos
carboxílicos y ácidos sulfónicos, por ejemplo, sales de ácido
clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico,
ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido toluenosulfónico,
ácido bencenosulfónico, ácido naftalendisulfónico, ácido acético,
ácido trifluoroacético, ácido propiónico, ácido láctico, ácido
tartárico, ácido málico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido
maleico y ácido benzoico.
Las sales fisiológicamente inocuas de los
compuestos que pueden prepararse o usarse según la invención también
comprenden sales de bases habituales como a modo de ejemplo y
preferiblemente sales de metales alcalinos (por ejemplo, sales de
sodio y potasio), sales alcalinotérreas (por ejemplo, sales de
calcio y magnesio) y sales de amonio derivadas de amoniaco o aminas
orgánicas con 1 a 16 átomos de C como a modo de ejemplo y
preferiblemente etilamina, dietilamina, trietilamina,
etildiisopropilamina, monoetanolamina, dietanolamina,
trietanolamina, diciclohexilamina, dimetilaminoetanol, procaína,
dibencilamina, N-metilmorfolina, arginina, lisina,
etilendiamina y N-metilpiperidina.
Como solvatos se denominan en el marco de
la invención aquellas formas de los compuestos que pueden prepararse
o usarse según la invención que en estado sólido o líquido forman un
complejo mediante coordinación con moléculas de disolvente. Los
hidratos son una forma especial de los solvatos en los que la
coordinación se realiza con agua.
\newpage
Ejemplo
1
YM: agar de
levadura-malta: D-glucosa (4 g/l),
extracto de levadura (4 g/l), extracto de malta (10 g/l), 1 litro de
agua con Lewatit. Antes de la esterilización (20 minutos a 121ºC) se
ajusta el pH a 7,2.
HPM: manitol (5,4 g/l), extracto de
levadura (5 g/l), peptona de carne (3 g/l).
Conserva de trabajo: la cepa liofilizada (ATCC
53042) se cultiva en 50 ml de medio YM.
Fermentación en matraz: se inoculan 150
ml de medio YM o 100 ml de medio HPM en un matraz Erlenmeyer de 1 l
con 2 ml de la conserva de trabajo y se dejan crecer durante
30-48 horas a 28ºC en un agitador a 240 rpm.
Fermentación de 30 l: 300 ml de la
fermentación en matraz (medio HPM) se usan para inocular una
disolución de medio nutriente de 30 l estéril (1 ml de Antifoam SAG
5693/1). Este cultivo se deja crecer durante 21 horas a 28ºC, 300
rpm y una aireación con aire estéril de 0,3 vvm. El pH se mantiene
constante con ácido clorhídrico 1 M a pH = 7,2. En total, durante el
tiempo de cultivo se añaden 880 ml de ácido clorhídrico 1 M.
Cultivo principal (200 l): se inoculan 15
x 150 ml de medio YM en matraces Erlenmeyer de 1 l con 2 ml de la
conserva de trabajo y se dejan crecer a 28ºC durante 48 horas y 240
rpm en el agitador. 2250 ml de este cultivo se usan para inocular
una disolución de medio nutriente de 200 l estéril (YM) (1 ml de
Antifoam SAG 5693/1) y se dejan crecer durante 18,5 horas a 28ºC,
150 rpm y una aireación con aire estéril de 0,3 vvm.
Para controlar el desarrollo de la fermentación,
cada hora se sacan muestras (50 ml). 2 ml de este caldo de cultivo
se mezclan con 1 ml de metanol (ácido trifluoroacético al 0,5%) y se
filtran a través de un filtro de 0,45 \mum. 30 \mul de esta
suspensión se analizan mediante HPLC (Procedimiento 6 y
Procedimiento 7.
Después de 18,5 horas, el caldo de cultivo del
cultivo principal se separa a 17000 rpm en sobrenadante y
sedimento.
El sobrenadante (183 l) se ajusta a pH
6,5 a 7 con ácido trifluoroacético concentrado o solución cáustica y
se aplica a una columna Lewapol (OC 1064, contenido de 60 l). A
continuación se eluye con agua pura, agua/metanol 1:1 y a
continuación con metanol puro (con ácido trifluoroacético al 0,1%).
Esta fase orgánica se concentra a vacío hasta dar un resto acuoso
restante de 11,5 l.
La fase acuosa restante se une a gel de sílice
C_{18} y se separa (MPLC, Biotage Flash 75, 75 x 30 cm,
KP-C18-WP, 15-20
\mum, flujo: 30 ml; eluyente: acetonitrilo/agua con ácido
trifluoroacético al 0,1%; gradiente: 10%, 15% y 40% de
acetonitrilo). La fase de 40% de acetonitrilo, que contiene la
cantidad principal del Ejemplo 1A, se concentra a vacío y a
continuación se liofiliza (aproximadamente 13 g). Esta mezcla de
sólidos se separa inicialmente en porciones de 1,2 g en una HPLC
preparativa (Procedimiento 1), a continuación mediante filtración en
gel en Sephadex LH-20 (5 x 70 cm, acetonitrilo/agua
1:1, respectivamente con ácido trifluoroacético al 0,05%) y otra
HPLC preparativa (Procedi-
miento 8).
miento 8).
Este proceso proporciona 2250 mg del Ejemplo
1.
El sedimento se recoge en 41 de
acetona/agua 4:1, se mezcla con 2 kg de Celite, se ajusta a pH = 6
con ácido trifluoroacético, se agita y se centrifuga. El disolvente
se concentra a vacío y el residuo se liofiliza. El liofilizado
obtenido (89,9 g) se recoge en metanol, se filtra, se concentra y se
separa en gel de sílice (Procedimiento 9). El Ejemplo 1A se purifica
después mediante filtración en gel (Sephadex LH-20,
5 x 68 cm, agua/acetonitrilo 9:1 (con ácido trifluoroacético al
0,05%), flujo: 2,7 ml/min. Tamaño de fracciones 13,5 ml) para dar la
sustancia pura. Este proceso proporciona 447 mg del Ejemplo 1.
HPLC (Procedimiento 6): R_{t} = 6,19 min
EM (ESIpos): m/z = 1277 [M+H]^{+}
RMN ^{1}H (500,13 MHz,
d_{6}-DMSO): \delta = 0,75 (d, 3H), 0,78 (d,
6H), 0,80 (t, 3H), 0,82 (d, 3H), 0,90 (d, 3H), 0,91 (d, 3H), 0,92
(d, 3H), 0,95 (d, 3H), 0,96 (d, 3H), 1,05 (m, 1H), 1,19 (d, 3H),
1,25 (m, 2H), 1,50 (m, 4H), 1,51 (m, 2H), 1,55 (m, 1H), 1,61 (m,
1H), 1,65 (m, 1H), 1,84 (m, 1H), 1,85 (m, 1H), 1,86 (m, 1H), 1,89
(m, 1H), 1,95 (m, 1H), 2,75 (m, 2H), 3,40 (m, 1H), 3,52 (m, 2H),
3,53 (dd, 1H), 3,64 (m, 2H), 3,66 (m, 1H), 3,68 (dd, 1H), 3,73 (m,
2H), 4,00 (dd, 1H), 4,02 (a, 1H), 4,13 (a, 1H), 4,32 (dd, 1H), 4,39
(t, 1H), 4,55 (m, 1H), 4,75 (dd, 1H), 5,19 (t, 1H), 5,29 (d, 1H),
5,30 (a, 1H), 5,58 (m, 2H), 6,68 (m, 3H), 6,89 (d, 1H), 6,93 (m,
3H), 6,94 (a, 1H), 6,98 (d, 1H), 7,12 (a, 1H), 7,20 (a, 2H), 7,23
(m, 2H), 7,42 (m, 2H), 7,54 (d, 1H), 7,58 (d, 1H), 8,32 (a, 1H),
9,18 (a, 1H), 9,20 (m, 2H), 9,50
(a, 1H).
(a, 1H).
RMN ^{13}C (125,77 MHz,
d_{6}-DMSO): \delta = 10,3, 15,3, 19,0, 19,2,
19,6, 20,0, 20,9, 22,0, 22,4, 23,0, 23,2, 24,3, 24,4, 25,0, 25,4,
26,0, 27,8, 30,9, 35,4, 39,5, 40,8, 40,9, 41,6, 44,1, 51,5, 52,7,
55,9, 56,2, 56,4, 57,9, 58,8, 60,2, 61,1, 62,6, 70,1, 71,6, 71,7,
75,5, 128,1, 128,6, 136,7, 156,8, 168,2, 170,1, 170,4, 171,2, 171,5,
171,9, 172,2, 172,4, 173,7.
La asignación de las señales se realizó según la
asignación descrita en la bibliografía (T. Kato, H. Hinoo, Y. Terui,
J. Antibiot., 1988, 61, 719-725).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2 y Ejemplo
3
y
\vskip1.000000\baselineskip
Se disuelve el compuesto del Ejemplo 1
(lisobactina, 250 mg, 170 pmol) en isopropanol/agua (2:1, 60 ml) y
se hidrogena en presencia de 200 mg de Pd (10% sobre carbón) a 1 atm
(0,1 MPa) de hidrógeno. El desarrollo de la reacción se sigue
mediante EM-CL (Procedimiento 1). Después de la
conversión casi completa (>95%), el catalizador se separa por
filtración, se lava con isopropanol y el filtrado se liofiliza. En
este producto bruto, los productos se distribuyen según
EM-CL del siguiente modo:
dihidro-lisobactina aproximadamente el 74%,
octahidro-lisobactina aproximadamente el 12%. El
residuo se purifica por HPLC (Procedimiento 2). Después de la
liofilización de las fracciones adecuadas se obtiene el compuesto
puro Ejemplo 2 (81,5 mg, 31% d.t.).
EM-CL: (Procedimiento 1):
R_{t} = 1,56 min ES+: m/z = 1279 [M + H]^{+}, 640,1 [M +
2H]^{2+}; ES^{-}: m/z = 1277 [M - H]^{-}, 638,1
[M - 2H]^{2-}.
Véase la Tabla 1 para secuencias de péptidos de
la hidro-lisobactina.
Con hidrogenación a presión de hidrógeno de 3
atm (0,3 MPa), en el procedimiento por lo demás idéntico al
Procedimiento de hidrogenación 1 se obtiene la siguiente
distribución determinada por EM-CL en el producto
bruto: dihidro-lisobactina aproximadamente el 80%,
octahidro-lisobactina aproximadamente el 17%.
Después de la purificación por HPLC (Procedimiento 2) se obtiene el
compuesto puro Ejemplo 2 (86 mg, 33% d.t.).
Con un periodo de hidrogenación prolongado a 3
bar (0,3 MPa) de hidrógeno o con más presión (hasta 80 bar (8 MPa)
de presión de hidrógeno) puede obtenerse proporcionalmente más
octahidro-lisobactina. En la mayoría de los casos,
las mezclas brutas de dihidro- y
octahidro-lisobactina no se separan, sino que se
usan directamente en la disociación enzimática.
En el siguiente caso, el compuesto
octahidro-lisobactina también se aísla en forma
pura.
Se disuelve lisobactina (Ejemplo 1, 1,04 g, 0,69
mmol) en isopropanol/agua (2:1, 90 ml) y se hidrogena en presencia
de 200 mg de Pd (10% sobre carbón) a 3 atm (0,3 MPa) de hidrógeno
durante 7 días. El catalizador se separa por filtración, se lava con
isopropanol y el filtrado se libera del isopropanol en rotavapor y
luego se liofiliza. En este producto bruto, los productos se
distribuyen según EM-CL (Procedimiento 1) del
siguiente modo: dihidro-lisobactina aproximadamente
el 65%, octahidro-lisobactina aproximadamente el
35%. El residuo se purifica por HPLC (Procedimiento 2, a
continuación Procedimiento 3). Se obtienen
dihidro-lisobactina (Ejemplo 2) (280 mg, 27% d.t.) y
octahidro-lisobactina (Ejemplo 3) (212 mg, 20%
d.t.).
EM-CL: (Procedimiento 1):
R_{t} = 1,63 min ESIpos.: m/z = 643,3 (100) [M +
2H]^{2+}; ESIneg.: m/z = 1283 [M - H]^{-}, 641,2
[M – 2H]^{2-}.
Como ejemplo de una hidrogenación a alta presión
de hidrógeno, después de 4 días a 40ºC y 50 bar (5 MPa) de hidrógeno
se obtiene la siguiente mezcla bruta según EM-CL
(Procedimiento 1): 45% de dihidro-lisobactina y 45%
de octahidro-lisobactina.
Se disuelve bistrifluoroacetato de lisobactina
(Ejemplo 1, 500 mg, 0,33 mmol) en isopropanol/agua 2:1 (30 ml). Bajo
atmósfera protectora de argón se añade el 10% de paladio sobre
carbón (100 mg). La mezcla de reacción se agita (después de la
desgasificación) en un autoclave a presión a 80-70
bar (8-7 MPa) de hidrógeno y se agita a TA durante
48 h. Para la reacción se añade de nuevo 10% de paladio sobre carbón
(100 mg). La mezcla de reacción se agita de nuevo (después de la
desgasificación) en un autoclave a presión a 80-70
bar (8-7 MPa) de hidrógeno y se agita a TA durante
48 h. Ahora ya no puede detectarse más lisobactina mediante HPLC
(por ejemplo, Procedimiento 4). La mezcla de reacción se filtra a
través de una frita de vidrio (tamaño de poro de 2 ó 3), se
concentra a vacío, de nuevo se recoge en metanol/0,2% de ácido
acético glacial, se filtra a través de un filtro de jeringa (empr.
Biotage, PTFE), se concentra a vacío y se seca a alto vacío. Se
obtienen 496 mg (cuant.) de producto (80% de
dihidro-lisobactina, 20% de
octahidro-lisobactina).
Se hidrogena monoacetato de monotrifluoroacetato
de lisobactina (5 mg, 3,45 \mumol) en una mezcla de isopropanol (2
ml), agua (0,25 ml) y ácido acético (0,05 ml) en presencia de
dióxido de platino (20 mg) a 80 bar (8 MPa) y 50ºC. Después de 17 h,
la presión se alivia, se ventila con argón y la suspensión se libera
del catalizador mediante microfiltros. El análisis de
EM-CL del filtrado (Procedimiento 4) muestra el 7%
d.t. de octahidro-lisobactina (R_{t} = 1,54 min,
Procedimiento 4).
Se disuelve bistrifluoroacetato de lisobactina
(Ejemplo 1A, 10 g, 6,65 mmol) en isopropanol/agua 9:2 (110 ml). Bajo
atmósfera protectora de argón se añade paladio sobre carbón (del
10%; 5 g). La mezcla de reacción se agita (después de la
desgasificación) en un autoclave a presión a 80-70
bar (8-7 MPa) de presión de hidrógeno y 40ºC durante
12 h. Para la reacción se añade de nuevo paladio sobre carbón (del
10%; 5 g). La mezcla de reacción se agita de nuevo (después de la
desgasificación) en un autoclave a presión a 80-70
bar (8-7 MPa) de presión de hidrógeno y 40ºC durante
12 h. La mezcla de reacción se agita otra vez más (después de la
desgasificación) en un autoclave a presión a 80-70
bar (8-7 MPa) de presión de hidrógeno y 40ºC durante
12 h. Ahora ya no puede detectarse más lisobactina mediante HPLC
analítica (Procedimiento 10). La mezcla de reacción se filtra a
través de tierra de infusorios, se concentra a vacío y se seca a
alto vacío. Se obtienen 9,17 g (99% d.t.) de producto (60% de
dihidrolisobactina, 40% de octahidrolisobactina).
Se disuelve bistrifluoroacetato de lisobactina
(Ejemplo 1A, 5 g, 3,32 mmol) en isopropanol/agua 9:2 (110 ml). Bajo
atmósfera protectora de argón se añade paladio sobre carbón (del
10%; 5 g). La mezcla de reacción se agita (después de la
desgasificación) en un autoclave a presión a 80 bar (8 MPa) de
presión de hidrógeno y 40ºC durante 12 h. La mezcla de reacción se
filtra a través de tierra de infusorios, se concentra a vacío y se
seca a alto vacío. La hidrogenación se repite otras tres veces cada
vez con 5,0 g de bistrifluoroacetato de lisobactina (total: 4
pases). Como fracción de producto reunida se obtienen 18,27 g de
producto (dihidrolisobactina:octahidrolisobactina, aproximadamente
5:4).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se disuelven 200 \mug de
dihidro-lisobactina en 10 \mul de metanol y luego
se mezclan con 190 \mul de tampón de disociación
(hidrogenocarbonato de amonio 0,1 M/urea 0,5 M, pH 8). Se añaden 4
\mug de quimotripsina (1:50) y la reacción se realiza a 37ºC. Se
toman alícuotas de 30 \mul después de 0, 0,5, 1, 3, 6 y 24 h y la
disociación con enzima se detiene con 30 \mul de acetonitrilo/1%
de TFA. Las muestras se guardan hasta análisis por HPLC,
electroforesis capilar de zona, análisis de secuencias, análisis de
aminoácidos o investigación de EM a -20ºC.
Véase la Tabla 2 para las secuencias de péptidos
de los productos de disociación con quimotripsina.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se disuelven 200 \mug de
octahidro-lisobactina en 10 \mul de metanol y
luego se mezclan con 190 \mul de tampón de disociación
(hidrogenocarbonato de amonio 0,1 M/urea 0,5 M, pH 8). Se añaden 4
\mug de quimotripsina (1:50) y la reacción se realiza a 37ºC. Se
toman alícuotas de 30 \mul después de 0, 0,5, 1, 3, 6 y 24 h y la
disociación con enzima se detiene con 30 \mul de acetonitrilo/1%
de TFA. Las muestras se guardan hasta el análisis a -20ºC.
Véase la Tabla 2 para las secuencias de péptidos
de los productos de disociación con quimotripsina.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Se disuelven 200 \mug de dihidro- (59%) y
octahidro-lisobactina (34%) en 10 \mul de metanol
y luego se mezclan con 190 \mul de tampón de disociación
(hidrogenocarbonato de amonio 0,1 M/urea 0,5 M, pH 8). Se añaden 8
\mug de quimotripsina (1:25) y la reacción se realiza a 37ºC. Se
toman alícuotas de 30 \mul después de 0, 0,5, 1, 3 h y la
disociación con enzima se detiene con 30 \mul de acetonitrilo/1%
de TFA. Las muestras se guardan hasta el análisis a -20ºC.
Véase la Tabla 2 para las secuencias de péptidos
de los productos de disociación con quimotripsina.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Se disuelven 150 \mug de dihidro- (59%) y
octahidro-lisobactina (34%) en 15 \mul de etanol y
luego se mezclan con 126 \mul de tampón de disociación
(hidrogenocarbonato de amonio 0,1 M/urea 0,5 M, pH 8). Se añaden
0,38 \mug de quimotripsina (9 \mul de disolución de
quimotripsina agua/etilenglicol/tampón de disociación, 0,2 mg/ml;
1:400) y la reacción se realiza a 37ºC. Se toman alícuotas de 25
\mul después de 0, 0,5, 1, 3 h y la disociación con enzima se
detiene con 25 \mul de 30% de acetonitrilo/0,1% de TFA. Las
muestras se guardan hasta el análisis a -20ºC.
Véase la Tabla 2 para las secuencias de péptidos
de los productos de disociación con quimotripsina.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Se disuelven 900 \mug de dihidro- (59%) y
octahidro-lisobactina (34%) en 15 \mul de metanol
y luego se mezclan con 99 \mul de tampón de disociación
(hidrogenocarbonato de amonio 0,1 M/urea 0,5 M, pH 8). Se añaden 36
\mug de quimotripsina (36 \mul de disolución de quimotripsina
agua/etilenglicol 1:1,1 mg/ml; 1:25) y la reacción se realiza a
37ºC. Se toman alícuotas de 25 \mul después de 0, 0,5, 1, 3 h y la
disociación con enzima se detiene con 25 \mul de 30% de
acetonitrilo/0,1% de TFA. Las muestras se guardan hasta el análisis
a -20ºC.
Véase la Tabla 2 para las secuencias de péptidos
de los productos de disociación con quimotripsina.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
Se disuelven 150 \mug de dihidro- (59%) y
octahidro-lisobactina (34%) en 45 \mul de metanol
y luego se mezclan con 99 \mul de tampón de disociación
(hidrogenocarbonato de amonio 0,1 M/urea 0,5 M, pH 8). Se añaden 6
\mug de quimotripsina (6 \mul de disolución de quimotripsina
agua/etilenglicol 1:1,1 mg/ml; 1:25) y la reacción se realiza a
37ºC. Se toman alícuotas de 25 \mul después de 0, 0,5, 1, 3 h y la
disociación con enzima se detiene con 25 \mul de 30% de
acetonitrilo/0,1% de TFA. Las muestras se guardan hasta el análisis
a -20ºC.
Véase la Tabla 2 para las secuencias de péptidos
de los productos de disociación con quimotripsina.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
Se disuelven 200 \mug de dihidro- (59%) y
octahidro-lisobactina (34%) en 10 \mul de metanol
y luego se mezclan con 190 \mul de tampón de disociación
(hidrogenocarbonato de amonio 0,1 M/urea 0,5 M, pH 8). Se añaden 8
\mug de quimotripsina (8 \mul de disolución de quimotripsina
agua/etilenglicol 1:1, 1 mg/ml; 1:25) y la reacción se realiza a
temperatura ambiente (20-25ºC). Se toman alícuotas
de 30 \mul después de 0, 0,5, 1, 3, 6 h y la disociación con
enzima se detiene con 30 \mul de 30% de acetonitrilo/1% de TFA.
Las muestras se guardan hasta el análisis a -20ºC.
Véase la Tabla 2 para las secuencias de péptidos
de los productos de disociación con quimotripsina.
\newpage
Ejemplo
11
Se disuelven 2 x 80 mg de
dihidro-lisobactina (35,3 \mumol y 33,8 \mumol
de péptido puro determinado por análisis de aminoácidos) en cada vez
8 ml de metanol y luego se mezclan cada vez con 69 ml de tampón de
disociación (hidrogenocarbonato de amonio 0,1 M/urea 0,5 M, pH 8).
Antes de la adición de enzima, las disoluciones se calientan en la
estufa de secado a 37ºC. Se añaden 3,2 mg de quimotripsina (3,2 ml
de disolución de quimotripsina agua/etilenglicol 1:1, 1 mg/ml; 1:25;
precalentada a 37ºC) y las reacciones se realizan a 37ºC. Se toman
alícuotas de 200 \mul después de 0,5, 1 h y las disociaciones con
enzimas se detienen con 200 \mul de 30% de acetonitrilo/0,1% de
TFA. Las muestras se analizan con HPLC en paralelo a las
disociaciones con enzimas en el plazo de 15 min (tiempo de retención
del fragmento 4-11 aproximadamente 3,6 min,
fragmento 1-3 (LLF) aproximadamente 9,6 min,
condiciones: disolvente A 0,1% de TFA, disolvente B 60% de
acetonitrilo/0,1% de TFA, gradiente: 0 min 30% de B, 10 min 80% de
B, 11 min 100% de B, 12 min 30% de B, 15 min 30% de B; flujo 0,7
ml/min, 40ºC, detección UV 210 nm). Las reacciones enzimáticas se
detienen después de aproximadamente 70 min con 3 ml de acetonitrilo
y aproximadamente 0,6 ml de TFA. El valor de pH de la disolución se
encuentra entre 1 y 2. Las disoluciones pueden guardarse a -20ºC
hasta la separación preparativa.
Se filtran 2 x aproximadamente 80 ml de las
disoluciones de disociación a través de un filtro (0,2 \mum) y
luego se reúnen. La disolución se divide en cuatro porciones cada
una de aproximadamente 38,5 ml (total 154 ml) y se cromatografían
respectivamente en una columna Source 15RPC (3 ml) con un gradiente
de acetonitrilo/TFA. Condiciones: disolvente A 0,1% de TFA,
disolvente B 0,1% de TFA/acetonitrilo; gradiente: 0% de B al 45% de
B en 40 min; flujo 2 ml/min; detección UV 210 nm. Las cuatro pasadas
se realizan sucesivamente y las fracciones se recogen en el mismo
tubo. Los cromatogramas resultantes son congruentes.
Los fragmentos 4-11 (R_{t} =
aproximadamente 15 min) y 1-3 (LLF) (R_{t} =
aproximadamente 25 min) se combinan, se diluyen 1:1 con agua y luego
se liofilizan.
Se liofilizan por separado alícuotas de 200
\mul de los conjuntos respectivos para el análisis de aminoácidos,
la HPLC analítica, la electroforesis capilar de zona (CZE), el
análisis de secuencias y la espectrometría de masas.
El rendimiento del fragmento
4-11 asciende después del análisis de aminoácidos a
68,3 \mumol (99% d.t.) y del fragmento 1 -3 a 67,4 \mumol (98%
d.t.).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
12
Mezcla 1
Se disuelven 2 x 700 mg de dihidro- (56%) y
octahidro-lisobactina (21%) (682 \mumol de
dihidro- y octahidro-lisobactina contenidos como
péptidos puros determinados mediante análisis de aminoácidos) cada
uno en 70 ml de metanol y luego se mezclan cada uno con 602 ml de
tampón de disociación (hidrogenocarbonato de amonio 0,1 M/urea 0,5
M, pH 8). Antes de la adición de enzima, las disoluciones se
calientan en la estufa de secado a 37ºC. Se añaden 28 mg de
quimotripsina (28 ml de disolución de quimotripsina
agua/etilenglicol 1:1, 1 mg/ml; 1:25; precalentada a 37ºC) y las
reacciones se realizan a 37ºC. Se toman alícuotas de 200 \mul
después de 0,5, 1 h y las disociaciones con enzimas se detienen con
200 \mul de 30% de acetonitrilo/0,1% de TFA. Las muestras se
analizan con HPLC en paralelo a las disociaciones con enzimas en el
plazo de 15 min (tiempo de retención del fragmento
4-11 aproximadamente 3,6 min, fragmento
1-3 (LLF) aproximadamente 9,6 min, fragmento
1-3
(LL(3-ciclohexil)A) aproximadamente
11,3 min, condiciones: disolvente A 0,1% de TFA, disolvente B 60% de
acetonitrilo/0,1% de TFA, gradiente: 0 min 30% de B, 10 min 80% de
B, 11 min 100% de B, 12 min 30% de B, 15 min 30% de B; flujo 0,7
ml/min, 40ºC, detección UV 210 nm). Las reacciones enzimáticas se
detienen después de aproximadamente 60 min con 30 ml de acetonitrilo
y aproximadamente 6 ml de TFA. El valor de pH de la disolución se
encuentra entre 1 y 2. Las disoluciones pueden guardarse a -20ºC
hasta la separación preparativa.
\vskip1.000000\baselineskip
Mezcla 2
Se disuelven 775 mg de dihidro- (45%) y
octahidro-lisobactina (48%) (468 \mumol de
dihidro- y octahidro-lisobactina contenidos como
péptidos puros determinados por análisis de aminoácidos) en 77,5 ml
de metanol y luego se mezclan con 667 ml de tampón de disociación
(hidrogenocarbonato de amonio 0,1 M/urea 0,5 M, pH 8). Antes de la
adición de enzima, la disolución se calienta en estufa de secado a
37ºC. Se añaden 31 mg de quimotripsina (31 ml de disolución de
quimotripsina agua/etilenglicol 1:1, 1 mg/ml; 1:25; precalentada a
37ºC) y la reacción se realiza a 37ºC. Se toman alícuotas de 200
\mul después de 0,5,1 h y la disociación con enzima se detiene con
200 \mul de 30% de acetonitrilo/0,1% de TFA. Las muestras se
analizan con HPLC en paralelo a la disociación con enzima en el
plazo de 15 min (tiempo de retención del fragmento
4-11 aproximadamente 3,6 min, fragmento
1-3 (LLF) aproximadamente 9,6 min, fragmento
1-3
(LL(3-ciclohexil)A) aproximadamente
11,3 min) (disolvente A 0,1% de TFA, disolvente B 60% de
acetonitrilo/0,1% de TFA, gradiente 0 min 30% de B, 10 min 80% de B,
11 min 100% de B, 12 min 30% de B, 15 min 30% de B; flujo: 0,7
ml/min, temperatura: 40ºC, detección UV 210 nm). La reacción
enzimática se detiene después de 60 min con 30 ml de acetonitrilo y
aproximadamente 6 ml de TFA. El valor de pH de la disolución debe
encontrarse entre 1 y 2. La disolución puede guardarse a -20ºC hasta
la separación preparativa.
\vskip1.000000\baselineskip
Las mezclas de disociación 1 y 2 se filtran a
través de un filtro (0,2 \mum) y luego se reúnen. La disolución se
divide en varias porciones y se cromatografían respectivamente en
una columna Source 15RPC con un gradiente de acetonitrilo/TFA como
se describe anteriormente. Las pasadas se realizan sucesivamente y
las fracciones se recogen en el mismo tubo. Los cromatogramas
resultantes son congruentes.
El fragmento 4-11 (R_{t}
aproximadamente 15 min) se combina, se diluye 1:1 con agua y luego
se liofiliza.
El rendimiento del fragmento
4-11 asciende después de la liofilización a 1,1 g
(1095 \mumol). Con un uso de 1150 \mumol de material disociable,
el rendimiento del fragmento 4-11 es del 95%
d.t.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
13
Se disuelven 2 x 0,995 g de una mezcla de
dihidro- (52%) y octahidro-lisobactina (37%) cada
una en 33 ml de metanol y luego se mezclan cada una con 257 ml de
tampón de disociación (hidrogenocarbonato de amonio 0,1 M/urea 0,5
M, pH 8). Antes de la adición de enzima, la disolución se calienta
en estufa de secado a 37ºC. Se añaden 39,6 mg de quimotripsina (39,6
ml de disolución de quimotripsina agua/etilenglicol 1:1, 1 mg/ml;
1:25; precalentada a 37ºC) y la reacción se realiza a 37ºC. Se toman
alícuotas de 200 \mul después de 0,5,1 h y la disociación con
enzima se detiene con 200 \mul de 30% de acetonitrilo/0,1% de TFA.
Las muestras se analizan con HPLC en paralelo a la disociación con
enzima en el plazo de 15 min (tiempo de retención del fragmento
4-11 aproximadamente 3,6 min, fragmento
1-3 (LLF) aproximadamente 9,6 min, fragmento
1-3
(LL(3-ciclohexil)A) aproximadamente
11,3 min) (disolvente A 0,1% de TFA, disolvente B 60% de
acetonitrilo/0,1% de TFA, gradiente 0 min 30% de B, 10 min 80% de B,
11 min 100% de B, 12 min 30% de B, 15 min 30% de B; flujo: 0,7
ml/min, temperatura: 40ºC, detección UV 210 nm). Las reacciones
enzimáticas se detienen después de 60 min cada una con 30 ml de
acetonitrilo y aproximadamente 2,5 ml de TFA. El valor de pH de la
disolución debe encontrarse entre 1 y 2. La disolución puede
guardarse a -20ºC hasta la separación preparativa.
\newpage
Ejemplo
14
Se disuelven 10 g de dihidro- (aproximadamente
el 40%) y octahidro-lisobactina (aproximadamente el
60%) en 200 ml de metanol y luego se mezclan con 1700 ml de tampón
de disociación (hidrogenocarbonato de amonio 0,1 M/urea 0,5 M, pH
8). Antes de la adición de enzima, la disolución se calienta en
estufa de secado a 37ºC. Se añaden 400 mg de quimotripsina (100 ml
de disolución de quimotripsina agua/etilenglicol 1:1, 4 mg/ml; 1:25;
precalentada a 37ºC) y la reacción se realiza a 37ºC. Se toman
alícuotas de 200 \mul después de 0,5,1 h y la disociación con
enzima se detiene con 200 \mul de 30% de acetonitrilo/0,1% de TFA.
Las muestras se analizan con HPLC en paralelo a la disociación con
enzima en el plazo de 15 min (tiempo de retención del fragmento
4-11 aproximadamente 3,6 min, fragmento
1-3 (LLF) aproximadamente 9,6 min, fragmento
1-3 (LLA(3-ciclohexil))
aproximadamente 11,3 min) (disolvente A 0,1% de TFA, disolvente B
60% de acetonitrilo/0,1% de TFA, gradiente 0 min 30% de B, 10 min
80% de B, 11 min 100% de B, 12 min 30% de B, 15 min 30% de B; flujo:
0,7 ml/min, temperatura: 40ºC, detección UV 210 nm). La reacción
enzimática se detiene después de 60 min con 75 ml de acetonitrilo y
aproximadamente 15 ml de TFA. El valor de pH de la disolución debe
encontrarse entre 1 y 2. La disolución puede guardarse a -20ºC hasta
la separación
preparativa.
preparativa.
El fragmento 4-11 se aísla en
varias pasadas como se describe anteriormente mediante HPLC
preparativa.
La actividad de la carga de quimotripsina usada
(70 U/mg) se comprueba mediante una disociación de control con la
proteína muteína doble de interleucina 4 Arg(121)
\rightarrow Asp(121)/Tyr(124) \rightarrow
Asp(124) (BAYER Healthcare AG,
D-Wuppertal).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
15
Se disuelven 200 \mug de
dihidro-lisobactina en 10 \mul de metanol y luego
se mezclan con 190 \mul de tampón de disociación
(hidrogenocarbonato de amonio 0,1 M/urea 0,5 M, pH 8). Se añaden 4
\mug de subtilisina (1:50) y la reacción se realiza a 37ºC. Se
toman alícuotas de 30 \mul después de 0, 0,5, 1, 3, 6 y 24 h y la
disociación con enzima se detiene con 30 \mul de acetonitrilo/1%
de TFA. Las muestras se guardan hasta el análisis a -20ºC.
Véase la Tabla 3 para las secuencias de péptidos
de los productos de disociación con subtilisina.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
16
Se disuelven 200 \mug de
octahidro-lisobactina en 10 \mul de metanol y
luego se mezclan con 190 \mul de tampón de disociación
(hidrogenocarbonato de amonio 0,1 M/urea 0,5 M, pH 8). Se añaden 4
\mug de subtilisina (1:50) y la reacción se realiza a 37ºC. Se
toman alícuotas de 30 \mul después de 0, 0,5, 1, 3, 6 y 24 h y la
disociación con enzima se detiene con 30 \mul de acetonitrilo/1%
de TFA. Las muestras se guardan hasta el análisis a -20ºC.
Véase la Tabla 3 para las secuencias de péptidos
de los productos de disociación con subtilisina.
La actividad de la carga de subtilisina usada
(aproximadamente 12 U/mg) se comprueba mediante una disociación de
control con la proteína muteína doble de interleucina 4
Arg(121) \rightarrow Asp(121)/Tyr(124)
\rightarrow Asp(124) (BAYER Healthcare AG,
D-Wuppertal).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
17
Se disuelven 200 \mug de
dihidro-lisobactina en 10 \mul de metanol y luego
se mezclan con 190 \mul de tampón de disociación
(tris-(hidroximetil)-aminometano 0,1 M/cloruro de
calcio 5 mM, pH 7,45). Se añaden 4 \mug de termolisina (1:50) y la
reacción se realiza a 37ºC. Se toman alícuotas de 30 \mul después
de 0, 0,5, 1, 3, 6 y 24 h y la disociación con enzima se detiene con
30 \mul de acetonitrilo/1% de TFA. Las muestras se guardan hasta
el análisis a -20ºC.
Véase la Tabla 4 para las secuencias de péptidos
de los productos de disociación con termolisina.
\newpage
Ejemplo
18
Se disuelven 200 \mug de
octahidro-lisobactina en 10 \mul de metanol y
luego se mezclan con 190 \mul de tampón de disociación
(hidrogenocarbonato de amonio 0,1 M/urea 0,5 M, pH 8). Se añaden 4
\mug de termolisina (1:50) y la reacción se realiza a 37ºC. Se
toman alícuotas de 30 \mul después de 0, 0,5, 1, 3, 6 y 24 h y la
disociación con enzima se detiene con 30 \mul de acetonitrilo/1%
de TFA. Las muestras se guardan hasta el análisis a -20ºC.
Véase la Tabla 4 para las secuencias de péptidos
de los productos de disociación con termolisina.
La actividad de la carga de termolisina usada
(aproximadamente 55 U/mg) se comprueba mediante una disociación de
control con la proteína muteína doble de interleucina 4
Arg(121) \rightarrow Asp(121)/Tyr(124)
\rightarrow Asp(124) (BAYER Healthcare AG,
D-Wuppertal).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
19
Se disuelven 200 \mug de
dihidro-lisobactina en 10 \mul de metanol y luego
se mezclan con 190 \mul de tampón de disociación (fosfato de sodio
0,1 M/cisteína 10 mM, EDTA 2 mM, pH 6,5). Se añaden 4 \mug de
papaína (1:50) y la reacción se realiza a 37ºC. Se toman alícuotas
de 30 \mul después de 0, 0,5, 1, 3, 6 y 24 h y la disociación con
enzima se detiene con 30 \mul de acetonitrilo/1% de TFA. Las
muestras se guardan hasta el análisis a -20ºC.
Véase la Tabla 5 para las secuencias de péptidos
de los productos de disociación con papaína.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
20
Se disuelven 200 \mug de
octahidro-lisobactina en 10 \mul de metanol y
luego se mezclan con 190 \mul de tampón de disociación (fosfato de
sodio 0,1 M/cisteína 10 mM, EDTA 2 mM, pH 6,5). Se añaden 4 \mug
de papaína (1:50) y la reacción se realiza a 37ºC. Se toman
alícuotas de 30 \mul después de 0, 0,5, 1, 3, 6 y 24 h y la
disociación con enzima se detiene con 30 \mul de acetonitrilo/1%
de TFA. Las muestras se guardan hasta el análisis a -20ºC.
Véase la Tabla 5 para las secuencias de péptidos
de los productos de disociación con papaína.
La actividad de la carga de papaína usada
(aproximadamente 11 U/mg) se comprueba mediante una disociación de
control con la proteína muteína doble de interleucina 4
Arg(121) \rightarrow Asp(121)/Tyr(124)
\rightarrow Asp(124) (BAYER Healthcare AG,
D-Wuppertal).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
21
Se disuelven 200 \mug de
dihidro-lisobactina en 10 \mul de metanol y luego
se mezclan con 190 \mul de tampón de disociación (tetraborato de
sodio 0,1 M, pH 9). Se añaden 4 \mug de proteinasa K (1:50) y la
reacción se realiza a 37ºC. Se toman alícuotas de 30 \mul después
de 0, 0,5, 1, 3, 6 y 24 h y la disociación con enzima se detiene con
30 \mul de acetonitrilo/1% de TFA. Las muestras se guardan hasta
el análisis a -20ºC.
Véase la Tabla 6 para las secuencias de péptidos
de los productos de disociación con proteinasa K.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
22
Se disuelven 200 \mug de
octahidro-lisobactina en 10 \mul de metanol y
luego se mezclan con 190 \mul de tampón de disociación
(tetraborato de sodio 0,1 M, pH 9). Se añaden 4 \mug de proteinasa
K (1:50) y la reacción se realiza a 37ºC. Se toman alícuotas de 30
\mul después de 0, 0,5, 1, 3, 6 y 24 h y la disociación con enzima
se detiene con 30 \mul de acetonitrilo/1% de TFA. Las muestras se
guardan hasta el análisis a -20ºC.
Véase la Tabla 6 para las secuencias de péptidos
de los productos de disociación con proteinasa K.
\newpage
La actividad de la carga de proteinasa K usada
(aproximadamente 30 U/mg) se comprueba mediante una disociación de
control con la proteína muteína doble de interleucina 4
Arg(121) \rightarrow Asp(121)/Tyr(124)
\rightarrow Asp(124) (BAYER Healthcare AG,
D-Wuppertal).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
23
Se disuelven 200 \mug de
dihidro-lisobactina en 10 \mul de metanol y luego
se mezclan con 190 \mul de tampón de disociación (fosfato de sodio
0,1 M, cisteína 10 mM, EDTA 2 mM, pH 6,5). Se añaden 4 g de
bromelaína (1:50) y la reacción se realiza a 37ºC. Se toman
alícuotas de 30 \mul después de 0, 0,5, 1, 3, 6 y 24 h y la
disociación con enzima se detiene con 30 \mul de acetonitrilo/1%
de TFA. Las muestras se guardan hasta el análisis a -20ºC.
Véase la Tabla 7 para las secuencias de péptidos
de los productos de disociación con bromelaína.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
24
Se disuelven de 200 \mug de
octahidro-lisobactina en 10 \mul de metanol y
luego se mezclan con 190 \mul de tampón de disociación (fosfato de
sodio 0,1 M, cisteína 10 mM, EDTA 2 mM, pH 6,5). Se añaden 4 \mug
de bromelaína (1:50) y la reacción se realiza a 37ºC. Se toman
alícuotas de 30 \mul después de 0, 0,5, 1, 3, 6 y 24 h y la
disociación con enzima se detiene con 30 \mul de acetonitrilo/1%
de TFA. Las muestras se guardan hasta el análisis a -20ºC.
Véase la Tabla 7 para las secuencias de péptidos
de los productos de disociación con bromelaína.
La actividad de la carga de bromelaína usada
(aproximadamente 4 U/mg) se comprueba mediante una disociación de
control con la proteína muteína doble de interleucina 4
Arg(121) \rightarrow Asp(121)/Tyr(124)
\rightarrow Asp(124) (BAYER Healthcare AG,
D-Wuppertal).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
25
Se disuelven 800 \mug del péptido
Leu-Leu-PheOMe y 100 \mug del
péptido 4-11 en 200 \mul de metanol y luego se
mezclan con 200 \mul de tampón de síntesis (tetraborato de sodio
0,1 M, pH 9). Se añaden 24 \mug de quimotripsina y la reacción se
realiza a 37ºC. Se toman alícuotas de 30 \mul después de 0, 0,5,
1, 3, 6 y 24 h y la síntesis se detiene con 30 \mul de
acetonitrilo/1% de TFA. Las muestras se guardan hasta el análisis a
-20ºC.
La detección de la
dihidro-lisobactina se realiza mediante HPLC y
CZE.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
26
Se disuelven 800 \mug del péptido
Boc-Leu-Leu-PheOMe
en 200 \mul de tetraclorometano y luego se mezclan con 200 \mul
de tampón de síntesis (tetraborato de sodio 0,1 M, pH 9) de 100
\mug del péptido 4-11. Se añaden 24 \mug de
quimotripsina y la reacción se realiza a 37 -C. Se toman alícuotas
de 30 \mul después de 0, 0,5, 1, 3, 6 y 24 h y la síntesis se
detiene con 30 \mul de acetonitrilo/1% de TFA. Las muestras se
guardan hasta el análisis a -20ºC.
La detección de derivados de
dihidro-lisobactina se realiza mediante HPLC y
CZE.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
27
Se disuelven 800 \mug del péptido
Leu-Leu-Ala(3-ciclohexil)OMe
y 100 \mug del péptido 4-11 en 200 \mul de
metanol y luego se mezclan con 200 \mul de tampón de síntesis
(tetraborato de sodio 0,1 M, pH 9). Se añaden 24 \mug de
quimotripsina y la reacción se realiza a 37ºC. Se toman alícuotas de
30 \mul después de 0, 0,5, 1, 3, 6 y 24 h y la síntesis se detiene
con 30 \mul de acetonitrilo/1% de TFA. Las muestras se guardan
hasta el análisis a -20ºC.
La detección de la
octahidro-lisobactina se realiza mediante HPLC y
CZE.
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Ejemplo
28
Se cargan 3 nmol de fragmentos disueltos en 60%
de acetonitrilo/0,1% de TFA en una hoja de secuenciador que se ha
incubado previamente con Polybren^{R}. Las proteínas se secuencian
con el ciclo de secuenciador normal. Los aminoácidos PTH se
identifican mediante HPLC en línea con ayuda de un patrón de PTH de
40 pmol. Los aminoácidos no proteinógenos se identifican mediante su
posición relativa con respecto a los aminoácidos patrón. La pureza
de los péptidos se estima mediante el aminoácido del 1 3 ciclo de
PTH. Los distintos péptidos se secuencian durante 4 a 12 horas. Las
Tablas 1 a 7 muestran las secuencias de proteínas determinadas.
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Ejemplo
29
El análisis de aminoácidos representa un
importante parámetro cualitativo y cuantitativo para la
caracterización de proteínas. Además del contenido de proteínas, con
la estructura primaria conocida se determina el número de
aminoácidos individuales. El análisis de aminoácidos de derivados de
lisobactina o fragmentos de péptidos concuerda bien con los valores
teóricos de la estructura primaria (Tabla 8). Los aminoácidos no
proteinógenos sólo se cuantifican en presencia de patrones
correspondientes. Se disuelven 100 \mug de derivados de
lisobactina o fragmentos de péptidos en 200 \mul de ácido
clorhídrico 6 N y se hidrolizan 1 h a 166ºC. Se añaden
aproximadamente 5 nmol de las muestras al analizador de aminoácidos.
La cantidad de aminoácido se determina mediante un patrón de
aminoácidos de 4 nmol.
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Ejemplo
30
En la cromatografía por HPLC de proteínas en
fases inversas químicamente unidas, mediante una interacción
hidrófoba de las proteínas se produce un enlace a la fase usada. Los
péptidos son desplazados por disolventes orgánicos (fase móvil) a la
fase estacionaria según la fuerza de su enlace. Por este motivo,
este procedimiento es un buen criterio para la valoración de la
pureza de un péptido y para el control de la velocidad de la
disociación enzimática y de los productos de disociación formados.
Los péptidos dihidro-lisobactina y
octahidro-lisobactina se eluyen a aproximadamente 35
min y aproximadamente 38 min, el fragmento 4-11 a
aproximadamente 16 min, 1-3 (LLF) a aproximadamente
31 min y 1-3
(LLA(3-ciclohexilo)) a aproximadamente 37 min
de la fase RP-18. La Figura 1 muestra el desarrollo
temporal de una disociación enzimática preparativa con quimotripsina
(Ejemplo 11).
Se cromatografían aproximadamente 20 \mug de
los productos de disociación enzimática o de los compuestos de
partida dihidro-lisobactina y
octahidro-lisobactina o de la mezcla en una columna
Zobax 300SB-C18 (4,6 mm x 150 mm; material de 3,5
\mum; diámetro de poro de 300 Angström). Como eluyente se usa un
gradiente de acetonitrilo/TFA. Condiciones: disolvente A 0,1% de
TFA, disolvente B 60% de de acetonitrilo/0,1% de TFA; flujo 0,7
ml/min, temperatura de columna 40ºC, detección UV 210 nm, disolvente
A 0,1% de TFA, disolvente B 0,1% de TFA/60% de acetonitrilo;
gradiente: 0 min 0% de B, 2 min 10% de B, 50 min 80% de B, 52 min
100% de B, 55 min O% de B, 60 min O% de B.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
31
La electroforesis capilar de zona permite la
separación de péptidos y proteínas debido a su carga en el campo
eléctrico. La calidad de la separación depende a este respecto del
tampón, el valor de pH, la temperatura y los aditivos usados. Como
capilares se usan las llamadas columnas de "sílice fundida" con
un diámetro interno de 50-100 \mum. Este
procedimiento es un criterio muy bueno para la valoración de la
pureza de un péptido y para el control de la formación de productos
de disociación enzimática. Los péptidos
dihidro-lisobactina y
octahidro-lisobactina se eluyen a aproximadamente 21
min, el fragmento 4-11 a aproximadamente 18 min,
1-3 (LLF) a aproximadamente 24 min,
1-3 (LLA(3-ciclohexilo)) a
aproximadamente 22 min, las formas desamidadas como pico doble a
aproximadamente 30 min (1 -11) y 24 min (4-11) de la
columna capilar. La Figura 2 muestra el desarrollo temporal de una
disociación enzimática de octahidro-lisobactina con
quimotripsina (Ejemplo 5). Se ve claramente el fuerte aumento de los
productos desamidados después de 24 h en tampón.
Se investigan aproximadamente 4 ng de los
productos de disociación enzimática o de los compuestos de partida
dihidro-lisobactina y
octahidro-lisobactina o de la mezcla mediante
electroforesis capilar de zona en una columna de vidrio (longitud 72
cm, diámetro interno 50 \mum). Condiciones: intensidad de
corriente 90 \muA, temperatura de columna 25ºC, tampón de fosfato
100 mM, pH 3,0, detección UV 210 nm, alimentación a presión 3
segundos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
32
Los péptidos y los productos de disociación
enzimática se separan mediante cromatografía
RP-18-HPLC y el peso molecular se
determina por ionización por electropulverización (ESI).
Se separan aproximadamente 100 \mug de
disociación con quimotripsina de la mezcla de
dihidro-lisobactina y
octahidro-lisobactina con una columna de HPLC C18
bajo las siguientes condiciones: disolvente A 0,1% de TFA,
disolvente B 60% de acetonitrilo/0,1% de TFA; flujo 0,7 ml/min,
temperatura de columna 40ºC, detección UV 210 nm, disolvente A 0,1%
de TFA, disolvente B 0,1% de TFA/60% de acetonitrilo; gradiente: 0
min 0% de B, 2 min 10% de B, 50 min 80% de B, 52 min 100% de B, 55
min 0% de B, 60 min 0% de B. Los péptidos se transfieren a la fuente
de iones a presión atmosférica del espectrómetro de masas y allí se
ionizan. Desde allí, los iones se transfieren a la región de alto
vacío del espectrómetro de masas y se detectan. La Tabla 9 muestra
los pesos moleculares determinados.
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Ejemplo
33
Se disuelven 18,27 g de dihidro- y
octa-lisobactina (aproximadamente 5:4) en 365 ml de
metanol y se diluyen a 3654 ml con quimotripsina (731 mg) y tampón
de disociación. La reacción se realiza 30 min a 37ºC y luego se
detiene con 20 ml de TFA y 150 ml de acetonitrilo. Antes de la
adición de enzima, las disoluciones se calientan en estufa de secado
a 37ºC. Se toman alícuotas de 200 \mul después de 0 y 0,5 h y la
disociación con enzima se detiene con 200 \mul de 0,1% de TFA en
30% de acetonitrilo/70% de agua. Las muestras se analizan por HPLC
(tiempo de retención del fragmento 4-11
aproximadamente 3,6 min, fragmento 1-3 (LLF)
aproximadamente 9,6 min, fragmento 1-3
(LL(hexahidro)F) aproximadamente 11,3 min) (eluyente
A: 0,1% de TFA en agua, eluyente B: 0,1% de TFA en 60% de
acetonitrilo/ 40% de agua, gradiente: 0 min 30% de B, 10 min 80% de
B, 11 min 100% de B, 12 min 30% de B, 15 min 30% de B; flujo: 0,7
ml/min, temperatura de columna: 40ºC, detección: 210 nm).
Alternativamente se usa el Procedimiento 11. La disolución se
reparte en 9 porciones x 500 ml y se congelan hasta la separación en
RP preparativa a -70ºC. El fragmento 4-11 se aísla
en varias pasadas por HPLC preparativa.
\vskip1.000000\baselineskip
Se filtran aproximadamente 800 ml de la
disolución de disociación a través de un cartucho (0,2 \mum) y se
cromatografían en dos partes de aproximadamente 400 ml en una
columna Source 15RPC (tamaño de columna: 2360 ml) con un gradiente
de metanol/TFA. Eluyente A: 0,1% de TFA en agua, eluyente B: 0,1% de
TFA en 100% de metanol; flujo: 30 ml/min; detección 215 nm. El
gradiente se ejecuta según volúmenes de columna: después de la
aplicación se lava con 3,6 volúmenes de columna de eluyente A, luego
en 18 volúmenes de columna al 45% de B, en 0,67 volúmenes de columna
al 100% de B, 1,3 volúmenes de columna al 100% de B, en 0,67 al 0%
de B, 7 volúmenes de columna de eluyente A para el equilibrado.
Como producto se obtienen 10,36 g (77% d.t.) del
fragmento 4-11.
HPLC/UV-Vis (Procedimiento 4):
R_{t} = 0,5 min.
EM-CL (Procedimiento 1): R_{t}
= 1,0 min;
EM (ESIpos.): m/z (%) = 453,6 (100) [M +
2H]^{2+}, 906 (10) [M + H]^{+}.
EM (ESIneg.): m/z (%) = 904 (100) [M –
H]^{-}.
Claims (12)
1. Procedimiento para la preparación de
fragmentos de lisobactina que presenta las siguientes etapas,
concretamente
- -
- apertura de anillo hidrogenolítica de lisobactina usando hidrógeno en presencia de un catalizador de hidrogenación en un disolvente para la formación de dihidro-lisobactina y/u octahidro-lisobactina,
- -
- disociación enzimática de la dihidro-lisobactina y/u octahidro-lisobactina.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que como enzima se usa serina proteasa eucariota o una serina
proteasa microbiana.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que como enzima se usa una metaloproteasa o una cisteína
proteasa.
4. Procedimiento para la preparación de
derivados de lisobactina que presenta las siguientes etapas,
concretamente
- -
- apertura de anillo hidrogenolítica de lisobactina usando hidrógeno en presencia de un catalizador de hidrogenación en un disolvente para la formación de dihidro-lisobactina y/u octahidro-lisobactina,
- -
- disociación enzimática de la dihidro-lisobactina y/u octahidro-lisobactina,
- -
- unión de los fragmentos de lisobactina.
5. Procedimiento para la preparación de
dihidro-lisobactina y/u
octahidro-lisobactina, caracterizado porque
la lisobactina se convierte en dihidro-lisobactina
y/u octahidro-lisobactina mediante apertura de
anillo hidrogenolítica con hidrógeno en presencia de un catalizador
de hidrogenación en un disolvente.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en
el que como catalizador de hidrogenación se usa un catalizador de
paladio.
7. Procedimiento según la reivindicación 5 ó 6,
en el que como disolvente se usa una mezcla de
isopropanol-agua.
8. Procedimiento para la preparación del
fragmento de lisobactina 4-11 y el fragmento de
lisobactina 1-3, caracterizado porque la
dihidro-lisobactina y/u
octahidro-lisobactina se disocia enzimáticamente
para dar el fragmento de lisobactina 4-11 y el
fragmento de lisobactina 1-3.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que como enzima se usa una serina proteasa eucariota o una serina
proteasa microbiana.
10. Procedimiento según la reivindicación 8 ó 9,
en el que como serina proteasa se usa quimotripsina.
11. Procedimiento para la preparación del
fragmento de lisobactina 3-11 y/o el fragmento de
lisobactina 5-11 y/o el fragmento de lisobactina
4-10 y/o el fragmento de lisobactina
1-9, caracterizado porque la
dihidro-lisobactina y/u
octahidro-lisobactina se disocian enzimáticamente
para dar el fragmento de lisobactina 3-11 y/o el
fragmento de lisobactina 5-11 y/o el fragmento de
lisobactina 4-10 y/o el fragmento de lisobactina
1-9.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en
el que como enzima se usa una metaloproteasa o una cisteína
proteasa.
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