JP4846104B2 - 一酸化窒素産生抑制剤 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、一酸化窒素産生抑制剤、さらに詳しくは、アレルギー性疾患、慢性関節リウマチ、炎症性疾患の予防または治療に有用な有効成分としてトリテルペン成分を含有する一酸化窒素産生抑制剤に関する。
【0002】
【従来の技術】
一酸化窒素(NO)は、哺乳類の細胞内において、L−アルギニンからNO合成酵素(nitric oxide synthetase、NOS)の触媒作用によって産生される。ここで、NOSは、非誘導型(constitutive NOS、cNOS)と誘導型(inducible NOS、iNOS)に分類される。cNOSは、血管内皮細胞や胃粘膜細胞において恒常的に低濃度のNOの産生を触媒作用し、他方、iNOSの発現量は、マクロファージや好中球などの炎症に関与する細胞、肝細胞や血管平滑筋において、リポポリサッカライド(LPS)、サイトカインまたは病原体などの刺激によって活性化されて多量のNOを産生する。
例えば、生体内のマクロファージが病原体からの刺激を受けると、iNOSの発現量が増加し、L−アルギニンからのNO産生を促進する。産生されたNOは、腫瘍細胞のミトコンドリア系内の電子伝達系酵素に作用してその活性を阻害したり(免疫応答調節作用)、感染に対しての殺菌能力を有している。生体内でのNOの他の有効な作用としては、血管弛緩により血圧を低下させたり、あるいは多核白血球や血小板の接着を阻止して血小板の凝集を妨ぐことが挙げられる。
【0003】
しかしながら、腎炎、肝障害や潰瘍性大腸炎、または慢性関節リウマチ、更にはアレルギー性疾患等の炎症性疾患によって、マクロファージから高濃度のNOが産生されると、NOによって周辺組織が傷害され、自己免疫現象と類似の症状が発現することがあり、それにより別の疾患の発症を促進することがある。例えば、敗血症を患っている場合には、大量のNOの産生により心筋収縮力によるショック症状(敗血症性ショック)が引き起こされることもある。
【0004】
NOの過剰産生による組織や細胞の傷害または更なる疾患の発現もしくは促進を防ぐため、NOが有効な濃度で生体内に存在するようにNOの産生を抑制する必要がある。そのため、NOの産生に関与するNOSの作用を阻害するNOS阻害剤や、NO産生抑制剤の開発が進められている。
実験室レベルで使用される代表的なNOS阻害剤(基質競合剤)としては、NG−モノメチル−L−アルギニン(L−NMMA)やNG−ニトロ−L−アルギニンメチルエステル(L−NAME)等のL−アルギニン誘導体(ここで、NGは、グアニジノ基のN原子にニトロ基などが付いていることを表す。)が挙げられ、これらの構造式はいずれも基質であるL−アルギニンの構造式と類似している。iNOS誘導阻害剤としては、コルチコステロイドやセリンおよびシステイン・プロテアーゼ阻害剤等があり、あるいは天然起源のiNOS誘導阻害に基づくNO産生抑制作用を有する化合物として、月桂樹由来セスキテルペンのcostunolideやdehydrocostus lactone〔Matsuda H., Kageura T., Toguchida I., Ueda H., Morikawa T., Yoshikawa M., Life Sciences, 66巻, p. 2151−2157 (2000年)〕、ルバーブ由来スチルベンのrhapontigenin、piceatannol、resveratrol〔Matsuda H., Kageura T., Morikawa T., Toguchida I., Harima S., Yoshikawa M., Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters, 10巻, p. 323−327(2000年)〕、タクシャ由来トリテルペンのalisol F〔Matsuda H., Kageura T., Toguchida I., Murakami T., Kishi A., Yoshikawa M., Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters, 9巻, p. 3081−3086(1999年)〕等も報告されている。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、植物由来成分として容易に入手でき、生体に対し安全性の高い(すなわち、副作用の少ない)NO産生抑制剤を提供することである。
【0006】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、NO産生抑制活性を指標に、天然植物からの有効成分のスクリーニングを行った結果、スリランカやインドに自生するカンラン科 (Burceraceae)の潅木Balsamodendron mukul HOOK.に含有される(特に、この植物から得られる樹脂“Myrrha(ミルラ)”に含有される)5種の新規トリテルペンがいずれも強いNO産生抑制活性を有することを見出した。
すなわち、本発明は、構造式:
【化2】
(式中、R1は、水酸基またはケトン基[(>C)=O;ここで、>COの炭素原子は母体構造の炭素骨格に含まれる]であり、ここで、R1が水酸基の場合、R2はヒドロキシメチル基、カルボキシル基またはメチル基であり、またはR1がケトン基の場合、R2はヒドロキシメチル基またはカルボキシル基である。)
で表されるトリテルペン成分を有効成分として含有する一酸化窒素(NO)産生抑制剤である。本発明において特徴的なこれらトリテルペン成分はいずれも、最も好ましくは、Myrrhaの有機溶媒(好ましくはアルコール系溶媒)抽出エキスから単離される。
【0007】
【発明の実施の形態】
本発明のNO産生抑制剤において、有効成分であるトリテルペン成分は、カンラン科植物のBalsamodendron mukul HOOK.からの有機溶媒抽出エキスに含有されることを特徴とする。本発明において、前記トリテルペン成分を含有する抽出エキスは、Balsamodendron mukul HOOK.のどの部分(例えば、葉、根など)を原料として用いてもよく、例えば、幹から得られる樹脂“myrrha(ミルラ)”をアルコール系溶媒で抽出したエキス等であり得る。
【0008】
ここで、myrrhaは、アフリカ東部から東南アジアに至る広い地域に自生するカンラン科の潅木から得られる樹脂をいい、芳香性が強く、苦味があり、収斂性を有し、古代エジプトにおいてはミイラの防腐剤として使用されていた。また、中国では一般に没薬(モツヤク)と呼ばれ、健胃、通経、強壮に効用を有する生薬として内用されていたが、日本においては、口腔内の炎症の予防や治療のためのうがい薬や歯磨きとして、あるいは香料工業用原料として使用されている。
【0009】
本発明のNO産生抑制剤は、カンラン科植物のBalsamodendron mukul HOOK.からの有機溶媒抽出エキス、特に好ましくは”myrrha(ミルラ)”からの有機溶媒抽出エキスを有効成分として含有する。有効成分は、具体的には、この有機溶媒抽出エキスから単離される新規トリテルペン5種(myrrhanol A、BおよびCおよびmyrrhanone AおよびB)であるが、必要に応じて、有機溶媒抽出エキスのまま使用することも可能である。
【0010】
以降の実施例では、カンラン科植物のBalsamodendron mukul HOOK.の幹から得られる樹脂”myrrha”から有機溶媒抽出エキスを抽出する方法を詳細に説明するが、ここでは、基本的な抽出方法を説明する。先ず、粉砕したBalsamodendron mukul HOOK.(葉、根、myrrha等)に抽出用有機溶媒を加えて、使用する溶媒の沸点付近まで加熱した後、濾過し、濾別される残渣を前記有機溶媒で再度抽出し、濾過した後、得られる濾液を減圧濃縮することを含む。抽出に適した有機溶媒は、溶媒は、例えば、炭素数1〜6の低級アルコール、ジエチルエーテル、酢酸エチル、ヘキサン、ベンゼン、トルエン、石油エーテルなどのようなアルコール、エーテル、エステルおよび飽和および不飽和の環式炭化水素(ここで、環は、アルキル基などで置換されていても、非置換であってもよい)から選択され、最も好ましくはメタノールを使用する。次に、こうして得られる有機溶媒抽出エキスに、水および酢酸エチルを加え、酢酸エチル層を分離し、これを減圧濃縮することにより、酢酸エチル移行エキスを得る。また、残りの水層からも水移行エキスを得る。
本発明において、酢酸エチル移行エキスからは、カラムクロマトグラフィー法などを用いることにより、新規トリテルペン成分としてのmyrrhanol AおよびCおよびmyrrhanone Aがそれぞれ分離でき、他方、水移行エキスからは、同様にして、新規トリテルペン成分としてのmyrrhanol Bおよびmyrrhanone Bがそれぞれ分離できる。
【0011】
本発明のNO産生抑制剤は、有効成分として、前記有機溶媒抽出エキスをそのままの形態で含有するか、または有機溶媒抽出エキスより単離される新規トリテルペン成分少なくとも1つを含有する。本発明において、前記エキスまたはトリテルペン成分は、NO産生抑制剤の全重量に対し、好ましくは0.1〜50重量%、より好ましくは3〜10重量%の量で含有されるが、この量は、NO産生抑制剤が適用される対象の年齢や体重により適宜変化してよい。
【0012】
NO産生抑制剤は、より好ましくは経口剤または外用剤として提供される。そのため、本発明のNO産生抑制剤は、提供される形態に応じて前記有効成分以外に、医薬分野において常用される既知の他の化合物、または例えば、粉末、固形剤、液剤に成型するのに必要な化合物を適宜包含されてよい。そのような化合物の具体例としては、乳糖、デンプン、ヒドロキシプロピルセルロース、カオリン、タルク、炭酸カルシウムなどが挙げられる。
【0013】
NO産生抑制剤は、外用剤として提供される場合、例えば、軟膏剤、テープ剤、バップ剤またはクリーム剤であってよい。
【0014】
対象へのNO産生抑制剤の適用(または投与)量は、成人に対し、1日0.01〜2gであり、この1日分の適用量は、1〜3回に分けて使用することができる。
【0015】
【実施例】
以下の実施例および製造例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例および製造例に限定されるものではない。
実施例1
Myrrha 成分の単離
本発明のNO産生抑制剤に有効性成分として含有される新規トリテルペン5種をそれぞれ、インド産myrrhaを原料として、以下の方法により単離した。
粉砕したmyrrha(1.85kg)にメタノール(7L)を加えて、80℃で3時間抽出した。これをろ過後、残渣をメタノールでさらに2回抽出した後、ろ液を合わせ、40℃以下で減圧濃縮・乾固してメタノール抽出エキス(105g、5.7%)を得た。メタノール抽出エキスに水(2L)を加えて充分にエキスを分散させた後、酢酸エチル(3L)を加えてよく振盪した。酢酸エチル層を分離し、そこへ水(2L)を加えて分散させた後、酢酸エチル(3L)を加えて振盪する操作をさらに2回行った後、酢酸エチル層を分離し、減圧濃縮することにより、酢酸エチル移行部エキス(34g、1.8%)を得た。他方、酢酸エチル層の分離により残った水層も同様に減圧濃縮を行い、水移行部エキス(63g、3.4%)を得た。
【0016】
酢酸エチル移行部を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにおいて、n−ヘキサン:酢酸エチル(3:1およびその後1:1)、クロロホルム:メタノール(10:1)、およびメタノールを溶離液として順次用いて溶出して、メタノールフラクションA1〜A10に分画した。
メタノールフラクションA2(1.1g、0.06%)を、逆相ODSカラム[メタノール:水(80:20およびその後90:10)]で精製後、更に逆相HPLC[メタノール:水(90:10)]で精製することにより、myrrhanol C(156mg、0.0084%)を得た。
メタノールフラクションA4(4.5g、0.24%)についても、メタノールフラクションA2と同様の精製操作を行って、myrrhanone A(479mg、0.026%)を得た。メタノールフラクションA5(3.6g、0.20%)を、逆相ODSカラム[メタノール:水(70:30およびその後80:20)]で精製した後、更に逆相HPLC[メタノール:水(85:15)]で精製を行って、myrrhanol A(665mg、0.036%)を得た。
【0017】
水移行部をシリカゲルクロマトグラフィーに付し、クロロホルム:メタノール(▲1▼50:1、▲2▼20:1および▲3▼10:1の順)およびその後メタノールで順次溶出することにより、水フラクションB1〜B8に分画した。
水フラクションB3(2.2g、0.12%)を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー[溶離液として、n−ヘキサン:酢酸エチル(2:1)およびその後メタノールを使用]、逆相HPLC[移動相として、メタノール:水(85:15)を使用]、シリカゲルカラムクロマトグラフィー[溶離液として、n−ヘキサン:酢酸エチル(2:1およびその後1:1)およびその後メタノールを使用]に順次付すことにより、精製し、myrrhanone B(247mg、0.013%)を得た。
水フラクションB4(1.7g、0.094%)は、逆相ODSカラムクロマトグラフィー [溶離液として、メタノール:水(▲1▼70:30、▲2▼80:20および▲3▼90:10の順)およびその後メタノールを使用]、逆相HPLC[移動相として、メタノール:水(90:10)を使用]、シリカゲルカラムクロマトグラフィー[n−ヘキサン:酢酸エチル(2:1およびその後1:1)およびその後メタノールを使用]に順次付すことにより、精製し、myrrhanol B(46mg、0.0025%) を得た。
【0018】
ここで、myrrhaからは、既知トリテルペンとしてmyrrhanone C[(8R)-3-オキソ-8-ヒドロキシ-ポリポーダ−13E,17E,21-トリエン]が既に単離されており、その絶対構造も以下の通りであると判明している[Marner F. J., Freyer A.およびLex J.著、Phytochemistry, 30, 3709〜3712頁(1991年)参照]。
【化3】
上記式中の数字はそれぞれ、3,8-ナフトヒドロキノン部位の第1位炭素から付された炭素番号を表す。
【0019】
単離された各種新規トリテルペンは、化学構造を同定するために各種試験(旋光度測定、FAB−MS測定、IR測定、1H−および13C−NMR測定)に付した。以下、各種試験結果をまとめる。
【0020】
(1)myrrhanol A
[α]D 27+12.2°(c=1.0, MeOH)
高分解能FAB−MS:計算値m/z 483.3814(M+Na)+、実測値;483.3830
FAB−MS:m/z 483 (M+Na)+
IR(フィルム):3432、1462、1387、1046cm−1
1H−NMR(CDCl3、500MHz)δ:0.75 (1H, s, 24-H), 0.79 (1H, s, 25-H), 0.98 (1H, s, 23-H), 1.02 (1H, t-like, 9-H), 1.13 (1H, s, 26-H), 1.60 (1H, s, 27-H), 1.60 (1H, s, 28-H), 1.65 (1H, s, 29-H), 3.21 (1H, dd, J=4.9, 11.6 Hz, 3-H), 3.96 (1H, s, 30-H), 5.12 (1H, dd, J=5.8, 6.7 Hz, 17-H), 5.16 (1H, dd-like, 13-H), 5.38 (1H, dd-like, 21-H)
13C−NMR(CDCl3、125MHz)δc:13.7 (29-C), 15.4 (24-C), 15.5 (25-C), 16.0 (28-C), 16.2 (27-C), 20.2 (6-C), 23.7 (26-C), 25.5 (11-C), 26.1 (20-C), 26.5 (16-C), 27.0 (2-C), 28.1 (23-C), 31.3 (12-C), 37.9 (1-C), 38.8 (4-C), 38.8 (10-C), 39.3 (19-C), 39.6 (15-C), 44.3 (7-C), 55.0 (5-C), 61.1 (9-C), 68.6 (30-C), 73.9 (8-C), 78.6 (3-C), 124.5 (17-C), 125.1 (13-C), 125.7 (21-C), 134.6 (18-C), 134.7 (22-C), 135.0 (14-C)
【0021】
上記結果より、myrrhanol Aは正の旋光性を示す無色油状物質として単離され、FAB−MSおよび高分解能FAB−MSにより、分子式C30H52O3を有する化合物であることが明らかとなった。
1H−NMR測定結果(位相検波NOESYスペクトルデータ)では、3位プロトンと23位メチルプロトン、5位プロトンと3位、9位プロトン、25位メチルプロトンと24位、26位メチルプロトン、21位プロトンと30位メチレンプロトン間にそれぞれ相関が観測された。更には、13C−NMRスペクトルにおいて、27位、28位および29位メチル基が高磁場シフト[δc 16.2(C-27)、16.0(C-28)、13.7(C-29)]していることから、myrrhanol Aの相対立体配置は5位、9位プロトン、23位メチル基および8位水酸基がα配置、24位、25位および26位メチル基および3位水酸基がβ配置、および13−14位間、17−18位間、21−22位間のジオメトリーがE配置であることが判明した。さらに、絶対構造については改良Mosher法を適用することで決定した。すなわち、myrrhanol Aを、1-エチル-3-(3'-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドの塩酸塩(EDC・HCl)と4-ジメチル-アミノピリジン(DMAP)との存在下、R体およびS体のα-メトキシ-α-トリフルオロメチルフェニル酢酸(RおよびS−MTPA)で処理し、R−およびS−MTPAエステル体に誘導した。
そして、これらの化学シフトの差[Δδ=δS−δR]が、3位水酸基を境にして23位および24位メチルプロトンで正に、他方、1位、2位プロトンおよび25位メチルプロトンで負に観測されたことから、myrrhanol Aの3位はS配置であること見出した。
【0022】
以上の検討結果より、myrrhanol Aは、3S、5R、8R、9R、10S、13E、17E、21E配置の、以下の化学構造を有する化合物であると決定された。
【化4】
上記式中の数字はそれぞれ、3,8-ナフトヒドロキノン部位の第1位炭素から付された炭素番号を表す。
【0023】
(2)myrrhanol B
旋光度 [α]D 28+10.6°(c=1.0、MeOH)
高分解能FAB−MS:計算値m/z 497.3607(M+Na)+、実測値;497.3602
FAB−MS:m/z 497 (M+Na)+
IR(フィルム):3453, 1654, 1466, 1387, 1124 cm−1
1H−NMR(CDCl3、500MHz)δ:0.76 (1H, s, 24-H), 0.80 (1H, s, 25-H), 0.99 (1H, s, 23-H), 1.05 (1H, t-like, 9-H), 1.15 (1H, s, 26-H), 1.59 (1H, s, 27-H), 1.59 (1H, s, 28-H), 1.81 (1H, s, 29-H), 3.23 (1H, dd, J=4.8, 10.9 Hz, 3-H), 5.10 (1H, dd, J=6.9, 13.4 Hz, 13-H), 5.10 (1H, dd, J=6.9, 13.4 Hz, 17-H), 5.38 (1H, dd, J=5.8, 7.4 Hz, 21-H)
13C−NMR(CDCl3、125MHz)δc:12.2 (29-C), 15.4 (24-C), 15.6 (25-C), 15.9 (28-C), 16.2 (27-C), 20.3 (6-C), 23.7 (26-C), 25.7 (11-C), 26.1 (16-C), 27.0 (20-C), 27.1 (2-C), 28.2 (23-C), 31.5 (12-C), 37.9 (15-C), 38.0 (1-C), 38.8 (4-C), 38.8 (10-C), 39.4 (19-C), 44.2 (7-C), 55.0 (5-C), 61.3 (9-C), 74.6 (8-C), 78.8 (3-C), 125.2 (13-C), 125.2 (17-C), 125.3 (22-C), 133.3 (14-C), 134.3 (18-C), 143.8 (21-C), 171.7 (30-C)
【0024】
myrrhanol Bは、正の旋光性を有する無色油状物質として単離され、FAB−MSおよび高分解能FAB−MSの解析結果から分子式C30H52O4を有する化合物であると決定された。
myrrhanol Bの1H−および13C−NMRスペクトルデータをmyrrhanol Aと比較すると、側鎖部分を除くデータが非常に類似していた。しかしながら、myrrhanol Aで認められたヒドロキシメチル基に由来するシグナルが消失し、新たにカルボキシル基に由来するシグナルが認められた。さらにHMBCスペクトルでは、21位と30位、29位と21位、29位と22位、29位と30位のプロトン−カーボン間に相関が観測されたことから、myrrhanol Bは、myrrhanol Aの30位ヒドロキシル基がカルボキシル基になった構造であることが明らかになった。
さらに、myrrhanol Bの絶対配置の決定は、メチル化後、改良Mosher法を適用してmyrrhanone Cへ化学誘導することにより、myrrhanone Cと同一の配置であることを確認した。これにより決定されたmyrrhanol Bの化学式を以下に示す。
【化5】
上記式中の数字はそれぞれ、3,8-ナフトヒドロキノン部位の第1位炭素から付された炭素番号を表す。
【0025】
(3)myrrhanol C
旋光度 [α]D 28+14.6°(c=1.0、MeOH)
高分解能FAB−MS:計算値m/z 467.3865(M+Na)+、実測値;467.3878
FAB−MS:m/z 497 (M+Na)+
IR(フィルム):3453, 1658, 1456, 1387, 1048 cm-1
1H−NMR(CDCl3、500MHz)δ:0.76 (1H, s, 24-H), 0.80 (1H, s, 25-H), 0.99 (1H, s, 23-H), 1.02 (1H, t-like, 9-H), 1.13 (1H, s, 26-H), 1.60 (1H, s, 27-H), 1.60 (1H, s, 28-H), 1.61 (1H, s, 30-H), 1.68 (1H, s, 29-H), 3.21 (1H, dd, J=5.0, 10.9 Hz, 3-H), 5.11 (1H, dd-like, 13-H), 5.11 (1H, dd-like, 17-H), 5.17 (1H, dd-like, 21-H)
13C−NMR(CDCl3、125MHz)δc:15.4 (24-C), 15.5 (25-C), 16.0 (28-C), 16.2 (27-C), 17.7 (29-C), 20.2 (6-C), 23.7 (26-C), 25.6 (11-C), 25.7 (30-C), 26.6 (16-C), 26.7 (20-C), 27.1 (2-C), 28.1 (23-C), 31.3 (12-C), 37.8 (1-C), 38.8 (4-C), 38.8 (10-C), 39.7 (15-C), 39.7 (19-C), 44.3 (7-C), 55.0 (5-C), 61.2 (9-C), 73.9 (8-C), 78.7 (3-C), 124.2 (17-C), 124.9 (13-C), 124.9 (21-C), 131.2 (22-C), 134.9 (18-C), 135.2 (14-C)
【0026】
myrrhanolCも、myrrhanol AおよびBと同様に、正の旋光性を有する無色油状物質として単離され、FAB−MSおよび高分解能FAB−MSの解析結果から分子式C30H52O2を有する化合物であると決定された。また、myrrhanol Cは、1H−および13C−NMRスペクトルデータをmyrrhanol Aと比較すると、myrrhanol Aで認められたヒドロキシメチル基に由来するシグナルが消失し、代わりにメチル基に由来するシグナルが認められた。
さらに、HMBCスペクトルでは、21位と30位、29位と21位、29位と22位、29位と30位のプロトン−カーボン間に相関が観測されたことから、myrrhanol Cは、myrrhanol Aの30位ヒドロキシル基がメチル基になった構造であることが明らかになった。
myrrhanol Cの絶対配置は、絶対構造既知のmyrrhanone Cの30位ヒドロキシル基をメチル基に還元する化学誘導により、myrrhanone Cと同一の配置であることを確認することにより決定した。決定されたmyrrhanol Cの化学式を以下に示す。
【化6】
上記式中の数字はそれぞれ、3,8-ナフトヒドロキノン部位の第1位炭素から付された炭素番号を表す。
【0027】
(4)myrrhanone A
旋光度 [α]D 27+11.9°(c=1.0、MeOH)
高分解能FAB−MS:計算値m/z 481.3658(M+Na)+、実測値;481.3669
FAB−MS:m/z 481 (M+Na)+
IR(フィルム):3453, 1650, 1456, 1387, 1080 cm-1
1H−NMR(CDCl3、500MHz)δ:0.95 (1H, s, 25-H), 1.02 (1H, s, 24-H), 1.09 (1H, s, 23-H), 1.13 (1H, t, J=4.0 Hz, 9-H), 1.19 (1H, s, 26-H), 1.60 (1H, s, 27-H), 1.60 (1H, s, 28-H), 1.65 (1H, s, 29-H), 3.96 (1H, s, 30-H), 5.12 (1H, dd-like, 17-H), 5.16 (1H, dd-like, 13-H), 5.39 (1H, dd-like, 21-H)
13C−NMR(CDCl3、125MHz)δc:13.7 (29-C), 15.5 (25-C), 16.0 (28-C), 16.2 (27-C), 21.3 (6-C), 21.3 (24-C), 23.7 (26-C), 25.8 (11-C), 26.1 (20-C), 26.3 (2-C), 26.3 (23-C), 26.5 (16-C), 31.2 (12-C), 38.3 (1-C), 38.5 (10-C), 39.3 (19-C), 39.6 (15-C), 43.7 (7-C), 47.4 (4-C), 55.1 (5-C), 60.3 (9-C), 68.6 (30-C), 73.6 (8-C), 124.4 (17-C), 124.8 (13-C), 125.7 (21-C), 134.6 (18-C), 134.6 (22-C), 135.1 (14-C), 217.0 (3-C)
【0028】
myrrhanone Aは、無色油状の物質として単離され、FAB−MSおよび高分解能FAB−MS、1H−および13C−NMRスペクトルデータをおよびHMBCスペクトルデータの解析結果から分子式C30H50O3で表される化合物であると決定された。
さらに、得られたmyrrhanone AをNaBH4を用いて還元してmyrrhanol Aに化学誘導し、これらが同一の配置であることを確認することにより、myrrhanone Aの絶対構造を決定した。決定されたmyrrhanone Aの化学式を以下に示す。
【化7】
上記式中の数字はそれぞれ、3,8-ナフトヒドロキノン部位の第1位炭素から付された炭素番号を表す。
【0029】
(5)myrrhanone B
旋光度 [α]D 27+13.5°(c=1.0、MeOH)
高分解能FAB−MS:計算値m/z 495.3450(M+Na)+、実測値;495.3461
FAB−MS:m/z 495 (M+Na)+
IR(フィルム):3432, 1699, 1654, 1456, 1387, 1080 cm−1
1H−NMR(CDCl3、500MHz)δ:1.02 (1H, s, 24-H), 0.80 (1H, s, 25-H), 1.09 (1H, s, 23-H), 1.16 (1H, t, J=4.0 Hz, 9-H), 1.21 (1H, s, 26-H), 1.61 (1H, s, 27-H), 1.59 (1H, s, 28-H), 1.82 (1H, s, 29-H), 5.13 (1H, dd-like, 17-H), 5.13 (1H, dd-like, 13-H), 5.38 (1H, t, J=5.9 Hz, 21-H)
13C−NMR(CDCl3、125MHz)δc:12.0 (29-C), 14.7 (25-C), 15.8 (28-C), 16.0 (27-C), 21.2 (6-C), 21.2 (24-C), 23.4 (26-C), 25.7 (11-C), 26.1 (2-C), 26.2 (23-C), 27.0 (16-C), 31.2 (12-C), 33.8 (20-C), 37.9 (15-C), 38.1 (1-C), 38.4 (10-C), 39.3 (19-C), 43.4 (7-C), 47.4 (4-C), 55.0 (5-C), 60.2 (9-C), 74.0 (8-C), 124.9 (17-C), 125.2 (13-C), 127.1 (22-C), 133.4 (14-C), 134.6 (18-C), 144.0 (21-C), 172.2 (30-C), 216.9 (3-C)
【0030】
myrrhanone Bは、無色油状の物質として単離され、FAB−MSおよび高分解能FAB−MS、1H−および13C−NMRスペクトルデータをおよびHMBCスペクトルデータの解析結果から分子式C30H50O3で表される化合物であると決定された。
myrrhanone Bの絶対構造は、myrrhanone Aについての記載と同様にしてNaBH4を用いて還元し、myrrhanol Bに誘導できることを確認することにより決定した。決定されたmyrrhanone Bの化学式を以下に示す。
【0031】
【化8】
上記式中の数字はそれぞれ、3,8-ナフトヒドロキノン部位の第1位炭素から付された炭素番号を表す。
【0032】
実施例3
NO産生抑制活性の評価
本発明における有効成分である各新規トリテルペン(myrrhanol A、BおよびCおよびmyrrhanone AおよびB)について、リポポリサッカライド(LPS)刺激によるマウス腹腔内マクロファージからのNO産生に対する抑制効果を検討した。
ddy系雄性マウスの腹腔より得た滲出細胞を、10%ウシ胎児血清、ペニシリン100単位/mL、ストレプトマイシン100μg/mLを含むRPMI-1640培地に5×106個/mLになるようにサスペンドし、96穴培養プレートに100μLずつ播種した。37℃、5%CO2条件下で1時間培養後、非付着性の細胞を培地ごと除去した。ここに、本発明の新規トリテルペンをそれぞれ10μM、30μMおよび100μMとLPS 10μg/mLとを含む新しい培地を100μLずつ添加して20時間培養後、培地中に産生されたNOをグリース法により定量した。
【表1】
表1:リポポリサッカライド(LPS)刺激による一酸化窒素(NO)産生抑制効果
上記表1中、各結果はそれぞれ平均値±標準誤差で表し、また各結果の末尾の符号「**」は、Dunnettの多重比較検定による対照との有意差:pが0.01未満であったことを表す。
【0033】
表1の結果より、いずれのトリテルペンもNO産生抑制活性を有し、特にmyrrhanol Aの活性が最も強いことが判明した。
【0034】
以下に、本発明の新規トリテルペンを含有する一酸化窒素産生抑制剤を例示するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
製造例1:ドリンク剤の製造
【0035】
〔製法〕
処方に従って上記の成分を蒸留水800 mlに溶解し、蒸留水を加えて全量1000 mLとした後、0.22μmの滅菌フィルターで滅菌し、100mLずつ褐色びんに無菌充填して、1剤あたり10mgのmyrrhanol Aを含有するドリンク剤を得た。
【0036】
製造例2:軟膏剤の製造
〔製法〕
上記全組成を混合、撹拌して均一な組成物(軟膏剤)を調製した。
【0037】
製造例3:テープ剤の製造
〔製法〕
上記全組成を加熱攪拌したものをテープ状に展延して調製した。
【0038】
製造例4:バップ剤の製造
〔製法〕
上記全組成を練合したものを、基布上に展延して調製した。
【0039】
製造例5:クリーム剤の製造
〔製法〕
上記全組成を混和してクリーム剤を調製した。
【0040】
【発明の効果】
本発明の一酸化窒素(NO)産生抑制剤は、有効成分としてカンラン科植物のBalsamodendron mukul HOOK.からの有機溶媒抽出エキス、特にこの植物の幹より得られる樹脂“myrrha(ミルラ)”からの有機溶媒抽出エキスに含有される新規トリテルペン成分を含有する。このトリテルペン成分は、天然植物起源であることから、入手が容易で、さらには生体に対する安全性も高い。
本発明のNO産生抑制剤は、上記抽出エキスから単離される新規トリテルペン成分少なくとも1つを有効成分として含有することにより、リポポリサッカライド(LPS)刺激によるマウス腹腔内マクロファージからのNO産生に対し、優れた抑制効果を発現し、特にmyrrhanol Aの活性が最も強い。
本発明では、このNO産生抑制剤を、経口剤または外用剤の形態で適宜対象に適用(投与)できる。
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