JP4840866B2 - 癌ワクチン - Google Patents
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Description
なお、本出願は、2005年1月19日出願の日本国出願番号特願2005−12092の優先権の利益を主張し、これを引用することにより本明細書に含める。
ウエブサイト上のデータベースであるBioInformatics & Molecular Analysis Section (BIMAS) のHLA Peptide Binding predictions Program を用い、SOX6遺伝子がコードするアミノ酸配列から、HLAクラスIと結合性が高い、9〜10アミノ酸残基のペプチド配列を特定した。日本人のHLAクラスIのタイプは、HLA−A2とHLA−A24が多く、これらで日本人全体の約80%をカバーする。なお、日本人に多いHLA−Aの遺伝子型として、HLA−A2はA0201及びA0206、HLA−A24はA2402が挙げられ、本明細書では、細胞の遺伝子型としてA0201、A2402と記載した場合、記載したアレルを少なくとも一つ有することを意味する。
現在、癌ワクチンとして、腫瘍特異的癌抗原、癌抗原提示抗原提示細胞、または癌抗原反応性細胞障害性T細胞を腫瘍患者に投与する方法が開発されている。本発明においては、SOX6の部分ペプチドを用いているので、治療(予防も含まれる)対象となる腫瘍は、SOX6が発現している腫瘍であれば何でもよく、特にSOX6を高レベルに発現しているグリオーマ、肝癌、肺癌、膵癌、食道癌、メラノーマ、前立腺癌、乳癌、腎癌、または白血病も治療対象の一つとなる。主な治療対象は、こうした腫瘍を有するヒト患者であるが、腫瘍を有するヒト以外の脊椎動物でもかまわない。
==実験初日==
HLAクラス1のタイプがA24(遺伝子型はA2402)の健常人末梢血から、以下のように単核球を分離した。まず、ヘパリン5mlで洗浄したシリンジで、末梢血を50ml採血した。等量のLymphoprep (Fresenius kabi Norge AS, Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway) を転倒混和し、遠心(20℃、2000 rpm、35分間 、ブレーキなし)し、中間層を吸引して採取した。これにPBSを加えて再混濁し、遠心(20℃、2000 rpm、10分間)する操作を3回繰り返して、得られた単核球を洗浄した。
培養7日目に分化した樹状細胞を抗原提示細胞(antigen presenting cells;APCs)として用いた。得られた樹状細胞をirradiate (60Gy)したのち、合成・精製したペプチド(配列番号1〜3及び5のSOX6由来のペプチド)を10μM添加し、37℃、5%CO2存在下で2時間培養して細胞に結合させ、PBSで2回洗浄し、刺激細胞(stimulator cells)とした。なお、コントロールとして、SOX6由来のペプチドのかわりにサイトメガロウィルス(CMV)由来のペプチド(配列番号4:QYDPVAALFF、Provenzano et al., Transfusion 43, pp1567-1574参照)を用いた実験を行った。
培養7日目から培養し、分化させた樹状細胞を用いて、上記と同様の操作で刺激細胞を調整した。
また、培養7日目より刺激細胞と共培養した応答細胞を回収し、新たに調整した刺激細胞と、同様に共培養した。ただし、培養液は培養7日目に用いた上記培養液においてIL−12を含まない培養液を用いた。
なお、実験22日目に樹状細胞を得るための単核球の培養を、同様にして、新たに始めておいた。
実験15日目と同様に、刺激細胞と共培養を続けている応答細胞を回収し、新たに調整した刺激細胞と共培養した。
なお、樹状細胞を得るための単核球の培養を始めたが、24ウエルの培養皿ではなく、96ウエルの培養皿を用い、4x104個/ウエルに調整して播種し、培養した。
96ウエルで培養した単核球を用いて分化誘導した樹状細胞に、0μM、0.1μM、1μM、10μMの各濃度のSOX6由来のペプチドあるいは0μM、0.1μM、1μM、10μMの各濃度のCMV由来のペプチドを添加して、37℃、5%CO2存在下で2時間培養して細胞に結合させ、PBSで2回洗浄し、ターゲット細胞として用いた。
共培養を続けている応答細胞を回収し、エフェクター細胞として2x104個に調整した細胞を、こうして新たに調整したターゲット細胞のウエルに添加し、共培養した。
上記共培養から培養上清を回収し、以下のようにIFN-γELISAを行った。
HLA−A24に結合し得ると予想されたSOX6由来ペプチド(表1参照)のうち、SOX6−360、SOX6−504、およびSOX6−628を添加された樹状細胞との共培養により刺激された細胞障害性T細胞(エフェクター細胞)は、各々の抗原ペプチドを提示した樹状細胞をターゲットとして共培養した時、様々なコントロールに比して、IFN-γ放出量が増加した(図1)。このことは、SOX6ペプチドに由来するペプチド(SOX6−360、SOX6−504、およびSOX6−628)を抗原提示細胞に添加すると、それらのペプチドを提示する抗原提示細胞が得られ、得られた抗原提示細胞によってT細胞を刺激することにより各ペプチドを特異的に認識するT細胞が誘導されたことを示す。
[1]SOX6の発現解析
SOX6を発現している細胞を明らかにすることにより、具体的にどのような細胞が、本発明の方法の対象となるかを調べた。
ヒト正常組織(成人脳及び精巣、及びヒト胎児脳)、グリオーマ細胞株(GI−1、U87、及びT98G)、患者から単離されたグリオーマ組織(グリオブラストーマ組織、及びアストロサイトーマ組織)、ヒト腫瘍細胞株(888mel、928mel、586mel、LK2、PC9、LU99、RERF−LC−MA、TE8、PK56、PK1、PC3、MDA231、RCC6、RCC8、KU7、及びMolt4)におけるSOX6のmRNAの発現を定量的PCRにより解析した。
forward primer, 5'-GATGCCATCAACTCCACAGC-3'(配列番号6)
reverse primer, 5'-GCTGCAGAGCCATTCATTGC-3'(配列番号7)
を用い、 内部コントロールとしてのβ-actinに対するプライマーは
forward primer, 5'-GGCACCCAGCACAATGAAG-3'(配列番号8)
reverse primer, 5'-GCCGATCCACACGGAGTACT-3'(配列番号9)
を用いた。定量的PCRの条件は95℃10分、その後、変性を95℃で30秒,アニーリングを60℃で1分の過程を50サイクル行い、最後に伸長反応を72℃で1分間行った。結果を図2Aに示した。なお、各組織でのSOX6の発現量は、それぞれの組織におけるβアクチンの発現量で標準化した。
次に、タンパク質レベルでのSOX6の発現をウエスタン・ブロッティングによって調べた。まず、上記と同様にして得られた細胞を回収し、破砕バッファー(最終濃度20mM HEPES、最終濃度0.25Mショ糖を純水950mlに加え、PH 7.5に調整した)と共にDounce型ホモジナイザーにいれ、氷上にて細胞を破砕した。破砕液を1000gで7分間遠心し、上清を破棄し、核や未破砕細胞を含む沈殿を回収した。この沈殿に、SDSゲル用ローディングバッファーを加えて溶解し、電気泳動用サンプルとした。これらのサンプルを、SDS-PAGEを用い、各レーンに20μgずつ泳動した。メンブレンにトランスファーし、10μg/mlに調製した抗SOX6抗体(CHEMICON社)によってSOX6タンパク質を認識し、AP結合ヤギ抗ウサギIgG (Fc) 抗体 (2000倍希釈、Cappel, Aurora, Ohio)を反応させた後、Nitro blue tetrazolium (Boehringer Mannheim, GmbH, Germany) と 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)の混合液にて発色させた。結果を図2Bに示した。
SOX6は、これまでに発現が報告された、ヒト胎児脳、成人精巣、グリオーマ細胞株、グリオーマ組織のみならず、メラノーマ、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、扁平上皮肺癌、食道癌、膵癌、前立腺癌、乳癌、腎癌、慢性骨髄性白血病、T細胞性白血病由来の細胞株においても、発現が検出された。(図2A)。
==実験29日目==
この日まで、実施例1と同様にしてエフェクター細胞を調整した。なお、単核球を得る健常人のHLAクラス1のタイプをA24(遺伝子型はA2402)とし、添加したペプチドとして配列番号1〜3のペプチドを用い、コントロールのペプチドとしてCMV由来のペプチド(配列番号4:QYDPVAALFF)を用いた。
上記共培養から培養上清を回収し、IFN-γELISAを行った。図3に結果を示す。
SOX6由来の部分ペプチド(SOX6−504、およびSOX6−628)を用いて誘導された細胞障害性T細胞(エフェクター細胞)は、ターゲット細胞であるグリオーマ細胞(KNS−81)に反応して、コントロールに比して細胞数比依存的にIFN-γ放出量の増加を示した(図3)。このことは、SOX6−504またはSOX6−628を提示している抗原提示細胞を用いて刺激することにより樹立したT細胞は、SOX6とHLA−24を発現しているグリオーマ細胞(KNS−81)を特異的に認識し得ることを示す。樹立したT細胞はU87(HLA−A201とSOX6が共に発現しているがHLA−A24は発現していない細胞)に反応しないことから、これらのSOX6特異的T細胞はHLA−A24拘束性に抗原を認識することが示された。
==実験28日目==
この日まで、実施例1と同様にしてエフェクター細胞を調整した。なお、単核球を得る人のHLAクラス1のタイプをA24(A2402)とし、添加したペプチドとして配列番号1及び2のペプチドを用いた。なお、本実施例では、単核球を得るための末梢血には、健常人末梢血(結果は図4)だけでなく、グリオーマ患者末梢血(結果は図5)も用いた。
特異的溶解率= (cpm−csr)/(cmr−csr) x100
(なお、csr(cpm spontaneous release)はエフェクター細胞を含まない培地を添加したウエルのcpmであり、cmr(cpm maximal release)はエフェクター細胞を含まない0.1% Triton Xを添加したウエルのcpmである。)
CIR−A24−SOX6、グリオーマ細胞由来Marcus、グリオーマ細胞由来SF126、グリオーマ細胞由来KNS−42、肝癌由来HepG2、肺癌由来PC9は、HLA−A24とSOX6を発現している細胞である。図4(健常人由来の末梢血リンパ球からCTLを誘導した場合)及び図5(グリオーマ患者由来の末梢血リンパ球からCTLを誘導した場合)に示したように、SOX6−504またはSOX6−628を添加され樹状細胞との共培養により刺激された細胞障害性T細胞(エフェクター細胞)であるCTL(SOX6−504)とCTL(SOX6−628)は、これらのHLA−A24とSOX6を発現している細胞をE/T ratio依存性に溶解した。
SOX6由来のペプチドの刺激により樹立したエフェクター細胞の、SOX6と無関係なペプチドを表面に有する細胞に対する細胞障害活性を調べることにより、エフェクター細胞のターゲット細胞に対する特異性を調べた。
(1)HLA-A24とSOX6が共に発現しているグリオーマ細胞株Marcus
(2)HLA-A24を発現していてSOX6を発現していないCIR-A2402に、配列番号1を有するペプチドSOX6-504を結合させたCIR-A2402(SOX6-504)または配列番号2を有するペプチドSOX6-628を結合させたCIR-A2402(SOX6-628)
(3)非特異的細胞障害を測定するためのコントロールとして、CIR-A2402に対し、CMV由来の無関係なペプチド(配列番号4)を結合させたCIR-A2402(CMV)
(4)無処理のCIR-A2402
を用いた。実施例3−1に記載の手順にて、上記細胞を51Crでラベルし、5x103/100μlに調整して96穴プレートの各ウエルに100μlずつ添加した。
以上より、SOX6に由来する配列1〜3を有するペプチドを用いて、それらの抗原ペプチドを提示した抗原提示細胞を作製することができ、さらに、その抗原提示細胞によって刺激することにより、各ペプチドのみならずSOX6を発現した細胞を認識する、特異的T細胞が誘導される。
Claims (8)
- 配列番号1〜3のいずれかの配列からなるペプチド
- 配列番号1〜3のいずれかの配列からなるペプチドを提示した抗原提示細胞。
- 配列番号1〜3のアミノ酸配列からなるペプチド群から選択される一つ以上のペプチドを含有する癌ワクチン。
- 配列番号1〜3のいずれかの配列からなるペプチドを提示した抗原提示細胞を含有する癌ワクチン。
- 配列番号1〜3のいずれかの配列からなるペプチドを提示した抗原提示細胞によって誘導され、SOX6を発現する細胞を認識するT細胞を含有する癌ワクチン。
- SOX6を発現する癌細胞に対する癌ワクチンであることを特徴とする請求項3〜5のいずれかに記載の癌ワクチン。
- グリオーマに対する癌ワクチンであることを特徴とする請求項3〜5のいずれかに記載の癌ワクチン。
- 肝癌、肺癌、膵癌、食道癌、メラノーマ、前立腺癌、乳癌、腎癌、または白血病に対する癌ワクチンであることを特徴とする請求項3〜5のいずれかに記載の癌ワクチン。
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