JP5984113B2 - がん免疫療法 - Google Patents
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Landscapes
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Description
本発明は、がん免疫療法に関する。
近年、腫瘍免疫学において、免疫細胞による腫瘍抗原認識機構がかなり解明されてきた。それによると、まず、抗原提示細胞である樹状細胞（dendritic cells；ＤＣ）は、細胞内で、腫瘍が発現するタンパク質を分解する際に生じた８〜１０個のアミノ酸からなる抗原ペプチドを、主要組織適合性抗原複合体（major histocompatibility complex；ＭＨＣ、ヒトでは、human leukocyte antigen；ＨＬＡ）と共に細胞表面に提示する。細胞障害性Ｔ細胞（cytotoxic T lymphocyte；ＣＴＬ）は、樹状細胞表面のＨＬＡクラスＩに結合した抗原ペプチドを認識し、活性化・増殖し、腫瘍内に侵入し、抗原ペプチドが由来するタンパク質を有する腫瘍細胞に対し細胞障害を生じる（例えば、非特許文献１参照）。
この腫瘍抗原認識機構を利用し、正常組織に発現しないか極めて発現が低いががんに発現している分子を標的とした免疫治療や分子標的治療が開発されてきた。このような治療方法は、例えばがん患者体内でがん細胞が原発巣に限局していない場合でもがん細胞を攻撃できるため、外科的治療、化学的治療、放射線治療といった標準治療では腫瘍の治癒が困難な場合に、特に有効な手段として期待されている。
具体的には、腫瘍特異的タンパク質由来の抗原ペプチドを細胞表面に提示する樹状細胞をin vitroで作製し、増殖させ、腫瘍患者に投与したり、その樹状細胞によって教育された細胞障害性Ｔ細胞を投与したりすることにより、腫瘍患者の体内で腫瘍免疫を誘導する。あるいは、腫瘍特異的タンパク質を腫瘍患者に投与し、患者の体内で、腫瘍免疫機構の全過程を誘導させるのである（例えば、非特許文献２〜７参照）。これらの手法は、がん免疫療法として知られている。
このがん免疫療法に用いることができるペプチドは、腫瘍特異的抗原由来であることが好ましいが、腫瘍に発現し、正常組織では、精巣以外には発現が観察されない癌精巣抗原（Cancer-Testis antigen；ＣＴ抗原）由来でもよい（例えば、非特許文献８参照）。精巣では、ＨＬＡが発現していないため、ＣＴ抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞や抗体による攻撃を受けることが無いからである。
一方、最近、腫瘍組織は均一ではなく、抗がん剤や放射線に抵抗性の高いがん細胞集団が存在することが明らかにされ、治療後の再発の原因とされている。特に、腫瘍形成能力が高い一群の細胞集団が存在し、がん幹細胞として知られている。例えば、乳がん細胞株や大腸がん細胞株において、色素Hoechst 33342を排出する能力が高いside populationは、がん幹細胞としての機能を有していることが報告されている（例えば、非特許文献９参照）。このような抗がん剤や放射線に抵抗性の腫瘍細胞に発現が高いＣＴ抗原を標的とした免疫治療や分子標的治療が開発できれば、放射線などによる治療後の腫瘍再発の可能性を低下させ、より奏功率の高い治療法になることが期待される。
Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．（１９９０）１２６：２００−２０５
Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５４：１６４３−１６４７
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９６）１８３：１１８５−１１９２
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）１６３：４９９４−５００４
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：４３２−４３６
Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）２６９：１２８１−１２８４
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９７）１８６：７８５−７９３
Ｍｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．（２０１１）５：１６４−１８２
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００８）６８：２４１９−２４２６
本発明は、がん免疫を効率的に誘導できるペプチド、そのペプチドを含有する組成物、そのペプチドを提示した抗原提示細胞、この抗原提示細胞によって刺激されたＴ細胞、これらのペプチドや細胞を利用した組成物、医薬組成物、医薬、及び抗腫瘍薬、これらのペプチドや抗原提示細胞を利用したがんワクチン、及びがん免疫療法に使用するためのペプチドの同定方法やスクリーニング方法を提供することを目的としてなされた。
悪性黒色腫や白血病で高頻度に高い発現が認められるＣＸｏｒｆ４８は、染色体Ｘｑ２６．３に存在し、肝細胞がん、大腸がん、胃がん、非小細胞肺がんに発現するＣＴ抗原ＢＪ-ＨＣＣ-２０として同定された（Biochem.Cell.Biol.(2004) 82:577-582 ）。本発明者は、これまでに同定されている多数のＣＴ抗原のうち、ＣＸｏｒｆ４８のアミノ酸配列の一部であるＤＹＧＭＩＤＥＳＩ（配列番号１）を用いることにより、ＨＬＡ-Ａ＊２４０２陽性でＣＸｏｒｆ４８を発現している悪性黒色腫細胞株や白血病細胞株を傷害する細胞傷害性Ｔ細胞が誘導できることを見出し、本発明の完成に至った。
本発明の一実施態様は、ＤＹＧＭＩＤＥＳＩ（配列番号１）からなるペプチドである。
本発明の他の一実施態様は、ＤＹＧＭＩＤＥＳＩ（配列番号１）からなるペプチドを提示した抗原提示細胞である。抗原提示細胞は、樹状細胞であってもよい。
本発明の他の一実施態様は、ＤＹＧＭＩＤＥＳＩ（配列番号１）からなるペプチドを提示した抗原提示細胞である。抗原提示細胞は、樹状細胞であってもよい。
本発明のさらなる他の一実施態様は、前記抗原提示細胞によって誘導され、ＣＸｏｒｆ４８を発現する細胞を認識するＴ細胞である。Ｔ細胞は、細胞障害性Ｔ細胞であってもよい。また、ＣＸｏｒｆ４８を発現する細胞が腫瘍細胞であってもよい。前記腫瘍細胞が、悪性黒色腫、慢性骨髄性白血病、または多発性骨髄腫であってもよい。
本発明のさらなる他の一実施態様は、ＤＹＧＭＩＤＥＳＩ（配列番号１）からなるペプチド、または前記いずれかの抗原提示細胞、または前記いずれかのＴ細胞を含有する組成物、医薬組成物、医薬、抗腫瘍薬である。なお、当該ペプチドまたは当該抗原提示細胞を含有するがんワクチンとしてもよい。これらの医薬組成物、医薬または抗腫瘍薬は、悪性黒色腫、慢性骨髄性白血病、または多発性骨髄腫に対するものであってもよい。
本発明のさらなる他の一実施態様は、がん免疫療法に使用するためのペプチドの同定方法であって、ＤＹＧＭＩＤＥＳＩ（配列番号１）において、１〜数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列からなるペプチドが、がん免疫療法に使用できるかどうかを検定する工程を含む。
本発明のさらなる他の一実施態様は、がん免疫療法に使用するためのペプチドのスクリーニング方法であって、ＤＹＧＭＩＤＥＳＩ（配列番号１）からなるペプチドに対し、アミノ酸変異を導入し、変異ペプチドを作製する工程と、前記変異ペプチドが、がん免疫療法に使用できるかどうか、検定する工程と、を含む。
本発明によって、がん免疫を効率的に誘導できるペプチド、そのペプチドを含有する組成物、そのペプチドを提示した抗原提示細胞、この抗原提示細胞によって刺激されたＴ細胞、これらのペプチドや細胞を利用した組成物、医薬組成物、医薬、及び抗腫瘍薬、これらのペプチドや抗原提示細胞を利用したがんワクチン、及びがん免疫療法に使用するためのペプチドの同定方法やスクリーニング方法が提供できるようになった。
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、M. R. Green & J. Sambrook (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (4th edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2012); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
＝＝がん免疫を効率的に誘導できるペプチド＝＝
現在、抗腫瘍薬として、腫瘍特異的がん抗原、がん抗原提示細胞、またはがん抗原反応性細胞障害性Ｔ細胞を腫瘍患者に投与する方法が開発されている。そのうち、腫瘍特異的がん抗原、またはがん抗原提示細胞を含有する抗腫瘍薬は、がんワクチンとして知られている。
現在、抗腫瘍薬として、腫瘍特異的がん抗原、がん抗原提示細胞、またはがん抗原反応性細胞障害性Ｔ細胞を腫瘍患者に投与する方法が開発されている。そのうち、腫瘍特異的がん抗原、またはがん抗原提示細胞を含有する抗腫瘍薬は、がんワクチンとして知られている。
ＤＹＧＭＩＤＥＳＩ（配列番号１）からなるペプチドを合成し、抗原提示細胞である樹状細胞表面に投与すると、ＨＬＡクラスＩ分子であるＨＬＡ−Ａ＊２４０２に結合し、細胞表面に提示され、細胞障害性Ｔ細胞に認識されることで特異的な細胞障害性Ｔ細胞を効率よく誘導できる。また、このペプチドの刺激により樹立された細胞障害性Ｔ細胞は、ＣＸｏｒｆ４８を発現している腫瘍細胞を効率よく認識する。従って、配列番号１のペプチド、そのペプチドを細胞表面に提示した抗原提示細胞、及びその抗原提示細胞の刺激によって樹立された細胞障害性Ｔ細胞は、ＨＬＡ-Ａ＊２４０２陽性でＣＸｏｒｆ４８を発現している腫瘍細胞に対する抗腫瘍薬として有用である。
なお、日本人のＨＬＡクラスＩのタイプは、ＨＬＡ−Ａ＊０２とＨＬＡ−Ａ＊２４が多く、これらで日本人全体の約８０％をカバーする。なお、日本人に多い遺伝子型として、ＨＬＡ−Ａ＊２４に対してはＡ＊２４０２が挙げられ、本明細書では、細胞の遺伝子型としてＡ＊２４０２と記載した場合、そのアレルを少なくとも一つ有することを意味するものとする。
＝＝抗腫瘍薬の投与方法＝＝
本発明の組成物、医薬組成物、医薬、及び抗腫瘍薬は、配列番号１からなるペプチド、配列番号１からなるペプチドを提示した抗原提示細胞、または配列番号１からなるペプチドを提示した抗原提示細胞の刺激によって樹立されたＴ細胞を含有してもよい。
本発明の組成物、医薬組成物、医薬、及び抗腫瘍薬は、配列番号１からなるペプチド、配列番号１からなるペプチドを提示した抗原提示細胞、または配列番号１からなるペプチドを提示した抗原提示細胞の刺激によって樹立されたＴ細胞を含有してもよい。
本発明においては、腫瘍特異的がん抗原としてＣＸｏｒｆ４８の部分ペプチドを用いているので、治療及び予防の対象となる腫瘍は、ＣＸｏｒｆ４８が発現している腫瘍であれば何でもよく、例えば、肝細胞がん、大腸がん、胃がん、非小細胞肺がん、乳がん、悪性黒色腫、神経膠芽腫、肺がん、膵臓がん、膀胱がん、前立腺がん、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫が挙げられるが、特に発現している患者の頻度が非常に高い悪性黒色腫、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫が好ましい。主な治療及び予防の対象は、こうした腫瘍を有するヒト患者であるが、腫瘍を有するヒト以外の脊椎動物でもかまわない。
[ペプチド]
本発明の抗腫瘍薬は、配列番号１からなるペプチドを含有してもよい。この場合、あらかじめ患者のＨＬＡクラスＩのタイプを調べるのが好ましい。ここでは、患者のＨＬＡクラスＩタイプがＡ＊２４０２である場合に、配列番号１からなるペプチドを投与することが好ましい。この抗腫瘍薬は、配列番号１からなるペプチド以外に、治療対象である腫瘍細胞の発現している他種の腫瘍抗原ペプチドを含有していてもよい。また、投与する際には、免疫誘導能を高めるアジュバンドなどと共にペプチドを投与してもよい。また、投与されるペプチドは、生体内で分解されにくくするような修飾が施されていてもよい。さらには、ペプチドそのものではなく、これらのペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターなどを用い、ＤＮＡワクチンとして投与してもよい。
本発明の抗腫瘍薬は、配列番号１からなるペプチドを含有してもよい。この場合、あらかじめ患者のＨＬＡクラスＩのタイプを調べるのが好ましい。ここでは、患者のＨＬＡクラスＩタイプがＡ＊２４０２である場合に、配列番号１からなるペプチドを投与することが好ましい。この抗腫瘍薬は、配列番号１からなるペプチド以外に、治療対象である腫瘍細胞の発現している他種の腫瘍抗原ペプチドを含有していてもよい。また、投与する際には、免疫誘導能を高めるアジュバンドなどと共にペプチドを投与してもよい。また、投与されるペプチドは、生体内で分解されにくくするような修飾が施されていてもよい。さらには、ペプチドそのものではなく、これらのペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターなどを用い、ＤＮＡワクチンとして投与してもよい。
投与部位に関しては、皮内投与、皮下投与、静脈内投与、リンパ節投与、腹腔内投与などが考えられ、特に限定されることはない。
ここで、配列番号１からなるペプチドの取得方法は特に制限されず、遺伝子組み換え技術を用いて製造された組換えペプチドであっても、周知の方法で化学合成したペプチドであってもよい。
[抗原提示細胞]
配列番号１からなるペプチドを提示した抗原提示細胞も、抗腫瘍薬として使用することができる。ここで、細胞表面に提示されているペプチドは、無修飾であっても、糖やリン酸などで修飾されてもよく、生体内で分解されにくくするような修飾が施されていてもよい。抗原提示細胞としては、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、Ｂ７や４−１ＢＢＬなどのＴ細胞刺激因子などを遺伝子導入等で強制的に発現させた腫瘍細胞（偽抗原提示細胞）等が例示できるが、抗原提示能の高さなどを考慮すると、樹状細胞が好ましい。以下、樹状細胞の単離方法の一例を記載するが、他の細胞も公知の方法で容易に取得できる。
配列番号１からなるペプチドを提示した抗原提示細胞も、抗腫瘍薬として使用することができる。ここで、細胞表面に提示されているペプチドは、無修飾であっても、糖やリン酸などで修飾されてもよく、生体内で分解されにくくするような修飾が施されていてもよい。抗原提示細胞としては、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、Ｂ７や４−１ＢＢＬなどのＴ細胞刺激因子などを遺伝子導入等で強制的に発現させた腫瘍細胞（偽抗原提示細胞）等が例示できるが、抗原提示能の高さなどを考慮すると、樹状細胞が好ましい。以下、樹状細胞の単離方法の一例を記載するが、他の細胞も公知の方法で容易に取得できる。
まず、脊椎動物個体の末梢血から単核球（以下、ＰＢＭＣとも称する）を単離し、ＨＬＡクラスＩタイプを調べてＡ＊２４０２であることを確認する。このＰＢＭＣは、治療対象となる個体自身から分離することが好ましいが、他の個体から単離してもよい。また、このＰＢＭＣはＣＤ１４陽性またはＣＤ１１ｃ陽性であることが好ましい。ＰＢＭＣの単離方法は特に制限されず、単離したいＰＢＭＣの種類によって当業者が適宜決定できる。例えば、フィコール遠心分離法等によりＰＢＭＣ全体（ＰＢＭＣ分画）を単離でき、抗体結合磁気ビーズ分離法等によりＣＤ１４陽性ＰＢＭＣやＣＤ１１ｃ陽性ＰＢＭＣを単離できる。単離したＰＢＭＣを、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４を添加した培地で５〜７日間培養することにより、樹状細胞前駆細胞に分化誘導することができる。このようにして分化誘導した樹状細胞前駆細胞のＨＬＡクラスＩタイプがＡ＊２４０２である場合には、配列番号１からなるペプチドを添加する。こうして得られた樹状細胞は、配列番号１からなるペプチドを提示した抗原提示細胞であり、これを、がんに罹患した個体に投与してもよい。
投与部位は、皮内投与、皮下投与、静脈内投与、リンパ節投与、腹腔内投与などが考えられ、特に限定されない。ただし、生理的な樹状細胞の抗原提示を含む生理的な抗がん免疫反応が、がん組織内並びに樹状細胞投与部位の所属リンパ節近傍で行われることを考慮すると、がん組織内またはリンパ節内への直接投与が好ましい。
[がん抗原反応性細胞障害性Ｔ細胞]
本発明のがん抗原反応性細胞障害性Ｔ細胞は、ＣＸｏｒｆ４８を発現する細胞を認識するＴ細胞であって、例えば、配列番号１からなるペプチドを提示した抗原提示細胞と共に、血清の存在下でナイーブＴ細胞を共培養し、ＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）またはＣＤ４陽性のヘルパーＴ細胞などへと分化させることによって得られる。
本発明のがん抗原反応性細胞障害性Ｔ細胞は、ＣＸｏｒｆ４８を発現する細胞を認識するＴ細胞であって、例えば、配列番号１からなるペプチドを提示した抗原提示細胞と共に、血清の存在下でナイーブＴ細胞を共培養し、ＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）またはＣＤ４陽性のヘルパーＴ細胞などへと分化させることによって得られる。
なお、ナイーブＴ細胞の由来は特に限定されず、例えば、脊椎動物の末梢血由来であってもよい。用いるナイーブＴ細胞は、ＰＢＭＣ分画から単離されたＣＤ８陽性細胞やＣＤ４陽性細胞であってもよいが、ＣＴＬの誘導効率を考慮すると、ＰＢＭＣ分画から単離されておらず、他種の細胞や成分と混在した状態のＣＤ８陽性細胞やＣＤ４陽性細胞であることが好ましい。例えば、ＰＢＭＣ分画の細胞を配列１からなるペプチドと血清が添加された培地で培養すると、ＰＢＭＣが樹状細胞前駆細胞に分化し、樹状細胞前駆細胞はさらにペプチドと結合することで樹状細胞へと分化し、このペプチドを提示する抗原提示細胞になる。この抗原提示細胞がＰＢＭＣに含まれるＣＤ８陽性Ｔ細胞を刺激し、ＣＴＬに分化誘導する。こうして、添加したペプチドを認識するＣＴＬを得ることができる。この際、培養時間はＣＴＬが得られる範囲で当業者が適宜設定できるが、例えば、３７℃において４〜１０日間であることが好ましく、６日間であることがより好ましい。
このようにして得られたＴ細胞は、単離した後、そのまま使用してもよいが、ＩＬ−２等のインターロイキン、抗原提示細胞、および配列１からなるペプチドの存在下でさらに培養した後に使用してもよい。この操作によって、Ｔ細胞の細胞傷害性を高めることができる。
投与部位は、皮内投与、皮下投与、静脈内投与、腫瘍内投与などが例示でき、特に限定されないが、細胞傷害性Ｔ細胞の場合、抗原を発現する細胞を直接攻撃できるため、腫瘍内投与が好ましい。
＝＝がん免疫療法に使用するためのペプチドのスクリーニング方法＝＝
配列番号１からなるペプチドを基礎として、がん免疫療法に使用するための新たなペプチドを同定することができる。
配列番号１からなるペプチドを基礎として、がん免疫療法に使用するための新たなペプチドを同定することができる。
まず、配列番号１からなるペプチドに対し、１〜数個のアミノ酸変異を導入した配列を設計する。アミノ酸変異の種類は特に限定されず、欠失、置換、挿入、及びそれらの組み合わせのいずれであっても構わない。アミノ酸変異の数は、特に限定されず、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、のいずれであっても良いが、設計した変異ペプチドは８〜１０個のアミノ酸からなることが好ましく、９個のアミノ酸からなることが最も好ましい。すなわち、最終的にそのような数のアミノ酸からなる配列になるように、導入する変異を決め、変異ペプチドを設計する。
そして、その様に設計した変異ペプチドを、実際に合成する。合成方法は、配列番号１からなるペプチドについて上述したものと、同様の方法を用いることができる。
次に、合成した変異ペプチドが、がん免疫療法に使用できるかどうかを検定する。検定方法は特に限定されないが、当業者がその結果を見て、がんワクチンなどの抗腫瘍薬の製造に利用できるかどうか判断できるものであれば良い。例えば、変異ペプチドまたは変異ペプチドを提示させた樹状細胞が誘導したＣＴＬが、変異ペプチドあるいはＣＸｏｒｆ４８またはその一部を発現したり提示している細胞に対し、ＩＦＮ−γを分泌する活性があるかどうか調べたり、細胞障害活性があるかどうかを調べたりすればよい。そして、抗腫瘍薬の製造に利用できると判断できた変異ペプチドは、次の段階、例えば臨床試験などに移すことができる。
この方法を応用して、がん免疫療法に使用するためのペプチドのスクリーニングを行うこともできる。即ち、複数の変異ペプチドを含むペプチドライブラリーにおいて、各変異ペプチドに対し、ここで述べたように、抗腫瘍薬の製造に利用できるかどうか検定することにより、ペプチドライブラリーの中から、がん免疫療法に使用するための変異ペプチドを同定することができる。
[１]ＣＸｏｒｆ４８遺伝子の発現
本実施例では、ＣＸｏｒｆ４８遺伝子が、正常組織では、精巣以外で発現していないが、様々ながん細胞株およびがん組織では発現が高いことを示す。
本実施例では、ＣＸｏｒｆ４８遺伝子が、正常組織では、精巣以外で発現していないが、様々ながん細胞株およびがん組織では発現が高いことを示す。
[１−１]まず、試料として、メラノサイトを含む正常組織、及びメラノーマ細胞株８検体を用い、Isogen（ニッポンジーン社）を用いてｍＲＮＡを抽出し、GoScriptTMReverse Transcription System（Promega社）を用いてｃＤＮＡを合成し、TakaraTaq polymerase（Takara Bio社）を用いてＰＣＲを行った。図１に、得られた増幅産物のシグナルを示す。なお、ＰＣＲのプライマーは、全てのアイソフォームが検出できる、以下のものを用いた。
Forward：5’-GTTGTGCCTCGCCATCTTTATG-3’（配列番号２）
Reverse：5’-TGCACTGGGGTGATAGAAATCG-3’（配列番号３）
図１に示されるように、正常組織においては、ＣＸｏｒｆ４８遺伝子は精巣においてのみ発現が観察され、メラノーマ細胞では、高頻度で、高レベルの発現が観察された。
Reverse：5’-TGCACTGGGGTGATAGAAATCG-3’（配列番号３）
図１に示されるように、正常組織においては、ＣＸｏｒｆ４８遺伝子は精巣においてのみ発現が観察され、メラノーマ細胞では、高頻度で、高レベルの発現が観察された。
[１−２]次に、試料として、固形腫瘍細胞株１３検体、造血器腫瘍細胞株(多発性骨髄腫細胞株を含む)１５検体を用い、同様にして、ＲＴ−ＰＣＲを行った。今回は、増幅産物を電気泳動して得られたシグナルを、ｉｍａｇｅＪを用いて定量し、ヒトメラノーマ細胞株である５０１Ａを基準としてＣＸｏｒｆ４８遺伝子の発現量を比較した。図２に、各試料において得られたシグナルと、発現量の相対値を示す。
図２Ａに示されるように、ＣＸｏｒｆ４８遺伝子は、様々な種類の腫瘍（アストログリオーマ、グリオブラストーマ、肺がん、膵がん、膀胱がん、前立腺がん、乳がん、腎がん）において、発現していた。また、図２Ｂに示されるように、様々な種類の造血器腫瘍（慢性骨髄性白血病、バーキットリンパ腫、組織球性リンパ腫、多発性骨髄腫）において、発現していた。
このように、ＣＸｏｒｆ４８遺伝子は、正常組織では、精巣以外で発現していないが、様々ながん細胞株および腫瘍組織で、高レベルで発現している。従って、ＣＸｏｒｆ４８遺伝子をターゲットとすることで、広範な種類の腫瘍を治療することができる。
[１−３]次に、試料として、慢性骨髄性白血病(Chronic Myelogenous Leukemia；ＣＭＬ)患者検体２０検体、 健常人リンパ球５検体を用い、同様にして、ＲＴ−ＰＣＲを行った。図３に、得られた増幅産物のシグナルを示す。
図３に示されるように、ＣＭＬ患者においても、高頻度（２０例中１７例）でＣＸｏｒｆ４８遺伝子の発現が検出された。
このように、ＣＸｏｒｆ４８遺伝子は、ＣＭＬ患者においても、高頻度で、高レベルで発現している。従って、ＣＸｏｒｆ４８遺伝子は、ＣＭＬ患者に対するがん免疫療法のためのターゲット遺伝子として有効である。
[１−４]さらに、試料として、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞株（ＫＵ８１２）、または多発性骨髄腫（Multiple myeloma）細胞株（ＫＭＳ３４）において、それぞれ、抗ＣＤ３４抗体（Miltenyi Biotec社130-081-002）と抗ＣＤ３８抗体（Miltenyi Biotec社130-092-219）、または抗ＣＤ１３８抗体（Miltenyi Biotec社130-081-301）を用い、ＦＡＣＳを用いたソーティングにより、がん幹細胞分画、すなわちＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性ＫＵ８１２細胞分画及びＣＤ１３８陰性ＫＭＳ３４細胞分画を採取した（ＣＭＬのがん幹細胞分画については、Blood (1996) 88(5):1796-1804を参照のこと。また、多発性骨髄腫のがん幹細胞分画については、Cancer Letters(2009) 277:1-7を参照のこと。なお、これらの文献を本明細書に援用する。）。そして、同様にして、ＲＴ−ＰＣＲを行い、ＣＸｏｒｆ４８遺伝子の発現量を比較した。図４に、各試料において得られたシグナルと、発現量の相対値を示す。
図４に示されるように、ＣＤ３４陽性ＣＤ３８陰性ＫＵ８１２細胞分画、及びＣＤ１３８陰性ＫＭＳ３４細胞分画で得られたがん幹細胞においても、ＣＸｏｒｆ４８遺伝子の発現が検出できた。従って、ＣＸｏｒｆ４８遺伝子は、ＣＭＬ患者に対するがん免疫療法のターゲット遺伝子として、非常に有効である。
[２]ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性健常人ＰＢＭＣを用いたＣＴＬの誘導
まず、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性健常人から末梢血をヘパリン採血し、その末梢血に等量のＰＢＳ（Phospate Buffered Salines;Sigma-Aldrich社）を加え、Lymphoprep（Nycomed 社）に重層して遠心し（２０００ｒｐｍ、３０分、室温）、ＰＢＭＣが含まれる中間層をＰＢＭＣ分画として分離した。得られたＰＢＭＣに対し、ＭＡＣＳ法を用い、ＣＤ１４陽性細胞を単離した。この細胞を、ＩＬ−４（最終濃度１００ｎｇ／ｍｌ）及びＧＭ−ＣＳＦ（最終濃度１００ｎｇ／ｍｌ）を添加した１０％ＡＢ型ヒト血清添加ＡＩＭ−Ｖ培地（GIBCO社）で、３７℃、５％ＣＯ２環境下で（以下、全ての培養は同環境条件で行った）５日間培養した後、ＴＮＦ−α（最終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）を培地に添加し、さらに２日間培養した。
まず、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性健常人から末梢血をヘパリン採血し、その末梢血に等量のＰＢＳ（Phospate Buffered Salines;Sigma-Aldrich社）を加え、Lymphoprep（Nycomed 社）に重層して遠心し（２０００ｒｐｍ、３０分、室温）、ＰＢＭＣが含まれる中間層をＰＢＭＣ分画として分離した。得られたＰＢＭＣに対し、ＭＡＣＳ法を用い、ＣＤ１４陽性細胞を単離した。この細胞を、ＩＬ−４（最終濃度１００ｎｇ／ｍｌ）及びＧＭ−ＣＳＦ（最終濃度１００ｎｇ／ｍｌ）を添加した１０％ＡＢ型ヒト血清添加ＡＩＭ−Ｖ培地（GIBCO社）で、３７℃、５％ＣＯ２環境下で（以下、全ての培養は同環境条件で行った）５日間培養した後、ＴＮＦ−α（最終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）を培地に添加し、さらに２日間培養した。
得られた樹状細胞に対し配列番号１からなるペプチド５０μｇ／ｍｌを加えて室温で3時間反応させ、Ｘ線照射（５０Ｇｙ）したものとＰＢＭＣに対してＭＡＣＳ（Magnetic Cell Sorting）法を用いて単離されたＣＤ８陽性細胞を１：２０の割合で混合し、ＩＬ−７（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）を添加した培地で７日間刺激培養した。なお、培養途中（１日目及び４日目）で、培地にＩＬ−２（最終濃度２０ｕ／ｍｌ）を添加した。
得られた細胞に対し、ＰＢＭＣにphytohaemagglutinin（SIGMA社）を９６時間加えて作成したＰＨＡｂｌａｓｔに配列番号１からなるペプチド５０μｇ／ｍｌを加えてＸ線照射（１００Ｇｙ）した細胞を２：１で混合し、さらに、７日間刺激培養した。なお、培養途中（１日目及び４日目）で、培地にＩＬ−２（最終濃度２０ｕ／ｍｌ）を添加した。
得られた細胞に対し、再度、前回と同じ方法で配列番号１からなるペプチド５０μｇ／ｍｌをパルスしたＰＨＡｂｌａｓｔを２：１の割合で混合し、さらに、７日間刺激培養して、目的のＣＴＬを得た。
[３]５１Ｃｒ細胞傷害試験
[２]で得られたＣＴＬ（effector細胞）を、１０％ＡＢヒト血清添加ＡＩＭ−Ｖを用いて、アイソトープ（５１Ｃｒ）で標識した標的細胞（target細胞）１Ｘ１０３細胞／ウェルと様々な比率（E/T比；effector/target ratio ０．３：１〜３０：１）で混合し、４時間培養後、上清を回収し、上清中の放射線量を測定した。
[２]で得られたＣＴＬ（effector細胞）を、１０％ＡＢヒト血清添加ＡＩＭ−Ｖを用いて、アイソトープ（５１Ｃｒ）で標識した標的細胞（target細胞）１Ｘ１０３細胞／ウェルと様々な比率（E/T比；effector/target ratio ０．３：１〜３０：１）で混合し、４時間培養後、上清を回収し、上清中の放射線量を測定した。
まず、標的細胞として、配列番号１からなるペプチド５μｇ／ｍｌを室温で１時間添加したＣ１Ｒ−Ａ２４細胞を用い、コントロールとして、等量のＤＭＳＯを添加したＣ１Ｒ−Ａ２４細胞、ＨＩＶペプチド(RYLRDQQLL：配列番号４)、Ｋ５６２細胞（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陰性、ＣＸｏｒｆ４８陽性）を用いた。
得られた放射線量から、下式に従って、細胞傷害割合（Cytotoxicity）を算出し、グラフにプロットした。
Cytotoxicity (%) =（Experimental 51Cr release (cpm) - Spontaneous 51Cr release (cpm)）X100／（Maximum 51Cr release (cpm) - Spontaneous 51Cr release (cpm)）
Maximum 51Cr release ; 標的細胞にTritonXを加えて100％傷害した場合の51Cr放出
Spontaneous 51Cr release ；標的細胞にmediumのみを加えた場合の51Cr放出
図５に示されるように、配列番号１からなるペプチドを添加したＣ１Ｒ−Ａ２４細胞を標的細胞として用いた場合にのみ、特異的に細胞障害活性が検出された。このように、配列番号１からなるペプチドによって誘導されたＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性に抗原特異的な細胞障害活性を有する。
Maximum 51Cr release ; 標的細胞にTritonXを加えて100％傷害した場合の51Cr放出
Spontaneous 51Cr release ；標的細胞にmediumのみを加えた場合の51Cr放出
図５に示されるように、配列番号１からなるペプチドを添加したＣ１Ｒ−Ａ２４細胞を標的細胞として用いた場合にのみ、特異的に細胞障害活性が検出された。このように、配列番号１からなるペプチドによって誘導されたＣＴＬは、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２拘束性に抗原特異的な細胞障害活性を有する。
次に、標的細胞として、メラノーマ患者由来のメラノーマ細胞（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性、ＣＸｏｒｆ４８陽性）を用いた。コントロールとしては、５２６ｍｅｌ細胞（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陰性、ＣＸｏｒｆ４８陽性）を用いた。同様に、細胞傷害割合を算出し、グラフにプロットした。
図６に示されるように、生体由来であるＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性メラノーマ細胞に対しても、細胞障害活性が検出された。このように、配列番号１からなるペプチドによって誘導されたＣＴＬは、腫瘍細胞に対する抗腫瘍薬として有効である。
[４]ELISpot法（Enzyme-Linked Immunospot法）
抗ヒトＩＦＮ-γ抗体（Mabtech社）をＰＢＳで１５倍希釈した溶液を１ウエルあたり１００μl加え、４℃で一晩コーティングした９６穴プラスティックプレートを用い、１ウエル当たり、各細胞５．０ｘ１０４個でＣＴＬと標的細胞をＡＩＭ−Ｖ培地中で１：１で混合した。３７℃、５％ＣＯ２環境下で２４時間培養後、細胞を洗浄し、アルカリフォスファターゼで標識した抗ヒトＩＦＮ-γ抗体（Mabtech社）を反応させた。これに発色基質としてＢＣＩＰ（5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphatase）(BIORAD社）およびＮＢＴ（nitroblue tetrazolium）(BIORAD社）を加えて発色させ、Ｔ細胞が産生したＩＦＮ-γをスポットとして検出した。そして、ＥＬＩＳｐｏｔアナライザーにて各ウエルのスポット数を測定し、グラフ化した。
抗ヒトＩＦＮ-γ抗体（Mabtech社）をＰＢＳで１５倍希釈した溶液を１ウエルあたり１００μl加え、４℃で一晩コーティングした９６穴プラスティックプレートを用い、１ウエル当たり、各細胞５．０ｘ１０４個でＣＴＬと標的細胞をＡＩＭ−Ｖ培地中で１：１で混合した。３７℃、５％ＣＯ２環境下で２４時間培養後、細胞を洗浄し、アルカリフォスファターゼで標識した抗ヒトＩＦＮ-γ抗体（Mabtech社）を反応させた。これに発色基質としてＢＣＩＰ（5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphatase）(BIORAD社）およびＮＢＴ（nitroblue tetrazolium）(BIORAD社）を加えて発色させ、Ｔ細胞が産生したＩＦＮ-γをスポットとして検出した。そして、ＥＬＩＳｐｏｔアナライザーにて各ウエルのスポット数を測定し、グラフ化した。
標的細胞としては、配列番号１からなるペプチドを添加したＣ１Ｒ−Ａ２４細胞及びＫＭＳ２１（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陽性、ＣＸｏｒｆ４８陽性）を用い、コントロールとして、培地のみ、ＤＭＳＯ添加Ｃ１Ｒ−Ａ２４細胞、ＨＩＶペプチドを添加したＣ１Ｒ−Ａ２４細胞、Ｋ５６２細胞（ＨＬＡ−Ａ＊２４０２陰性、ＣＸｏｒｆ４８陽性）を用いた。
図７に示されるように、配列番号１からなるペプチドを添加したＣ１Ｒ−Ａ２４細胞及びＫＭＳ２１からは、それぞれＤＭＳＯ添加Ｃ１Ｒ−Ａ２４細胞及びＤＭＳＯ添加Ｃ１Ｒ−Ａ２４細胞に比べ、有意に多量のＩＦＮ-γが分泌された。
このように、配列番号１からなるペプチドによって誘導されたＣＴＬは、ＨＬＡ−A＊２４０２拘束性に抗原特異的なＩＦＮ-γ分泌を生じる活性を有する。
Claims (13)
- ＤＹＧＭＩＤＥＳＩ（配列番号１）からなるペプチド。
- ＤＹＧＭＩＤＥＳＩ（配列番号１）からなるペプチドを提示したＨＬＡ−Ａ ＊ ２４０２陽性抗原提示細胞。
- 樹状細胞であることを特徴とする請求項２に記載のＨＬＡ−Ａ ＊ ２４０２陽性抗原提示細胞。
- 請求項２または３に記載のＨＬＡ−Ａ ＊ ２４０２陽性抗原提示細胞によって誘導され、ＣＸｏｒｆ４８を発現する細胞を認識するＴ細胞。
- 細胞障害性Ｔ細胞であることを特徴とする請求項４のＴ細胞。
- ＣＸｏｒｆ４８を発現する細胞が腫瘍細胞であることを特徴とする請求項４のＴ細胞。
- 前記腫瘍細胞が、悪性黒色腫、慢性骨髄性白血病、または多発性骨髄腫であることを特徴とする請求項６のＴ細胞。
- ＤＹＧＭＩＤＥＳＩ（配列番号１）からなるペプチド、請求項２または３に記載のＨＬＡ−Ａ ＊ ２４０２陽性抗原提示細胞、請求項４〜７のいずれかに記載のＴ細胞を含有する組成物。
- ＤＹＧＭＩＤＥＳＩ（配列番号１）からなるペプチド、請求項２または３に記載のＨＬＡ−Ａ ＊ ２４０２陽性抗原提示細胞、請求項４〜７のいずれかに記載のＴ細胞を含有する医薬組成物。
- ＤＹＧＭＩＤＥＳＩ（配列番号１）からなるペプチド、請求項２または３に記載のＨＬＡ−Ａ ＊ ２４０２陽性抗原提示細胞、請求項４〜７のいずれかに記載のＴ細胞を含有する抗腫瘍薬。
- 悪性黒色腫、慢性骨髄性白血病、または多発性骨髄腫に対する抗腫瘍薬であることを特徴とする請求項１０に記載の抗腫瘍薬。
- がん免疫療法に使用するためのペプチドの検定方法であって、
ＤＹＧＭＩＤＥＳＩ（配列番号１）において、１〜数個のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列からなるペプチドが、がん免疫療法に使用できるかどうかを検定する工程を含む、検定方法。 - がん免疫療法に使用するためのペプチドのスクリーニング方法であって、
ＤＹＧＭＩＤＥＳＩ（配列番号１）からなるペプチドに対し、アミノ酸変異を導入し、変異ペプチドを作製する工程と、
前記変異ペプチドが、がん免疫療法に使用できるかどうか、検定する工程と、
を含むスクリーニング方法。
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