JP4837249B2

JP4837249B2 - ニトロチロシン生成阻害剤・ペルオキシナイトライト阻害剤

Info

Publication number: JP4837249B2
Application number: JP2003412935A
Authority: JP
Inventors: 一博末次
Original assignee: Naris Cosmetics Co Ltd
Current assignee: Naris Cosmetics Co Ltd
Priority date: 2003-12-11
Filing date: 2003-12-11
Publication date: 2011-12-14
Anticipated expiration: 2023-12-11
Also published as: JP2005170849A

Description

本発明は、水溶性の高いペルオキシナイトライト阻害作用を有する成分を含有するペルオキシナイトライト阻害剤及びそれを配合してなる虚血・再灌流障害抑制剤に関する。

近年、虚血・再灌流障害に起因する臓器障害等の疾患が注目されている。虚血の種類としては、腫瘍など外部からの圧迫による動脈壁の狭窄または閉塞によって生じる圧迫性虚血、血栓・動脈硬化症のように血管内または血管自体の変化による閉塞性虚血、および脳貧血・狭心症などのように血管痙攣による痙攣性虚血に分けることができ、虚血が血管内腔の狭窄によるか、または完全閉塞によるかに依って相対的虚血と絶対的虚血とに分類される。また、病態に起因する場合以外にも手術中の出血防止、止血処置などで、容易に虚血状態が生じる。通常、虚血
により生ずる局所の変化は、虚血の持続時間、虚血に対する組織の感受性、あるいはその部位での血管吻合の有無によって異なるが、一般に虚血
領域の細胞や組織に酸素欠乏と栄養障害をもたらす。

初期の梗塞や梗塞にまで至らない手術中の虚血の場合などは、虚血状態を改善すれば梗塞が回避されるようにも考えられるが、実際には頻繁に虚血・再灌流障害が生じる。虚血・再灌流障害
とは、虚血に陥った臓器への血流再開に伴う再灌流による臓器の細胞や組織に生じる障害のことである。脳や心筋、肺、肝、腎、膵、消化管などの虚血後の障害
発生機序としては、主に好中球やマクロファージなどの貪食細胞、血管内皮細胞などにより産生される活性酸素の発生、ロイコトリエン、トロンボキサンの生成、脂質・糖の過酸化、タンパク質の変性、酵素の不活性化、DNA鎖の切断、核酸塩基の修飾などが組織障害の原因の一つと考えられている。

虚血・再灌流時に発生する活性酸素としては、スーパーオキサイドアニオン（O₂ ^-）の関与が知られている。近年、スーパーオキサイドアニオンは、血中に存在する一酸化窒素（NO）に捕捉され、ペルオキシナイトライト〔ペルオキシ亜硝酸イオン（ONOO-）／ペルオキシ亜硝酸（ONOOH）〕という、より強力な酸化力や毒性を持つ物質が生成されこれが、虚血・再灌流障害に深く関与しているといわれている。これらのことから、虚血・再灌流時に生じる障害を抑制する事が、虚血を伴う種々の病態の改善や手術時の組織障害などを低減させるためには必要であることが理解される。再灌流障害を抑制するためには、再灌流時に発生するペルオキシナイトライトを捕捉することが必要である。
P.Wang ＆ J.I.Zweier、J.Biol.Chem.、271、29230−29233（1996）

現在、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）やカタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼほか多数の生体の酸化障害に対する予防、制御物質が実際に治療に用いられているが、これらは直接ペルオキシナイトライトを捕捉するのではなく、スーパーオキサイドアニオンを捕捉し、ペルオキシナイトライトの生成を抑えるものであるが、スーパーオキサイドアニオンとNOとの反応速度は、SODとスーパーオキサイドアニオンとの反応より3倍速いため、十分にペルオキシナイトライトの生成を抑えることはできない。

皮膚外用剤としてグルタチオンやシスチンなどの中から選ばれたペルオキシナイトライト阻害剤を配合した皮膚外用剤が提案されている。しかし、グルタチオン、システインなどは、酸化され分子間でジスルフィドを形成することが知られており、ジスルフィドを形成すればペルオキシナイトライト阻害作用は消失してしまうと考えられる。つまり、−SH基を有する化合物に関しては、経時的な安定性に優れることが望まれている。
特開２００２−３２６９２２

強力なペルオキシナイトライト捕捉能のある物質として、血液中に存在する尿酸が知られている。しかし、尿酸は血液中における溶解性が低いため、痛風などの原因となり、血中への投与は困難であり、尿酸と同等の活性を有し、血中での溶解性が高く、保管上の面から、熱安定性に優れた成分の開発が求められている。

ＮＯは生体内で炎症や感染が起こったときなどに大量に発生し、この過剰に産出されたＮＯが種々の細胞傷害を起こすと言われてきた。しかし、最近の研究によって、このＮＯは活性酸素の一種であるスーパーオキシドと速やかに反応してペルオキシナイトライトを形成することが明らかになったことから、従来ＮＯによるとされてきた生体内抗酸化酵素の失活や細胞傷害などはペルオキシナイトライトによる可能性が高いという報告がなされている。また、このときペルオキシナイトライトは蛋白質のチロシン残基をニトロ化することにより、ニトロチロシンを生成するが、老化に伴って生体内にニトロチロシンが蓄積されるという報告もある。ペルオキシナイトライトが発生するとニトロチロシンが生成されることから、ニトロチロシンを検出することがペルオキシナイトライトを捕える方法であるとされ、この方法がペルオキシナイトライトの検出手法として一般に用いられているこのことから、広義では、ペルオキシナイトライト阻害剤はニトロチロシンの生成阻害剤と同一であると考えられている。
吉村哲彦編、生体内一酸化窒素（NO）実験プロトコール、共立出版、p167−173(2000)

以上のことから、本発明者らは、ニトロチロシンの生成を阻害することがペルオキシナイトライト阻害作用であると考え、鋭意努力した結果、ニトロチロシンの生成を阻害する成分を検索することにより、ペルオキシナイトライト阻害剤および虚血・再灌流障害抑制剤
の検索を行った。

その結果、D-ペニシラミン、ブシラミン、チオプロリン、チオサリチル酸にペルオキシナイトライト阻害作用が強く、尿酸と比較して水に対する溶解性が極めて優れ、更に、熱安定性に優れることを見出し、発明が完成するに至った。すなわち、本発明は、D-ペニシラミン、ブシラミン、チオプロリン、チオサリチル酸およびその塩から選ばれる成分を含有することを特徴とする。

以上のごとく、本発明のD-ペニシラミン、ブシラミン、チオプロリン、チオサリチル酸およびその塩から選ばれる成分を含有することにより、血中に投与しても安定で、高いペルオキシナイトライト阻害作用を発揮するものである。更に、熱安定性に優れ、製剤にしても安定なものである。

本発明において、このペルオキシナイトライト阻害剤のスクリーニング法は限定されないが、ペルオキシナイトライトをチロシンと共存させ、生成するニトロチロシンの生成を吸光度（４２５ｍｎ）の増加による確認又はＨＰＬＣにより測定を行なう。ペルオキシナイトライト阻害作用があれば、ニトロチロンシンの生成は抑えられ、吸光度（４２５ｎｍ）の上昇は見られないか、ＨＰＬＣでニトロチロシンの増加が見られないことからペルオキシナイトライト阻害作用有する物質のスクリーニングを行なうことができる。

血液に対する溶解度は、水に対する溶解性の確認で代用が可能である。被検試料として、尿酸に骨格が類似であるプリン類、部分的に類似骨格を持つ化合物、含窒素化合物、含イオウ化合物に関して、ペルオキシナイトライト阻害作用の確認と水への溶解性の確認を実施した。その結果グルタチオン、D-ペニシラミン、ブシラミン、チオプロリン、チオサリチル酸、チオ尿素、システイン、N-アセチルシステインに尿酸と同程度の活性が見られ、水に対する溶解性が高いため、血中への投与でも尿酸のように結晶化が起こらず、有効であることを確認した。

さらに、熱安定性を確認したところ、D-ペニシラミン、ブシラミン、チオプロリン、チオサリチル酸は熱安定性が非常に優れていた。

本発明にかかるD-ペニシラミンは、別名メルカプターゼとも言われ、アミノ酸の一種で、分子式及び分子量はC₅H₁₁NO₂S＝149である。ペニシリンを100℃下、希酸で分解するかまたはアルカリで不活化したのち塩化水銀（II）で分解して得られる。本品は、一般試薬または大正製薬から入手可能である。L−型は毒性が強いため臨床的にはD型が使用される。構造式は図１に示す。

ブシラミンは、別名リマチルとも呼ばれ、2個の−SH基を有するシステイン誘導体で分子式及び分子量はC_７H₁₂NO₃S₂＝208である。本品は、参天製薬より入手可能である。D-ペニシラミンとブシラミンはSH製剤と呼ばれ、同じような薬理作用を有しており、重金属のキレート作用を持つことが知られており、解毒剤や抗リュウマチ剤として使用されている。
構造式は図２に示す。

チオプロリンは、魚のタラを加熱することで得られるアミノ酸で分子量及び分子式は、C₄H₇ N O₂S＝133である。発ガン抑制効果があるといわれる。本品は、一般試薬として入手可能である。構造式は図３に示す。

チオサリチル酸は、別名メルカプト安息香酸といい、分子式及び分子量はC₇H₆O₂S＝154である。アントラニル酸をジアゾ化し、ポリ硫化ナトリウムを作用させジチオサリチル酸おし、これを亜鉛末と酢酸で還元して得られる。また、これらの成分は、そのままでも十分溶解性に優れるが、塩酸塩やナトリウム塩にすることで更に溶解性を向上させることが可能である。構造式は図４に示す。

本発明のペルオキシナイトライト阻害剤の含有量は、乾燥固形分として０．０００１〜１００重量％が可能であり、好ましくは０．０５〜１０重量％であり、より好ましくは０．００１〜５重量％である。この範囲内であれば、安定に配合することができる。

また、薬剤として考えるとき、ペルオキシナイトライト阻害剤を生理食塩水に溶解し、投与することができる。また、溶液の形態であれば、塩類、糖類などが加えられる。溶液状の製剤の場合、安定化のために、防腐剤や酸化防止剤が適宜加えられる。

次に、試験例及び実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらになんら制約されるものではない。

試験例１ [ペルオキシナイトライト阻害作用と水に対する溶解性]
被検試料溶液1mLと１mMチロシン/100mリン酸緩衝液１mLにFe（III）−EDTA 溶液（最終濃度２０μM）、次いでペルオキシナイトレート（最終濃度１mM）を加え、室温下、5分間インキュベートを行い、吸光度（４２５nm）又はHPLCにて分析を行なった。水に対する溶解性は１gずつ試料を追加し、溶解しなくなった時点で、ろ過を行い、次いで水を減圧下、留去し、残分の重量から溶解度を測定した。
＜HPLC分析条件＞
分離管：ODSカラム
溶出液：１０mMリン酸緩衝液／アセトニトリル=(９：１)
流速：１.０mL/min付近の一定量
検出器：UV２７４nm or ４２５nm

ペルオキシナイトライト阻害作用の確認を表１に示した成分に関して実施した。試料は、尿酸、骨格的に尿酸に類似のプリン類、部分的に類似骨格を持つ化合物、含イオウ化合物に関して実施し、表１のように尿酸類似骨格の成分には、高いペルオキシナイトライト阻害作用は見られず、水に対する溶解性はそれほど高くなかった。それに対して、グルタチオン、D-ペニシラミン、ブシラミン、チオプロリン、チオサリチル酸、チオ尿素、システイン、N-アセチルシステインに尿酸と同程度の活性が見られ、水に対する溶解性が高いため、血中への投与でも尿酸のように結晶化が起こらず、有効であると考えられる。

試験例２ [熱に対する安定性の確認]
対象化合物を０.１％含む生理食塩水溶液を作成し、６０℃で０、２、４、８、２０時間放置したものを試料溶液とした。試料溶液１００μLを取り、精製水９００μL加え、そこへエルマン試薬（5,5’-ジチオビス（2-ニトロ安息香酸）（DTNB）を０.０５Mリン酸緩衝液(pH７.０)に０.０１Mとなるように溶解した）50μLを加え、よく攪拌し、吸光度(４１２nm)を測定した。

図５に示したように、グルタチオン、システイン、N-アセチルシステインは熱安定性に難点があり、D-ペニシラミン、ブシラミン、チオプロリン、チオサリチル酸はそれに対して、熱耐性に優れることを確認した。このことから、注射液などの形態で保管する場合の安定性に優れるものである。

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら制限されるものではない。

＜処方例１＞注射剤
（重量％）
D-ペニシラミン０．０５
ポリソルベート８００．５
塩化ナトリウム０．８０
注射用水残部
上記成分を６０℃で加温溶解した後、室温に戻し、無菌ろ過し、さらにガラス製のアンプルに１０ｍＬずつ充填した。

＜処方例２＞注射剤
チオプロリン５．０
チオ安息香酸５．０
塩化ナトリウム５０．０
デキストリン４０．０
上記成分を攪拌機で、均一になるように混合した。

＜処方例３＞錠剤
（重量%）
チオウラシル１．０
チオプロリン２．０
乳糖６７．０
デキストリン１５．０
結晶セルロース５．０
軽質無水ケイ酸５．０
ヒドロキシプロピルセルロース３．０
ステアリン酸マグネシウム２．０
チオウラシル、チオプロリン、乳糖、デキストリン、結晶セルロース及び軽質無水ケイ酸を混合し、ヒドロキシプロピルセルロースの１０％エタノール溶液を加えて混練造粒し、顆粒を調製し、乾燥したのちステアリン酸マグネシウムを加えて、圧縮成型して５００ｍｇの錠剤とした。

Ｄ−ペニシラミンの構造式ブシラミンの構造式チオプロリンの構造式サリチル酸の構造式各種物質の熱安定性

Claims

チオプロリンからなるニトロチロシン生成阻害剤（但し、心筋梗塞に起因する虚血・再灌流障害抑制剤を除く）。
チオプロリンからなるペルオキシナイトライト阻害剤（但し、心筋梗塞に起因する虚血・再灌流障害抑制剤を除く）。