JP4833502B2 - 抗酸化性組成物 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、動物性天然エキスに由来する抗酸化能を有する特定の成分を特定の量比で配合してなる抗酸化用組成物に関するものであり、更に詳しくは、特定の活性酸素種に対して有効に抗酸化能を発揮できる当該活性酸素種抗酸化用組成物に関するものである。本発明は、人体内で発生する活性酸素による酸化ストレスを解消して広義の生活習慣病の予防、具体的には体内活性酸素が顕著に高い糖尿病患者の糖尿病関連疾患の予防に供せる食品及び食品素材の創製を可能とするものとして有用である。
【０００２】
【従来の技術】
近年、わが国では、高齢者人口の増加に伴う各種成人病の増加とその医療に関わる人的、経済的負担の増大が極めて深刻な問題として取り上げられている。生物の老化と病気の発生は言わば不可分の関係にあるので、高齢者が増加すれば病人の数も増えることは避けられないことである。そこで、人間の老化する速度を可能な限り遅くし、病気の発生もなるべく抑制しようということが重要になる。
人間が老化する第一の原因は、体を構成する細胞には分裂増殖する回数に限りがあることであり、細胞が傷害を受けることによって細胞の老化が促進されることにある。細胞を傷害する要因として、紫外線や放射線の照射、薬物による有害作用などがあるが、最も大きい要因は、生体を構成する成分が酸化されることであると言われている。
【０００３】
この酸化反応を起こす物質は、活性酸素と呼ばれるものであるが、活性酸素は、蛋白質、糖、脂肪などの生体構成成分を酸化する以外に、細胞の遺伝子ＤＮＡを直接傷害する作用を持っている。しかも、活性酸素は、我々人間が食物として体内に持ち込むものは少なく、酸素を利用してエネルギーを生産している我々の体内で毎日生産されているものであり、紫外線や放射線を浴びても活性酸素が体内に生産されるし、タバコや排気ガスとともに活性酸素も吸い込む。また、体内に侵入した細菌を殺菌するために、白血球は活性酸素を作り出す酵素を分泌して活性酸素を放出し、精神的なストレスや病気などでも体内の活性酸素は増加する。これらの活性酸素は、必ず細胞のＤＮＡを傷害して細胞の老化を促進し、時には細胞を突然変異させて異常細胞やガン細胞の発生を促進することにもなるのである。特に注目されることは、糖尿病患者の生体内では正常人に比較して活性酸素が顕著に高まることであり、糖尿病に関連する疾患として、糖尿病性動脈硬化、高血圧、末梢循環障害、腎症などが知られているが、このことは、これらの典型的な生活習慣病の発生に、この活性酸素が密接に関与していることを示していることである。
【０００４】
このように、あらゆる細胞の老化と病気の発生に活性酸素が関与していることから、人間の老化を抑え、可能な限り健康を維持させるために、活性酸素を消去する抗酸化剤が重要視されて来た。従来、抗酸化性ビタミンと呼ばれるビタミンＣ（Ｖ．Ｃと略記）やビタミンＥ（Ｖ．Ｅと略記）が典型的な活性酸素消去剤として広く使用されているが、これに加えて、最近では、緑黄色野菜のβ―カロチン、お茶や大豆に含まれるカテキン類、フラボノイド化合物、ブドウの種子に含まれるイソチオシァネートなどが注目されて来た。また、本発明で利用する動物組織に存在するヒスチジン含有ジペプチドのアンセリンやカルノシンも有力な抗酸化性物質として関心が持たれて来た。
【０００５】
ところで、ここに挙げた抗酸化性物質のうち、アンセリンやカルノシンを除いて、Ｖ．Ｃ、Ｖ．Ｅ、ポリフェノール類などは、全て植物由来のものである。抗酸化性物質の素材として植物原料が多い理由は、植物は太陽光線を浴びて生育し、かつ酸素も利用しているから、植物の生体内で発生する活性酸素の量は極めて多く、また、酸化されやすい脂質の合成も活発に行うからである。一方、動物の場合にも植物と同様に生体内で抗酸化作用を持つ物質を生産する能力があり、例えば、貝類が作るアミノ酸の一種のタウリン、脊椎動物の筋肉組織で作られる上記のアンセリン−カルノシンがそれである。我々人間にとって、これらの動物由来の抗酸化性物質が有益なのか、植物由来のものが有益なのかは確たる知見はない。
【０００６】
植物性抗酸化剤であるＶ．ＣとＶ．Ｅは、人間が利用でき、かつ必須なものである。しかし、これらを含めて植物性抗酸化剤が動物生体内で発生するどのような活性酸素に有効で、どのようなものには無効か、更にはこれらの植物由来抗酸化性物質がどのように人間の腸から吸収され、人間の体内で有効に抗酸化作用を発揮しているのか否かは、完全に解明されているわけではない。また、動物由来のタウリンやアンセリン−カルノシンは、生体内で生成され、腸からの吸収も植物性抗酸化剤とは比較にならないほど高いが、しかし、植物性抗酸化剤ほどには抗酸化性食品素材としての利用は進んでいなかった。
【０００７】
これまで、天然の抗酸化性物質の抗酸化活性評価には、活性酸素と同様に分子内にラジカルを持つＤＰＰＨ色素（1,1'-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，非特許文献１参照）を捕捉する作用で評価する方法や、同じくラジカル発生物質と反応して蛍光を発するルミノールの蛍光発光消去作用で評価する方法（2,2'-azobis-2-amidinopropane，非特許文献２参照）が用いられて来た。しかし、これらの試験で用いられるＤＰＰＨラジカル色素やルミノールを酸化する反応は我々の生体内で起こる酸化反応ではない。従って、これらの方法で強い抗酸化活性が認められても、それがそのまま生体内で有効であるとは限らないのである。また、活性酸素には、様々な物質が存在しているので、ＤＰＰＨ法や蛍光発光消去法で強い活性を有する抗酸化性物質が生体内の全ての活性酸素に対して有効に働いているという証拠もない。更に、植物由来の抗酸化性物質の多くは、Ｖ．Ｅを含めて多環芳香族化合物からなり水に溶解しないものがほとんどであり、人間がこれらの物質を吸収し、利用するためにはそれらを運ぶ脂質蛋白質等の共存が必須である。
【０００８】
脊椎動物原料の熱水抽出エキス中には、ヒスチジンを含有する抗酸化性ジペプチド(Histidine-containg dipeptide, ＨＣＤＰと略記）であるアンセリン（β-alanyl-1-methyl-L -histidine)とカルノシン（β-alanyl- L-histidine) が含まれているが、Ｖ．ＣやＶ．Ｅが植物由来の抗酸化性物質であるのに対して、これらは動物に由来する抗酸化性物質である。この動物由来アンセリン−カルノシンは、抗酸化剤として様々な生理機能が知られており、老化防止作用や糖尿病関連疾病などの予防効果も期待されている。しかし、抗酸化剤としてのこれらの実用的な利用は植物性抗酸化剤ほどには普及していなかった。この理由の一つとして、アンセリンやカルノシンをＤＰＰＨ法や蛍光発光法で抗酸化活性を測定すると、後記する表１に示されるように、植物由来のＶ．ＣやＶ．Ｅに比べていずれも１万分の１以下に測定されるので、抗酸化性物質としての意義を見出すことが困難であったことが挙げられる。
【０００９】
【非特許文献１】
T. Yamaguchi, et al. Biosci. Biothech. Biochem. ６２巻、１２０１−１２０４頁、１９９８）
【非特許文献２】
O. Hirayama, et al. Analytical Biochemistry 、２４７巻、２３７−２４１頁、１９９７年
【非特許文献３】
A.R.Hipkiss ら、Cellular and Molecular Life Sciences，５７巻、７４７−７５３頁、２０００年
【００１０】
これまでに、抗酸化性食品と呼ばれるものは、Ｖ．ＣやＶ．Ｅをはじめ植物由来の抗酸化剤を含有する極めて多種・多様なものが生産、販売されているが、それらの抗酸化活性が主として上記のＤＰＰＨ法や蛍光発光法などによる評価であったために、生体内で有効に抗酸化活性を示す証拠に乏しいものであった。しかも、ポリフェノール類と総称される植物由来の多環芳香族化合物は吸収性の問題やこれらを運ぶ脂質や脂質蛋白質の共存が不可欠であり、動物の生体内で有効に抗酸化活性を発揮するか否かは依然不明なことが多かった。これらのことから、幅広い活性酸素種に対して有効に作用することを明示した抗酸化性食品や抗酸化性成分を組み合わせた食品組成はこれまでのところ皆無である。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
このような状況の中で、本発明者らは、幅広い活性酸素種に対して有効に抗酸化作用を発揮する当該活性酸素種抗酸化用組成物を開発することを目標として鋭意研究を進める過程で、チキンエキスやその他の動物エキスに含まれる抗酸化性ＨＣＤＰであるアンセリンとカルノシンに着目し、エキス自身の風味や旨みを保持させたままそのＨＣＤＰ含有量に見合った量の植物由来抗酸化性ビタミンであるＶ．ＣとＶ．Ｅを補強することによって、幅広い活性酸素に対して作用し、かつ生体蛋白質がこれらの活性酸素により酸化分解されることを防止できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、水酸化ラジカル、ジ亜塩素酸ラジカル及び過酸化硝酸ラジカル等の活性酸素種に対して特異的な抗酸化作用を有する当該活性酸素種抗酸化作用組成物、及び当該抗酸化用組成物を配合した抗酸化性食品組成物を提供することを目的とするものである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段より構成される。
（１）生体内で発生する活性酸素に対して抗酸化性能を有する抗酸化性組成物からなる抗酸化剤であって、当該組成物は、食用家禽類、畜肉類、及び回遊性魚類の１種以上の筋肉より熱水抽出して得られる動物性エキス中のアンセリン−カルノシン混合体の、アンセリンとカルノシンの含量比率を任意に各種エキスを混合することによって、３：１〜１：３の範囲になるように調整したアンセリン−カルノシン混合体と、ビタミンＣ及びビタミンＥとから構成される組成を有し、上記アンセリン−カルノシン混合体１００ｍｇに対して、ビタミンＣ（Ｌ−アスコルビン酸又はＬ−アスコルビン酸ナトリウム）を２０〜１００ｍｇ、ビタミンＥ（α−トコフェロール）を６〜３０ｍｇの割合で配合した組成比を有し、水酸化ラジカル、ジ亜塩素酸ラジカル及び過酸化硝酸ラジカルの３種の活性酸素種に対して相乗的な抗酸化作用を有することを特徴とする抗酸化剤。
（２）上記アンセリン−カルノシン混合体が、上記熱水抽出して得られる動物エキスを分画分子量３，０００〜１０，０００の限外ろ過膜処理して、該ろ過膜透過液を更に分画分子量２００〜５００のナノろ過膜もしくは逆浸透膜で処理してろ過膜上に透過阻止されて濃縮されたアンセリン−カルノシン混合体であることを特徴とする前記（１）記載の抗酸化剤。
（３）上記アンセリン−カルノシン混合体が、上記熱水抽出して得られる動物エキスを分画分子量３，０００〜１０，０００の限外ろ過膜処理して、該ろ過膜透過液を更に分画分子量２００〜５００のナノろ過膜もしくは逆浸透膜で処理してろ過膜上に濃縮されたものを陽イオン交換体クロマトグラフによって純度７５％以上に精製されたアンセリン−カルノシン混合体であることを特徴とする前記（１）記載の抗酸化剤。
（４）前記（１）から（３）のいずれかに記載の、生体内で発生する活性酸素に対して抗酸化性能を有する抗酸化性組成物からなる抗酸化剤を配合したことを特徴とする抗酸化性食品。
【００１３】
【発明の実施の形態】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明者らは、従来の食品素材として得られる抗酸化性物質が生体内で有効に抗酸化活性を示すか否かを評価するために、実際に生体内で発生する活性酸素を用いて、それらの動物蛋白質を酸化分解する反応に対して抗酸化性物質がどのように作用するか、そして、その抗酸化作用の強さはどのようなものであるかを試験してみた。
生体内で発生する代表的な活性酸素としては、過酸化水素（Ｈ2 Ｏ2 ）、水酸化ラジカル（ＯＨ・）、ジ亜塩素酸ラジカル（ＣｌＯ・）、過酸化硝酸ラジカル（ＯＮＯＯ・）などがある。そこで、試験管内で蛋白質を酸化分解する能力の高いＯＨ・、ＣｌＯ・、及びＯＮＯＯ・の３種類を作製し、試験に供した。また、各抗酸化剤の抗酸化活性の比較では、ヘモグロビン、卵白アルブミン、血清アルブミンを標的蛋白質として用いた。その結果、Ｖ．Ｃ、Ｖ．Ｅ及びアンセリン−カルノシンが示す抗酸化活性は、活性酸素の種類によって大きく異なり、Ｖ．ＣはＯＮＯＯ・に対して、Ｖ．ＥはＯＨ・に対して、そして、アンセリン−カルノシンはＣｌＯ・に対してそれぞれ最も強い抗酸化活性を示すことが分かった。アンセリンとカルノシンの特徴を更に挙げると、アンセリンはＯＨ・に対してカルノシンより強く、逆にカルノシンはＣｌＯ・に対してアンセリンよりも強い抗酸化性を示すことが分かった。これらの結果を総合して抗酸化活性を評価すると、後記する表２に示されるように、ＤＰＰＨ法や蛍光発光法による評価とは全く異なり、動物由来の抗酸化性物質であるアンセリン−カルノシンは、動物蛋白質であるヘモグロビンや卵白アルブミン、牛血清アルブミンの酸化分解に対してＶ．ＣやＶ．Ｅとほぼ同等の抗酸化活性を持っていることが判明した。
【００１４】
本発明者らが調べたところ、チキンエキス中にはアンセリン−カルノシンが２：１〜４：１の比率で含有しており、牛肉エキスでは１：３〜１：５、豚肉エキスでは１：４〜１：１０、マグロエキスでは１０：０〜２０：１の比率で存在していること、これらのアンセリンとカルノシンはＣｌＯ・とＯＮＯＯ・ラジカルに対して最も強い抗酸化活性を示すが、ＯＨ・ラジカルではＶ．Ｅより弱く、Ｖ．Ｃと類似の抗酸化作用を有していること、また、アンセリンはＯＨ・に対してカルノシンより強い抗酸化作用を持つが、カルノシンはＣｌＯ・とＯＮＯＯ・に対してアンセリンよりも強い抗酸化作用を持っていること、そして、これらのことから、ＨＣＤＰ中に占めるアンセリン−カルノシン混合体のアンセリンとカルノシンの含量比率を任意に各種エキスを混合することによって、３：１〜１：３の範囲になるように調整し、更に総量として測定されるアンセリン−カルノシン１００ｍｇに対してＶ．Ｃを２０〜１００ｍｇ、Ｖ．Ｅを２．５〜３０ｍｇの割合で配合することにより、これらの３種の系統の異なる活性酸素による蛋白質酸化をほぼ完全に阻止することが可能であることが分かった。
【００１５】
また、天然エキスの味や旨みを生かした各精製段階のアンセリン−カルノシン混合体でも、ＨＣＤＰ含量として調整すれば高純度アンセリン−カルノシンと同等の抗酸化活性が得られるので、各種原料から抽出された天然エキスの状態のままでも、このＶ．ＣとＶ．Ｅの添加量で高い抗酸化活性を持ったエキスを作製することが可能である。なお、本発明に係る天然エキス中のアンセリン−カルノシン含有比率が適切な範囲から逸脱するものは、例えば、豚肉エキスとマグロ、カツオなどの魚肉エキスであり、豚肉の場合はカルノシン含量が高く、魚肉エキスではアンセリン含量が高い。これらのエキスは、豚肉エキスと魚肉エキスから得られるＨＣＤＰをほぼ１：１に混合することによって抗酸化活性を発現させる上で適切なアンセリンとカルノシンの含有比率３：１〜１：３の範囲にすることが可能である。
【００１６】
動物性エキス中に存在するアンセリン−カルノシンの抗酸化剤としての有用性や生活習慣病予防効果の可能性についてこれまで多くのことが報告されて来た。しかし、植物性抗酸化剤ほどには一般の実用が進んでいなかったが、その原因として、一般的に使用される抗酸化活性測定法において、Ｖ．ＣやＶ．Ｅなどの抗酸化性ビタミン類より極めて低い活性しか示さなかったことが挙げられる。しかし、生体内には数多くの活性酸素が生成され、これらが直接、老化や疾病の原因になっているのに対して、従来の方法では抗酸化剤のこれらに対する作用様式は不明であった。本発明によれば、生体内で発生する代表的な活性酸素３種類のＣｌＯ・、ＯＮＯＯ・及びＯＨ・に強く作用する抗酸化性組成物が得られるが、従来の抗酸化剤を組み合わせてもこのような効果は得られない。これらは、従来の評価法による結果と異なるものであり、従来の評価法では知り得なかったことである。本発明の組成物は、上記成分を特定の量比で組み合わせた場合に、上記活性酸素種に対して特異的、かつ相乗的な抗酸化作用を示すものであり、これらの構成及びその有効性は、前記試験例及び実施例に示した格別の実験を実施することではじめて実証されたものであり、その作用効果は従来の知見からは予期し得ないものである。従来の生活習慣病や老化、ガンの発生を予防しようという目的に、Ｖ．ＣやＶ．Ｅ、或はアンセリンとカルノシンを単独で使用した場合には、いずれも生体内で発生する活性酸素に対して有効ではなく、活性酸素の種類によっては全く無効の場合があった。しかし、本発明の組成物によれば広い種類の活性酸素に対して有効に抗酸化活性を発揮でき、従って、従来には無い新規な生活習慣病や疾病予防に有効な抗酸化性組成物を調製し、提供することが可能である。
【００１７】
次に、試験例を示して本発明を詳細に説明する。
試験例１
（１）従来法によるアンセリン−カルノシンの抗酸化活性
動物性エキス中の抗酸化性ペプチドであるアンセリンとカルノシンを植物性抗酸化ビタミンであるＶ．ＣとＶ．Ｅの抗酸化活性を比較するために、上記のＤＰＰＨ法とケミルミネッセンス法（蛍光発光法）で試験した。アンセリン・硝酸塩とカルノシンは試薬（シグマ社製）を用い、動物性エキス中のアンセリン−カルノシン混合体は各精製段階のチキンエキスを用いた。Ｖ．ＣとしてはＬ−アスコルビン酸及びＬ−アスコルビン酸ナトリウム試薬（和光純薬製）を使用し、また、Ｖ．Ｅとしてはα−トコフェロールをショ糖エステルに乳化させて親水性を付与した超エマルジョン（商品名：サンアクティブＶＥ−２０２、ＶＥ−７０２、太陽化学製）を用いた。その結果は表１に示す通りであった。ＤＰＰＨ法と蛍光発光法ではいずれもＶ．Ｃが最も強い抗酸化活性を示し、次いで、Ｖ．Ｅであり、試薬のアンセリンとカルノシン、精製したアンセリン−カルノシン混合体はいずれも弱い抗酸化活性として測定された。
【００１８】
【表１】
【００１９】
（２）蛋白質酸化分解系でのアンセリン−カルノシンの抗酸化活性
人間の生体内で発生する代表的な活性酸素４種のうち、Ｈ2 Ｏ2 は蛋白質を酸化分解する作用が低く判定が困難であることから、その他のＯＨ・、ＣｌＯ・及びＯＮＯＯ・の３種を用いて試験した。ＯＨ・はFenton法(B.Halliwellら、Analytical Biochemistry 、１６５巻、２１５〜２１９頁、１９８７年の改変）、ＣｌＯ・はジ亜塩素酸ナトリウム、ＯＮＯＯ・はquenching flow reactor法(R.Radi ら、Journal of Biological Chemistrｙ、２６６巻、４２４４〜４２５０頁、１９９１年）で調製した。蛋白質を２．５ｍｇ／ｍＬになるように緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．２に溶解し、蛋白溶液に対して１０：１の比率で各濃度の活性酸素（ＣｌＯ・：４００ｐｐｍ、ＯＨ・：８００ｐｐｍ、ＯＮＯＯ・：５ｍＭ）を添加して、３７℃、３０分間反応させた。また、抗酸化性物質は活性酸素添加の３０分前に蛋白溶液に対して同じく１０：１の比率で添加した。各反応液を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で泳動した後、染色したゲルをデンシトメーターで、或は蛋白質反応液を直接ＴＳＫＧ−３，０００ＳＷカラムのＧＰＣ−ＨＰＬＣにかけて、蛋白分解阻止活性を次の式で算出した。
【００２０】
蛋白質分解阻止活性（％）＝抗酸化剤５ｍＭ添加時の活性酸素分解蛋白質のピーク面積 ×１００（％）／未分解蛋白質のピーク面積
【００２１】
その結果を表２に示す。表２の結果から、ＣｌＯ・とＯＮＯＯ・に対しては各種エキス中に含まれるアンセリンとカルノシンが最も抗酸化活性が強く、Ｖ．Ｃはアンセリンとカルノシンに類似の抗酸化活性を示し、Ｖ．ＥはＯＨ・に対して最も強い抗酸化活性を示すことが分かった。
【００２２】
【表２】
【００２３】
（３）抗酸化剤の配合による活性酸素の蛋白質分解阻止作用
チキンエキスなどの動物エキス中に含まれるアンセリンとカルノシンは、生体内で発生する活性酸素に対してＶ．Ｃに類似した抗酸化作用の傾向を持っているが、Ｖ．Ｅとは対照的である。従って、Ｖ．Ｅが最も強く、動物由来のアンセリン−カルノシン混合体やＶ．Ｃが最も弱いＯＨ・に対して、そして、動物由来アンセリン−カルノシン混合体が最も強く、Ｖ．Ｅが最も弱いＣｌＯ・に対してこれらは相互補完的な効果が期待でき、更に、ＯＮＯＯ・ではアンセリン−カルノシン混合体にＶ．ＣとＶ．Ｅを加えることによって更に完全な抗酸化活性が期待できる。各種エキス由来のアンセリン−カルノシン混合体の濃度を１．２ｍｇ／ｍＬ（約５ｍＭ）とし、Ｖ．Ｃナトリウムを０．６ｍｇ／ｍＬ（約３．０ｍＭ）、Ｖ．Ｅを０．５ｍｇ／ｍＬ（約１ｍＭ）添加配合した場合の蛋白分解阻止作用を表３に示す。
【００２４】
【表３】
【００２５】
表３に示した結果の通り、ポークエキスとマグロエキスではＶ．ＣとＶ．Ｅを添加してもＣｌＯ・による酸化分解を完全に阻止することができなかったが、これは、表４に示すように、アンセリンとカルノシンの含有に偏りがあったためと考えられた。表３と表４の結果から、ＨＣＤＰが適切な抗酸化活性を発揮するためのアンセリンとカルノシンの含量比率は、チキンエキスの比率とビーフエキスの比率の範囲である。すなわち、アンセリン−カルノシンが３：１〜１：３の範囲であった。実施例３で調製したＵＦ処理ビーフエキス、同ポークエキス、同マグロエキスを等量混合した場合、アンセリンとカルノシンの含有比率は１．８：１．７とほぼ等量となったが、この混合エキスにＶ．ＣとＶ．Ｅを添加したもののＣｌＯ・に対する酸化分解阻止率は１００％であった。
【００２６】
【表４】
【００２７】
なお、アンセリン−カルノシン混合体の濃度を２．４ｍｇ／ｍＬ（約１０ｍＭ）にした場合には、Ｖ．ＣとＶ．Ｅの添加量をそれぞれ０．５ｍｇ／ｍＬ（約２．５ｍＭ）、０．０６ｍｇ／ｍＬ（約０．１５ｍＭ）でＯＨ・酸化分解に対して９５％以上の分解阻止活性を示す結果であった。すなわち、動物エキス由来のアンセリン−カルノシン混合体の量を増加させることによって抗酸化活性は上昇するが、アンセリン−カルノシンが完全に抑制できないＯＨ・ラジカルに対しては、アンセリン−カルノシンとの重量比でＶ．Ｃを５：１、Ｖ．Ｅを４０：１の割合で添加すると各種活性酸素による蛋白質分解は十分に抑制される結果が得られた。これは、アンセリン−カルノシン混合体１００ｍｇ当たりＶ．Ｃは２０ｍｇ、Ｖ．Ｅは２．５ｍｇとなる。また、上限値は各抗酸化剤の推奨される一日最大摂取量となるので、アンセリン−カルノシンとＶ．Ｃは３，０００ｍｇ、Ｖ．Ｅは３００ｍｇであることから、アンセリン−カルノシン１００ｍｇ当たりＶ．Ｃは１００ｍｇ、Ｖ．Ｅは３０ｍｇの割合となる。
【００２８】
（４）糖尿病ラット（ＧＫラット）における糖化蛋白質生成抑制作用
糖尿病の病態では血中の活性酸素量が増加し、酸化された蛋白質と血中の高ブドウ糖値により糖化蛋白質、具体的には糖化モグロビンＡ１ｃ量が増加することが知られている。この活性酸素の増加に伴う糖化蛋白質の生成は最終糖化産物(Advanced glycation endoproducts、ＡＧＥｓと略記）の生体内蓄積を意味し、糖尿病に併発する各種の疾患、すなわち、糖尿病性高血圧、同動脈硬化、同腎症、同痴呆症、同末梢循環障害などがこのＡＧＥｓの蓄積に起因していると考えられている。過剰栄養摂取により発症する２型糖尿病のモデル動物であるＧＫラット(Y.Iharaら、FEBS Letters、４７３巻、２４−２６頁、２０００年）に対して、本発明に関わるＶ．Ｃ及びＶ．Ｅを添加したアンセリン−カルノシン混合体が実際に生体内の酸化反応により促進される糖化ヘモグロビンＡ１ｃ生成の抑制作用を持つか否かを試験した。図３に示すとおり、ＧＫラットの体重１ｋｇ当たりＵＦ処理チキンエキスのアンセリン−カルノシン２００ｍｇ、Ｖ．Ｃ１００ｍｇ、Ｖ．Ｅ２０ｍｇを経口投与した場合、上記Ｙ．Ｉｈａｒａらにより報告されたＶ．Ｅの２０ｍｇ単独投与より、アンセリン−カルノシン２００ｍｇを含む飼料を投与したほうが明らかに糖化ヘモグロビンＡ１ｃ値が低下する結果が得られた。
【００２９】
【実施例】
次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
実施例１
丸鶏から熱水抽出して得られたチキンエキス４０Ｌを分画分子量３，０００の限外ろ過膜（旭化成製ＳＥＰ−１０１３）にかけ、ろ過膜透過液３２Ｌを回収した。ろ過液を減圧濃縮してＢｒｉｘ濃度２０％にした。この濃縮チキンエキスのアンセリン−カルノシン含量は固形物当たり１８０ｍｇ／ｇであったので、Ｖ．Ｃ（食品添加物）を９０ｍｇ／ｇ、Ｖ．Ｅ（太陽化学製サンアクティブＶＥ−２０２）を１８ｍｇ／ｇになるように添加し、更にデキストリン（食品添加物）を濃縮チキンエキスの固形物当たり３３％（１：２）になるように加えて噴霧乾燥し、抗酸化性チキンエキス粉末約３０ｇを調製した。この粉末は１ｇ当たりアンセリン−カルノシンを１２０ｍｇ、Ｖ．Ｃを６０ｍｇ、Ｖ．Ｅを１２ｍｇ含有しており、上記のＧＫラットに２週間経口投与すると図３に示したとおり、血中糖化ヘモグロビン含量を低下させる活性を有していた。
【００３０】
実施例２
丸鶏から熱水抽出したチキンエキス１，２００Ｌを分画分子量３，０００の限外ろ過膜（旭化成製ＳＥＰ−３０１３）にかけ、ろ過膜透過液２００Ｌを分画分子量５００(Danish Separation Systems社製ＮＦＴ−５０）のナノろ過膜で濃縮して、Ｂｒｉｘ濃度１０％のチキンエキス２０Ｌを調製した。このナノろ過処理チキンエキスには固形物１ｇ当たりアンセリン−カルノシンが２００ｍｇ含有されているので、実施例１と同様に、Ｖ．ＣとＶ．Ｅを添加して凍結乾燥法により粉末化した。また、ナノろ過濃縮チキンエキス２０Ｌを一度製造用水を加えて脱塩し、０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液を４Ｌ加えて、０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ５．０で平衡化したＤｏｗｅｘ５０ＷＸ−８陽イオン交換樹脂カラムに通液し、アンセリン−カルノシンをカラムに吸着させ、希薄な緩衝液でカラムを洗浄した後、アルカリ溶液でアンセリン−カルノシンを溶出させて回収した。この液を減圧濃縮してから活性炭で脱色し、エタノール沈澱法でアンセリン−カルノシンを沈澱させ、アルコールを減圧下に除去して精製されたアンセリン−カルノシン混合体粉末約１０ｇを調製した。この精製粉末のアンセリン−カルノシン含量比率は１．２：１．０であり、２％レモン果汁１００ｍＬ当たりアンセリン−カルノシンの総量が５００ｍｇ、Ｖ．Ｃ２５０ｍｇ、Ｖ．Ｅ３０ｍｇになるように添加して抗酸化性清涼飲料を調製した。
【００３１】
実施例３
骨を除去した豚肉、牛肉、マグロ肉１ｋｇ当たり３Ｌの水を加えて９８℃、１時間熱水抽出し、分液ロートで油層を分離した後、珪藻土をろ過補助剤として吸引ろ過した。これらのエキス中にはアンセリンとカルノシンが混合体として含有され、固形分１ｇ当たりのアンセリン−カルノシン含量は豚で９６ｍｇ、牛で６７ｍｇ、マグロで１２０ｍｇであった。これらのエキスを減圧濃縮してＢｒｉｘ５．０％とし、３種を等量混合した。このときのアンセリン−カルノシン含量比率は１．８：１．７であったので、アンセリン−カルノシン混合体１００ｍｇ当たりＶ．Ｃナトリウム（食品添加物）を５０ｍｇ、Ｖ．Ｅ（太陽化学製、サンアクティブＶＥ７２０）を２０ｍｇ添加して無菌ろ過し、液状の動物性エキスを調製した。また、これらの珪藻土ろ過したエキスを限外ろ過膜（旭化成製ＳＥＰ−１０１３）にかけて蛋白質を除去し、減圧濃縮して前記と同様に混合し、アンセリン−カルノシン混合体１００ｍｇ当たりＶ．Ｃナトリウム５０ｍｇ及びＶ．Ｅを３０ｍｇ添加し、同様に液状の抗酸化性動物エキスを調製した。これらのエキスは表３に示した３種の活性酸素による蛋白質の分解をほぼ完全に抑制する活性を示すものであった。
【００３２】
【発明の効果】
以上詳述したとおり、本発明は、動物性天然エキスに由来する抗酸化能を有する特定の成分を特定の量比で配合してなる抗酸化用組成物に係るものであり、本発明により、次のような効果が奏される。
（１）多様な活性酸素種に対して特異的な抗酸化作用を有する当該活性酸素種抗酸化用組成物を提供することができる。
（２）生体内で発生する代表的な活性酸素３種類の全てに抗酸化性能を有する新規抗酸化性組成物を提供することができる。
（３）従来、Ｖ．ＣやＶ．Ｅなどの抗酸化性ビタミン類より極めて低い活性しか示さないと考えられていたアンセリンとカルノシンを有効成分とする広い活性酸素種に対する抗酸化用組成物を提供することができる。
（４）アンセリン−カルノシン混合体、Ｖ．Ｃ、及びＶ．Ｅを組み合わせることで、それらの各成分単独では期待できない相乗的な抗酸化作用が得られる。
（５）これらのことより、活性酸素が関わる生活習慣病やその他の疾病の発症を効果的に予防できる抗酸化性組成物又は食品の調製が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、生体内で発生する代表的な活性酸素による卵白アルブミンの酸化分解に対する各種抗酸化剤の防止作用を示す（Ａ：ＣｌＯ・、Ｂ：ＯＨ・、Ｃ：ＯＮＯＯ・、１：未分解卵白アルブミン、２：分解卵白アルブミン、３：Ｖ．Ｃ添加、４：Ｖ．Ｅ添加、５：アンセリン添加、６：カルノシン添加、７：チキンエキス由来精製アンセリン−カルノシン添加）。
【図２】図２は、糖尿病病態モデルのＧＫラットにおける本発明物質の血中糖化ヘモグロビンＡ１ｃ生成抑制作用を示す（ＣＥ＋ＶＣ＋ＶＥ：ＵＦ処理チキンエキス＋ビタミンＣ＋ビタミンＥ；ＣＥ＋ＶＣ：ＵＦ処理チキンエキス＋ビタミンＣ；ＶＥ：ビタミンＥ単独）。
【発明の属する技術分野】
本発明は、動物性天然エキスに由来する抗酸化能を有する特定の成分を特定の量比で配合してなる抗酸化用組成物に関するものであり、更に詳しくは、特定の活性酸素種に対して有効に抗酸化能を発揮できる当該活性酸素種抗酸化用組成物に関するものである。本発明は、人体内で発生する活性酸素による酸化ストレスを解消して広義の生活習慣病の予防、具体的には体内活性酸素が顕著に高い糖尿病患者の糖尿病関連疾患の予防に供せる食品及び食品素材の創製を可能とするものとして有用である。
【０００２】
【従来の技術】
近年、わが国では、高齢者人口の増加に伴う各種成人病の増加とその医療に関わる人的、経済的負担の増大が極めて深刻な問題として取り上げられている。生物の老化と病気の発生は言わば不可分の関係にあるので、高齢者が増加すれば病人の数も増えることは避けられないことである。そこで、人間の老化する速度を可能な限り遅くし、病気の発生もなるべく抑制しようということが重要になる。
人間が老化する第一の原因は、体を構成する細胞には分裂増殖する回数に限りがあることであり、細胞が傷害を受けることによって細胞の老化が促進されることにある。細胞を傷害する要因として、紫外線や放射線の照射、薬物による有害作用などがあるが、最も大きい要因は、生体を構成する成分が酸化されることであると言われている。
【０００３】
この酸化反応を起こす物質は、活性酸素と呼ばれるものであるが、活性酸素は、蛋白質、糖、脂肪などの生体構成成分を酸化する以外に、細胞の遺伝子ＤＮＡを直接傷害する作用を持っている。しかも、活性酸素は、我々人間が食物として体内に持ち込むものは少なく、酸素を利用してエネルギーを生産している我々の体内で毎日生産されているものであり、紫外線や放射線を浴びても活性酸素が体内に生産されるし、タバコや排気ガスとともに活性酸素も吸い込む。また、体内に侵入した細菌を殺菌するために、白血球は活性酸素を作り出す酵素を分泌して活性酸素を放出し、精神的なストレスや病気などでも体内の活性酸素は増加する。これらの活性酸素は、必ず細胞のＤＮＡを傷害して細胞の老化を促進し、時には細胞を突然変異させて異常細胞やガン細胞の発生を促進することにもなるのである。特に注目されることは、糖尿病患者の生体内では正常人に比較して活性酸素が顕著に高まることであり、糖尿病に関連する疾患として、糖尿病性動脈硬化、高血圧、末梢循環障害、腎症などが知られているが、このことは、これらの典型的な生活習慣病の発生に、この活性酸素が密接に関与していることを示していることである。
【０００４】
このように、あらゆる細胞の老化と病気の発生に活性酸素が関与していることから、人間の老化を抑え、可能な限り健康を維持させるために、活性酸素を消去する抗酸化剤が重要視されて来た。従来、抗酸化性ビタミンと呼ばれるビタミンＣ（Ｖ．Ｃと略記）やビタミンＥ（Ｖ．Ｅと略記）が典型的な活性酸素消去剤として広く使用されているが、これに加えて、最近では、緑黄色野菜のβ―カロチン、お茶や大豆に含まれるカテキン類、フラボノイド化合物、ブドウの種子に含まれるイソチオシァネートなどが注目されて来た。また、本発明で利用する動物組織に存在するヒスチジン含有ジペプチドのアンセリンやカルノシンも有力な抗酸化性物質として関心が持たれて来た。
【０００５】
ところで、ここに挙げた抗酸化性物質のうち、アンセリンやカルノシンを除いて、Ｖ．Ｃ、Ｖ．Ｅ、ポリフェノール類などは、全て植物由来のものである。抗酸化性物質の素材として植物原料が多い理由は、植物は太陽光線を浴びて生育し、かつ酸素も利用しているから、植物の生体内で発生する活性酸素の量は極めて多く、また、酸化されやすい脂質の合成も活発に行うからである。一方、動物の場合にも植物と同様に生体内で抗酸化作用を持つ物質を生産する能力があり、例えば、貝類が作るアミノ酸の一種のタウリン、脊椎動物の筋肉組織で作られる上記のアンセリン−カルノシンがそれである。我々人間にとって、これらの動物由来の抗酸化性物質が有益なのか、植物由来のものが有益なのかは確たる知見はない。
【０００６】
植物性抗酸化剤であるＶ．ＣとＶ．Ｅは、人間が利用でき、かつ必須なものである。しかし、これらを含めて植物性抗酸化剤が動物生体内で発生するどのような活性酸素に有効で、どのようなものには無効か、更にはこれらの植物由来抗酸化性物質がどのように人間の腸から吸収され、人間の体内で有効に抗酸化作用を発揮しているのか否かは、完全に解明されているわけではない。また、動物由来のタウリンやアンセリン−カルノシンは、生体内で生成され、腸からの吸収も植物性抗酸化剤とは比較にならないほど高いが、しかし、植物性抗酸化剤ほどには抗酸化性食品素材としての利用は進んでいなかった。
【０００７】
これまで、天然の抗酸化性物質の抗酸化活性評価には、活性酸素と同様に分子内にラジカルを持つＤＰＰＨ色素（1,1'-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，非特許文献１参照）を捕捉する作用で評価する方法や、同じくラジカル発生物質と反応して蛍光を発するルミノールの蛍光発光消去作用で評価する方法（2,2'-azobis-2-amidinopropane，非特許文献２参照）が用いられて来た。しかし、これらの試験で用いられるＤＰＰＨラジカル色素やルミノールを酸化する反応は我々の生体内で起こる酸化反応ではない。従って、これらの方法で強い抗酸化活性が認められても、それがそのまま生体内で有効であるとは限らないのである。また、活性酸素には、様々な物質が存在しているので、ＤＰＰＨ法や蛍光発光消去法で強い活性を有する抗酸化性物質が生体内の全ての活性酸素に対して有効に働いているという証拠もない。更に、植物由来の抗酸化性物質の多くは、Ｖ．Ｅを含めて多環芳香族化合物からなり水に溶解しないものがほとんどであり、人間がこれらの物質を吸収し、利用するためにはそれらを運ぶ脂質蛋白質等の共存が必須である。
【０００８】
脊椎動物原料の熱水抽出エキス中には、ヒスチジンを含有する抗酸化性ジペプチド(Histidine-containg dipeptide, ＨＣＤＰと略記）であるアンセリン（β-alanyl-1-methyl-L -histidine)とカルノシン（β-alanyl- L-histidine) が含まれているが、Ｖ．ＣやＶ．Ｅが植物由来の抗酸化性物質であるのに対して、これらは動物に由来する抗酸化性物質である。この動物由来アンセリン−カルノシンは、抗酸化剤として様々な生理機能が知られており、老化防止作用や糖尿病関連疾病などの予防効果も期待されている。しかし、抗酸化剤としてのこれらの実用的な利用は植物性抗酸化剤ほどには普及していなかった。この理由の一つとして、アンセリンやカルノシンをＤＰＰＨ法や蛍光発光法で抗酸化活性を測定すると、後記する表１に示されるように、植物由来のＶ．ＣやＶ．Ｅに比べていずれも１万分の１以下に測定されるので、抗酸化性物質としての意義を見出すことが困難であったことが挙げられる。
【０００９】
【非特許文献１】
T. Yamaguchi, et al. Biosci. Biothech. Biochem. ６２巻、１２０１−１２０４頁、１９９８）
【非特許文献２】
O. Hirayama, et al. Analytical Biochemistry 、２４７巻、２３７−２４１頁、１９９７年
【非特許文献３】
A.R.Hipkiss ら、Cellular and Molecular Life Sciences，５７巻、７４７−７５３頁、２０００年
【００１０】
これまでに、抗酸化性食品と呼ばれるものは、Ｖ．ＣやＶ．Ｅをはじめ植物由来の抗酸化剤を含有する極めて多種・多様なものが生産、販売されているが、それらの抗酸化活性が主として上記のＤＰＰＨ法や蛍光発光法などによる評価であったために、生体内で有効に抗酸化活性を示す証拠に乏しいものであった。しかも、ポリフェノール類と総称される植物由来の多環芳香族化合物は吸収性の問題やこれらを運ぶ脂質や脂質蛋白質の共存が不可欠であり、動物の生体内で有効に抗酸化活性を発揮するか否かは依然不明なことが多かった。これらのことから、幅広い活性酸素種に対して有効に作用することを明示した抗酸化性食品や抗酸化性成分を組み合わせた食品組成はこれまでのところ皆無である。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
このような状況の中で、本発明者らは、幅広い活性酸素種に対して有効に抗酸化作用を発揮する当該活性酸素種抗酸化用組成物を開発することを目標として鋭意研究を進める過程で、チキンエキスやその他の動物エキスに含まれる抗酸化性ＨＣＤＰであるアンセリンとカルノシンに着目し、エキス自身の風味や旨みを保持させたままそのＨＣＤＰ含有量に見合った量の植物由来抗酸化性ビタミンであるＶ．ＣとＶ．Ｅを補強することによって、幅広い活性酸素に対して作用し、かつ生体蛋白質がこれらの活性酸素により酸化分解されることを防止できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、水酸化ラジカル、ジ亜塩素酸ラジカル及び過酸化硝酸ラジカル等の活性酸素種に対して特異的な抗酸化作用を有する当該活性酸素種抗酸化作用組成物、及び当該抗酸化用組成物を配合した抗酸化性食品組成物を提供することを目的とするものである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段より構成される。
（１）生体内で発生する活性酸素に対して抗酸化性能を有する抗酸化性組成物からなる抗酸化剤であって、当該組成物は、食用家禽類、畜肉類、及び回遊性魚類の１種以上の筋肉より熱水抽出して得られる動物性エキス中のアンセリン−カルノシン混合体の、アンセリンとカルノシンの含量比率を任意に各種エキスを混合することによって、３：１〜１：３の範囲になるように調整したアンセリン−カルノシン混合体と、ビタミンＣ及びビタミンＥとから構成される組成を有し、上記アンセリン−カルノシン混合体１００ｍｇに対して、ビタミンＣ（Ｌ−アスコルビン酸又はＬ−アスコルビン酸ナトリウム）を２０〜１００ｍｇ、ビタミンＥ（α−トコフェロール）を６〜３０ｍｇの割合で配合した組成比を有し、水酸化ラジカル、ジ亜塩素酸ラジカル及び過酸化硝酸ラジカルの３種の活性酸素種に対して相乗的な抗酸化作用を有することを特徴とする抗酸化剤。
（２）上記アンセリン−カルノシン混合体が、上記熱水抽出して得られる動物エキスを分画分子量３，０００〜１０，０００の限外ろ過膜処理して、該ろ過膜透過液を更に分画分子量２００〜５００のナノろ過膜もしくは逆浸透膜で処理してろ過膜上に透過阻止されて濃縮されたアンセリン−カルノシン混合体であることを特徴とする前記（１）記載の抗酸化剤。
（３）上記アンセリン−カルノシン混合体が、上記熱水抽出して得られる動物エキスを分画分子量３，０００〜１０，０００の限外ろ過膜処理して、該ろ過膜透過液を更に分画分子量２００〜５００のナノろ過膜もしくは逆浸透膜で処理してろ過膜上に濃縮されたものを陽イオン交換体クロマトグラフによって純度７５％以上に精製されたアンセリン−カルノシン混合体であることを特徴とする前記（１）記載の抗酸化剤。
（４）前記（１）から（３）のいずれかに記載の、生体内で発生する活性酸素に対して抗酸化性能を有する抗酸化性組成物からなる抗酸化剤を配合したことを特徴とする抗酸化性食品。
【００１３】
【発明の実施の形態】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明者らは、従来の食品素材として得られる抗酸化性物質が生体内で有効に抗酸化活性を示すか否かを評価するために、実際に生体内で発生する活性酸素を用いて、それらの動物蛋白質を酸化分解する反応に対して抗酸化性物質がどのように作用するか、そして、その抗酸化作用の強さはどのようなものであるかを試験してみた。
生体内で発生する代表的な活性酸素としては、過酸化水素（Ｈ2 Ｏ2 ）、水酸化ラジカル（ＯＨ・）、ジ亜塩素酸ラジカル（ＣｌＯ・）、過酸化硝酸ラジカル（ＯＮＯＯ・）などがある。そこで、試験管内で蛋白質を酸化分解する能力の高いＯＨ・、ＣｌＯ・、及びＯＮＯＯ・の３種類を作製し、試験に供した。また、各抗酸化剤の抗酸化活性の比較では、ヘモグロビン、卵白アルブミン、血清アルブミンを標的蛋白質として用いた。その結果、Ｖ．Ｃ、Ｖ．Ｅ及びアンセリン−カルノシンが示す抗酸化活性は、活性酸素の種類によって大きく異なり、Ｖ．ＣはＯＮＯＯ・に対して、Ｖ．ＥはＯＨ・に対して、そして、アンセリン−カルノシンはＣｌＯ・に対してそれぞれ最も強い抗酸化活性を示すことが分かった。アンセリンとカルノシンの特徴を更に挙げると、アンセリンはＯＨ・に対してカルノシンより強く、逆にカルノシンはＣｌＯ・に対してアンセリンよりも強い抗酸化性を示すことが分かった。これらの結果を総合して抗酸化活性を評価すると、後記する表２に示されるように、ＤＰＰＨ法や蛍光発光法による評価とは全く異なり、動物由来の抗酸化性物質であるアンセリン−カルノシンは、動物蛋白質であるヘモグロビンや卵白アルブミン、牛血清アルブミンの酸化分解に対してＶ．ＣやＶ．Ｅとほぼ同等の抗酸化活性を持っていることが判明した。
【００１４】
本発明者らが調べたところ、チキンエキス中にはアンセリン−カルノシンが２：１〜４：１の比率で含有しており、牛肉エキスでは１：３〜１：５、豚肉エキスでは１：４〜１：１０、マグロエキスでは１０：０〜２０：１の比率で存在していること、これらのアンセリンとカルノシンはＣｌＯ・とＯＮＯＯ・ラジカルに対して最も強い抗酸化活性を示すが、ＯＨ・ラジカルではＶ．Ｅより弱く、Ｖ．Ｃと類似の抗酸化作用を有していること、また、アンセリンはＯＨ・に対してカルノシンより強い抗酸化作用を持つが、カルノシンはＣｌＯ・とＯＮＯＯ・に対してアンセリンよりも強い抗酸化作用を持っていること、そして、これらのことから、ＨＣＤＰ中に占めるアンセリン−カルノシン混合体のアンセリンとカルノシンの含量比率を任意に各種エキスを混合することによって、３：１〜１：３の範囲になるように調整し、更に総量として測定されるアンセリン−カルノシン１００ｍｇに対してＶ．Ｃを２０〜１００ｍｇ、Ｖ．Ｅを２．５〜３０ｍｇの割合で配合することにより、これらの３種の系統の異なる活性酸素による蛋白質酸化をほぼ完全に阻止することが可能であることが分かった。
【００１５】
また、天然エキスの味や旨みを生かした各精製段階のアンセリン−カルノシン混合体でも、ＨＣＤＰ含量として調整すれば高純度アンセリン−カルノシンと同等の抗酸化活性が得られるので、各種原料から抽出された天然エキスの状態のままでも、このＶ．ＣとＶ．Ｅの添加量で高い抗酸化活性を持ったエキスを作製することが可能である。なお、本発明に係る天然エキス中のアンセリン−カルノシン含有比率が適切な範囲から逸脱するものは、例えば、豚肉エキスとマグロ、カツオなどの魚肉エキスであり、豚肉の場合はカルノシン含量が高く、魚肉エキスではアンセリン含量が高い。これらのエキスは、豚肉エキスと魚肉エキスから得られるＨＣＤＰをほぼ１：１に混合することによって抗酸化活性を発現させる上で適切なアンセリンとカルノシンの含有比率３：１〜１：３の範囲にすることが可能である。
【００１６】
動物性エキス中に存在するアンセリン−カルノシンの抗酸化剤としての有用性や生活習慣病予防効果の可能性についてこれまで多くのことが報告されて来た。しかし、植物性抗酸化剤ほどには一般の実用が進んでいなかったが、その原因として、一般的に使用される抗酸化活性測定法において、Ｖ．ＣやＶ．Ｅなどの抗酸化性ビタミン類より極めて低い活性しか示さなかったことが挙げられる。しかし、生体内には数多くの活性酸素が生成され、これらが直接、老化や疾病の原因になっているのに対して、従来の方法では抗酸化剤のこれらに対する作用様式は不明であった。本発明によれば、生体内で発生する代表的な活性酸素３種類のＣｌＯ・、ＯＮＯＯ・及びＯＨ・に強く作用する抗酸化性組成物が得られるが、従来の抗酸化剤を組み合わせてもこのような効果は得られない。これらは、従来の評価法による結果と異なるものであり、従来の評価法では知り得なかったことである。本発明の組成物は、上記成分を特定の量比で組み合わせた場合に、上記活性酸素種に対して特異的、かつ相乗的な抗酸化作用を示すものであり、これらの構成及びその有効性は、前記試験例及び実施例に示した格別の実験を実施することではじめて実証されたものであり、その作用効果は従来の知見からは予期し得ないものである。従来の生活習慣病や老化、ガンの発生を予防しようという目的に、Ｖ．ＣやＶ．Ｅ、或はアンセリンとカルノシンを単独で使用した場合には、いずれも生体内で発生する活性酸素に対して有効ではなく、活性酸素の種類によっては全く無効の場合があった。しかし、本発明の組成物によれば広い種類の活性酸素に対して有効に抗酸化活性を発揮でき、従って、従来には無い新規な生活習慣病や疾病予防に有効な抗酸化性組成物を調製し、提供することが可能である。
【００１７】
次に、試験例を示して本発明を詳細に説明する。
試験例１
（１）従来法によるアンセリン−カルノシンの抗酸化活性
動物性エキス中の抗酸化性ペプチドであるアンセリンとカルノシンを植物性抗酸化ビタミンであるＶ．ＣとＶ．Ｅの抗酸化活性を比較するために、上記のＤＰＰＨ法とケミルミネッセンス法（蛍光発光法）で試験した。アンセリン・硝酸塩とカルノシンは試薬（シグマ社製）を用い、動物性エキス中のアンセリン−カルノシン混合体は各精製段階のチキンエキスを用いた。Ｖ．ＣとしてはＬ−アスコルビン酸及びＬ−アスコルビン酸ナトリウム試薬（和光純薬製）を使用し、また、Ｖ．Ｅとしてはα−トコフェロールをショ糖エステルに乳化させて親水性を付与した超エマルジョン（商品名：サンアクティブＶＥ−２０２、ＶＥ−７０２、太陽化学製）を用いた。その結果は表１に示す通りであった。ＤＰＰＨ法と蛍光発光法ではいずれもＶ．Ｃが最も強い抗酸化活性を示し、次いで、Ｖ．Ｅであり、試薬のアンセリンとカルノシン、精製したアンセリン−カルノシン混合体はいずれも弱い抗酸化活性として測定された。
【００１８】
【表１】
（２）蛋白質酸化分解系でのアンセリン−カルノシンの抗酸化活性
人間の生体内で発生する代表的な活性酸素４種のうち、Ｈ2 Ｏ2 は蛋白質を酸化分解する作用が低く判定が困難であることから、その他のＯＨ・、ＣｌＯ・及びＯＮＯＯ・の３種を用いて試験した。ＯＨ・はFenton法(B.Halliwellら、Analytical Biochemistry 、１６５巻、２１５〜２１９頁、１９８７年の改変）、ＣｌＯ・はジ亜塩素酸ナトリウム、ＯＮＯＯ・はquenching flow reactor法(R.Radi ら、Journal of Biological Chemistrｙ、２６６巻、４２４４〜４２５０頁、１９９１年）で調製した。蛋白質を２．５ｍｇ／ｍＬになるように緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．２に溶解し、蛋白溶液に対して１０：１の比率で各濃度の活性酸素（ＣｌＯ・：４００ｐｐｍ、ＯＨ・：８００ｐｐｍ、ＯＮＯＯ・：５ｍＭ）を添加して、３７℃、３０分間反応させた。また、抗酸化性物質は活性酸素添加の３０分前に蛋白溶液に対して同じく１０：１の比率で添加した。各反応液を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で泳動した後、染色したゲルをデンシトメーターで、或は蛋白質反応液を直接ＴＳＫＧ−３，０００ＳＷカラムのＧＰＣ−ＨＰＬＣにかけて、蛋白分解阻止活性を次の式で算出した。
【００２０】
蛋白質分解阻止活性（％）＝抗酸化剤５ｍＭ添加時の活性酸素分解蛋白質のピーク面積 ×１００（％）／未分解蛋白質のピーク面積
【００２１】
その結果を表２に示す。表２の結果から、ＣｌＯ・とＯＮＯＯ・に対しては各種エキス中に含まれるアンセリンとカルノシンが最も抗酸化活性が強く、Ｖ．Ｃはアンセリンとカルノシンに類似の抗酸化活性を示し、Ｖ．ＥはＯＨ・に対して最も強い抗酸化活性を示すことが分かった。
【００２２】
【表２】
（３）抗酸化剤の配合による活性酸素の蛋白質分解阻止作用
チキンエキスなどの動物エキス中に含まれるアンセリンとカルノシンは、生体内で発生する活性酸素に対してＶ．Ｃに類似した抗酸化作用の傾向を持っているが、Ｖ．Ｅとは対照的である。従って、Ｖ．Ｅが最も強く、動物由来のアンセリン−カルノシン混合体やＶ．Ｃが最も弱いＯＨ・に対して、そして、動物由来アンセリン−カルノシン混合体が最も強く、Ｖ．Ｅが最も弱いＣｌＯ・に対してこれらは相互補完的な効果が期待でき、更に、ＯＮＯＯ・ではアンセリン−カルノシン混合体にＶ．ＣとＶ．Ｅを加えることによって更に完全な抗酸化活性が期待できる。各種エキス由来のアンセリン−カルノシン混合体の濃度を１．２ｍｇ／ｍＬ（約５ｍＭ）とし、Ｖ．Ｃナトリウムを０．６ｍｇ／ｍＬ（約３．０ｍＭ）、Ｖ．Ｅを０．５ｍｇ／ｍＬ（約１ｍＭ）添加配合した場合の蛋白分解阻止作用を表３に示す。
【００２４】
【表３】
表３に示した結果の通り、ポークエキスとマグロエキスではＶ．ＣとＶ．Ｅを添加してもＣｌＯ・による酸化分解を完全に阻止することができなかったが、これは、表４に示すように、アンセリンとカルノシンの含有に偏りがあったためと考えられた。表３と表４の結果から、ＨＣＤＰが適切な抗酸化活性を発揮するためのアンセリンとカルノシンの含量比率は、チキンエキスの比率とビーフエキスの比率の範囲である。すなわち、アンセリン−カルノシンが３：１〜１：３の範囲であった。実施例３で調製したＵＦ処理ビーフエキス、同ポークエキス、同マグロエキスを等量混合した場合、アンセリンとカルノシンの含有比率は１．８：１．７とほぼ等量となったが、この混合エキスにＶ．ＣとＶ．Ｅを添加したもののＣｌＯ・に対する酸化分解阻止率は１００％であった。
【００２６】
【表４】
なお、アンセリン−カルノシン混合体の濃度を２．４ｍｇ／ｍＬ（約１０ｍＭ）にした場合には、Ｖ．ＣとＶ．Ｅの添加量をそれぞれ０．５ｍｇ／ｍＬ（約２．５ｍＭ）、０．０６ｍｇ／ｍＬ（約０．１５ｍＭ）でＯＨ・酸化分解に対して９５％以上の分解阻止活性を示す結果であった。すなわち、動物エキス由来のアンセリン−カルノシン混合体の量を増加させることによって抗酸化活性は上昇するが、アンセリン−カルノシンが完全に抑制できないＯＨ・ラジカルに対しては、アンセリン−カルノシンとの重量比でＶ．Ｃを５：１、Ｖ．Ｅを４０：１の割合で添加すると各種活性酸素による蛋白質分解は十分に抑制される結果が得られた。これは、アンセリン−カルノシン混合体１００ｍｇ当たりＶ．Ｃは２０ｍｇ、Ｖ．Ｅは２．５ｍｇとなる。また、上限値は各抗酸化剤の推奨される一日最大摂取量となるので、アンセリン−カルノシンとＶ．Ｃは３，０００ｍｇ、Ｖ．Ｅは３００ｍｇであることから、アンセリン−カルノシン１００ｍｇ当たりＶ．Ｃは１００ｍｇ、Ｖ．Ｅは３０ｍｇの割合となる。
【００２８】
（４）糖尿病ラット（ＧＫラット）における糖化蛋白質生成抑制作用
糖尿病の病態では血中の活性酸素量が増加し、酸化された蛋白質と血中の高ブドウ糖値により糖化蛋白質、具体的には糖化モグロビンＡ１ｃ量が増加することが知られている。この活性酸素の増加に伴う糖化蛋白質の生成は最終糖化産物(Advanced glycation endoproducts、ＡＧＥｓと略記）の生体内蓄積を意味し、糖尿病に併発する各種の疾患、すなわち、糖尿病性高血圧、同動脈硬化、同腎症、同痴呆症、同末梢循環障害などがこのＡＧＥｓの蓄積に起因していると考えられている。過剰栄養摂取により発症する２型糖尿病のモデル動物であるＧＫラット(Y.Iharaら、FEBS Letters、４７３巻、２４−２６頁、２０００年）に対して、本発明に関わるＶ．Ｃ及びＶ．Ｅを添加したアンセリン−カルノシン混合体が実際に生体内の酸化反応により促進される糖化ヘモグロビンＡ１ｃ生成の抑制作用を持つか否かを試験した。図３に示すとおり、ＧＫラットの体重１ｋｇ当たりＵＦ処理チキンエキスのアンセリン−カルノシン２００ｍｇ、Ｖ．Ｃ１００ｍｇ、Ｖ．Ｅ２０ｍｇを経口投与した場合、上記Ｙ．Ｉｈａｒａらにより報告されたＶ．Ｅの２０ｍｇ単独投与より、アンセリン−カルノシン２００ｍｇを含む飼料を投与したほうが明らかに糖化ヘモグロビンＡ１ｃ値が低下する結果が得られた。
【００２９】
【実施例】
次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
実施例１
丸鶏から熱水抽出して得られたチキンエキス４０Ｌを分画分子量３，０００の限外ろ過膜（旭化成製ＳＥＰ−１０１３）にかけ、ろ過膜透過液３２Ｌを回収した。ろ過液を減圧濃縮してＢｒｉｘ濃度２０％にした。この濃縮チキンエキスのアンセリン−カルノシン含量は固形物当たり１８０ｍｇ／ｇであったので、Ｖ．Ｃ（食品添加物）を９０ｍｇ／ｇ、Ｖ．Ｅ（太陽化学製サンアクティブＶＥ−２０２）を１８ｍｇ／ｇになるように添加し、更にデキストリン（食品添加物）を濃縮チキンエキスの固形物当たり３３％（１：２）になるように加えて噴霧乾燥し、抗酸化性チキンエキス粉末約３０ｇを調製した。この粉末は１ｇ当たりアンセリン−カルノシンを１２０ｍｇ、Ｖ．Ｃを６０ｍｇ、Ｖ．Ｅを１２ｍｇ含有しており、上記のＧＫラットに２週間経口投与すると図３に示したとおり、血中糖化ヘモグロビン含量を低下させる活性を有していた。
【００３０】
実施例２
丸鶏から熱水抽出したチキンエキス１，２００Ｌを分画分子量３，０００の限外ろ過膜（旭化成製ＳＥＰ−３０１３）にかけ、ろ過膜透過液２００Ｌを分画分子量５００(Danish Separation Systems社製ＮＦＴ−５０）のナノろ過膜で濃縮して、Ｂｒｉｘ濃度１０％のチキンエキス２０Ｌを調製した。このナノろ過処理チキンエキスには固形物１ｇ当たりアンセリン−カルノシンが２００ｍｇ含有されているので、実施例１と同様に、Ｖ．ＣとＶ．Ｅを添加して凍結乾燥法により粉末化した。また、ナノろ過濃縮チキンエキス２０Ｌを一度製造用水を加えて脱塩し、０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液を４Ｌ加えて、０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ５．０で平衡化したＤｏｗｅｘ５０ＷＸ−８陽イオン交換樹脂カラムに通液し、アンセリン−カルノシンをカラムに吸着させ、希薄な緩衝液でカラムを洗浄した後、アルカリ溶液でアンセリン−カルノシンを溶出させて回収した。この液を減圧濃縮してから活性炭で脱色し、エタノール沈澱法でアンセリン−カルノシンを沈澱させ、アルコールを減圧下に除去して精製されたアンセリン−カルノシン混合体粉末約１０ｇを調製した。この精製粉末のアンセリン−カルノシン含量比率は１．２：１．０であり、２％レモン果汁１００ｍＬ当たりアンセリン−カルノシンの総量が５００ｍｇ、Ｖ．Ｃ２５０ｍｇ、Ｖ．Ｅ３０ｍｇになるように添加して抗酸化性清涼飲料を調製した。
【００３１】
実施例３
骨を除去した豚肉、牛肉、マグロ肉１ｋｇ当たり３Ｌの水を加えて９８℃、１時間熱水抽出し、分液ロートで油層を分離した後、珪藻土をろ過補助剤として吸引ろ過した。これらのエキス中にはアンセリンとカルノシンが混合体として含有され、固形分１ｇ当たりのアンセリン−カルノシン含量は豚で９６ｍｇ、牛で６７ｍｇ、マグロで１２０ｍｇであった。これらのエキスを減圧濃縮してＢｒｉｘ５．０％とし、３種を等量混合した。このときのアンセリン−カルノシン含量比率は１．８：１．７であったので、アンセリン−カルノシン混合体１００ｍｇ当たりＶ．Ｃナトリウム（食品添加物）を５０ｍｇ、Ｖ．Ｅ（太陽化学製、サンアクティブＶＥ７２０）を２０ｍｇ添加して無菌ろ過し、液状の動物性エキスを調製した。また、これらの珪藻土ろ過したエキスを限外ろ過膜（旭化成製ＳＥＰ−１０１３）にかけて蛋白質を除去し、減圧濃縮して前記と同様に混合し、アンセリン−カルノシン混合体１００ｍｇ当たりＶ．Ｃナトリウム５０ｍｇ及びＶ．Ｅを３０ｍｇ添加し、同様に液状の抗酸化性動物エキスを調製した。これらのエキスは表３に示した３種の活性酸素による蛋白質の分解をほぼ完全に抑制する活性を示すものであった。
【００３２】
【発明の効果】
以上詳述したとおり、本発明は、動物性天然エキスに由来する抗酸化能を有する特定の成分を特定の量比で配合してなる抗酸化用組成物に係るものであり、本発明により、次のような効果が奏される。
（１）多様な活性酸素種に対して特異的な抗酸化作用を有する当該活性酸素種抗酸化用組成物を提供することができる。
（２）生体内で発生する代表的な活性酸素３種類の全てに抗酸化性能を有する新規抗酸化性組成物を提供することができる。
（３）従来、Ｖ．ＣやＶ．Ｅなどの抗酸化性ビタミン類より極めて低い活性しか示さないと考えられていたアンセリンとカルノシンを有効成分とする広い活性酸素種に対する抗酸化用組成物を提供することができる。
（４）アンセリン−カルノシン混合体、Ｖ．Ｃ、及びＶ．Ｅを組み合わせることで、それらの各成分単独では期待できない相乗的な抗酸化作用が得られる。
（５）これらのことより、活性酸素が関わる生活習慣病やその他の疾病の発症を効果的に予防できる抗酸化性組成物又は食品の調製が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、生体内で発生する代表的な活性酸素による卵白アルブミンの酸化分解に対する各種抗酸化剤の防止作用を示す（Ａ：ＣｌＯ・、Ｂ：ＯＨ・、Ｃ：ＯＮＯＯ・、１：未分解卵白アルブミン、２：分解卵白アルブミン、３：Ｖ．Ｃ添加、４：Ｖ．Ｅ添加、５：アンセリン添加、６：カルノシン添加、７：チキンエキス由来精製アンセリン−カルノシン添加）。
【図２】図２は、糖尿病病態モデルのＧＫラットにおける本発明物質の血中糖化ヘモグロビンＡ１ｃ生成抑制作用を示す（ＣＥ＋ＶＣ＋ＶＥ：ＵＦ処理チキンエキス＋ビタミンＣ＋ビタミンＥ；ＣＥ＋ＶＣ：ＵＦ処理チキンエキス＋ビタミンＣ；ＶＥ：ビタミンＥ単独）。
Claims (4)
- 生体内で発生する活性酸素に対して抗酸化性能を有する抗酸化性組成物からなる抗酸化剤であって、当該組成物は、食用家禽類、畜肉類、及び回遊性魚類の１種以上の筋肉より熱水抽出して得られる動物性エキス中のアンセリン−カルノシン混合体の、アンセリンとカルノシンの含量比率を任意に各種エキスを混合することによって、３：１〜１：３の範囲になるように調整したアンセリン−カルノシン混合体と、ビタミンＣ及びビタミンＥとから構成される組成を有し、上記アンセリン−カルノシン混合体１００ｍｇに対して、ビタミンＣ（Ｌ−アスコルビン酸又はＬ−アスコルビン酸ナトリウム）を２０〜１００ｍｇ、ビタミンＥ（α−トコフェロール）を６〜３０ｍｇの割合で配合した組成比を有し、水酸化ラジカル、ジ亜塩素酸ラジカル及び過酸化硝酸ラジカルの３種の活性酸素種に対して相乗的な抗酸化作用を有することを特徴とする抗酸化剤。
- 上記アンセリン−カルノシン混合体が、上記熱水抽出して得られる動物エキスを分画分子量３，０００〜１０，０００の限外ろ過膜処理して、該ろ過膜透過液を更に分画分子量２００〜５００のナノろ過膜もしくは逆浸透膜で処理してろ過膜上に透過阻止されて濃縮されたアンセリン−カルノシン混合体であることを特徴とする請求項１記載の抗酸化剤。
- 上記アンセリン−カルノシン混合体が、上記熱水抽出して得られる動物エキスを分画分子量３，０００〜１０，０００の限外ろ過膜処理して、該ろ過膜透過液を更に分画分子量２００〜５００のナノろ過膜もしくは逆浸透膜で処理してろ過膜上に濃縮されたものを陽イオン交換体クロマトグラフによって純度７５％以上に精製されたアンセリン−カルノシン混合体であることを特徴とする請求項１記載の抗酸化剤。
- 請求項１から３のいずれかに記載の、生体内で発生する活性酸素に対して抗酸化性能を有する抗酸化性組成物からなる抗酸化剤を配合したことを特徴とする抗酸化性食品。
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