JP4808880B2 - バクテリオファージｐｈｉｃ３１組み換え系による真核細胞におけるｄｎａ組み換え - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
連邦政府が後援する研究に関する説明
本発明は、政府の指示で米国農務省、農業リサーチサービスによって授与された許可No.5335-21000-009-06Sの下でなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願への相互参照
本出願は、ここで参照として組み込む1999年7月23日に出願された米国仮出願番号60/145,469の利益をクレームする。
【０００３】
本発明は、真核細胞の染色体の中への特異的かつ安定した核酸の組み込みを得るための方法の分野に関する。本発明は、ΦC31インテグラーゼなどの原核リコンビナーゼポリペプチドを使用する部位特異的組み換え系を利用する。
【０００４】
【従来の技術】
原核の遺伝子形質転換は、しばしば重大な短所に苦しむ。例えば、トランス遺伝子の組み込みを興味ある特定の座で再生産可能に得ることはしばしば困難である。相同組み換えは、一般に非常に低い頻度でのみ生じる。この問題を克服するために、部位特異的組み換え系を用いた。これらの方法は、より高等な原核細胞において機能することが可能な部位特異的組み換え系の使用を含む。多くのバクテリオファージ及び組み込みプラスミドは、それらのゲノムをそれらの宿主のものの中へ安定に組み込むことが可能な部位特異的組み換え系をコード化する。これらの系において、組み換え反応の最小必要条件は、組み換え現象を触媒するリコンビナーゼ酵素又はインテグラーゼ、及び2つの組み換え部位である（Sadowski（1986）J.Bacteriol．165：341-347；Sadowski（1993）FASEB J.7:760-767）。ファージ組み込み系について、これらは、付着（att）部位といい、ファージDNA由来のattP因子と、バクテリアゲノムによってコード化されるattB因子がある。2つの付着部位は、２，３の塩基対と同じくらい小さい配列を共有する。リコンビナーゼタンパク質は、両方のatt部位に結合し、宿主への環状ファージ又はプラスミドDNAの組み込みを生ずる、DNA鎖のコンサーバティブ（保存型）及び相互作用交換を触媒する。DNAベンディングタンパク質IHF、組み込み宿主因子などの追加のファージ又は宿主因子波、効率的な反応に対して要求されるかもしれない（Freidman （1988）Cell 55:545-554；Finkel ＆ Johnson（1992）Mol.Microbiol. 6：3257-3265）。逆切り取り反応は、時折、ファージλのxis遺伝子産物などの追加のファージ因子を必要とする。（Weisberg ＆ Landy（1983）“ファージλにおける部位特異的組み換え”In Lambda II、eds. Hendrix et al．（Cold Dpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）pp.211−250；Landy（1989）Ann.Rev.Biochem. 58：913−949）。
【０００５】
リコンビナーゼは、2つのグループ、λインテグラーゼ（Argos et al.（1986）EMBO J．5：433-44；Voziyanov et al（1999）Nucl. Acids Res.27:930-941）、及びリゾルバーゼ/転化酵素属（Hatfull ＆ Grindley （1988）“Resolvases and DNA−invertase：a family of enzymes active in site-specific recombination” In Genetic Recombination, eds. Kucherlipati, R., & Smith, G.R. (Am. Soc. Microbiol., Wachington DC), pp. 357-396）に分類される。これらは、インテグラーゼ酵素の構造、及び触媒のそれらのモードの分子詳細を変える（Stark et al. （1992）Trends Genetics ８：432−439）。鋳型Streptomyces ファージΦC31は、後者の分類の68kDリコンビナーゼをコード化する。同系の付着部位を組み換える際にΦC31インテグラーゼ酵素の有効性が、試験官内及び生体内でrecA突然変異体大腸菌において最近証明された（Thorpe ＆ Smith（1998）Proc．Nat’ｌ. Acad．Sci．USA95:5505−5510）。ΦC31インテグラーゼ反応は、おそらく追加のファージタンパク質が切り取りに要求されないために、宿主因子を必要とせず、不可逆であるようであるという点においてシンプルである。ファージ及びバクテリアatt部位は、クロスオーバー点で相同性の3つの塩基対だけを共有する。この相同関係は、逆方向反復、おそらくインテグラーゼタンパク質の結合部位によって隣接する。両方のattB及びattPに対する最小の既知の機能的な大きさは、〜５０bpである。
【０００６】
バクテリオファージP1のCre-lox系、及びSaccharomyces cerevisiae のFLP−FRT系は、動物及び植物におけるトランス遺伝子及び染色体工学技術に広く使用されている（Sauer（1994）Curr．Opin．Biotechnol.５：521−527；Ow（1996）Curr.Opin．Biotechnol.７：181−186）。動物又は植物細胞において作用する他の系は、以下すなわち、１）Zygosaccharomyces rouxii 由来のR−RS系（Onouchi et al（1995）Mol. Gen．Genet．247:653−660）、２）バクテリオファージMu由来のGin−gix系（Maeser ＆ Kahmann（1991）Mol．Gen．Genet．230:170−176）、及び３）バクテリアプラスミドpSM19035 由来のβリコンビナーゼ−six系（Diaz et al．（1999）J．Biol．Chem．274:6634−6640）、を含む。部位特異的リコンビナーゼを使用することによって、より高頻度で組み込みを得ることができる。
【０００７】
しかしながら、これら5つの系は、重大な短所を有する。各これらの系は、単一のポリペプチドリコンビナーゼは、同一かほぼ同一の配列の2つの部位間の組み換えを触媒するという共通した特性を有する。組み換えによって生じた生産部位は、それ自体次の組み換えに対する基質である。結果として、組み換え反応は容易に可逆可能である。分子内相互作用の反応速度論は、分子間相互作用に渡って好ましいので、これら組み換え系は、DNAを組み込むよりむしろ削除するのに有効である。したがって、トランス遺伝子の安定的な部位特異的組み込みを得るための方法と系に対する必要性が存在する。本発明は、この及び他の必要性を、満たす。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、真核細胞において、安定で、部位特異的な組み換えを得るための方法を提供する。以前に知られた部位特異的組み換え方法と違って、本発明の方法を使用して得られた組み換え体は、安定である。組み換え反応は、可逆的ではない。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本方法は、第一の組み換え部位と、前記第一の組み換え部位との組み換えの基質として機能することが可能な第二の組み換え部位とを含む真核細胞を提供することを含む。第一及び第二の組み換え部位は、原核リコンビナーゼポリペプチドと接触し、組み換え部位間に組み換えを生じ、それによって1又は2つのハイブリッド組み換え部位を形成する。有意義なことに、リコンビナーゼポリペプチドは、第一及び第二の組み換え部位間の部位特異的組み換えを仲介することができるが、真核細胞において存在しない追加のファージ生産因子の不存在下で2つのハイブリッド組み換え部位間の組み換えを仲介することができないものである。組み換え部位のいずれか又は両方が真核細胞の染色体において存在することができる。いくつかの実施態様において、組み換え部位の1つは染色体に存在し、他は染色体の中へ組み込まれるべき核酸内に含まれる。
【００１０】
本発明は、原核リコンビナーゼポリペプチド又は原核リコンビナーゼをコード化する核酸を含む真核細胞も提供する。これらの実施態様において、リコンビナーゼは、第一の組み換え部位と、前記第一の組み換え部位との組み換えの基質として作用することが可能な第二の組み込み部位との間の部位特異的組み換えを仲介をすることができるが、第一の組み換え部位と第二の組み換え部位との間の組み換えに形成された2つのハイブリッド組み換え部位間の組み換えを、真核細胞に存在しない追加の因子の不存在下では仲介することができないものである。現在好ましい実施態様において、本発明の細胞は、リコンビナーゼポリペプチドのコード化配列を有する核酸を含む。リコンビナーゼコード化配列は、真核細胞においてリコンビナーゼコード化ポリヌクレオチドの発現を仲介するプロモーターと作用可能に結合することが好ましい。本発明の真核細胞は、例えば、動物細胞、植物細胞、酵母細胞、又はカビ細胞とすることができる。
【００１１】
別の実施態様において、本発明は、安定に組み込んだトランス遺伝子を有する真核細胞を得るための方法を提供する。これらの方法は、第一の組み換え部位を含む真核細胞の中へ核酸を導入することを含み、前記核酸は興味あるトランス遺伝子と前記第一の組み換え部位との組み換えの基質として作用することが可能な第二の組み換え部位とを含むことを特徴とする。第一及び第二の組み換え部位は、原核リコンビナーゼポリペプチドと接触する。リコンビナーゼポリペプチドは、第一及び第二の組み換え部位間の組み換えを触媒し、第一の組み換え部位で核酸の組み込みを生じ、それによって核酸の各末端でハイブリッド組み換え部位を形成する。かさねて、リコンビナーゼポリペプチドは、第一及び第二の組み換え部位間の部位特異的組み換えを仲介するが、真核細胞において存在しない付加的因子の不存在下では2つのハイブリッド組み換え部位間の組み換えを仲介することができないものである。
【００１２】
本発明の別の実施態様において、真核細胞において機能するプロモーターと作用可能に結合するバクテリアリコンビナーゼポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明のこれらの核酸によってコード化されるリコンビナーゼポリペプチドは、真核細胞において存在しないバクテリオファージ因子の不存在下では第一の組み換え部位と第二の組み換え部位との間の組み換えで形成された2つのハイブリッド組み換え部位間の組み換えを仲介することができない。いくつかの実施態様において、さらに、核酸は、リコンビナーゼポリペプチドによって認識される少なくとも1つの組み換え部位を含む。
【００１３】
本発明によって提供される真核細胞は、また、真核細胞において存在しないバクテリオファージ因子の不存在下では第一の組み換え部位と第二の組み換え部位との間の組み換えで形成された2つのハイブリッド組み換え部位を仲介できない1又はそれ以上のバクテリオファージΦC31組み換え部位、または他のリコンビナーゼに対する組み換え部位を有するポリヌクレオチドを含む。
【００１４】
【発明の実施の形態】
定義
ここで使用するような「外因性DNA断片」、「異質ポリヌクレオチド」、「トランス遺伝子」、「異質核酸」は、異質の起源から特定の宿主へ創造したものか、あるいは、もし同じ起源由来ならその原型由来のものから修飾したものである。したがって、宿主細胞における異質遺伝子は、特定の宿主細胞へ内生的であるが、修飾されていない遺伝子を含む。それゆえ、前記用語は、細胞に対して外来性か、異質か又は相同であるが、因子が通常見られない宿主細胞核酸内に位置するDNA断片を言う。外因性のDNA断片を発現させて外因性ポリペプチドを生産する。
【００１５】
「遺伝子」の語は、生物学上の機能と関係するいずれのDNA断片を表すものとして広く使用する。したがって、遺伝子は、それらの発現に要求されるコード化配列及び／又は調節配列を含む。遺伝子は、例えば、他のタンパク質に対する認識配列を形成する非発現DNA断片も含むことができる。遺伝子は、種々の起源から得ることができ、興味ある起源由来のクローン、または既知の若しくは予想した配列情報からゴウセイしたもの、所望のパラメーターを有するように設計された配列を含むことができる。
【００１６】
核酸又はタンパク質に適用するとき、「単離」の語は、核酸又はタンパク質が自然の状態に関係する他の細胞成分が本質的に存在しないことを表す。乾燥しているか水溶液のいずれかとすることができるが、均質な状態が好ましい。純度や均質性は、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高性能液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を使用して典型的に決定される。調製において存在する有力種であるタンパク質は、本質的に精製される。特に、遺伝子を隣接させて、興味ある遺伝子以外のタンパク質をコード化するオープンリーディングフレームから単離した遺伝子を分離する。「精製」の語は、電気泳動ゲルにおいて核酸又はタンパク質が1つのバンドを本質的に生じることを意味する。特に、核酸又はタンパク質が少なくとも約50％純粋、より好ましくは少なくとも約85％純粋、最も好ましくは少なくとも約99％純粋であることを意味する。
【００１７】
「自然に生じる」の語は、ヒトによって人工的に生産されることから区別するものとして天然に見出すことができる対象を記述するために使用する。例えば、実験室においてヒトによって意図的に修飾されていない天然の起源から単離することが可能な（ウイルスを含む）組織において存在するポリペプチド、又はポリヌクレオチド配列は、自然に生じる。
【００１８】
「核酸」又は「ポリヌクレオチド」の語は、一本鎖又は二本鎖型のいずれかにおけるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、及びその重合体を言う。特に限定しない場合、前記語は、引用核酸と同様の結合特性を有し、自然に生ずるヌクレオチドと同様の方法で代謝される自然のヌクレオチドの既知のアナログを含有する核酸を包含する。他に指示しない場合、特定の核酸配列は、伝統的に修飾したその変異体（例えば、縮退コドン置換）、相補的配列、及び明確に指示した配列も絶対的に包含する。具体的に、1又はそれ以上選択した（又はすべての）コドンの3つの部分を、混合した塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換した配列を発生させることによって縮退コドン置換を達成することができる（Batzer et al.（1991）Nucleic Acid Res. 19：5081；Ohtsuka et al．（1985）J．Biol．Chem。260：2605−2608；Cassol et al.（1992）；Rossolini et al．（1994）Mol．Cell．Probes ８：91−98）。核酸の語は、遺伝子、遺伝子によってコード化されたｃDNA及びｍRNAと交互に使用される。
【００１９】
「遺伝子から誘導される核酸」とは、遺伝子又はそのサブ配列（例えば、コード化領域）を合成し、最終的に鋳型として機能する核酸を言う。それゆえ、ｍRNA、ｍRNAから逆転写されたｃDNA、そのｃDNAから転写されたRNA、ｃDNAから増幅したDNA、増幅したDNAから転写したRNAなどは、すべて遺伝子から誘導され、そのように誘導された産物の検出は、オリジナルの存在及び/又は不存在の指示となる。
【００２０】
DNA断片は、別のDNA断片と機能ある関係に置かれたとき、「作用可能に結合」する。例えば、ポリペプチドの分泌に加わるプレタンパク質として発現するなら、ポリペプチドをコード化するDNAに、単一の配列についてのDNAは作用可能に結合する。プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写を刺激するならコード化配列に作用可能に結合する。一般に作用可能に結合するDNA配列は、隣接と読み取り段階の両方のシグナル配列の場合、隣接する。しかしながら、例えば、エンハンサーは、それらが制御する転写のコード化配列と隣接する必要がない。結合は、従来の制限酵素部位、又はその代わりに挿入したアダプター、リンカーでのライゲーションによって達成される。
【００２１】
「植物」の語は、全植物、植物組織（例えば、葉、茎、根など）、種子、植物細胞、及び同様の子孫を含む。本発明の方法で使用可能な植物の分類は、形質転換技術に修正可能なより高い植物の分類と同様に一般に広く、単子葉、双子葉植物の両方を含む。
【００２２】
「プロモーター」の語は、転写を開始するためにRNAポリメラーゼとの結合に関わるDNA領域を言う。「誘導プロモーター」は、発現のレベルを、例えば、温度、pH、転写因子及び化学薬品などの環境又は開発因子によって変更可能である遺伝子の発現を導くプロモーターをいう。
【００２３】
細胞に関して使用するとき「組み換え」の語は、細胞が異質核酸を複製するか、又は異質核酸によってコード化されるペプチド又はタンパク質を発現することを表す。組み換え細胞は、細胞の野生型（非組み換え型）内では見出すことができないポリヌクレオチドを含むことができる。組み換え細胞は、ポリヌクレオチドが人工的な手段によって細胞の中へ修正又は再導入される細胞の野生型に見出されるポリヌクレオチドも含む。語は、細胞から核酸を除去することなしに修飾された細胞に内在する核酸を含む細胞も包含し、そのような修飾は、遺伝子置換、部位特異的突然変異体、及び関連技術等によって得られるものを含む。
【００２４】
「組み換え発現カセット」又は単なる「発現カセット」は、構造遺伝子の発現をそのような配列と両立できる宿主において達成することが可能な核酸因子を持つ組み換え的、又は合成的に発生させた核酸構築物である。発現カセットは、少なくともプロモーター、及び選択的に、転写終結シグナルを含む。典型的には、組み換え発現カセットは、転写すべき核酸（例えば、所望のポリペプチドをコード化する核酸）、及びプロモーターを含む。発現を達成する際に必要な又は役立つ追加の因子をここで述べたように使用することができる。例えば、発現カセットは、宿主細胞由来の発現タンパク質の分泌を指示するシグナル配列をコード化するヌクレオチド配列も含むことができる。遺伝子発現に影響する転写終結シグナル、エンハンサー、及び他のヌクレオチド配列も、発現カセットに含まれる。
【００２５】
「リコンビナーゼ」の語は、2つ又はそれ以上の組み換え部位間の組み換えを触媒する酵素をいう。本発明のおいて役立つリコンビナーゼは、特定のリコンビナーゼによって認識される特異的ポリヌクレオチド配列である特異的組み換え部位での組み換えを触媒する。「インテグラーゼ」の語は、リコンビナーゼのタイプをいう。
【００２６】
「形質転換率」は、異質ポリヌクレオチドをそのゲノム及び残存物の中へ上手く組み込んだ細胞の割合をいう。
【００２７】
「トランスジェニック」の語は、細胞の中へか、細胞の原型の中へ導入された特異的修飾を含む細胞をいう。そのような修飾は、一又はそれ以上の点突然変異、欠失、挿入、又はその組み合わせを含むことができる。動物に言及するとき、「トランスジェニック」の語は、トランスジェニックである細胞を含む動物を意味する。トランスジェニック及び非トランスジェニック細胞の両方からなる動物は、ここでは「キメラ」動物という。
【００２８】
「ベクター」の語は、核酸（又は複数の核酸）を宿主細胞へ運搬するための組成物を言う。ベクターは、運搬すべき核酸をコード化する核酸を含み、核酸の宿主細胞内への加入及び／又はベクターの宿主細胞への複製を容易にするために、ウイルスキャプシド又は他の物質（例えば、キャプシド内、又はキャプシドの一部としてパッケージされた逆転写酵素又は他の酵素）を選択的に含む。
【００２９】
「組み換え部位」はここで述べるリコンビナーゼ酵素によって認識される特異的ポリヌクレオチド配列である。典型的には、（相補部位と呼ばれる）２つの異なる部位を含み、１つは目的の核酸に存在し（例えば、真核の染色体又はエピソームなど）、別のものは、目的の組み換え部位で組み込まれるべき核酸上に存在する。特別の酵素の組み換え部位が異なる名前を持つかもしれないが、「attB」及び「attP」の語は、それぞれ、本来的にバクテリアターゲット、及びファージドナー由来の付着（又は組み換え）部位をいう。組み換え部位は、典型的に、コア又スペーサー領域によって分離された左及び右アームを含む。それゆえ、attB組み換え部位は、BOB‘からなり、B及びB’は、それぞれ左及び右アームであり、Oはコア領域である。同様に、attPは「POP‘」であり、P及びP’はアームであり、Oは重ねてコア領域である。前記attB及びattP部位との間の組み換えでは、核酸の標的での付随する組み込み、組み込んだDNAに隣接する組み換え部位は、「attL」及び「attR」という。それゆえ、上述した用語を使用してattL及びattRは、それぞれBOP’及びPOB‘からなる。ここでのいくつかの表示において、「O」を省略し、attB及びattPはそれぞれBB’及びPP’と示す。
【００３０】
（好適な態様の説明）
本発明は、真核細胞において部位特異的な組み換えを得るための方法を提供するものである。部位特異的な組み換えを得るための過去に知られたシステムとは異なり、本発明の方法を用いて行われた組み換えの産物は安定である。そこで、例えば、真核細胞の染色体へトランスジーンを導入するために本方法を用いることが可能であり、そして既に知られた部位特異的な組み換えシステムを用いる場合にしばしば起こる、トランスジーンの切除を避けることができる。安定な逆位（inversion ）、トランスロケーション（translocation ）及び他の転位（rearrangement ）もまた、得ることができる。
【００３１】
本発明は、バクテリオファージのインテグラーゼの様な原核細胞のリコンビナーゼを採用し、その様な酵素は２つの相補的な組み換え部位の間の組み換えを触媒するが、この組み換えにより形成されたハイブリッド部位の間の組み換えを触媒することができない、という点において単方向性である。その様なリコンビナーゼの一つであるΦC31 インテグラーゼは、それ自身ではattB x attP 反応のみを触媒する。そのインテグラーゼは、attBとattPの間の組み換えにより形成された、attLとattR部位の間の組み換えをを仲介することはできない。ΦC31 インテグラーゼの様なリコンビナーゼは単独で逆反応を触媒することはできないために、ΦC31 のattB x attP 組み換えは安定である。この性質により、真核細胞において現在使用されている部位特異的な組み換えシステムから、本発明の方法は離れている。現在使用されているシステムにはCre-lox システム又はFLP-FRT システムの様なものがあり、そこでは組み換え反応は容易に逆転される。本発明の組み換えシステムの使用により、真核細胞において、安定なトランスジーン及び染色体転位（rearrangement ）に向けての新たな機会が提供される。
【００３２】
本方法は、対応するリコンビナーゼを用いて、真核細胞に存在している一組の組み換え部位（例えば、attB及びattP）に接触することを含む。そこでリコンビナーゼは組み換え部位の間の組み換えを仲介する。二つの組み換え部位の相対的な位置に応じて、組み換えの結果としての数多くのイベントのいずれか一つが起こることがある。例えば、もし二つの組み換え部位が異なった核酸分子上に存在しているならば、その組み換えは一つの核酸分子を第二の分子へと組み込む結果と成り得るであろう。そこで、対応する組み換え部位を含んでいる真核細胞染色体へ、一つの組み換え部位を含んでいるプラスミドを組み込むことができるであろう。本発明の方法において用いられたリコンビナーゼは逆反応を触媒することができないから、その組み込みは安定である。その様な方法は、例えば、プラスミド上に存在しているトランスジーンを、真核細胞の染色体へ安定に組み込むために有用である。
【００３３】
二つの組み換え部位が、同一の核酸分子上に存在することもまたできる。その様な場合には、得られた産物は典型的には、その部位の相対的な方向性に依存する。例えば、直線方向にある部位の間の組み換えは一般的に、その２つの組み換え部位の間にある任意のDNA が切り出されるという結果となる。対照的に、逆方向にある部位の間の組み換えは、仲介しているDNA のインバージョンが起こるという結果となることがある。再び、付加的因子の非存在下において組み換えは不可逆的であるという点において、得られた転位した（rearranged）核酸は安定であり、付加的因子は一般的にそのリコンビナーゼが由来する特定のバクテリオファージによってコードされ、正常には真核細胞においては見られないものである。この方法が有用である適用の一つの例は、２つの組み換え部位の間のプロモーターの交換に伴って生じる。もしプロモーターが、そのプロモーターによって発現されるべきコード配列に関して最初に反対向きであって、そしてそのプロモーターをフランク（flank ）する組み換え部位が逆方法であるならば、組み換え部位を接触させることはプロモーターの逆位（inversion ）が起こる結果となり、従ってプロモーターを正しい方向に置いてコード配列の発現を駆り立てるであろう。同様に、もしプロモーターが最初に発現のために正しい方向性にあり、組み換え部位が同じ方向性にあるならば、組み換え部位がプロモーターと接触することによりプロモーターフ断片を切り出して、そしてコード配列の発現を停止させるという結果を得ることができる。
【００３４】
本発明の方法は、例えば、染色体のトランスロケーションを得るためにもまた有用である。これらの態様において、一つの組み換え部位は一つの染色体上に置かれ、そして第一の組み換え部位と共に組み換えの基質として働くことができる第二の組み換え部位が第二の染色体上に置かれている。その二つの組み換え部位をリコンビナーゼと接触させると組み換えが起こって、２つの染色体アームが交換されるという結果となる。例えば、生物の２つの系統を構築することが可能であり、そのうちの一つの系統は第一の組み換え部位を含み、第二の系統は第二の組み換え部位を含んでいる。その２つの系統は掛け合わされ、その組み換え部位の両者を含む子孫の系統が得られる。その部位をリコンビナーゼと接触させると、染色体アームの交換が起こる。
【００３５】
（リコンビナーゼと組み換え部位）
本方法は、真核細胞において、安定な核酸の組み込み又は他の転位（rearrangement ）を達成するために、リコンビナーゼのシステムを使用する。リコンビナーゼのシステムは典型的には３つの要素から成り、その要素は２つの特異的なDNA 配列（「組み換え部位」）及び特異的な酵素（「リコンビナーゼ」）である。リコンビナーゼは、特異的な組み換え部位の間の組み換え反応を触媒する。
【００３６】
組み換え部位は方向性を有している。言い換えれば、それらは回文（バリンドローム）ではない。相互の関連性における組み換え部位の方向性により、どの様な組み換えイベントが起こるか決定される。組み換え部位は、平行（同じ方向性）または反対という、２つの方向性をとることが可能である。組み換え部位が単一の核酸分子上に存在し、そして相互に平行な方向性であるときには、その際にリコンビナーゼにより触媒される典型的な組み換えイベントは、仲介している核酸の切り出して単一の組み換え部位を離すことである。組み換え部位が反対の方向性にあるときには、その際には任意の仲介配列が逆位（inverted）となるのが典型的である。
【００３７】
本発明の方法において使用されるリコンビナーゼは、第一の組み換え部位と第二の組み換え部位の間の部位特異的な組み換えを仲介することができ、その第二の組み換え部位は第一の組み換え部位と共に組み換えのための基質として働くことができる。しかしながら、正常には真核細胞に存在しない、付加的因子の非存在下では、第一の組み換え部位と第二の組み換え部位の間の組み換えにより形成される、二つのハイブリッド組み換え部位の間の組み換えを仲介することができない。これらのリコンビナーゼの例には、例えば、バクテリオファージΦC31 インテグラーゼ（例えばThorpe & Smith (1998) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:5505-5510 ; Kuhstoss & Rao (1991) J.Mol.Biol.222:897-890 ;米国特許番号5,190,871 を見よ）、ファージP4リコンビナーゼ（Ow & Ausubel (1983) J.Bacteriol.155:704-713 ）、リステリアファージリコンビナーゼ、バクテリオファージR4 Sreリコンビナーゼ(Matsuura et al. (1996) J.Bacteriol.178:3374-3376)、CisAリコンビナーゼ(Sato et al.(1990) J.Bacteriol.172:1092-1098 ; Stragier et al.(1989) Science 243:507-512) 、XisFリコンビナーゼ(Carrasco et al.(1994)Genes Dev.8:74-83)、トランスポゾンTn4451 TnpX リコンビナーゼ(Bannam et al.(1995) Mol.Microbiol. 16:535-551 ; Crelin & Rood (1997) J.Bacteriol.179:5148-5156)が含まれる。
【００３８】
リコンビナーゼポリペプチド、及びそのリコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸は本技術分野において述べられており、日常的な方法を用いて得ることが可能である。例えば、ΦC31 インテグラーゼをコードする核酸フラグメントを含むベクターは米国特許番号5,190,871 の中に述べられており、B-18477 というアクセッション番号の下でノザンレジョナル リサーチラボラトリー（ぺオリア、イリノイ 61604）から入手可能である。
【００３９】
任意の適切な方法により、組み換えを望む場所において、組み換え部位を含む真核細胞へリコンビナーゼを導入することができる。例えばリコンビナーゼをポリペプチドの形で、例えばマイクロインジェクション又は他の方法によって導入することができる。しかしながら、現在において好ましい態様においては、リコンビナーゼをコードする遺伝子が細胞に導入される。遺伝子の発現はリコンビナーゼが作られるという結果となり、そのリコンビナーゼは対応する組み換え部位の間の組み換えを触媒する。興味の対象である外来性のポリヌクレオチドを導入する前、後、又はそれと同時に、リコンビナーゼ遺伝子を細胞中に導入することができる。一つの態様において、リコンビナーゼ遺伝子は挿入されるべきポリヌクレオチドを運搬するベクター中に存在し、そのリコンビナーゼ遺伝子はポリヌクレオチド中に含まれることさえも可能である。他の態様においては、リコンビナーゼ遺伝子は、形質転換した植物、動物、カビ又はその類似物の様な形質転換した真核生物中へ導入され、その後にそれらは対応する組み換え部位を含む生物と掛け合わされる。
【００４０】
（標的生物）
本発明の方法は、任意の型の真核細胞において、DNA の安定した組み込み及び／又は転位（rearrangement ）を得るために有用である。例えば、本方法は動物、植物、カビ、細菌、及び他の微生物の細胞において有用である。いくつかの態様において、その細胞は多細胞生物、例えば形質転換植物又は動物等の一部分である。本発明の方法は、形質転換したコムギ、トウモロコシ、及び動物の様な、形質転換した材料を得ることが困難である状況において特に有用である。これらの状況において、まれにしかない単一コピー挿入物を見出すには、独立して得られた多数の形質転換したクローンを前もって得ることが必要となるが、それはそれ自身非常に多くの労力を払う必要がある。
【００４１】
特に興味が持たれる植物標的には単子葉植物があり、その中には、例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オオムギ、バナナ、ヤシ、ユリ、ラン及びスゲが含まれる。双子葉植物もまた適切な標的であり、例えば、タバコ、リンゴ、ジャガイモ、テンサイ、ニンジン、ヤナギ、ニレ、カエデ、バラ、キンポウゲ、ペチュニア、フロックス、スミレ及びヒマワリが含まれる。他の標的には、動物及びカビ細胞が含まれる。これらのリストは単に説明するためのものであり、限定するものではない。
【００４２】
（標的細胞内へ外来DNA を導入するためのコンストラクト）
本発明の方法は、標的細胞内へ外来DNA を導入することをしばしば含む。例えば、一つ又はそれ以上の組み換え部位を含む核酸が細胞中へしばしば導入される。細胞内へ導入されるべきポリヌクレオチドコンストラクトは、一つ又は複数の組み換え部位に加えて、望まれる形質型を細胞に与えるであろう遺伝子又は機能的な配列を含むことができる。
【００４３】
いくつかの態様において、組み換え部位に加えて、リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドコンストラクトが真核細胞内へ導入される。リコンビナーゼをコードしているポリペプチドは、一つ又は複数の組み換え部位として同一の核酸上に含まれることが可能であり、また別個の核酸として細胞内へ導入されることも可能である。本発明は組み換え部位を含む核酸のみならず、その核酸内においてリコンビナーゼをコードしているポリヌクレオチド配列が標的真核細胞内において機能しているプロモーターに作用可能に結合している核酸もまた提供する。
【００４４】
一般的には、発現するべきポリヌクレオチド（例えばリコンビナーゼをコードしているポリヌクレオチド又は興味の対象であるトランスジーン）は発現カセットに存在しているであろうし、それはそのポリヌクレオチドが発現制御シグナルに作用可能に結合していることを意味しており、その発現制御シグナルは、例えばプロモーターやターミネーターであって興味の対象である宿主細胞において機能を有する。リコンビナーゼ及び選択可能なマーカーをコードする遺伝子もまた、宿主細胞内において機能するその様なシグナルの制御下にあるであろう。発現の制御はプロモーターの選択によって最も容易に達成される。転写ターミネーターは一般的には重要でなく、細胞によって認識される限り種々の既知の因子を使用することができる。
【００４５】
研究がなされている遺伝子からプロモーターを得ることが可能であり、または異なった遺伝子または異なった種から得られた異種プロモーターであることも可能である。形質転換植物又は他の生物の全ての組織において遺伝子の直接的な発現が望まれる場合には、「構成的な」プロモーターを使用することが可能であり、「構成的な」プロモーターは多くの環境条件や発達又は細胞分化の状況において一般的に活性である。
【００４６】
植物において使用するために適切な構成的なプロモーターには、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35S 転写開始領域及び領域VIプロモーター、アグロバクテリウムツメファシエンスのT-DNA から得られた1'- 又は2'- プロモーター、及び本技術分野の当業者に知られている植物細胞中で活性である他のプロモーターが含まれる。他の適切なプロモーターには、フィグウオート（Figwort ）モザイクウイルス由来の全長の転写プロモーター、アクチンプロモーター、ヒストンプロモーター、チュブリンプロモーター、又はマンノピン合成酵素プロモーター（MAS ）が含まれる。
【００４７】
他の構成的な植物プロモーターには、とりわけシロイヌナズナ（Sun and Callis, Plant J.,11(5):1017-1027(1997)）より得られた、種々のユビキチン又はポリユビキチンプロモーター、マス（mas ）、マック（Mac ）又はダブルマック（DoubleMac ）プロモーター（米国特許番号5,106,739 、及びComai et al によってPlant Mol.Biol.15:373-381 (1990)において述べられている）、及び本技術分野の当業者に知られている、種々の植物遺伝子に由来する他の転写開始領域が含まれる。その様な遺伝子には、例えば、シロイヌナズナ由来のACT11 （Huang et al.,Plant Mol.Biol.33:125-139(1996)）、シロイヌナズナ由来のCat3（（GenBank No.U43147,Zhong et al.,Mol.Gen.Genet.251:196-203(1996)）、セイヨウアブラナ（Brassica napus）由来のステアロイルアシルキャリア蛋白質不飽和化酵素をコードしている遺伝子（GenBank No.X74782,Solocombe et al.,Plant Physiol.104:1167-1176(1997)）、トウモロコシ由来のGPc1（GenBank No.X15596 Martinez et al.,J.Mol.Biol 208:551-565(1989)）、及びトウモロコシ由来のGpc2（GenBank No.U45855,Manjunath et al.,Plant Mol.Biol.33:97-112(1997) ）が含まれる。
【００４８】
植物のための有用なプロモーターには、Ti- 又はRi- プラスミドから、植物細胞から得られたプロモーター、プロモーターが植物中において機能を有することが見出されているときには植物ウイルス又は他の宿主が含まれる。植物中で機能し、そしてそのため本発明の方法において使用するのに適切である細菌プロモーターには、オクトピン合成酵素プロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター、マノピン（manopine）合成酵素プロモーターが含まれる。適切な内在性植物プロモーターには、リブロース-1,6- ビスホスファターゼ（RUBP）、カルボキシラーゼスモールサブユニット（ssu ）プロモーター、α- コングリチニン（conglycinin ）プロモーター、ファゼオリン（phaseolin ）プロモーター、ADH プロモーター、及び熱ショックプロモーターが含まれる。
【００４９】
大腸菌において使用するためのプロモーターには、T7、trp 、又はラムダプロモーター、リボソーム結合部位を含み、及び好ましくは転写終結シグナルである。真核細胞のためには、制御配列は典型的にはプロモーターを含み、そのプロモーターは随意にイムノグロブリン遺伝子、SV40、サイトメガロウイルス等に由来するエンハンサー及びポリアデニレーション配列を含み、そしてスプライスドナー及びアクセプター配列を含むこともできる。酵母において、便利なプロモーターにはGAL1-10 （Johnson and Davies (1984) Mol.Cell.Biol.4:1440-1448 ）、ADH2（Russell et al.(1983) J.Biol.Chem.258:2674-2682）、PHO5（EMBO J.(1982) 6:675-680 ）及びMFα（Herskowitz and Oshima (1982) The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces （酵母サッカロミセスの分子生物学）（eds.Strathem,Jones, and Broach）Cold Spring Harbor Lab.,Cold Spring Haror,N.Y.,PP181-209の中において）が含まれる。
【００５０】
代わりに、興味の対象である遺伝子の特異的な組織における発現を標的としたプロモーター、又はさもなければより厳密な環境又は発達による制御の下にあるプロモーターを使用することが可能である。その様なプロモーターをここでは、「誘導可能な」又は「抑制可能な」プロモーターと称する。誘導可能なプロモーターの転写によって転写に影響するかもしれない環境条件の例には、病原体の攻撃、嫌気性の条件、エチレン、又は光の存在が含まれる。発達による制御下にあるプロモーターには、葉、根、果実、種、又は花の様な特定の組織においてのみ転写を開始するプロモーターが含まれる。プロモーターの操作はゲノム中のそれの位置によってもまた変化する可能性がある。そこで、誘導可能なプロモーターはある位置において完全に又は部分的に構成的となることがある。誘導可能なプロモーターは、リコンビナーゼ遺伝子の発現を制御するためにしばしば使用され、そこで組み換え反応のタイミングを制御することが可能となる。
【００５１】
発達による制御の下にある組織特異的な植物プロモーターの例には、果実、種、花の様な特定の組織においてのみ転写を開始するプロモーターが含まれる。トマト由来の組織特異的なE8プロモーターは遺伝子発現を方向付けるために特に有用であり、そのために望まれる遺伝子発現産物は果実の中に位置する。例えば、Lincoln et al.(1988) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:2793-2797; Deikman et al.(1988) EMBO J.7:3315-3320; Deikman et al.(1992) Plant Physiol.100:2013-2017 を見よ。他の適切なプロモーターには胚の貯蔵蛋白質をコードしている遺伝子が含まれる。
【００５２】
誘導可能なプロモーターによる転写に影響するかもしれな環境条件の例には、嫌気的な条件、上昇した温度、又は光の存在が含まれる。更なる器官特異的、組織特異的、及び／又は誘導可能な外来のプロモーターもまた知られており（例えば、Kuhlemeier et al (1987) Ann.Rev.Plant Physiol.38:221において引用された参考文献を見よ）、それには、光誘導性であって光合成を行う組織においてのみ活性である、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の1,5-リブロースビスホスフェイトカルボキシラーゼ スモールサブユニット遺伝子類（"ssu" プロモーター）プロモーター、葯特異的なプロモーター（EP 344029 ）、及び例えばシロイヌナズナ由来の（Arabidopsis thaliana）種子特異的なプロモーター（Krebbers et al.(1988) Plant Physiol.87:859）が含まれる。見本となる緑色組織特異的なプロモーターにはトウモロコシのホスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（PEPC）プロモーター、スモールサブユニットリブロース ビスカルボキシラーゼプロモーター（ssRUBISCO ）及びクロロフィルa/b 結合蛋白質プロモーターが含まれる。プロモーターは、国際公開番号WO93/07278の中で述べられた通りの、植物TrpA遺伝子から単離されたプロモーターの様な樹心（pith）特異的なプロモーターであることもできる。
【００５３】
他の生物のための誘導可能なプロモーターには、例えば、アラビノースプロモーアー、lacZプロモーター、メタロチオネインプロモーター、及び熱ショックプロモーターのみならず、本技術分野の当業者に知られている他の多くのものが含まれる。S.pombe の様な酵母において有用な抑制可能なプロモーターは、ビタミンB1によって抑制可能なPmntプロモーターである。
【００５４】
典型的には、これらの細胞へ導入されるコンストラクトは組み換え発現技術を用いて調製される。組み換え発現技術は、組み換えた核酸の構築と感染した細胞内での遺伝子の発現を伴う。これらの末端に到達するための分子クローニング技術は本技術分野において知られている。組み換え核酸の構築に適する広範囲のクローニングとインビトロ増幅の方法は本技術部分野の当業者に良く知られている。これらの技術の例と、多くのクローニング演習を通じて当業者を教示するのに十分である指示は、Berger and Kimmel,Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology（分子クローニング技術への案内 酵素学における方法論）, volume 152, Academic Press, Inc.,San Diego,CA (Berger); 及びCurrent Protocols in Molecular Biology（分子生物学における現在のプロトコール） ,F.M. Ausubel et al., eds.,Current Protocols （現在のプロトコール）,a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons,Inc.,(1998 Supplement) (Ausubel) の中に見出される。
【００５５】
ポリヌクレオチドコンストラクトの構築には、細菌内で複製可能なベクターを使用することが通常必要となる。細菌からプラスミドを精製するために使用することができるキットは有り余る程市販されている。それらを適切に使用するために製造者の指示に従うこと（例えば、EasyPrepJ,FlexiPrepJ：両者はファルマシアバイオテック由来、StrataCleanJ：ストラタジーン由来、及びQIAexpress Expression System：キアゲン、を見よ）。単離されて精製されたプラスミドを更に操作して他のプラスミドを作製することも可能であり、細胞をトランスフェクトするか、又はアグロバクテリウムツメファシエンスへ導入して感染させて、植物を形質転換するのに使用される。アグロバクテリウムが形質転換の手段である場合にはシャトルベクターが構築される。ストレプトマイセス又はバシラスにおけるクローニングもまた可能である。
【００５６】
標的細胞中へ取り込まれるために使用されるポリヌクレオチドコンストラクト及び／又はベクター中へ、選択可能なマーカーがしばしば導入される。これらのマーカーによって、興味の対象であるポリヌクレオチドを含んでいる細胞のコロニーを選択することができる。ベクターは、例えば大腸菌又は他の細胞中で機能する選択マーカーをしばしば有するであろうし、標的細胞へ導入される前にその細胞中でベクターは複製される。大腸菌内で選択可能なマーカーの例には、例えばアンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、エリスロマイシンなどの抗生物質に対する耐性を特定している遺伝子、又はβ−ガラクトシダーゼの様な他の型の選択可能な酵素活性を与える遺伝子、又はラクトースオペロンが含まれる。哺乳細胞において使用するのに適している選択可能なマーカーには、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）、シミジンキナーゼ遺伝子（TK）、又は薬剤耐性を特定している原核細胞の遺伝子が含まれ、薬剤耐性を特定している原核細胞の遺伝子には、ミコフェノール酸（mycophenolic acid ）で選択することができるgpt （キサンチン−グアニン ホスフォリボシルトランスフェラーゼ）; G418、ハイグロマイシン又はピュロマイシンで選択することができるneo （ネオマイシンホスフォトランスフェラーゼ）; 及びメトトレキサートで選択することができるDHFR（ジヒドロ葉酸還元酵素）（Mulligan & Berg (1981) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072;Southern & Berg (1982) J.Mol.Appl.Genet.1:327）がある。
【００５７】
植物細胞のための選択マーカーはしばしば、例えば、カナマイシン、G418、ブレオマイシン、ハイグロマイシン又はクロラムフェニコールの様な殺生剤又は抗生物質に対する耐性、又はクロロスルフロン（chlorsulfuron ）又はバスタ（Basta ）の様な除草剤に対する耐性を与える。選択可能なマーカーのための適切なコード配列の例には、抗生物質カナマイシンに対する耐性を与えるネオマイシンホスフォトランスフェラーゼ酵素をコードするneo 遺伝子（Beck et al (1982)Gene 19:327 ）、ハイグロマイシンホスフォトランスフェラーゼ酵素をコードして抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を与えるhyg (hpt) 遺伝子（Gritz and Davies (1983) Gene 25:179 ）、及び除草剤物質であるホスフィノスリチン（phosphinothricin）及びビアラフォス（bialaphos ）に対する耐性をあたえるホスフィノスリチンアセチルトランスフェラーゼをコードするbar 遺伝子（EP 242236 ）がある。
【００５８】
もし一つ以上の外来遺伝子を標的とする真核細胞に導入するならば、通常は、各々の外来性の核酸について異なった選択可能なマーカーを使用することが望ましい。これにより、望まれる外来性の核酸の両者を含む細胞について同時に選択することができるようになる。
【００５９】
（標的細胞へコンストラクトを導入するための方法）
組み換え部位及び／又はリコンビナーゼをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドコンストラクトを、標的細胞及び／又は生物へ、当業者に知られているいくつかの手段のいずれかを用いて導入することができる。例えば、植物の培養中又は器官中のいずれかで、種々の通常の技術によって、DNA コンストラクトを植物細胞中へ導入することができる。例えば、DNA パーティクルボンバートメントの様なバイオリスティックな方法を用いてDNA コンストラクトを植物細胞へ直接に導入することが可能であり、又は植物細胞プロトプラストの電気穿孔法及びマイクロインジェクションの様な技術を用いてDNA コンストラクトを導入することが可能である。パーティクルにより仲介された形質転換技術（「バイオリスティック」としても知られている）は、Klein et al.,Nature,327:70-73 (1987); Vasil,V.et al.,Bio/Technol.11:1553-1558 (1993)及びBecker,D.et al.,Plant J.,5:299-307 (1994) において述べられている。これらの方法は、微小ビーズ又はパーティクルの基質の中又はその表面上のいずれかにおいて核酸を有する小さなパーティクルにより細胞を穿孔することを伴う。
【００６０】
バイオリスティックなSDS-1000遺伝子銃（バイオラッド、ヘラキュレス、CA）は、DNA を被覆した金又はタングステンの微小担体を標的細胞へ加速するためにヘリウムガスの圧力を使用する。その過程は広範囲の生物由来の組織及び細胞に適用可能であり、その生物には植物、細菌、カビ、藻、無傷動物組織、組織培養細胞及び動物胚が含まれる。電気パルス送達を用いることも可能であり、それは動物及び患者の生組織のための、本質的に緩和な電気穿孔の型である。Zhao,Advanced Drug Derivery Reviews （進歩した薬物送達の総論）17:257-262 (1995)。
【００６１】
他の形質転換方法が当業者に知られている。マイクロインジェクションの技術が本技術分野において知られ、科学及び特許文献において良く述べられている。ポリエチレングリコール（PEG ）沈殿を用いたDNA コンストラクトの導入は、Paszkowski et al.,EMBO J.3:2717 (1984)において述べられている。電気穿孔技術は、Fromm et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:5824 (1985)において述べられている。PEG により仲介された植物プロトプラストの形質転換及び電気穿孔もまた、Lazzeri,P.,Methods Mol.Biol.49:95-106 (1995)において議論されている。異種遺伝子の導入及び発現のための方法は単子葉及び双子葉植物の両者において知られている。米国特許番号5,633,446, 5,317,096, 5,689,052, 5,159,135及び5,679,558; Weising et al.(1988) Ann.Rev.Genet.22:421- 477 を見よ。単子葉植物の形質転換には特に種々の技術を使用することが可能であり、それには電気穿孔法（例えばShimamoto et al.,Nature (1992),338:274-276）、バイオリスティック（例えば欧州特許出願 270,356）、及びアグロバクテリウム（例えば、Bytebier et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1987) 84:5345-5349）が含まれる。
【００６２】
植物の形質転換のために、DNA コンストラクトを適切なT-DNA フランキング領域と結合させて、一般的なアグロバクテリウムツメファシエンス宿主ベクターへ導入することができる。アグロバクテリウムツメファシエンス宿主の毒性機能により、細胞が細菌によって感染した時に、トランスジーン及び隣接したマーカー遺伝子（もし存在しているならば）が植物細胞DNA へ挿入される。アグロバクテリウムツメファシエンスにより仲介された形質転換技術は、科学文献において良く述べられている。例えば、Horsch et al.Science,233:496 (1984), Fraley et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:4803 (1983)及びHooykaas,Plant Mol.Biol.,13:327-336 (1989), Bechtold et al.,Comptes Rendus De L Academie Des Sciences Serie Iii-Sciences De La Vie-Life Sciences,316:1194-1199 (1993), Valvekens et al.,Proc.Natl.Acad.SCI.USA,85:5536-5540 (1988)を見よ。植物及び細胞培養物の遺伝子移送方法の総論としては、Fisk et al.,Scientia Horticulturae 55:5-36 (1993) 及びPotrykus,CIBA Found.Symp.154:198 (1990) を見よ。
【００６３】
ポリヌクレオチド配列を細胞内へ送達するための他の方法には、例えば、リポソームに基づいた遺伝子送達（Debs and Zhu (1993) WO93/24640; Mannino andGould-Fogerite (1988) BioTechniques 6(7); Rose米国特許番号5,279,833; Brigham (1991) WO91/06309; 及びFelgner et al.(1987) Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:7413-7414）のみならず、ウイルスベクターの使用、（例えば、アデノウイルス（総論のために、Berns et al.(1995) Ann.NY Acad.Sci.772:95-104; Ali etal.(1994) Gene Ther.1:367-384;及びHaddada et al.(1995) Curr.Top.Microbiol.Immunol.199 (Pt3):297-306 を見よ）、パピローマ(papilloma) ウイルス、レトロウイルス（例えば、Buchscher et al.(1992) J.Virol.66(5) 2731-2739; Johann et al.(1992) J.Virol.66(5):1635-1640; Sommerfelt et al.,(1990) Virol.176:58-59; Wilson et al.(1989)）J.Virol.63:2374-2378; Miller et al.,J.Virol.65:2220-2224 (1991); Wong-Staal et al.,PCT/US94/05700,及びRosenburg and Fauci (1993) in Fundamental Immunology（基本的免疫学）,Third Edition Paul (ed) Raven Press,Ltd.,New York及びその中の引用文献、及びYu et al.,Gene Therapy (1994) supra を見よ）、及びアデノ関連ウイルスベクター（West et al.(1987) Virology 160:38-47; Canter et al.(1989) 米国特許番号4,797,368; Canter et al.WO93/24641 (1993); Kotin (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Muzyczka (1994) J.Clin.Invst.94:1351及びSamulski(supra) をAAVベクターの概観のために見よ。また、Lebkowski,米国特許番号5,173,414; Tratschin et al.(1985) Mol.Cell.Biol.,5(11):3251-3260; Tratschin et al.(1984) Mol.Cell.Biol.,4:2072-2081; Hermonat and Muzyczka (1984) Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6466-6470; McLaughlin et al.(1988)及びSamulski et al. (1989) J.Virol.,63:03822-3828 もまた見よ）及びそれに類似なものが含まれる。
【００６４】
導入された外来DNA が組み込まれたパターンを解析することができる方法は、当業者に良く知られている。例えば形質転換した細胞からDNA を抽出し、一つ又はそれ以上の制限酵素によってそのDNA を消化し、そしてポリヌクレオチドコンストラクトのラベル化された断片をハイブリダイズさせることができる。挿入された配列をポリメラーゼ連鎖反応（PCR ）を用いて同定することもまた可能である。例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning - A Laboratory Manual （分子クローニング、実験室マニュアル）, Cold Spring Harbor Laboratory, ColdSpring Harbor, New York,1989を、これら及び他の適切な方法の記載のために見よ。
【００６５】
（形質転換植物及び動物の再生）
本発明の方法は、安定して組み込まれた外来性ポリヌクレオチド又は他の細胞内核酸の安定な転位（rearrangement ）を有する、形質転換したキメラ型の多細胞生物を得るために特に有用である。形質転換したキメラ型の生物を得るための方法は、植物と動物の両者について当業者に良く知られている。
【００６６】
上記のいずれかの形質転換技術によって得られた形質転換した植物細胞は培養され、形質転換した遺伝子型及びそのために望みの表現型を有している完全な植物が再生される。その様な再生技術は組織培養成長培地の中の特定の植物ホルモンの取り扱いに依り、典型的には望みの核酸配列と共に導入された殺生剤及び／又は除草剤マーカーに依る。培養されたプロトプラストからの植物再生は、Evans et al.,Protoplast Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture （プロトプラストの単離及び培養、植物細胞培養のハンドブック）,pp.124-176, Macmillian Publishing Company, New York (1983);及びその結びつきで、Regeneration of Plants, Plant Protoplast（植物、植物プロトプラストの再生）,pp.21-73,CRC Press, Boca Raton,(1985)において述べられている。植物カルス、外植片、体細胞胚（Dandekar et al.,J.Tissue Cult.Meth.,12:145 (1989); MacGranahan et al.,Plant Cell Rep.,8:512 (1990)）、器官、又はその一部分からもまた再生することができる。その様な再生技術は一般的にKlee et al.,Ann.Rev.of Plant Phys.,38:467-486 (1987)において述べられている。
【００６７】
その方法は大部分の脊椎動物種の形質転換したキメラ型の動物を作製するのに有用である。その様な種には、それに限定されるものではないが、ネズミ及びラットの様なゲッシ類、ウサギ、ヒツジやヤギの様なヒツジ類（ovines）、ブタの様なブタ類（porcines）、ウシ（cattle）やバッファローの様なウシ類（bovine）を含む、非ヒト哺乳類が含まれる。形質転換動物を得る為の方法は、例えば、Puhler,A.,Ed.,Genetic Engineering of Animals（動物の遺伝工学）VCH Publ.,1993; Murphy and Carter, Eds.,Transgenesis Techniques:Principles and Protocols（形質転換技術：原理とプロトコール）（Methods in Molecular Biology, Vol.18）,1993;及びPinkert,CA,Ed.,Transgenic Animal Technology:A Laboratory Handbook （形質転換動物の技術工学：実験室ハンドブック）,Academic Press,1994において述べられている。特異的な遺伝的修飾を有している形質転換魚類もまた、クレイムされた方法を用いて作製することができる。形質転換魚類を作製するための一般的な方法のためには、例えば、Iyengar et al.(1996) Transgenic Res.5:147-166 を見よ。
【００６８】
そのゲノム中に特異的な修飾を有している、形質転換した又はキメラ型の動物を得る一つの方法は、受精した卵母細胞を興味の対象であるポリヌクレオチドを組み換え部位に隣接して含んでいるベクターと接触させることである。ネズミの様ないくつかの動物についてインビボで受精が行われ、受精した卵子は手術により移された。他の動物、特にウシおいては、生きた又は屠殺された動物から卵子を移して来て、そしてその卵子をインビトロで受精させることは好ましい。DeBoer et al.,WO91/08216を見よ。インビトロで受精させることにより、実質的に同調した細胞に導入すべき修飾を行うことができる。そして、着床前の胚が約16-150個の細胞を含むようになるまで受精した卵母細胞をインビトロで培養した。16-32 細胞期の胚は桑実胚として述べられている。32細胞以上を含んでいる着床前の胚を胞胚と称する。これらの胚は、典型的には64細胞期において胞胚腔の空洞（cavity）の発達を示した。もし望むならば、胚細胞の中における望みの外来性ポリヌクレオチドの存在を当業者に知られている方法によって検出することができる。
【００６９】
受精した卵母細胞を着床前の段階まで培養するための方法は、Gordon et al.(1984) Methods Enzymol.101:414; Hogan et al. Manipulation of the Mouse Embryo:A Laboartory Manual（マウス胚の操作：実験室マニュアル）C.S.H.L. N.Y.(1986) （マウス胚）; Hammer et al.(1985) Nature 315:680（ウサギ及びブタ胚）;Gandolfi et al.(1987) J.Reprod.Fert.81:23-28;Rexroad et al.(1988) J.Anim.Sci.66:947-953（ヒツジ胚）及びEyestone et al.(1989) J.Reprod.Fert.85:715-720; Camous et al.(1984) J.Reprod.Fert.72:779-785及びHeyman et al.(1987) Theriogenology 27:5968（ウシ胚）において述べられている。時々、着床を待つ間の期間着床前の胚を凍結して保存した。着床前の胚を適切なメスに移植し、その結果、トランスジーンが組み込まれたときの発達の段階に依って、形質転換した又はキメラ型の動物が誕生するという結果となった。正しい生殖系列の形質転換動物を形成するために、キメラ型の哺乳動物を繁殖させることができる。
【００７０】
替わりに本方法を用いて、望みの外来性ポリヌクレオチドの単一コピーを有する胚幹細胞（ES）を得ることができる。これらの細胞は、インビトロで培養された着床前の胚から得られた。例えば、Hooper,ML,Embryonal Stem Cells:Introducing Planned Changes into the Animal Germline （胚性幹細胞；計画された変化の動物生殖系列への導入）(Modern Genetics,v.1) Int'1.Pub.Distrib.,Inc.,1993; Bradley et al.(1984) Nature 309,255-258 を見よ。形質転換したES細胞を非ヒト動物由来の胞胚と結合させた。ES細胞は胚をコロナイズし、いくつかの胚においては得られたキメラ動物の生殖系列を形成する。Jaenisch,Science,240:1468-1474 (1988) を見よ。代わりに、生物を再構成することができるES細胞又は体細胞（”体細胞再集団細胞：somatic repopulating cells”）を、形質転換した哺乳動物を生み出す、除核された受精卵母細胞へ着床させるための核の起源として使用することができる。例えば、Wilmut et al.(1997) Nature 385:810-813を見よ。
【００７１】
（実施例）
下記の実施例は説明の目的で与えられたものであって本発明を限定するものではない。
【００７２】
（実施例１）
（シゾサッカロミセス・ボンベ（Schizosaccharomyces pombe ）におけるΦC31組み換えシステム）
この実施例は、ストレプトミセスバクテリオファージΦC31 部位特異的な組み換えシステムが、真核細胞において機能することを示している。S.Pombe のleu1遺伝子座において、バクテリオファージ接着部位（attP）をシゾサッカロミセス・ボンベの染色体において導入した。続いてこの標的株を、ura4＋選択可能なマーカーと連結した細菌接着部位（attB）を含むプラスミドにより形質転換された。ΦC31 インテグラーゼ遺伝子を有している第二のプラスミドによって共トランスフェクトしたとき、インテグラーゼ遺伝子が発現している条件下で、Ura＋へ高い効率で形質転換していることが観察された。
【００７３】
組み換えイベントのサザン解析により、leu1遺伝子座のattPへ、attB-ura4＋プラスミドが挿入されていることが示された。ハイブリッドジャンクジョンのヌクレオチド配列により、attB x attP 組み換え反応は正確であることが明らかとなった。
【００７４】
（材料及び方法）
（組み換えDNA ）
全体として標準的な方法が用いられた。大腸菌株XL2-Blue（recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F' proAB lAcIq Z △M15Tn10(Tetr) Amy Camr、ストラタジーン]がDNA コンストラクトとして働いた。
【００７５】
（培地）
分裂酵母株を、必要に応じて225mg/l のアデニン、ヒスチジン、ロイシン又はウラシルを添加した、最小培地（バイオ101 由来EMM-低グルコース）で生育させた。5-FOA （5-フロロオロチン酸、ザイモリサーチ社より）を含む最小プレートをGrimm ら（(1988) Mol.Gen.Genet.215:81-86）に従って調製し、アデニン、ヒスチジン及びロイシンを添加した。使用した時、5 μg/mlとなるようにチアミンを添加した。
【００７６】
（ΦC31 attP標的を有するS.prombe）
pHS282からApaI-SacI 断片として単離された（Thorpe & Smith (1998) Proc.NATL.Acad.Sci.USA 95:5505-5510 ）84塩基対のΦC31 attP部位（PP' と略称）を、S.prombe組み込みベクターpJK148の同じ部位にクローン化し（Keeney & Boeke (1994) Genetics 136:849-856）、pLT44 を作製した。NdeI切断DNA を用いた酢酸リチウムにより仲介された形質転換により、このプラスミドはS.prombe leu1-32アリールへ標的化された。pLT44 による相同組み換えによってLeu＋へ変換された、レシピエント宿主FY527(h-ade6-M216 his3-D1 leu1-32 ura4-D18) を、サザンブロットによって試験した。FY527attP と名付けられた一つのLeu＋型は単一コピーのpLT44 を含んでいることが見出された。FY527attPx2 と名付けられたもう一つの形質転換体は直列（tandem）のプラスミド挿入を有していた。
【００７７】
（ΦC31 attB部位を有する組み込み可能なura4＋ベクター）
1.8kb のEcoRI-BamHI 断片上でpTZura4 (S.Forsburg)から切り出した、S.prombeのura4＋遺伝子を、同じ酵素を用いて切断されたpJK へ挿入し、pLT40 を作製した。500bp のBamHI-XbaI断片としてpHS21 から単離されたΦC31 attB部位（BB'と略称）を、それらの酵素を用いて切断されたpLT40 へ連結してpLT42 を作製した。XhoI断片を削除することによりpLT42 からleu1遺伝子の大部分を除去し、pLT45 を作製した。これにより、pLT45 からleu1の全部であるが229bp が除去されて、その形質転換効率はleu1相同性を持たないプラスミドの形質転換効率まで低下した。ura4のすぐ反対側に同じ方向の第二でattB部位を有しているpLT50 が構築され、それは最初にpLT42 由来のattB BamHI-SacI 断片をpUC19 へサブクローニングし、それをEcoRI とSalII によって切り出し、続いてそれをEcoRI とXhoIによって切断したpLT45 へ挿入することにより構築された。最終構築物中の第二のattB部位を各鎖について一回配列決定し、最初のattB部位と同一であることが見出された。
【００７８】
（平滑DNA 形質転換）
attB-ura4＋-attB 平滑DNA は、pLT50 から精製されたattII-AlwNl 断片として、又はpLT50 を鋳型として用いたPCR 産物として調製された。T3プライマーとpJK148のプラスミド骨格に対応している第二のプライマー（5' ggc cct gaa att gtt gct tct gcc 3' ）を用いて、標準的な条件によりPCR は行われた。
【００７９】
（ΦC31 インテグラーゼの抑制的な合成）
ビタミンB1によって抑制される、S.prombe Pmntプロモーターは、pMO147から1.2kb のPstI-SacI 断片として切り出され、同じ酵素を用いて切断されたhis3＋,ars1 ベクターpBG2（Ohi et al.(1996)）Gene 174:315-318）へ挿入され、pLT41 が作製された。ΦC31 int コード領域を含んでいる2.0kb SacI断片を、pHS33（Thorpe & Smith (1998) supra ）からpLT41 のSacI部位へ移した。発現がPmntの制御下にある様にint コード領域が配向されたクローンを、pLT43 と名付けた。
【００８０】
（分子解析）
ベーリンガーマンハイムのGeniusTMシステムを用いてサザン解析を行った。leu1の998bp の内部EcoRV 断片、ura4の1.8kb 断片及び2.0kb のΦC31 int 遺伝子をランダムプライマー法によってジゴキシゲン標識し、プローブとして使用した。ストラタジーンTurbo PFU 酵素又はVENTポリメラーゼを用いて、パーキンエルマーCetus Gene Amp PCR 9600 で、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。可能なところでは標準的なT3及びT7プライマーを用いた。ura4プライマー（5' gtc aaa aag ttt cgt caa tat cac 3' ）（配列番号１）及びpJK148プライマーをオペロンテクノロジーから購入した。全てのPCR 反応において、51℃のアニーリニング温度と30秒の伸長時間が用いられた。
【００８１】
（結果と考察）
（S.prombeゲノムへの標的部位の挿入）
ΦC31 により仲介された組み込みのための標的部位を有する宿主株を作製するために、相同組み換えによって、ΦC31 attP部位を分裂酵母ゲノムのleu1遺伝子座へ挿入し、Leu＋株FY527 attPが形成された（図1 Ａ）。過去の研究により、S.prombeのDNA をXbaIによって開裂し、leu1＋遺伝子の内部の1kp 断片により検証したら、そのプローブにより14kbのバンドが検出されることが示されている（Keeney & Boeke (1994) Genetics 136:849-856）。leu＋プラスミドpJK148がleu1-32 遺伝子座において挿入されていると、3 と18kbのバンドが検出されるという結果となる（図1 Ａ）。84bpのΦC31 attP因子が封入されている点で、pLT44はpJK148から異なっているために、leu1-32 におけるpLT44 の組み込みは、FY527 attPにおいて、同様の3kb と18kbのハイブリダイゼーションパターンをもたらした。他のハイブリダイズしている断片が存在しないことは、単一に組み込まれたコピーとしてのpLT44 のDNA 残基を示している。
【００８２】
ΦＣ３１インテグラーゼ仲介形質転換
ｕｒａ４＋およびａｔｔＢ配列（ＢＢ’）を有するが、複製の原点を欠くＦＹ５２７ａｔｔＰをｐＬＴ４５で形質転換した。このコンストラクトを、それ自体により、またはΦＣ３１インテグラーゼを産生するｈｉｓ３＋複製ベクターｐＬＴ４３を用いて導入した。ｐＬＴ４３を封入することにより、Ｕｒａ＋形質転換体の数が平均で１５倍増加した（表１）。この効果はインテグラーゼ遺伝子発現によるものなので、この増加がｐＬＴ４５と複製にプロフィシエントな（replication-proficient）ｐＬＴ４３との間の組み換えに起因するものではありえない。インテグラーゼ遺伝子の転写は、高濃度のビタミンＢ１により抑制可能なプロモーターＰｍｎｔの支配を受ける（Ｍａｕｎｄｒｅｌｌ，Ｋ．（１９９３年）Ｇｅｎｅ １２３：１２７〜１３０頁）。抑制は完全ではないが（Ｆｏｒｓｂｕｒｇ，Ｓ．Ｌ．（１９９３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２１：２９５５〜２９５６頁）、インテグラーゼたん白の生成が減少する。発育培地にチアミンを加えた場合、Ｕｒａ＋形質転換体の数は背景レベル付近にまで減少した。培地からヒスチジンを省略することによりインテグラーゼプラスミドを共選択してもしなくても、Ｕｒａ＋形質転換体の頻度が顕著に変化することは無かった。ｐＬＴ４３またはその前駆体プラスミドｐＢＧ２を用いて得たＨｉｓ＋形質転換体の数から、ＦＹ５２７ａｔｔｔＰの形質転換能力を推定した。両方の複製プラスミドの頻度を比較したところ、ＦＹ５２７ａｔｔＰのｐＬＴ４３依存形質転換は平均で約１５％であった。
【００８３】
【表１】
【００８４】
ΦＣ３１インテグラーゼをプロモートしたａｔｔＰ ｘ ａｔｔＢ組み換え
ｐＬＴ４５をコードしたΦＣ３１ａｔｔＢエレメントと染色体的に位置の定まったａｔｔＰ配列との間の組み換えにより、図１Ｂに示すように、環状ＤＮＡがｌｅｕ１遺伝子座に組み込まれた。この反応が起きた場合、Ｕｒａ＋形質転換体から得たＸｂａＩ分別ゲノムのＤＮＡをｌｅｕ１ ＤＮＡでプローブすると、３ｋｂバンドは変わらないが、一方１８ｋｂバンドは約２３ｋｂまで増大する（図１Ｃ）。無作為に選択したＵｒａ＋コロニーをハイブリダイゼーション分析により検査した。チアミンの省略によりΦＣ３１インテグラーゼ遺伝子発現を抑制解除した場合の実験から得られた８つの分離株のうち７つが、この約２３ｋｂバンドの存在を示した。この同サイズバンドをｕｒａ４プローブにハイブリダイズした。ｕｒａ４−Ｄ１８欠損対立遺伝子から期待されるように、これは親株にｕｒａ４ハイブリダイゼーションしなかったものと対照的である。これら７つの分離株の一つが、両方のプローブにハイブリタイズする付加的なバンドを示した。部位に特異的な組み換え現象に加えて、この候補物質がｌｅｕ１遺伝子座にＤＮＡ再配列を有すると思われる。ｌｅｕ１再配列が、有効なＳ．ｐｏｍｂｅ相同体組み換え系によりおそらく触媒された。残る分離株は部位特異的組み換え現象を経験したことが無く、ｐＬＴ４５とｐＬＴ４３との間の組み換えにより、ウラシル原栄養株が増大したと思われた。これら８つの分離株のうち、半分をＵｒａ＋およびＨｉｓ＋の両方として選択したが、このグループとＵｒａ＋のみで選択したグループとの間に顕著な差は見られなかった。
【００８５】
ビタミンＢ１の存在下で行った形質転換実験から、ＤＮＡハイブリダイゼーションにより同数のＵｒａ＋形質転換体を調べた。チアミン抑制可能なＰｎｍｔプロモーターがインテグラーゼ産生を制限し、したがって部位特異的組込みを制限すると考えられる。この低頻度形質転換から分離された８つのＵｒａ＋候補物質のうちの２つにより、２３ｋｂバンドがｌｅｕ１およびｕｒａ４プローブにハイブリダイズしていることが示された。しかし、いずれのプローブも付加的バンドを検出したので、これらは正確な組込み現象を表しておらず、発明者らはこれらをクラスｂインテグラントとして分類した。他の６つの分離体では、ハイブリダイゼーションのパターンを翻訳することは困難である。これらのいくつかにおいて、遺伝子座は再配列を経験しているが、ｌｅｕ１プローブでは３ｋｂバンドを検出できなかった。これらの多くにおいて、ｕｒａ４に対するハイブリダイゼーションが弱いことから、Ｕｒａ＋表現型はゲノム中のｐＬＴ４５の安定な保守によるものではないであろう。
【００８６】
選択しない場合にインテグラーゼプラスミドを維持する形質転換体の比率を確実にするために、インテグラーゼ遺伝子配列でブロットを再プローブした。Ｕｒａ＋Ｈｉｓ＋として選択されたそれらはプラスミドを維持すると考えられており、かつハイブリダイゼーションが明らかになるにつれてそうなった。Ｈｉｓ表現型に関係なくＵｒａ＋として選択された８つの分離株のうちの５つは、インテグラーゼプローブにハイブリダイズするバンドも与えた。ｉｎｔの損失が安定な組込みに影響を及ぼすことを確認するため、無作為に選択したＵｒａ＋細胞の別の組を数世代にわたり非選択的に成長させ、ｐＬＴ４３を失ったＨｉｓ−子孫に対してスクリーニングをした。８つの代表的Ｕｒａ＋Ｈｉｓ−クローンの分析は、全てが正確に染色体が位置するａｔｔＰ部位に組込まれたｐＬＴ４５の単一コピーを有することを示した。これらの組込み体のＤＮＡはインテグラーゼプローブでハイブリダイズしなかった。対照的に、ｐＬＴ４５単体の形質転換により誘導された背景頻度Ｕｒａ＋クローンにより、ｌｅｕ１遺伝子座にハイブリダイジングバンドの親構造が得られ、かつ５ｋｂおよび７ｋｂに更なる微弱バンドが得られた。これらの知見は、ゲノムのどこかのｐＬＴ４５の組込みまたはＳ．ｐｏｍｂｅ複製原点の欠損にもかかわらずいくつかの細胞中のプラスミドの維持のいずれかと一致している。
【００８７】
保守的部位特異的組み換え
ＰＣＲを用いて、３つの代表的Ｕｒａ＋候補物質からａｔｔＰ／ａｔｔＢ組み換え接合部を回収した。ハイブリッド部位の一つでは、ａｔｔＲ（ＰＢ’）がＴ３およびＴ７プロモーターに隣接していた。他の部位では、ａｔｔＬ（ＢＰ’）がＴ３プロモーターおよびｕｒａ４ＤＮＡに隣接していた（図１Ｃ）。いずれの場合も、プライマー対が、期待される大きさのバンドを増幅したこれらの配列に向けられ、一方、本来のａｔｔＰ（ＰＰ’）はもはや見つからない。ａｔｔＰは検出されるがａｔｔＬおよびａｔｔＲのいずれもが検出されない場合には、これは親株ＦＹ５２７ａａｔＰと対照的である。３つの代表的ａｔｔＬおよびａｔｔＲ ＰＣＲ製品のヌクレオチド配列は、付随的な突然変異体が無いことを示した。したがって、バクテリアおよび哺乳動物細胞において、Ｓ．ｐｏｍｂｅ中のΦＣ３１仲介部位特異的組み換えは保守的組み換え反応である。
【００８８】
ΦＣ３１インテグラーゼは組込みした分子を除去しない。
ＴｈｏｒｐｅとＳｍｉｔｈ（（１９９８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：５５０５〜５５１０）は、ゲル分別ＤＮＡ断片の分析でΦＣ３１インテグラーゼ反応の反転を検出しなかった。発明者らは遺伝学的選択法により反転反応の可能性を調べた。ｐＬＴ４５のＦＹ５２７ａｔｔＰへの正確な組込みが、サザン分析により３つのクローンに対して確認された。次いで、これらの株をｐＬＴ４３で再転換した。ｐＬＴ４５を切り取ることにより、ｕｒａ４＋マーカーの欠損を招いた。Ｕｒａ−表現型を５−ＦＯＡを用いてプレート上に得点することができる（Ｇｒｉｍｍら、（１９８８年）Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．２１５：８１〜８６頁）。３つのＵｒａ＋Ｈｉｓ−前駆体の培養体から得たＵｒａ−分離個体の頻度は５．７×１０−４、７．１×１０−４および５．６×１０−４であった。対照的に、３つのＵｒａ＋Ｈｉｓ＋誘導体から得たＵｒａ−コロニーの頻度はある程度高く、１．１×１０−２、３．８×１０−３および２．３×１０−３であり、それぞれ１９、５および４倍増加した。インテグラーゼ遺伝子を有しない制御ベクターｐＢＧ２を代わりに用いて、５−ＦＯＡ耐性の速度が増大することも分かった。それぞれ１．０×１０−２、１．０×１０−２および８．０×１０−３であった。形質転換プロセス自体は変異原性を示す。
【００８９】
ｐＬＴ４５で形質転換された３つの培養体のそれぞれから得られた３つのＵｒａ−Ｈｉｓ＋クローンをサザンブロッティングにより分析した。１つの分離体が、ｐＬＴ４５のＦＹ５２７ａｔｔＰへの安定な組込みと一致するＤＮＡパターンを有していた。したがって、このクローンにおいて、Ｕｒａ−表現型は、部位特異的組み換え反応の反転によるよりも、むしろ制限パターンが感知可能なほどに変わっていない変異体により引き起こされた。第２クローンはｐＬＴ４５挿入欠損ＦＹ５２７ａｔｔＰのサザンパターン特徴を示し、第３クローンはｐＬＴ４５挿入の無いＦＹ５２７ａｔｔＰ等の細胞とＦＹ５２７ａｔｔＰ前駆体株ＦＹ５２７等の細胞の２つの型の細胞の混合物と一致するパターンを有していた。後者の構造は、ｐＬＴ４４の挿入を反転するｌｅｕ反復の間の染色体内相同組み換えから生じる場合がある（図１Ａ）。組込みしたプラスミドＤＮＡの正確な切り取りが前述の２つの候補物質に現れた場合、ａｔｔＰ部位が再生した。これはＰＣＲで検出可能であった。ＰＣＲ製品の大きさは、完全なハイブリッド部位に期待される大きさであり、ハイブリッド部位の存在はＰＣＲ製品を配列決定することにより確認された。これらの観察は、ｕｒａ４遺伝子の欠損がΦＣ３１仲介切り取り以外の機構により発生するという考えと一致している。
【００９０】
（まとめ）
単一目的部位での環状分子の組込みは、ほとんど全ての形質転換体の正確な挿入を得る効果的な方法であった。発明者らが観察したわずかの異常現象は、おそらくｌｅｕ１反復ＤＮＡに作用するＳ．ｐｏｍｂｅ組み換え系に主として起因する。インテグラーゼ産生がそのプロモーターの発現により制限されていた場合、形質転換体の数を背景レベル付近にまで減らした。この条件下で、ΦＣ３１部位特異的組み換えから誘導された修復形質転換体はほとんどなかった。真核細胞におけるΦＣ３１部位特異的組み換え系の機能的操作により、トランス遺伝子および染色体のマニピュレーションを行う新たな機会が与えられた。ΦＣ３１系をａｔｔＢおよびａｔｔＰ部位の選択的配置と共に用いて、ＤＮＡの削除、反転または挿入を行うことができる。この系の重要な特徴は、ａｔｔＢ×ａｔｔＰ反応が切り取り特異的タンパク質の不存在下で不可逆という点である。
【００９１】
（実施例２）
ΦＣ３１インテグラーゼはＣＨＯ細胞中で安定な組込みを作る役目をする。
この実施例では、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞におけるａｔｔＢ組み換え部位とａｔｔＰ組み換え部位との間の組み換えを仲介する能力に関してΦＣ３１インテグラーゼをテストする実験を説明する。
【００９２】
（方法）
ゼオシン耐性を与える選択マーカーを含んだＣＨＯ細胞株５１ＹＴ２１１をａｔｔＰ含有プラスミドｐＦＹ１で形質転換した（図２）。単一コロニーを２回精製した後、６つのゼオシン耐性細胞株を分離した。サザンＤＮＡハイブリダイゼーションによる分析により、６つの細胞株のそれぞれが、ゲノム内に組込みされたｐＦＹ１の少なくとも一分子を有することが確認された。
【００９３】
６つの細胞株のそれぞれをａｔｔＢ含有プラスミドｐＦＹ９およびｉｎｔ含有プラスミドｐＦＹ６でトランスフェクトし、ｐＦＹ９上のａｔｔＢ部位とｐＦＹ１の染色体コピー上のａｔｔＰ部位との間の部位特異的組み換えに対するテストを行った。コントロールとして、同じ細胞株をｐＦＹ９で形質転換したが、ｉｎｔ含有ｐＦＹ６は用いなかった。ｐＦＹ９プラスミドは、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下でネオマイシン耐性選択マーカーおよびプロモーターに結合していない緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードした配列を含んでいた。したがって、部位特異的組み換えが、ｐＦＹ１に含まれるヒト・サイトメガロウイルス・プロモーターの制御下でＧＦＰコード化配列を配置し、その結果ＧＦＰを発現することが予想された。
【００９４】
（結果）
トランスフェクションの結果：ネオマイシン耐性コロニーを顕微鏡下に置き、ＧＦＰ遺伝子の活性の有無を観察した。ｐＦＴ９＋ｐＦＹ６でトランスフェクションした細胞では大部分が、しかしｐＦＹ９のみでトランスフェクションした細胞ではごく僅かが、ＧＦＰ活性を示した。このことは、ｐＦＹ６でトランスフェクションした場合のｐＦＹ９の部位特異的組込みおよび共トランスフェクションｉｎｔ遺伝子の不存在下のｐＦＹ９の無作為挿入と一致する。
【００９５】
Ｐｃ（ヒト・サイトメガロウイルス・プロモーター）およびＧＦＰ（図２）に対応するプライマー対を用いてＰＣＲ分析を行った。これらのプライマーは、組込み接合に対応する約０．６ｋｂのバンドを増幅すると予想された。部位特異的組込みと無作為組込みの両者からネオマイシン耐性コロニーが生じる場合があり、かつＧＦＰマーカーは選択的形質を与えないので、構成クローンの純粋な培養株を得ることは困難であった。したがって、各トランスフェクション株から得たネオマイシン体制細胞のプールをＰＣＲ分析に供し、ネオマイシン耐性細胞間に組込み接合が存在するか否かを調査した。大きさが約０．６ｋｂと予想されるバンドを２つの株から得た。これは、ａｔｔＢ×ａｔｔＰ組み換え接合により、ＰｃとＧＦＰの結合が形成されることを示している。
【００９６】
（実施例３）
ΦＣ３１インテグラーゼはＣＨＯ細胞中で部位特異的組み換えを触媒する。
本実施例では、ΦＣ３１インテグラーゼをテストして、ａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部位との間の組み換えにより、ＤＮＡ分子をチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の染色体中に組込む能力を調べた。
【００９７】
（方法）
プラスミドコンストラクト
染色体ａｔｔＢ標的コンストラクトｐＦＹ１２、ｐＦＹ１４およびｐＦＹ１５
プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をベクターバックボーンとして用いた。長さの異なるａｔｔＢ部位を含有し、ＨｉｎｄＩＩＩ部位とＫｐｎＩ部位に隣接した合成オリゴヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ／ｌａｃＺのＨｉｎｄＩＩＩ （ＡＡＧＣＴＴ）部位とＫｐｎＩ （ＧＧＴＡＣＣ）部位との間に挿入した。
プラスミドｐＦＹ１２は９０ｂｐのａｔｔＢ 配列（ＡＡＧＣＴＴ ｇａｃｇｇｔｃｔｃｇ ａａｇｃｃｇｃｇｇｔ ｇｃｇｇｇｔｇｃｃａ ｇｇｇｃｇｔｇｃｃｃ ｔｔｇｇｇｃｔｃｃｃ ｃｇｇｇｃｇｃｇｔａ ｃｔｃｃａｃｃｔｃａ ｃｃｃａｔｃｔｇｇｔ ｃｃａｔｃａｔｇａｔ ＧＧＴＡＣＣ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を含有する。
プラスミドｐＦＹ１４は５０ ｂｐのａｔｔＢ部位（ＡＡＧＣＴＴ ｇｃｇｇｇｔｇｃｃａ ｇｇｇｃｇｔｇｃｃｃ ｔｔｇｇｇｃｔｃｃｃ ｃｇｇｇｃｇｃｇｔａ ｃｔｃｃａｃｃｔｃａ ＴＧＧＴＡＣＣ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を含有する。
プラスミドｐＦＹ１５は３０ ｂｐのａｔｔＢ（ＡＡＧＣＴＴ ｃｃａｇｇｇｃｇｔｇ ｃｃｃｔｔｇｇｇｃｔ ｃｃｃｃｇｇｇｃｇｃ ＡＴＧＧＴＡＣＣ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を含有する。
【００９８】
ａｔｔＰプラスミドｐＦＹ１７、ｐＦＹ１９、ｐＦＹ２０の組込み
ハイグロマイシンに対する耐性のためにコードし、ｐＥＤ１１３から得られた１．６ｋｂのＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ断片として得られたｈｐｔ遺伝子を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫのＢａｍＨＩとＫｐｎＩとの間に挿入してコントロールプラスミドｐＢＳＫ−ｈｐｔを作った。
【００９９】
長さの異なるａｔｔＰ部位を含有する合成オリゴヌクレオチドをｐＢＳＫ−ｈｐｔ中のＳａｃＩ（ＧＴＣＧＡＣ）部位とＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）部位との間に挿入し、 次のプラスミドを作った。
ａ）９０ｂｐのａｔｔＰ部位（ＧＡＧＣＴＣ−ｇａａｇｃｇｇｔｔｔ ｔｃｇｇｇａｇｔａｇｔｇｃｃｃｃａａｃｔ ｇｇｇｇｔａａｃｃｔ ｔｔｇａｇｔｔｃｔｃ ｔｃａｇｔｔｇｇｇｇ ｇｃｇｔａｇｇｇｔｃ ｇｃｃｇａｃａｔｇａ ｃａｃａａｇｇｇｇｔ−ＧＧＡＴＣＣ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を含有するプラスミドｐＦＹ１７。
ｂ）５０ｂｐのａｔｔＰ部位（ＧＡＧＣＴＣ−ｔｇｃｃｃｃａａｃｔ ｇｇｇｇｔａａｃｃｔ ｔｔｇａｇｔｔｃｔｃ ｔｃａｇｔｔｇｇｇｇ ｇｃｇｔａｇｇｇｔｃ−ＧＧＡＴＣＣ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）を含有するプラスミドｐＦＹ１９。
ｃ）３２ｂｐのａｔｔＰ部位（ＧＡＧＣＴＣ−ａｃｔｇｇｇｇｔａａ ｃｃｔｔｔｇａｇｔｔ ｃｔｃｔｃａｇｔｔｇ ｇｇＡＴＣＣ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７） を含有するプラスミドｐＦＹ２０。
【０１００】
インテグラーゼ発現構成ｐＦＹ６
インテグラーゼ遺伝子のほぼ完全なオープンリーディングフレームを含有するＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＥｃｏＲＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間に挿入した。次いで、Ｋｏｚａｃｋ配列およびインテグラーゼ遺伝子の配列をコードするＮ末端アミノ酸を含有する合成オリゴヌクレオチド（ＧＧＧＣＣＣＧＣＣＡＣＧＡＴＧＡＣＡＣＡＡＧＧＧＧＴＴＧＴＧＡＣＣＧＧＧＧＴＧＧＡＣＡＣＧＴＡＣＧＣＧＧＧＴＧＣＴＴＡＣＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＧＣＧＣＧＡＧＣＧＣＧＡＧＡＡＴＴＣ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）をＡｐａＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間に挿入して、オープンリーディングフレームを再構成した。この方向は、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（−）中でＣＭＶ（ヒト・サイトメガロウイルス）プロモーターの制御下で、完全なインテグラーゼコード化領域を配置する。
【０１０１】
トランスフェクション・プロトコール
ＣＨＯ細胞株Ｋ−１をａｔｔＢ標的コンストラクトｐＦＹ１２、ｐＦＹ１４またはｐＦＹ１５でトランスフェクションした（図３）。これらのプラスミドは、ネオマイシン耐性に対する選択マーカー、およびｐＣ（ヒト・サイトメガロウイルス・プロモーター）とｌａｃＺコード化領域との間に位置する種々の長さのａｔｔＢ部位を有する。プラスミドｐＦＹ１２、ｐＦＹ１４およびｐＦＹ１５は、それぞれ９０、５０および３０ｂｐのａｔｔＢ配列を含有する。ネオマイシン耐性細胞株を単一コロニーの連続精製により得た。各コンストラクトの４つの株を組込み実験に用いた。
【０１０２】
１２株のそれぞれに、ΦＣ３１インテグラーゼ発現プラスミドｐＦＹ６を、組込みベクターｐＦＹ１７、ｐＦＹ１９またはｐＦＹ２０と共にトランスフェクションした。プラスミドｐＦＹ１７、ｐＦＹ１９およびｐＦＹ２０は、それぞれ長さ９０、５０および３２ｂｐのａｔｔＰ配列を有する。ａｔｔＰ配列をｈｐｔオープンリーディングフレームの上流に置いた。このａｔｔＰ配列は、ハイグロマイシン耐性を与えるハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼをコードする。ａｔｔＰ−ｈｐｔ部分の上流にプロモーターは無く、したがってｈｐｔコード化領域にゲノムプロモーターを融合するようにプラスミドをゲノムに組込みしない限り、ｈｐｔは発現しない。ｐＢＳＫ−ｈｐｔをコントロールに用いて、ｈｐｔへのプロモーター融合の頻度を監視した。ａｔｔＰ配列が無いという点を除いて、プラスミドｐＢＳＫ−ｈｐｔはｐＦＹ１７、ｐＦＹ１９およびｐＦＹ２０と同一である。ａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部位との間の組み換えは、組込みベクターを染色体標的に挿入し、Ｐｃ−ａｔｔＬ−ｈｐｔ結合を発生すると予想される。ｈｐｔの発現はハイグロマイシン耐性を与える。
【０１０３】
結果
トランスフェクションの結果：１２細胞株にトランスフェクションされた各組込みプラスミドに対して、ハイグロマイシン耐性コロニーを記録した（表２）。１×１０６細胞を塗布したものから、ｐＢＳＫ−ｈｐｔトランスフェクションは顕著に多数の耐性コロニーの産生に失敗した。これは、ゲノムプロモーターに与えるｈｔｐコード化領域の頻度が著しく低いことを示している。対照的に、ｐＦＹ１７、ｐＦＹ１９およびｐＦＹ２０は、特定の組込みプラスミドおよび特定の細胞株によっては、最大で千倍のハイグロマイシン耐性コロニーを生じた。ｐＦＹ１９またはｐＦＹ１７をＦＹ１２中にトランスフェクションしたものから、より多くのハイグロマイシン耐性コロニーが生じた。これは、より長いａｔｔＢ配列とａｔｔＰ配列との間の組み換えは、より短いａｔｔＢ部位とａｔｔＰ部位との間の組換えよりもより効率的であることを示している。
【０１０４】
ＰＣＲを用いて、代表的コロニーから予想される約０．８ｋｂ接合バンドを検出した。ヒト・サイトメラロウイルス・プロモーターおよびｈｐｔコード化領域に対応するプライマーは、予想サイズ（０．８ｋｂ）のＰＣＲ産生物を増幅した。これは、Ｐｃがｈｐｔコード化領域に結合していることを示しており、ゲノムのａｔｔＢ部位とプラスミドａｔｔＰ配列との間の組み換えと一致する。
【０１０５】
【表２】
【０１０６】
（実施例４）
ΦＣ３１インテグラーゼは植物染色体中でａｔｔＰ部位およびａｔｔＢ部位を組み換える働きをする。
本実施例は、ΦＣ３１インテグラーゼをテストして、植物染色体中に存在するａｔｔＰ部位およびａｔｔＢ部位を組み換える能力を調べた実験についての説明である。本実験の作成物および方法を図４に示す。
【０１０７】
方法
コンストラクトｐＷＰ２９は、３５Ｓ−ａｔｔＰ−ｎｐｔ−ａｔｔＢ−ｇｕｓからなりＲＢおよびＬＢに隣接した断片を含有する。ここにおいて、３５Ｓはカリフラワー・モザイクウイルス・プロモーターであり、ｎｐｔはネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼをコードする領域であり、ｇｕｓはグルクロニダーゼをコードする領域である。ＲＢおよびＬＢは、それぞれ右および左アグロバクテリウムＴ−ＤＮＡ境界配列である。３５Ｓとｎｐｔとの間のａｔｔＰ部位は非翻訳リーダー配列としての機能を果す。３５Ｓによるｎｐｔの転写によりカナマイシン耐性が与えられる。上流にプロモーターが無いので、ｇｕｓコード化領域は転写されない。
【０１０８】
植物形質転換に用いる第２のコンストラクトはｐＷＰ２４である。このコンストラクトはＲＢおよびＬＢに隣接する断片Ｐｎｏｓ−ｎｐｔ−３５Ｓ−ｉｎｔを含有する。ここにおいて、Ｐｎｏｓはノパリンシンターゼ・プロモーターであり、ｉｎｔはΦＣ３１インテグラーゼコード化領域である。ｎｐｔとｉｎｔの両者が、それぞれ上流のプロモーターから転写される。
【０１０９】
この２つのコンストラクトが同じゲノム中に存在する場合、ｐＷＰ２４を有する染色体からのｉｎｔの発現により、機能性ΦＣ３１インテグラーゼが発生し、ｐＷＰ２９を有する染色体上に位置するａｔｔＢ部位とａｔｔＰ部位との間の組み換えを触媒すると考えられた。組み換え現象により、ｐＷＰ２９構造体からｎｐｔ遺伝子を削除すること、およびｇｕｓに３５Ｓを与えることが予想された。得られる構造は３５Ｓ−ａｔｔＲ−ｇｕｓであり、ここでａｔｔＲは、ａｔｔＰとａｔｔＢとの間の組み換えにより形成されたハイブリッド部位であり、ＰＢ’とも表される（図４）。ｎｐｔの削除により３５Ｓの転写下でｇｕｓが得られ、かつＧＵＳ酵素活性を有する植物を生じると予想された。この活性は、植物組織を組織化学的に染色することにより検出することができる。
【０１１０】
結果
一時発現アッセイを行って、ｐＷＰ２９が組み換えに対して機能的であるか否かを調べた。裸のＤＮＡの遺伝子銃で仲介した送達により、ｐＷＰ２９をトウモロコシＢＭＳ細胞中にｐＷＰ８と共導入した。コンストラクトｐＷＰ８は、単子葉植物細胞中で発現するためのトウモロコシ・ユビキチン・プロモーターの後方に融合したインテグラーゼ遺伝子を有する。両方のプラスミドを共導入した場合には青色点が観察されたが、プラスミドの一方のみを用いた場合には、これは見つからなかった。このことは、トウモロコシ細胞中で部位特異的組み換えが起きたこと、およびｐＷＰ２９中のａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部位とが機能性部位であることを示している。
【０１１１】
カナマイシン耐性タバコ植物体を、ｐＷＰ２９またはｐＷＰ２４を用いてアグロバクテリウムで仲介した形質転換により再生した。もう一度、一時発現アッセイを行って、ｐＷＰ２４株が機能性インテグラーゼを産生するか否かを調べた。コンストラクトｐＷＰ２９を、裸のＤＮＡの遺伝子銃で仲介した送達により、ｐＷＰ２４植物体に導入した。ｐＷＰ２９ＤＮＡを有する細胞は、３５Ｓ−ａｔｔＲ−ｇｕｓ構成の形成の結果、ＧＵＳ酵素活性を発現すると予想された。実際、２つの株２４．３および２４．４は、ａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部位との間の機能性インテグラーゼ仲介部位特異的組み換えと一致した青色点を生じた。
【０１１２】
これら２つのｐＷＰ２４インテグラーゼ株をｐＷＰ２９テスター株と交雑して、ｐＷＰ２９とｐＷＰ２４とを同じゲノムに保有する染色体を有する子孫を作った。インテグラーゼ（２４．３、２４．４）とテスター株（２９．２、２９．４、２９．５、２９．１９）との間の遺伝子交雑から得られた結果を表３にまとめた。いずれの場合も、代表的子孫苗を選択せずに発芽させ、ＧＵＳ酵素活性に対して組織化学的に染色した。青色に染色された子孫の数を表に示した。一次形質転換したｐＷＰ２４およびｐＷＰ２９株は代表的トランス遺伝子に対してヘミ接合性であるので、子孫の４分の１だけが両方のトランス遺伝子型を保有することが期待された。サンプル数が少ないので、期待頻度からの顕著な偏差は異常ではない。
【０１１３】
【表３】
【０１１４】
親株として用いた株の組合せにより、染色の強度が変わった。組織の大部分が青色に染まった子孫を有するものは、組み換え現象がより効率的であったことを示している。逆に、染色が均一でない子孫を与えるものは、組み換え現象がより非効率であったことを示している。異なる子孫プールの間のこの偏差は、恐らくトランス遺伝子の組込み位置により生じる効果によるものである。２つのインテグラーゼ株のうち、２４．４は促進部位特異的組み換えにおいてより効率的に現れる。これは、恐らくｉｎｔ遺伝子発現のレベルが高いことによる。２４．４を２９．４および２９．１９に交雑して作った染色パターンは、ａｔｔＢおよびａｔｔＰのｉｎｔ仲介部位特異的組み換えによりｇｕｓ遺伝子活性の活性化を招くという、本実験の目的に一致する。
【０１１５】
（実施例５）
ΦＣ３１インテグラーゼは、植物染色体中への環状プラスミドの組み込みを触媒する。
本実施例は、ΦＣ３１インテグラーゼをテストして、ａｔｔＰ×ａｔｔＢ部位特異的組み換えにより植物染色体中に環状プラスミドを挿入する能力を調べた実験についての説明である。本実験を図５に図示する。
【０１１６】
方法
標的コンストラクトｐＷＰ６は、ＲＢおよびＬＢに隣接し３５Ｓ−ａｔｔＰ−ｎｐｔからなる断片を含む。３５Ｓとｎｐｔとの間のａｔｔＰ部位は非翻訳リーダー配列としての役割を果す。３５Ｓによるｎｐｔの転写によりカナマイシンに対する耐性が得られる。
【０１１７】
組み込んだコンストラクトｐＹＪＣ４３は断片ａｔｔＢ−ｈｐｔを有する。ここで、ｈｐｔはハイグロマイシンに対する耐性をコードしている。インテグラーゼ発現コンストラクトはｐＹＪＣ４１であり、３５Ｓはｉｎｔを転写する。
【０１１８】
標的コンストラクトｐＷＰ６を、ｐＷＰ６ＤＮＡの無作為組込みにより植物染色体中に配置した。次いで、ｐＷＰ６トランス遺伝子の単一コピーを含んだカナマイシン耐性植物をｐＹＪＣ４３およびｐＹＪＣ４１で形質転換した。ｐＹＪＣ４１から得たｉｎｔの一時発現が、ｐＹＪＣ４３のａｔｔＢ部位とｐＷＰ６トランス遺伝子の染色体的に定まったａｔｔＰ部位との間の組み換えを触媒することが期待された。ａｔｔＢ部位とａｔｔＰ部位との間の特異的組み換えにより、ｐＹＪＣ４３環状分子が染色体に挿入され、３５Ｓ−ａｔｔＬ−ｈｐｔ連鎖を作ることが期待された。ａｔｔＰ部位およびａｔｔＢ部位は逆方向に図示されているので、ａｔｔＬ部位も同様に逆方向にするか、または図中のＢＰ’を逆方向にしたものと同じＰ’Ｂで表すことに留意されたい。機能性３５Ｓ−ａｔｔＬ−ｈｐｔ連鎖はハイグロマイシン耐性表現型を与えた。
【０１１９】
結果
ｐＷＰ６を有するカナマイシン耐性タバコ植生を、アグロバクテリウム仲介形質転換により得た。サザンハイブリダイゼーション分析により、ｐＷＰ６トランス遺伝子の単一コピーを有する株を検出した。この株の子孫ＷＰ６．１を無菌的に発芽させ、これらの植物からプロトプラストを作った。このプロトプラストを、ｐＹＪＣ４３とｐＹＪＣ４１ＤＮＡとを組合せ、直接ＤＮＡ形質転換のためのポリエチレングリコール法により形質転換した。次いで、プロトプラストをアガロース中に埋め込み、培養してハイグロマイシン存在下でカルスを形成した。ハイグロマイシンを選択しない場合には、カルス形成速度は４×１０−４であった。これは通常の１０分の１であるが、プロトプラスト形質転換実験で観察される偏差の範囲内である。ハイグロマイシンを選択する場合には、カルス形成速度は７×１０−５であった。これは、プロトプラストから再生されたカルスの約１８％が、標的部位に組込みベクターを含有することを示している。インテグラーゼコンストラクトｐＹＪＣ４１を形質転換から除外した場合、カルス形成速度は１×１０−５未満であった。プラスミドｐＹＪＣ４１を発現するインテグラーゼの封入により作られたハイグロマイシン耐性カルスの頻度がより高いことは、ｐＹＪＣ４３の染色体ａｔｔＰ標的へのインテグラーゼ促進部位特異的組込みと一致する。
【０１２０】
本明細書で説明した実施例および実施態様は例示目的のためだけのものであって、当業者にとってこれらを考慮した種々の変更または修正は示唆されており、かつこれらの変更または修正は本明細書の精神および範囲、ならびに特許請求の範囲に含まれることを理解されたい。本明細書中で引用した刊行物、特許および特許出願書類の全てを、全ての目的のためにここに参照により組み入れる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、S．pombe leul Locusで染色体構造の概略的な外観を示す（縮小）。PLT４４の染色体への相同的挿入（図１A）は、図１Bで示されるようなleul 対立遺伝子間のΦC31 attP標的を設置する。
pLT45の染色体attP標的内へのpLT43促進部位特異的組み込みは、図１Cに示す構造を導入する。矢印は、T7プロモーター（T7）、T3プロモーター（T3）及びura４＋コード化領域（U4）に対応するPCRプライマーを示す。XbalI（X）切断産物の予想される大きさを示す。
【図２】 図２は、ΦC31インテグラーゼが、CHO細胞におけるグリーン蛍光タンパク質（GFP）をコード化するトランス遺伝子の部位特異的組み込みを触媒することを証明する実験の概略を示す。
【図３】 図３は、ΦC31が、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を染色体に位置したプロモーターの下流に挿入するためにattB部位での特異的組み換えを触媒することを証明する実験の概略図を示す。成功した組み込みは、Pc-att-hptリンケージ及びハイグロマイシン耐性表現型を生産する。attP及びattB部位の異なる長さの影響を、指標したプラスミドを使用して分析した。
【図４】 図４は、タバコゲノム由来のattB及びattP部位によって隣接させたDNAの切り取りを触媒することを示す実験の概略的な図表を示す。
【図５】 図５は、ΦC31インテグラーゼがタバコゲノムへのトランス遺伝子の組み込みを触媒したことを示す実験の概略的な図表を示す。
【発明の属する技術分野】
連邦政府が後援する研究に関する説明
本発明は、政府の指示で米国農務省、農業リサーチサービスによって授与された許可No.5335-21000-009-06Sの下でなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願への相互参照
本出願は、ここで参照として組み込む1999年7月23日に出願された米国仮出願番号60/145,469の利益をクレームする。
【０００３】
本発明は、真核細胞の染色体の中への特異的かつ安定した核酸の組み込みを得るための方法の分野に関する。本発明は、ΦC31インテグラーゼなどの原核リコンビナーゼポリペプチドを使用する部位特異的組み換え系を利用する。
【０００４】
【従来の技術】
原核の遺伝子形質転換は、しばしば重大な短所に苦しむ。例えば、トランス遺伝子の組み込みを興味ある特定の座で再生産可能に得ることはしばしば困難である。相同組み換えは、一般に非常に低い頻度でのみ生じる。この問題を克服するために、部位特異的組み換え系を用いた。これらの方法は、より高等な原核細胞において機能することが可能な部位特異的組み換え系の使用を含む。多くのバクテリオファージ及び組み込みプラスミドは、それらのゲノムをそれらの宿主のものの中へ安定に組み込むことが可能な部位特異的組み換え系をコード化する。これらの系において、組み換え反応の最小必要条件は、組み換え現象を触媒するリコンビナーゼ酵素又はインテグラーゼ、及び2つの組み換え部位である（Sadowski（1986）J.Bacteriol．165：341-347；Sadowski（1993）FASEB J.7:760-767）。ファージ組み込み系について、これらは、付着（att）部位といい、ファージDNA由来のattP因子と、バクテリアゲノムによってコード化されるattB因子がある。2つの付着部位は、２，３の塩基対と同じくらい小さい配列を共有する。リコンビナーゼタンパク質は、両方のatt部位に結合し、宿主への環状ファージ又はプラスミドDNAの組み込みを生ずる、DNA鎖のコンサーバティブ（保存型）及び相互作用交換を触媒する。DNAベンディングタンパク質IHF、組み込み宿主因子などの追加のファージ又は宿主因子波、効率的な反応に対して要求されるかもしれない（Freidman （1988）Cell 55:545-554；Finkel ＆ Johnson（1992）Mol.Microbiol. 6：3257-3265）。逆切り取り反応は、時折、ファージλのxis遺伝子産物などの追加のファージ因子を必要とする。（Weisberg ＆ Landy（1983）“ファージλにおける部位特異的組み換え”In Lambda II、eds. Hendrix et al．（Cold Dpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）pp.211−250；Landy（1989）Ann.Rev.Biochem. 58：913−949）。
【０００５】
リコンビナーゼは、2つのグループ、λインテグラーゼ（Argos et al.（1986）EMBO J．5：433-44；Voziyanov et al（1999）Nucl. Acids Res.27:930-941）、及びリゾルバーゼ/転化酵素属（Hatfull ＆ Grindley （1988）“Resolvases and DNA−invertase：a family of enzymes active in site-specific recombination” In Genetic Recombination, eds. Kucherlipati, R., & Smith, G.R. (Am. Soc. Microbiol., Wachington DC), pp. 357-396）に分類される。これらは、インテグラーゼ酵素の構造、及び触媒のそれらのモードの分子詳細を変える（Stark et al. （1992）Trends Genetics ８：432−439）。鋳型Streptomyces ファージΦC31は、後者の分類の68kDリコンビナーゼをコード化する。同系の付着部位を組み換える際にΦC31インテグラーゼ酵素の有効性が、試験官内及び生体内でrecA突然変異体大腸菌において最近証明された（Thorpe ＆ Smith（1998）Proc．Nat’ｌ. Acad．Sci．USA95:5505−5510）。ΦC31インテグラーゼ反応は、おそらく追加のファージタンパク質が切り取りに要求されないために、宿主因子を必要とせず、不可逆であるようであるという点においてシンプルである。ファージ及びバクテリアatt部位は、クロスオーバー点で相同性の3つの塩基対だけを共有する。この相同関係は、逆方向反復、おそらくインテグラーゼタンパク質の結合部位によって隣接する。両方のattB及びattPに対する最小の既知の機能的な大きさは、〜５０bpである。
【０００６】
バクテリオファージP1のCre-lox系、及びSaccharomyces cerevisiae のFLP−FRT系は、動物及び植物におけるトランス遺伝子及び染色体工学技術に広く使用されている（Sauer（1994）Curr．Opin．Biotechnol.５：521−527；Ow（1996）Curr.Opin．Biotechnol.７：181−186）。動物又は植物細胞において作用する他の系は、以下すなわち、１）Zygosaccharomyces rouxii 由来のR−RS系（Onouchi et al（1995）Mol. Gen．Genet．247:653−660）、２）バクテリオファージMu由来のGin−gix系（Maeser ＆ Kahmann（1991）Mol．Gen．Genet．230:170−176）、及び３）バクテリアプラスミドpSM19035 由来のβリコンビナーゼ−six系（Diaz et al．（1999）J．Biol．Chem．274:6634−6640）、を含む。部位特異的リコンビナーゼを使用することによって、より高頻度で組み込みを得ることができる。
【０００７】
しかしながら、これら5つの系は、重大な短所を有する。各これらの系は、単一のポリペプチドリコンビナーゼは、同一かほぼ同一の配列の2つの部位間の組み換えを触媒するという共通した特性を有する。組み換えによって生じた生産部位は、それ自体次の組み換えに対する基質である。結果として、組み換え反応は容易に可逆可能である。分子内相互作用の反応速度論は、分子間相互作用に渡って好ましいので、これら組み換え系は、DNAを組み込むよりむしろ削除するのに有効である。したがって、トランス遺伝子の安定的な部位特異的組み込みを得るための方法と系に対する必要性が存在する。本発明は、この及び他の必要性を、満たす。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、真核細胞において、安定で、部位特異的な組み換えを得るための方法を提供する。以前に知られた部位特異的組み換え方法と違って、本発明の方法を使用して得られた組み換え体は、安定である。組み換え反応は、可逆的ではない。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本方法は、第一の組み換え部位と、前記第一の組み換え部位との組み換えの基質として機能することが可能な第二の組み換え部位とを含む真核細胞を提供することを含む。第一及び第二の組み換え部位は、原核リコンビナーゼポリペプチドと接触し、組み換え部位間に組み換えを生じ、それによって1又は2つのハイブリッド組み換え部位を形成する。有意義なことに、リコンビナーゼポリペプチドは、第一及び第二の組み換え部位間の部位特異的組み換えを仲介することができるが、真核細胞において存在しない追加のファージ生産因子の不存在下で2つのハイブリッド組み換え部位間の組み換えを仲介することができないものである。組み換え部位のいずれか又は両方が真核細胞の染色体において存在することができる。いくつかの実施態様において、組み換え部位の1つは染色体に存在し、他は染色体の中へ組み込まれるべき核酸内に含まれる。
【００１０】
本発明は、原核リコンビナーゼポリペプチド又は原核リコンビナーゼをコード化する核酸を含む真核細胞も提供する。これらの実施態様において、リコンビナーゼは、第一の組み換え部位と、前記第一の組み換え部位との組み換えの基質として作用することが可能な第二の組み込み部位との間の部位特異的組み換えを仲介をすることができるが、第一の組み換え部位と第二の組み換え部位との間の組み換えに形成された2つのハイブリッド組み換え部位間の組み換えを、真核細胞に存在しない追加の因子の不存在下では仲介することができないものである。現在好ましい実施態様において、本発明の細胞は、リコンビナーゼポリペプチドのコード化配列を有する核酸を含む。リコンビナーゼコード化配列は、真核細胞においてリコンビナーゼコード化ポリヌクレオチドの発現を仲介するプロモーターと作用可能に結合することが好ましい。本発明の真核細胞は、例えば、動物細胞、植物細胞、酵母細胞、又はカビ細胞とすることができる。
【００１１】
別の実施態様において、本発明は、安定に組み込んだトランス遺伝子を有する真核細胞を得るための方法を提供する。これらの方法は、第一の組み換え部位を含む真核細胞の中へ核酸を導入することを含み、前記核酸は興味あるトランス遺伝子と前記第一の組み換え部位との組み換えの基質として作用することが可能な第二の組み換え部位とを含むことを特徴とする。第一及び第二の組み換え部位は、原核リコンビナーゼポリペプチドと接触する。リコンビナーゼポリペプチドは、第一及び第二の組み換え部位間の組み換えを触媒し、第一の組み換え部位で核酸の組み込みを生じ、それによって核酸の各末端でハイブリッド組み換え部位を形成する。かさねて、リコンビナーゼポリペプチドは、第一及び第二の組み換え部位間の部位特異的組み換えを仲介するが、真核細胞において存在しない付加的因子の不存在下では2つのハイブリッド組み換え部位間の組み換えを仲介することができないものである。
【００１２】
本発明の別の実施態様において、真核細胞において機能するプロモーターと作用可能に結合するバクテリアリコンビナーゼポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明のこれらの核酸によってコード化されるリコンビナーゼポリペプチドは、真核細胞において存在しないバクテリオファージ因子の不存在下では第一の組み換え部位と第二の組み換え部位との間の組み換えで形成された2つのハイブリッド組み換え部位間の組み換えを仲介することができない。いくつかの実施態様において、さらに、核酸は、リコンビナーゼポリペプチドによって認識される少なくとも1つの組み換え部位を含む。
【００１３】
本発明によって提供される真核細胞は、また、真核細胞において存在しないバクテリオファージ因子の不存在下では第一の組み換え部位と第二の組み換え部位との間の組み換えで形成された2つのハイブリッド組み換え部位を仲介できない1又はそれ以上のバクテリオファージΦC31組み換え部位、または他のリコンビナーゼに対する組み換え部位を有するポリヌクレオチドを含む。
【００１４】
【発明の実施の形態】
定義
ここで使用するような「外因性DNA断片」、「異質ポリヌクレオチド」、「トランス遺伝子」、「異質核酸」は、異質の起源から特定の宿主へ創造したものか、あるいは、もし同じ起源由来ならその原型由来のものから修飾したものである。したがって、宿主細胞における異質遺伝子は、特定の宿主細胞へ内生的であるが、修飾されていない遺伝子を含む。それゆえ、前記用語は、細胞に対して外来性か、異質か又は相同であるが、因子が通常見られない宿主細胞核酸内に位置するDNA断片を言う。外因性のDNA断片を発現させて外因性ポリペプチドを生産する。
【００１５】
「遺伝子」の語は、生物学上の機能と関係するいずれのDNA断片を表すものとして広く使用する。したがって、遺伝子は、それらの発現に要求されるコード化配列及び／又は調節配列を含む。遺伝子は、例えば、他のタンパク質に対する認識配列を形成する非発現DNA断片も含むことができる。遺伝子は、種々の起源から得ることができ、興味ある起源由来のクローン、または既知の若しくは予想した配列情報からゴウセイしたもの、所望のパラメーターを有するように設計された配列を含むことができる。
【００１６】
核酸又はタンパク質に適用するとき、「単離」の語は、核酸又はタンパク質が自然の状態に関係する他の細胞成分が本質的に存在しないことを表す。乾燥しているか水溶液のいずれかとすることができるが、均質な状態が好ましい。純度や均質性は、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高性能液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を使用して典型的に決定される。調製において存在する有力種であるタンパク質は、本質的に精製される。特に、遺伝子を隣接させて、興味ある遺伝子以外のタンパク質をコード化するオープンリーディングフレームから単離した遺伝子を分離する。「精製」の語は、電気泳動ゲルにおいて核酸又はタンパク質が1つのバンドを本質的に生じることを意味する。特に、核酸又はタンパク質が少なくとも約50％純粋、より好ましくは少なくとも約85％純粋、最も好ましくは少なくとも約99％純粋であることを意味する。
【００１７】
「自然に生じる」の語は、ヒトによって人工的に生産されることから区別するものとして天然に見出すことができる対象を記述するために使用する。例えば、実験室においてヒトによって意図的に修飾されていない天然の起源から単離することが可能な（ウイルスを含む）組織において存在するポリペプチド、又はポリヌクレオチド配列は、自然に生じる。
【００１８】
「核酸」又は「ポリヌクレオチド」の語は、一本鎖又は二本鎖型のいずれかにおけるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、及びその重合体を言う。特に限定しない場合、前記語は、引用核酸と同様の結合特性を有し、自然に生ずるヌクレオチドと同様の方法で代謝される自然のヌクレオチドの既知のアナログを含有する核酸を包含する。他に指示しない場合、特定の核酸配列は、伝統的に修飾したその変異体（例えば、縮退コドン置換）、相補的配列、及び明確に指示した配列も絶対的に包含する。具体的に、1又はそれ以上選択した（又はすべての）コドンの3つの部分を、混合した塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換した配列を発生させることによって縮退コドン置換を達成することができる（Batzer et al.（1991）Nucleic Acid Res. 19：5081；Ohtsuka et al．（1985）J．Biol．Chem。260：2605−2608；Cassol et al.（1992）；Rossolini et al．（1994）Mol．Cell．Probes ８：91−98）。核酸の語は、遺伝子、遺伝子によってコード化されたｃDNA及びｍRNAと交互に使用される。
【００１９】
「遺伝子から誘導される核酸」とは、遺伝子又はそのサブ配列（例えば、コード化領域）を合成し、最終的に鋳型として機能する核酸を言う。それゆえ、ｍRNA、ｍRNAから逆転写されたｃDNA、そのｃDNAから転写されたRNA、ｃDNAから増幅したDNA、増幅したDNAから転写したRNAなどは、すべて遺伝子から誘導され、そのように誘導された産物の検出は、オリジナルの存在及び/又は不存在の指示となる。
【００２０】
DNA断片は、別のDNA断片と機能ある関係に置かれたとき、「作用可能に結合」する。例えば、ポリペプチドの分泌に加わるプレタンパク質として発現するなら、ポリペプチドをコード化するDNAに、単一の配列についてのDNAは作用可能に結合する。プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写を刺激するならコード化配列に作用可能に結合する。一般に作用可能に結合するDNA配列は、隣接と読み取り段階の両方のシグナル配列の場合、隣接する。しかしながら、例えば、エンハンサーは、それらが制御する転写のコード化配列と隣接する必要がない。結合は、従来の制限酵素部位、又はその代わりに挿入したアダプター、リンカーでのライゲーションによって達成される。
【００２１】
「植物」の語は、全植物、植物組織（例えば、葉、茎、根など）、種子、植物細胞、及び同様の子孫を含む。本発明の方法で使用可能な植物の分類は、形質転換技術に修正可能なより高い植物の分類と同様に一般に広く、単子葉、双子葉植物の両方を含む。
【００２２】
「プロモーター」の語は、転写を開始するためにRNAポリメラーゼとの結合に関わるDNA領域を言う。「誘導プロモーター」は、発現のレベルを、例えば、温度、pH、転写因子及び化学薬品などの環境又は開発因子によって変更可能である遺伝子の発現を導くプロモーターをいう。
【００２３】
細胞に関して使用するとき「組み換え」の語は、細胞が異質核酸を複製するか、又は異質核酸によってコード化されるペプチド又はタンパク質を発現することを表す。組み換え細胞は、細胞の野生型（非組み換え型）内では見出すことができないポリヌクレオチドを含むことができる。組み換え細胞は、ポリヌクレオチドが人工的な手段によって細胞の中へ修正又は再導入される細胞の野生型に見出されるポリヌクレオチドも含む。語は、細胞から核酸を除去することなしに修飾された細胞に内在する核酸を含む細胞も包含し、そのような修飾は、遺伝子置換、部位特異的突然変異体、及び関連技術等によって得られるものを含む。
【００２４】
「組み換え発現カセット」又は単なる「発現カセット」は、構造遺伝子の発現をそのような配列と両立できる宿主において達成することが可能な核酸因子を持つ組み換え的、又は合成的に発生させた核酸構築物である。発現カセットは、少なくともプロモーター、及び選択的に、転写終結シグナルを含む。典型的には、組み換え発現カセットは、転写すべき核酸（例えば、所望のポリペプチドをコード化する核酸）、及びプロモーターを含む。発現を達成する際に必要な又は役立つ追加の因子をここで述べたように使用することができる。例えば、発現カセットは、宿主細胞由来の発現タンパク質の分泌を指示するシグナル配列をコード化するヌクレオチド配列も含むことができる。遺伝子発現に影響する転写終結シグナル、エンハンサー、及び他のヌクレオチド配列も、発現カセットに含まれる。
【００２５】
「リコンビナーゼ」の語は、2つ又はそれ以上の組み換え部位間の組み換えを触媒する酵素をいう。本発明のおいて役立つリコンビナーゼは、特定のリコンビナーゼによって認識される特異的ポリヌクレオチド配列である特異的組み換え部位での組み換えを触媒する。「インテグラーゼ」の語は、リコンビナーゼのタイプをいう。
【００２６】
「形質転換率」は、異質ポリヌクレオチドをそのゲノム及び残存物の中へ上手く組み込んだ細胞の割合をいう。
【００２７】
「トランスジェニック」の語は、細胞の中へか、細胞の原型の中へ導入された特異的修飾を含む細胞をいう。そのような修飾は、一又はそれ以上の点突然変異、欠失、挿入、又はその組み合わせを含むことができる。動物に言及するとき、「トランスジェニック」の語は、トランスジェニックである細胞を含む動物を意味する。トランスジェニック及び非トランスジェニック細胞の両方からなる動物は、ここでは「キメラ」動物という。
【００２８】
「ベクター」の語は、核酸（又は複数の核酸）を宿主細胞へ運搬するための組成物を言う。ベクターは、運搬すべき核酸をコード化する核酸を含み、核酸の宿主細胞内への加入及び／又はベクターの宿主細胞への複製を容易にするために、ウイルスキャプシド又は他の物質（例えば、キャプシド内、又はキャプシドの一部としてパッケージされた逆転写酵素又は他の酵素）を選択的に含む。
【００２９】
「組み換え部位」はここで述べるリコンビナーゼ酵素によって認識される特異的ポリヌクレオチド配列である。典型的には、（相補部位と呼ばれる）２つの異なる部位を含み、１つは目的の核酸に存在し（例えば、真核の染色体又はエピソームなど）、別のものは、目的の組み換え部位で組み込まれるべき核酸上に存在する。特別の酵素の組み換え部位が異なる名前を持つかもしれないが、「attB」及び「attP」の語は、それぞれ、本来的にバクテリアターゲット、及びファージドナー由来の付着（又は組み換え）部位をいう。組み換え部位は、典型的に、コア又スペーサー領域によって分離された左及び右アームを含む。それゆえ、attB組み換え部位は、BOB‘からなり、B及びB’は、それぞれ左及び右アームであり、Oはコア領域である。同様に、attPは「POP‘」であり、P及びP’はアームであり、Oは重ねてコア領域である。前記attB及びattP部位との間の組み換えでは、核酸の標的での付随する組み込み、組み込んだDNAに隣接する組み換え部位は、「attL」及び「attR」という。それゆえ、上述した用語を使用してattL及びattRは、それぞれBOP’及びPOB‘からなる。ここでのいくつかの表示において、「O」を省略し、attB及びattPはそれぞれBB’及びPP’と示す。
【００３０】
（好適な態様の説明）
本発明は、真核細胞において部位特異的な組み換えを得るための方法を提供するものである。部位特異的な組み換えを得るための過去に知られたシステムとは異なり、本発明の方法を用いて行われた組み換えの産物は安定である。そこで、例えば、真核細胞の染色体へトランスジーンを導入するために本方法を用いることが可能であり、そして既に知られた部位特異的な組み換えシステムを用いる場合にしばしば起こる、トランスジーンの切除を避けることができる。安定な逆位（inversion ）、トランスロケーション（translocation ）及び他の転位（rearrangement ）もまた、得ることができる。
【００３１】
本発明は、バクテリオファージのインテグラーゼの様な原核細胞のリコンビナーゼを採用し、その様な酵素は２つの相補的な組み換え部位の間の組み換えを触媒するが、この組み換えにより形成されたハイブリッド部位の間の組み換えを触媒することができない、という点において単方向性である。その様なリコンビナーゼの一つであるΦC31 インテグラーゼは、それ自身ではattB x attP 反応のみを触媒する。そのインテグラーゼは、attBとattPの間の組み換えにより形成された、attLとattR部位の間の組み換えをを仲介することはできない。ΦC31 インテグラーゼの様なリコンビナーゼは単独で逆反応を触媒することはできないために、ΦC31 のattB x attP 組み換えは安定である。この性質により、真核細胞において現在使用されている部位特異的な組み換えシステムから、本発明の方法は離れている。現在使用されているシステムにはCre-lox システム又はFLP-FRT システムの様なものがあり、そこでは組み換え反応は容易に逆転される。本発明の組み換えシステムの使用により、真核細胞において、安定なトランスジーン及び染色体転位（rearrangement ）に向けての新たな機会が提供される。
【００３２】
本方法は、対応するリコンビナーゼを用いて、真核細胞に存在している一組の組み換え部位（例えば、attB及びattP）に接触することを含む。そこでリコンビナーゼは組み換え部位の間の組み換えを仲介する。二つの組み換え部位の相対的な位置に応じて、組み換えの結果としての数多くのイベントのいずれか一つが起こることがある。例えば、もし二つの組み換え部位が異なった核酸分子上に存在しているならば、その組み換えは一つの核酸分子を第二の分子へと組み込む結果と成り得るであろう。そこで、対応する組み換え部位を含んでいる真核細胞染色体へ、一つの組み換え部位を含んでいるプラスミドを組み込むことができるであろう。本発明の方法において用いられたリコンビナーゼは逆反応を触媒することができないから、その組み込みは安定である。その様な方法は、例えば、プラスミド上に存在しているトランスジーンを、真核細胞の染色体へ安定に組み込むために有用である。
【００３３】
二つの組み換え部位が、同一の核酸分子上に存在することもまたできる。その様な場合には、得られた産物は典型的には、その部位の相対的な方向性に依存する。例えば、直線方向にある部位の間の組み換えは一般的に、その２つの組み換え部位の間にある任意のDNA が切り出されるという結果となる。対照的に、逆方向にある部位の間の組み換えは、仲介しているDNA のインバージョンが起こるという結果となることがある。再び、付加的因子の非存在下において組み換えは不可逆的であるという点において、得られた転位した（rearranged）核酸は安定であり、付加的因子は一般的にそのリコンビナーゼが由来する特定のバクテリオファージによってコードされ、正常には真核細胞においては見られないものである。この方法が有用である適用の一つの例は、２つの組み換え部位の間のプロモーターの交換に伴って生じる。もしプロモーターが、そのプロモーターによって発現されるべきコード配列に関して最初に反対向きであって、そしてそのプロモーターをフランク（flank ）する組み換え部位が逆方法であるならば、組み換え部位を接触させることはプロモーターの逆位（inversion ）が起こる結果となり、従ってプロモーターを正しい方向に置いてコード配列の発現を駆り立てるであろう。同様に、もしプロモーターが最初に発現のために正しい方向性にあり、組み換え部位が同じ方向性にあるならば、組み換え部位がプロモーターと接触することによりプロモーターフ断片を切り出して、そしてコード配列の発現を停止させるという結果を得ることができる。
【００３４】
本発明の方法は、例えば、染色体のトランスロケーションを得るためにもまた有用である。これらの態様において、一つの組み換え部位は一つの染色体上に置かれ、そして第一の組み換え部位と共に組み換えの基質として働くことができる第二の組み換え部位が第二の染色体上に置かれている。その二つの組み換え部位をリコンビナーゼと接触させると組み換えが起こって、２つの染色体アームが交換されるという結果となる。例えば、生物の２つの系統を構築することが可能であり、そのうちの一つの系統は第一の組み換え部位を含み、第二の系統は第二の組み換え部位を含んでいる。その２つの系統は掛け合わされ、その組み換え部位の両者を含む子孫の系統が得られる。その部位をリコンビナーゼと接触させると、染色体アームの交換が起こる。
【００３５】
（リコンビナーゼと組み換え部位）
本方法は、真核細胞において、安定な核酸の組み込み又は他の転位（rearrangement ）を達成するために、リコンビナーゼのシステムを使用する。リコンビナーゼのシステムは典型的には３つの要素から成り、その要素は２つの特異的なDNA 配列（「組み換え部位」）及び特異的な酵素（「リコンビナーゼ」）である。リコンビナーゼは、特異的な組み換え部位の間の組み換え反応を触媒する。
【００３６】
組み換え部位は方向性を有している。言い換えれば、それらは回文（バリンドローム）ではない。相互の関連性における組み換え部位の方向性により、どの様な組み換えイベントが起こるか決定される。組み換え部位は、平行（同じ方向性）または反対という、２つの方向性をとることが可能である。組み換え部位が単一の核酸分子上に存在し、そして相互に平行な方向性であるときには、その際にリコンビナーゼにより触媒される典型的な組み換えイベントは、仲介している核酸の切り出して単一の組み換え部位を離すことである。組み換え部位が反対の方向性にあるときには、その際には任意の仲介配列が逆位（inverted）となるのが典型的である。
【００３７】
本発明の方法において使用されるリコンビナーゼは、第一の組み換え部位と第二の組み換え部位の間の部位特異的な組み換えを仲介することができ、その第二の組み換え部位は第一の組み換え部位と共に組み換えのための基質として働くことができる。しかしながら、正常には真核細胞に存在しない、付加的因子の非存在下では、第一の組み換え部位と第二の組み換え部位の間の組み換えにより形成される、二つのハイブリッド組み換え部位の間の組み換えを仲介することができない。これらのリコンビナーゼの例には、例えば、バクテリオファージΦC31 インテグラーゼ（例えばThorpe & Smith (1998) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:5505-5510 ; Kuhstoss & Rao (1991) J.Mol.Biol.222:897-890 ;米国特許番号5,190,871 を見よ）、ファージP4リコンビナーゼ（Ow & Ausubel (1983) J.Bacteriol.155:704-713 ）、リステリアファージリコンビナーゼ、バクテリオファージR4 Sreリコンビナーゼ(Matsuura et al. (1996) J.Bacteriol.178:3374-3376)、CisAリコンビナーゼ(Sato et al.(1990) J.Bacteriol.172:1092-1098 ; Stragier et al.(1989) Science 243:507-512) 、XisFリコンビナーゼ(Carrasco et al.(1994)Genes Dev.8:74-83)、トランスポゾンTn4451 TnpX リコンビナーゼ(Bannam et al.(1995) Mol.Microbiol. 16:535-551 ; Crelin & Rood (1997) J.Bacteriol.179:5148-5156)が含まれる。
【００３８】
リコンビナーゼポリペプチド、及びそのリコンビナーゼポリペプチドをコードする核酸は本技術分野において述べられており、日常的な方法を用いて得ることが可能である。例えば、ΦC31 インテグラーゼをコードする核酸フラグメントを含むベクターは米国特許番号5,190,871 の中に述べられており、B-18477 というアクセッション番号の下でノザンレジョナル リサーチラボラトリー（ぺオリア、イリノイ 61604）から入手可能である。
【００３９】
任意の適切な方法により、組み換えを望む場所において、組み換え部位を含む真核細胞へリコンビナーゼを導入することができる。例えばリコンビナーゼをポリペプチドの形で、例えばマイクロインジェクション又は他の方法によって導入することができる。しかしながら、現在において好ましい態様においては、リコンビナーゼをコードする遺伝子が細胞に導入される。遺伝子の発現はリコンビナーゼが作られるという結果となり、そのリコンビナーゼは対応する組み換え部位の間の組み換えを触媒する。興味の対象である外来性のポリヌクレオチドを導入する前、後、又はそれと同時に、リコンビナーゼ遺伝子を細胞中に導入することができる。一つの態様において、リコンビナーゼ遺伝子は挿入されるべきポリヌクレオチドを運搬するベクター中に存在し、そのリコンビナーゼ遺伝子はポリヌクレオチド中に含まれることさえも可能である。他の態様においては、リコンビナーゼ遺伝子は、形質転換した植物、動物、カビ又はその類似物の様な形質転換した真核生物中へ導入され、その後にそれらは対応する組み換え部位を含む生物と掛け合わされる。
【００４０】
（標的生物）
本発明の方法は、任意の型の真核細胞において、DNA の安定した組み込み及び／又は転位（rearrangement ）を得るために有用である。例えば、本方法は動物、植物、カビ、細菌、及び他の微生物の細胞において有用である。いくつかの態様において、その細胞は多細胞生物、例えば形質転換植物又は動物等の一部分である。本発明の方法は、形質転換したコムギ、トウモロコシ、及び動物の様な、形質転換した材料を得ることが困難である状況において特に有用である。これらの状況において、まれにしかない単一コピー挿入物を見出すには、独立して得られた多数の形質転換したクローンを前もって得ることが必要となるが、それはそれ自身非常に多くの労力を払う必要がある。
【００４１】
特に興味が持たれる植物標的には単子葉植物があり、その中には、例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オオムギ、バナナ、ヤシ、ユリ、ラン及びスゲが含まれる。双子葉植物もまた適切な標的であり、例えば、タバコ、リンゴ、ジャガイモ、テンサイ、ニンジン、ヤナギ、ニレ、カエデ、バラ、キンポウゲ、ペチュニア、フロックス、スミレ及びヒマワリが含まれる。他の標的には、動物及びカビ細胞が含まれる。これらのリストは単に説明するためのものであり、限定するものではない。
【００４２】
（標的細胞内へ外来DNA を導入するためのコンストラクト）
本発明の方法は、標的細胞内へ外来DNA を導入することをしばしば含む。例えば、一つ又はそれ以上の組み換え部位を含む核酸が細胞中へしばしば導入される。細胞内へ導入されるべきポリヌクレオチドコンストラクトは、一つ又は複数の組み換え部位に加えて、望まれる形質型を細胞に与えるであろう遺伝子又は機能的な配列を含むことができる。
【００４３】
いくつかの態様において、組み換え部位に加えて、リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドコンストラクトが真核細胞内へ導入される。リコンビナーゼをコードしているポリペプチドは、一つ又は複数の組み換え部位として同一の核酸上に含まれることが可能であり、また別個の核酸として細胞内へ導入されることも可能である。本発明は組み換え部位を含む核酸のみならず、その核酸内においてリコンビナーゼをコードしているポリヌクレオチド配列が標的真核細胞内において機能しているプロモーターに作用可能に結合している核酸もまた提供する。
【００４４】
一般的には、発現するべきポリヌクレオチド（例えばリコンビナーゼをコードしているポリヌクレオチド又は興味の対象であるトランスジーン）は発現カセットに存在しているであろうし、それはそのポリヌクレオチドが発現制御シグナルに作用可能に結合していることを意味しており、その発現制御シグナルは、例えばプロモーターやターミネーターであって興味の対象である宿主細胞において機能を有する。リコンビナーゼ及び選択可能なマーカーをコードする遺伝子もまた、宿主細胞内において機能するその様なシグナルの制御下にあるであろう。発現の制御はプロモーターの選択によって最も容易に達成される。転写ターミネーターは一般的には重要でなく、細胞によって認識される限り種々の既知の因子を使用することができる。
【００４５】
研究がなされている遺伝子からプロモーターを得ることが可能であり、または異なった遺伝子または異なった種から得られた異種プロモーターであることも可能である。形質転換植物又は他の生物の全ての組織において遺伝子の直接的な発現が望まれる場合には、「構成的な」プロモーターを使用することが可能であり、「構成的な」プロモーターは多くの環境条件や発達又は細胞分化の状況において一般的に活性である。
【００４６】
植物において使用するために適切な構成的なプロモーターには、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35S 転写開始領域及び領域VIプロモーター、アグロバクテリウムツメファシエンスのT-DNA から得られた1'- 又は2'- プロモーター、及び本技術分野の当業者に知られている植物細胞中で活性である他のプロモーターが含まれる。他の適切なプロモーターには、フィグウオート（Figwort ）モザイクウイルス由来の全長の転写プロモーター、アクチンプロモーター、ヒストンプロモーター、チュブリンプロモーター、又はマンノピン合成酵素プロモーター（MAS ）が含まれる。
【００４７】
他の構成的な植物プロモーターには、とりわけシロイヌナズナ（Sun and Callis, Plant J.,11(5):1017-1027(1997)）より得られた、種々のユビキチン又はポリユビキチンプロモーター、マス（mas ）、マック（Mac ）又はダブルマック（DoubleMac ）プロモーター（米国特許番号5,106,739 、及びComai et al によってPlant Mol.Biol.15:373-381 (1990)において述べられている）、及び本技術分野の当業者に知られている、種々の植物遺伝子に由来する他の転写開始領域が含まれる。その様な遺伝子には、例えば、シロイヌナズナ由来のACT11 （Huang et al.,Plant Mol.Biol.33:125-139(1996)）、シロイヌナズナ由来のCat3（（GenBank No.U43147,Zhong et al.,Mol.Gen.Genet.251:196-203(1996)）、セイヨウアブラナ（Brassica napus）由来のステアロイルアシルキャリア蛋白質不飽和化酵素をコードしている遺伝子（GenBank No.X74782,Solocombe et al.,Plant Physiol.104:1167-1176(1997)）、トウモロコシ由来のGPc1（GenBank No.X15596 Martinez et al.,J.Mol.Biol 208:551-565(1989)）、及びトウモロコシ由来のGpc2（GenBank No.U45855,Manjunath et al.,Plant Mol.Biol.33:97-112(1997) ）が含まれる。
【００４８】
植物のための有用なプロモーターには、Ti- 又はRi- プラスミドから、植物細胞から得られたプロモーター、プロモーターが植物中において機能を有することが見出されているときには植物ウイルス又は他の宿主が含まれる。植物中で機能し、そしてそのため本発明の方法において使用するのに適切である細菌プロモーターには、オクトピン合成酵素プロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター、マノピン（manopine）合成酵素プロモーターが含まれる。適切な内在性植物プロモーターには、リブロース-1,6- ビスホスファターゼ（RUBP）、カルボキシラーゼスモールサブユニット（ssu ）プロモーター、α- コングリチニン（conglycinin ）プロモーター、ファゼオリン（phaseolin ）プロモーター、ADH プロモーター、及び熱ショックプロモーターが含まれる。
【００４９】
大腸菌において使用するためのプロモーターには、T7、trp 、又はラムダプロモーター、リボソーム結合部位を含み、及び好ましくは転写終結シグナルである。真核細胞のためには、制御配列は典型的にはプロモーターを含み、そのプロモーターは随意にイムノグロブリン遺伝子、SV40、サイトメガロウイルス等に由来するエンハンサー及びポリアデニレーション配列を含み、そしてスプライスドナー及びアクセプター配列を含むこともできる。酵母において、便利なプロモーターにはGAL1-10 （Johnson and Davies (1984) Mol.Cell.Biol.4:1440-1448 ）、ADH2（Russell et al.(1983) J.Biol.Chem.258:2674-2682）、PHO5（EMBO J.(1982) 6:675-680 ）及びMFα（Herskowitz and Oshima (1982) The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces （酵母サッカロミセスの分子生物学）（eds.Strathem,Jones, and Broach）Cold Spring Harbor Lab.,Cold Spring Haror,N.Y.,PP181-209の中において）が含まれる。
【００５０】
代わりに、興味の対象である遺伝子の特異的な組織における発現を標的としたプロモーター、又はさもなければより厳密な環境又は発達による制御の下にあるプロモーターを使用することが可能である。その様なプロモーターをここでは、「誘導可能な」又は「抑制可能な」プロモーターと称する。誘導可能なプロモーターの転写によって転写に影響するかもしれない環境条件の例には、病原体の攻撃、嫌気性の条件、エチレン、又は光の存在が含まれる。発達による制御下にあるプロモーターには、葉、根、果実、種、又は花の様な特定の組織においてのみ転写を開始するプロモーターが含まれる。プロモーターの操作はゲノム中のそれの位置によってもまた変化する可能性がある。そこで、誘導可能なプロモーターはある位置において完全に又は部分的に構成的となることがある。誘導可能なプロモーターは、リコンビナーゼ遺伝子の発現を制御するためにしばしば使用され、そこで組み換え反応のタイミングを制御することが可能となる。
【００５１】
発達による制御の下にある組織特異的な植物プロモーターの例には、果実、種、花の様な特定の組織においてのみ転写を開始するプロモーターが含まれる。トマト由来の組織特異的なE8プロモーターは遺伝子発現を方向付けるために特に有用であり、そのために望まれる遺伝子発現産物は果実の中に位置する。例えば、Lincoln et al.(1988) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:2793-2797; Deikman et al.(1988) EMBO J.7:3315-3320; Deikman et al.(1992) Plant Physiol.100:2013-2017 を見よ。他の適切なプロモーターには胚の貯蔵蛋白質をコードしている遺伝子が含まれる。
【００５２】
誘導可能なプロモーターによる転写に影響するかもしれな環境条件の例には、嫌気的な条件、上昇した温度、又は光の存在が含まれる。更なる器官特異的、組織特異的、及び／又は誘導可能な外来のプロモーターもまた知られており（例えば、Kuhlemeier et al (1987) Ann.Rev.Plant Physiol.38:221において引用された参考文献を見よ）、それには、光誘導性であって光合成を行う組織においてのみ活性である、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の1,5-リブロースビスホスフェイトカルボキシラーゼ スモールサブユニット遺伝子類（"ssu" プロモーター）プロモーター、葯特異的なプロモーター（EP 344029 ）、及び例えばシロイヌナズナ由来の（Arabidopsis thaliana）種子特異的なプロモーター（Krebbers et al.(1988) Plant Physiol.87:859）が含まれる。見本となる緑色組織特異的なプロモーターにはトウモロコシのホスフォエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（PEPC）プロモーター、スモールサブユニットリブロース ビスカルボキシラーゼプロモーター（ssRUBISCO ）及びクロロフィルa/b 結合蛋白質プロモーターが含まれる。プロモーターは、国際公開番号WO93/07278の中で述べられた通りの、植物TrpA遺伝子から単離されたプロモーターの様な樹心（pith）特異的なプロモーターであることもできる。
【００５３】
他の生物のための誘導可能なプロモーターには、例えば、アラビノースプロモーアー、lacZプロモーター、メタロチオネインプロモーター、及び熱ショックプロモーターのみならず、本技術分野の当業者に知られている他の多くのものが含まれる。S.pombe の様な酵母において有用な抑制可能なプロモーターは、ビタミンB1によって抑制可能なPmntプロモーターである。
【００５４】
典型的には、これらの細胞へ導入されるコンストラクトは組み換え発現技術を用いて調製される。組み換え発現技術は、組み換えた核酸の構築と感染した細胞内での遺伝子の発現を伴う。これらの末端に到達するための分子クローニング技術は本技術分野において知られている。組み換え核酸の構築に適する広範囲のクローニングとインビトロ増幅の方法は本技術部分野の当業者に良く知られている。これらの技術の例と、多くのクローニング演習を通じて当業者を教示するのに十分である指示は、Berger and Kimmel,Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology（分子クローニング技術への案内 酵素学における方法論）, volume 152, Academic Press, Inc.,San Diego,CA (Berger); 及びCurrent Protocols in Molecular Biology（分子生物学における現在のプロトコール） ,F.M. Ausubel et al., eds.,Current Protocols （現在のプロトコール）,a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons,Inc.,(1998 Supplement) (Ausubel) の中に見出される。
【００５５】
ポリヌクレオチドコンストラクトの構築には、細菌内で複製可能なベクターを使用することが通常必要となる。細菌からプラスミドを精製するために使用することができるキットは有り余る程市販されている。それらを適切に使用するために製造者の指示に従うこと（例えば、EasyPrepJ,FlexiPrepJ：両者はファルマシアバイオテック由来、StrataCleanJ：ストラタジーン由来、及びQIAexpress Expression System：キアゲン、を見よ）。単離されて精製されたプラスミドを更に操作して他のプラスミドを作製することも可能であり、細胞をトランスフェクトするか、又はアグロバクテリウムツメファシエンスへ導入して感染させて、植物を形質転換するのに使用される。アグロバクテリウムが形質転換の手段である場合にはシャトルベクターが構築される。ストレプトマイセス又はバシラスにおけるクローニングもまた可能である。
【００５６】
標的細胞中へ取り込まれるために使用されるポリヌクレオチドコンストラクト及び／又はベクター中へ、選択可能なマーカーがしばしば導入される。これらのマーカーによって、興味の対象であるポリヌクレオチドを含んでいる細胞のコロニーを選択することができる。ベクターは、例えば大腸菌又は他の細胞中で機能する選択マーカーをしばしば有するであろうし、標的細胞へ導入される前にその細胞中でベクターは複製される。大腸菌内で選択可能なマーカーの例には、例えばアンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、エリスロマイシンなどの抗生物質に対する耐性を特定している遺伝子、又はβ−ガラクトシダーゼの様な他の型の選択可能な酵素活性を与える遺伝子、又はラクトースオペロンが含まれる。哺乳細胞において使用するのに適している選択可能なマーカーには、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）、シミジンキナーゼ遺伝子（TK）、又は薬剤耐性を特定している原核細胞の遺伝子が含まれ、薬剤耐性を特定している原核細胞の遺伝子には、ミコフェノール酸（mycophenolic acid ）で選択することができるgpt （キサンチン−グアニン ホスフォリボシルトランスフェラーゼ）; G418、ハイグロマイシン又はピュロマイシンで選択することができるneo （ネオマイシンホスフォトランスフェラーゼ）; 及びメトトレキサートで選択することができるDHFR（ジヒドロ葉酸還元酵素）（Mulligan & Berg (1981) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072;Southern & Berg (1982) J.Mol.Appl.Genet.1:327）がある。
【００５７】
植物細胞のための選択マーカーはしばしば、例えば、カナマイシン、G418、ブレオマイシン、ハイグロマイシン又はクロラムフェニコールの様な殺生剤又は抗生物質に対する耐性、又はクロロスルフロン（chlorsulfuron ）又はバスタ（Basta ）の様な除草剤に対する耐性を与える。選択可能なマーカーのための適切なコード配列の例には、抗生物質カナマイシンに対する耐性を与えるネオマイシンホスフォトランスフェラーゼ酵素をコードするneo 遺伝子（Beck et al (1982)Gene 19:327 ）、ハイグロマイシンホスフォトランスフェラーゼ酵素をコードして抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を与えるhyg (hpt) 遺伝子（Gritz and Davies (1983) Gene 25:179 ）、及び除草剤物質であるホスフィノスリチン（phosphinothricin）及びビアラフォス（bialaphos ）に対する耐性をあたえるホスフィノスリチンアセチルトランスフェラーゼをコードするbar 遺伝子（EP 242236 ）がある。
【００５８】
もし一つ以上の外来遺伝子を標的とする真核細胞に導入するならば、通常は、各々の外来性の核酸について異なった選択可能なマーカーを使用することが望ましい。これにより、望まれる外来性の核酸の両者を含む細胞について同時に選択することができるようになる。
【００５９】
（標的細胞へコンストラクトを導入するための方法）
組み換え部位及び／又はリコンビナーゼをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドコンストラクトを、標的細胞及び／又は生物へ、当業者に知られているいくつかの手段のいずれかを用いて導入することができる。例えば、植物の培養中又は器官中のいずれかで、種々の通常の技術によって、DNA コンストラクトを植物細胞中へ導入することができる。例えば、DNA パーティクルボンバートメントの様なバイオリスティックな方法を用いてDNA コンストラクトを植物細胞へ直接に導入することが可能であり、又は植物細胞プロトプラストの電気穿孔法及びマイクロインジェクションの様な技術を用いてDNA コンストラクトを導入することが可能である。パーティクルにより仲介された形質転換技術（「バイオリスティック」としても知られている）は、Klein et al.,Nature,327:70-73 (1987); Vasil,V.et al.,Bio/Technol.11:1553-1558 (1993)及びBecker,D.et al.,Plant J.,5:299-307 (1994) において述べられている。これらの方法は、微小ビーズ又はパーティクルの基質の中又はその表面上のいずれかにおいて核酸を有する小さなパーティクルにより細胞を穿孔することを伴う。
【００６０】
バイオリスティックなSDS-1000遺伝子銃（バイオラッド、ヘラキュレス、CA）は、DNA を被覆した金又はタングステンの微小担体を標的細胞へ加速するためにヘリウムガスの圧力を使用する。その過程は広範囲の生物由来の組織及び細胞に適用可能であり、その生物には植物、細菌、カビ、藻、無傷動物組織、組織培養細胞及び動物胚が含まれる。電気パルス送達を用いることも可能であり、それは動物及び患者の生組織のための、本質的に緩和な電気穿孔の型である。Zhao,Advanced Drug Derivery Reviews （進歩した薬物送達の総論）17:257-262 (1995)。
【００６１】
他の形質転換方法が当業者に知られている。マイクロインジェクションの技術が本技術分野において知られ、科学及び特許文献において良く述べられている。ポリエチレングリコール（PEG ）沈殿を用いたDNA コンストラクトの導入は、Paszkowski et al.,EMBO J.3:2717 (1984)において述べられている。電気穿孔技術は、Fromm et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:5824 (1985)において述べられている。PEG により仲介された植物プロトプラストの形質転換及び電気穿孔もまた、Lazzeri,P.,Methods Mol.Biol.49:95-106 (1995)において議論されている。異種遺伝子の導入及び発現のための方法は単子葉及び双子葉植物の両者において知られている。米国特許番号5,633,446, 5,317,096, 5,689,052, 5,159,135及び5,679,558; Weising et al.(1988) Ann.Rev.Genet.22:421- 477 を見よ。単子葉植物の形質転換には特に種々の技術を使用することが可能であり、それには電気穿孔法（例えばShimamoto et al.,Nature (1992),338:274-276）、バイオリスティック（例えば欧州特許出願 270,356）、及びアグロバクテリウム（例えば、Bytebier et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1987) 84:5345-5349）が含まれる。
【００６２】
植物の形質転換のために、DNA コンストラクトを適切なT-DNA フランキング領域と結合させて、一般的なアグロバクテリウムツメファシエンス宿主ベクターへ導入することができる。アグロバクテリウムツメファシエンス宿主の毒性機能により、細胞が細菌によって感染した時に、トランスジーン及び隣接したマーカー遺伝子（もし存在しているならば）が植物細胞DNA へ挿入される。アグロバクテリウムツメファシエンスにより仲介された形質転換技術は、科学文献において良く述べられている。例えば、Horsch et al.Science,233:496 (1984), Fraley et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:4803 (1983)及びHooykaas,Plant Mol.Biol.,13:327-336 (1989), Bechtold et al.,Comptes Rendus De L Academie Des Sciences Serie Iii-Sciences De La Vie-Life Sciences,316:1194-1199 (1993), Valvekens et al.,Proc.Natl.Acad.SCI.USA,85:5536-5540 (1988)を見よ。植物及び細胞培養物の遺伝子移送方法の総論としては、Fisk et al.,Scientia Horticulturae 55:5-36 (1993) 及びPotrykus,CIBA Found.Symp.154:198 (1990) を見よ。
【００６３】
ポリヌクレオチド配列を細胞内へ送達するための他の方法には、例えば、リポソームに基づいた遺伝子送達（Debs and Zhu (1993) WO93/24640; Mannino andGould-Fogerite (1988) BioTechniques 6(7); Rose米国特許番号5,279,833; Brigham (1991) WO91/06309; 及びFelgner et al.(1987) Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:7413-7414）のみならず、ウイルスベクターの使用、（例えば、アデノウイルス（総論のために、Berns et al.(1995) Ann.NY Acad.Sci.772:95-104; Ali etal.(1994) Gene Ther.1:367-384;及びHaddada et al.(1995) Curr.Top.Microbiol.Immunol.199 (Pt3):297-306 を見よ）、パピローマ(papilloma) ウイルス、レトロウイルス（例えば、Buchscher et al.(1992) J.Virol.66(5) 2731-2739; Johann et al.(1992) J.Virol.66(5):1635-1640; Sommerfelt et al.,(1990) Virol.176:58-59; Wilson et al.(1989)）J.Virol.63:2374-2378; Miller et al.,J.Virol.65:2220-2224 (1991); Wong-Staal et al.,PCT/US94/05700,及びRosenburg and Fauci (1993) in Fundamental Immunology（基本的免疫学）,Third Edition Paul (ed) Raven Press,Ltd.,New York及びその中の引用文献、及びYu et al.,Gene Therapy (1994) supra を見よ）、及びアデノ関連ウイルスベクター（West et al.(1987) Virology 160:38-47; Canter et al.(1989) 米国特許番号4,797,368; Canter et al.WO93/24641 (1993); Kotin (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Muzyczka (1994) J.Clin.Invst.94:1351及びSamulski(supra) をAAVベクターの概観のために見よ。また、Lebkowski,米国特許番号5,173,414; Tratschin et al.(1985) Mol.Cell.Biol.,5(11):3251-3260; Tratschin et al.(1984) Mol.Cell.Biol.,4:2072-2081; Hermonat and Muzyczka (1984) Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6466-6470; McLaughlin et al.(1988)及びSamulski et al. (1989) J.Virol.,63:03822-3828 もまた見よ）及びそれに類似なものが含まれる。
【００６４】
導入された外来DNA が組み込まれたパターンを解析することができる方法は、当業者に良く知られている。例えば形質転換した細胞からDNA を抽出し、一つ又はそれ以上の制限酵素によってそのDNA を消化し、そしてポリヌクレオチドコンストラクトのラベル化された断片をハイブリダイズさせることができる。挿入された配列をポリメラーゼ連鎖反応（PCR ）を用いて同定することもまた可能である。例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning - A Laboratory Manual （分子クローニング、実験室マニュアル）, Cold Spring Harbor Laboratory, ColdSpring Harbor, New York,1989を、これら及び他の適切な方法の記載のために見よ。
【００６５】
（形質転換植物及び動物の再生）
本発明の方法は、安定して組み込まれた外来性ポリヌクレオチド又は他の細胞内核酸の安定な転位（rearrangement ）を有する、形質転換したキメラ型の多細胞生物を得るために特に有用である。形質転換したキメラ型の生物を得るための方法は、植物と動物の両者について当業者に良く知られている。
【００６６】
上記のいずれかの形質転換技術によって得られた形質転換した植物細胞は培養され、形質転換した遺伝子型及びそのために望みの表現型を有している完全な植物が再生される。その様な再生技術は組織培養成長培地の中の特定の植物ホルモンの取り扱いに依り、典型的には望みの核酸配列と共に導入された殺生剤及び／又は除草剤マーカーに依る。培養されたプロトプラストからの植物再生は、Evans et al.,Protoplast Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture （プロトプラストの単離及び培養、植物細胞培養のハンドブック）,pp.124-176, Macmillian Publishing Company, New York (1983);及びその結びつきで、Regeneration of Plants, Plant Protoplast（植物、植物プロトプラストの再生）,pp.21-73,CRC Press, Boca Raton,(1985)において述べられている。植物カルス、外植片、体細胞胚（Dandekar et al.,J.Tissue Cult.Meth.,12:145 (1989); MacGranahan et al.,Plant Cell Rep.,8:512 (1990)）、器官、又はその一部分からもまた再生することができる。その様な再生技術は一般的にKlee et al.,Ann.Rev.of Plant Phys.,38:467-486 (1987)において述べられている。
【００６７】
その方法は大部分の脊椎動物種の形質転換したキメラ型の動物を作製するのに有用である。その様な種には、それに限定されるものではないが、ネズミ及びラットの様なゲッシ類、ウサギ、ヒツジやヤギの様なヒツジ類（ovines）、ブタの様なブタ類（porcines）、ウシ（cattle）やバッファローの様なウシ類（bovine）を含む、非ヒト哺乳類が含まれる。形質転換動物を得る為の方法は、例えば、Puhler,A.,Ed.,Genetic Engineering of Animals（動物の遺伝工学）VCH Publ.,1993; Murphy and Carter, Eds.,Transgenesis Techniques:Principles and Protocols（形質転換技術：原理とプロトコール）（Methods in Molecular Biology, Vol.18）,1993;及びPinkert,CA,Ed.,Transgenic Animal Technology:A Laboratory Handbook （形質転換動物の技術工学：実験室ハンドブック）,Academic Press,1994において述べられている。特異的な遺伝的修飾を有している形質転換魚類もまた、クレイムされた方法を用いて作製することができる。形質転換魚類を作製するための一般的な方法のためには、例えば、Iyengar et al.(1996) Transgenic Res.5:147-166 を見よ。
【００６８】
そのゲノム中に特異的な修飾を有している、形質転換した又はキメラ型の動物を得る一つの方法は、受精した卵母細胞を興味の対象であるポリヌクレオチドを組み換え部位に隣接して含んでいるベクターと接触させることである。ネズミの様ないくつかの動物についてインビボで受精が行われ、受精した卵子は手術により移された。他の動物、特にウシおいては、生きた又は屠殺された動物から卵子を移して来て、そしてその卵子をインビトロで受精させることは好ましい。DeBoer et al.,WO91/08216を見よ。インビトロで受精させることにより、実質的に同調した細胞に導入すべき修飾を行うことができる。そして、着床前の胚が約16-150個の細胞を含むようになるまで受精した卵母細胞をインビトロで培養した。16-32 細胞期の胚は桑実胚として述べられている。32細胞以上を含んでいる着床前の胚を胞胚と称する。これらの胚は、典型的には64細胞期において胞胚腔の空洞（cavity）の発達を示した。もし望むならば、胚細胞の中における望みの外来性ポリヌクレオチドの存在を当業者に知られている方法によって検出することができる。
【００６９】
受精した卵母細胞を着床前の段階まで培養するための方法は、Gordon et al.(1984) Methods Enzymol.101:414; Hogan et al. Manipulation of the Mouse Embryo:A Laboartory Manual（マウス胚の操作：実験室マニュアル）C.S.H.L. N.Y.(1986) （マウス胚）; Hammer et al.(1985) Nature 315:680（ウサギ及びブタ胚）;Gandolfi et al.(1987) J.Reprod.Fert.81:23-28;Rexroad et al.(1988) J.Anim.Sci.66:947-953（ヒツジ胚）及びEyestone et al.(1989) J.Reprod.Fert.85:715-720; Camous et al.(1984) J.Reprod.Fert.72:779-785及びHeyman et al.(1987) Theriogenology 27:5968（ウシ胚）において述べられている。時々、着床を待つ間の期間着床前の胚を凍結して保存した。着床前の胚を適切なメスに移植し、その結果、トランスジーンが組み込まれたときの発達の段階に依って、形質転換した又はキメラ型の動物が誕生するという結果となった。正しい生殖系列の形質転換動物を形成するために、キメラ型の哺乳動物を繁殖させることができる。
【００７０】
替わりに本方法を用いて、望みの外来性ポリヌクレオチドの単一コピーを有する胚幹細胞（ES）を得ることができる。これらの細胞は、インビトロで培養された着床前の胚から得られた。例えば、Hooper,ML,Embryonal Stem Cells:Introducing Planned Changes into the Animal Germline （胚性幹細胞；計画された変化の動物生殖系列への導入）(Modern Genetics,v.1) Int'1.Pub.Distrib.,Inc.,1993; Bradley et al.(1984) Nature 309,255-258 を見よ。形質転換したES細胞を非ヒト動物由来の胞胚と結合させた。ES細胞は胚をコロナイズし、いくつかの胚においては得られたキメラ動物の生殖系列を形成する。Jaenisch,Science,240:1468-1474 (1988) を見よ。代わりに、生物を再構成することができるES細胞又は体細胞（”体細胞再集団細胞：somatic repopulating cells”）を、形質転換した哺乳動物を生み出す、除核された受精卵母細胞へ着床させるための核の起源として使用することができる。例えば、Wilmut et al.(1997) Nature 385:810-813を見よ。
【００７１】
（実施例）
下記の実施例は説明の目的で与えられたものであって本発明を限定するものではない。
【００７２】
（実施例１）
（シゾサッカロミセス・ボンベ（Schizosaccharomyces pombe ）におけるΦC31組み換えシステム）
この実施例は、ストレプトミセスバクテリオファージΦC31 部位特異的な組み換えシステムが、真核細胞において機能することを示している。S.Pombe のleu1遺伝子座において、バクテリオファージ接着部位（attP）をシゾサッカロミセス・ボンベの染色体において導入した。続いてこの標的株を、ura4＋選択可能なマーカーと連結した細菌接着部位（attB）を含むプラスミドにより形質転換された。ΦC31 インテグラーゼ遺伝子を有している第二のプラスミドによって共トランスフェクトしたとき、インテグラーゼ遺伝子が発現している条件下で、Ura＋へ高い効率で形質転換していることが観察された。
【００７３】
組み換えイベントのサザン解析により、leu1遺伝子座のattPへ、attB-ura4＋プラスミドが挿入されていることが示された。ハイブリッドジャンクジョンのヌクレオチド配列により、attB x attP 組み換え反応は正確であることが明らかとなった。
【００７４】
（材料及び方法）
（組み換えDNA ）
全体として標準的な方法が用いられた。大腸菌株XL2-Blue（recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F' proAB lAcIq Z △M15Tn10(Tetr) Amy Camr、ストラタジーン]がDNA コンストラクトとして働いた。
【００７５】
（培地）
分裂酵母株を、必要に応じて225mg/l のアデニン、ヒスチジン、ロイシン又はウラシルを添加した、最小培地（バイオ101 由来EMM-低グルコース）で生育させた。5-FOA （5-フロロオロチン酸、ザイモリサーチ社より）を含む最小プレートをGrimm ら（(1988) Mol.Gen.Genet.215:81-86）に従って調製し、アデニン、ヒスチジン及びロイシンを添加した。使用した時、5 μg/mlとなるようにチアミンを添加した。
【００７６】
（ΦC31 attP標的を有するS.prombe）
pHS282からApaI-SacI 断片として単離された（Thorpe & Smith (1998) Proc.NATL.Acad.Sci.USA 95:5505-5510 ）84塩基対のΦC31 attP部位（PP' と略称）を、S.prombe組み込みベクターpJK148の同じ部位にクローン化し（Keeney & Boeke (1994) Genetics 136:849-856）、pLT44 を作製した。NdeI切断DNA を用いた酢酸リチウムにより仲介された形質転換により、このプラスミドはS.prombe leu1-32アリールへ標的化された。pLT44 による相同組み換えによってLeu＋へ変換された、レシピエント宿主FY527(h-ade6-M216 his3-D1 leu1-32 ura4-D18) を、サザンブロットによって試験した。FY527attP と名付けられた一つのLeu＋型は単一コピーのpLT44 を含んでいることが見出された。FY527attPx2 と名付けられたもう一つの形質転換体は直列（tandem）のプラスミド挿入を有していた。
【００７７】
（ΦC31 attB部位を有する組み込み可能なura4＋ベクター）
1.8kb のEcoRI-BamHI 断片上でpTZura4 (S.Forsburg)から切り出した、S.prombeのura4＋遺伝子を、同じ酵素を用いて切断されたpJK へ挿入し、pLT40 を作製した。500bp のBamHI-XbaI断片としてpHS21 から単離されたΦC31 attB部位（BB'と略称）を、それらの酵素を用いて切断されたpLT40 へ連結してpLT42 を作製した。XhoI断片を削除することによりpLT42 からleu1遺伝子の大部分を除去し、pLT45 を作製した。これにより、pLT45 からleu1の全部であるが229bp が除去されて、その形質転換効率はleu1相同性を持たないプラスミドの形質転換効率まで低下した。ura4のすぐ反対側に同じ方向の第二でattB部位を有しているpLT50 が構築され、それは最初にpLT42 由来のattB BamHI-SacI 断片をpUC19 へサブクローニングし、それをEcoRI とSalII によって切り出し、続いてそれをEcoRI とXhoIによって切断したpLT45 へ挿入することにより構築された。最終構築物中の第二のattB部位を各鎖について一回配列決定し、最初のattB部位と同一であることが見出された。
【００７８】
（平滑DNA 形質転換）
attB-ura4＋-attB 平滑DNA は、pLT50 から精製されたattII-AlwNl 断片として、又はpLT50 を鋳型として用いたPCR 産物として調製された。T3プライマーとpJK148のプラスミド骨格に対応している第二のプライマー（5' ggc cct gaa att gtt gct tct gcc 3' ）を用いて、標準的な条件によりPCR は行われた。
【００７９】
（ΦC31 インテグラーゼの抑制的な合成）
ビタミンB1によって抑制される、S.prombe Pmntプロモーターは、pMO147から1.2kb のPstI-SacI 断片として切り出され、同じ酵素を用いて切断されたhis3＋,ars1 ベクターpBG2（Ohi et al.(1996)）Gene 174:315-318）へ挿入され、pLT41 が作製された。ΦC31 int コード領域を含んでいる2.0kb SacI断片を、pHS33（Thorpe & Smith (1998) supra ）からpLT41 のSacI部位へ移した。発現がPmntの制御下にある様にint コード領域が配向されたクローンを、pLT43 と名付けた。
【００８０】
（分子解析）
ベーリンガーマンハイムのGeniusTMシステムを用いてサザン解析を行った。leu1の998bp の内部EcoRV 断片、ura4の1.8kb 断片及び2.0kb のΦC31 int 遺伝子をランダムプライマー法によってジゴキシゲン標識し、プローブとして使用した。ストラタジーンTurbo PFU 酵素又はVENTポリメラーゼを用いて、パーキンエルマーCetus Gene Amp PCR 9600 で、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。可能なところでは標準的なT3及びT7プライマーを用いた。ura4プライマー（5' gtc aaa aag ttt cgt caa tat cac 3' ）（配列番号１）及びpJK148プライマーをオペロンテクノロジーから購入した。全てのPCR 反応において、51℃のアニーリニング温度と30秒の伸長時間が用いられた。
【００８１】
（結果と考察）
（S.prombeゲノムへの標的部位の挿入）
ΦC31 により仲介された組み込みのための標的部位を有する宿主株を作製するために、相同組み換えによって、ΦC31 attP部位を分裂酵母ゲノムのleu1遺伝子座へ挿入し、Leu＋株FY527 attPが形成された（図1 Ａ）。過去の研究により、S.prombeのDNA をXbaIによって開裂し、leu1＋遺伝子の内部の1kp 断片により検証したら、そのプローブにより14kbのバンドが検出されることが示されている（Keeney & Boeke (1994) Genetics 136:849-856）。leu＋プラスミドpJK148がleu1-32 遺伝子座において挿入されていると、3 と18kbのバンドが検出されるという結果となる（図1 Ａ）。84bpのΦC31 attP因子が封入されている点で、pLT44はpJK148から異なっているために、leu1-32 におけるpLT44 の組み込みは、FY527 attPにおいて、同様の3kb と18kbのハイブリダイゼーションパターンをもたらした。他のハイブリダイズしている断片が存在しないことは、単一に組み込まれたコピーとしてのpLT44 のDNA 残基を示している。
【００８２】
ΦＣ３１インテグラーゼ仲介形質転換
ｕｒａ４＋およびａｔｔＢ配列（ＢＢ’）を有するが、複製の原点を欠くＦＹ５２７ａｔｔＰをｐＬＴ４５で形質転換した。このコンストラクトを、それ自体により、またはΦＣ３１インテグラーゼを産生するｈｉｓ３＋複製ベクターｐＬＴ４３を用いて導入した。ｐＬＴ４３を封入することにより、Ｕｒａ＋形質転換体の数が平均で１５倍増加した（表１）。この効果はインテグラーゼ遺伝子発現によるものなので、この増加がｐＬＴ４５と複製にプロフィシエントな（replication-proficient）ｐＬＴ４３との間の組み換えに起因するものではありえない。インテグラーゼ遺伝子の転写は、高濃度のビタミンＢ１により抑制可能なプロモーターＰｍｎｔの支配を受ける（Ｍａｕｎｄｒｅｌｌ，Ｋ．（１９９３年）Ｇｅｎｅ １２３：１２７〜１３０頁）。抑制は完全ではないが（Ｆｏｒｓｂｕｒｇ，Ｓ．Ｌ．（１９９３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２１：２９５５〜２９５６頁）、インテグラーゼたん白の生成が減少する。発育培地にチアミンを加えた場合、Ｕｒａ＋形質転換体の数は背景レベル付近にまで減少した。培地からヒスチジンを省略することによりインテグラーゼプラスミドを共選択してもしなくても、Ｕｒａ＋形質転換体の頻度が顕著に変化することは無かった。ｐＬＴ４３またはその前駆体プラスミドｐＢＧ２を用いて得たＨｉｓ＋形質転換体の数から、ＦＹ５２７ａｔｔｔＰの形質転換能力を推定した。両方の複製プラスミドの頻度を比較したところ、ＦＹ５２７ａｔｔＰのｐＬＴ４３依存形質転換は平均で約１５％であった。
【００８３】
【表１】
ΦＣ３１インテグラーゼをプロモートしたａｔｔＰ ｘ ａｔｔＢ組み換え
ｐＬＴ４５をコードしたΦＣ３１ａｔｔＢエレメントと染色体的に位置の定まったａｔｔＰ配列との間の組み換えにより、図１Ｂに示すように、環状ＤＮＡがｌｅｕ１遺伝子座に組み込まれた。この反応が起きた場合、Ｕｒａ＋形質転換体から得たＸｂａＩ分別ゲノムのＤＮＡをｌｅｕ１ ＤＮＡでプローブすると、３ｋｂバンドは変わらないが、一方１８ｋｂバンドは約２３ｋｂまで増大する（図１Ｃ）。無作為に選択したＵｒａ＋コロニーをハイブリダイゼーション分析により検査した。チアミンの省略によりΦＣ３１インテグラーゼ遺伝子発現を抑制解除した場合の実験から得られた８つの分離株のうち７つが、この約２３ｋｂバンドの存在を示した。この同サイズバンドをｕｒａ４プローブにハイブリダイズした。ｕｒａ４−Ｄ１８欠損対立遺伝子から期待されるように、これは親株にｕｒａ４ハイブリダイゼーションしなかったものと対照的である。これら７つの分離株の一つが、両方のプローブにハイブリタイズする付加的なバンドを示した。部位に特異的な組み換え現象に加えて、この候補物質がｌｅｕ１遺伝子座にＤＮＡ再配列を有すると思われる。ｌｅｕ１再配列が、有効なＳ．ｐｏｍｂｅ相同体組み換え系によりおそらく触媒された。残る分離株は部位特異的組み換え現象を経験したことが無く、ｐＬＴ４５とｐＬＴ４３との間の組み換えにより、ウラシル原栄養株が増大したと思われた。これら８つの分離株のうち、半分をＵｒａ＋およびＨｉｓ＋の両方として選択したが、このグループとＵｒａ＋のみで選択したグループとの間に顕著な差は見られなかった。
【００８５】
ビタミンＢ１の存在下で行った形質転換実験から、ＤＮＡハイブリダイゼーションにより同数のＵｒａ＋形質転換体を調べた。チアミン抑制可能なＰｎｍｔプロモーターがインテグラーゼ産生を制限し、したがって部位特異的組込みを制限すると考えられる。この低頻度形質転換から分離された８つのＵｒａ＋候補物質のうちの２つにより、２３ｋｂバンドがｌｅｕ１およびｕｒａ４プローブにハイブリダイズしていることが示された。しかし、いずれのプローブも付加的バンドを検出したので、これらは正確な組込み現象を表しておらず、発明者らはこれらをクラスｂインテグラントとして分類した。他の６つの分離体では、ハイブリダイゼーションのパターンを翻訳することは困難である。これらのいくつかにおいて、遺伝子座は再配列を経験しているが、ｌｅｕ１プローブでは３ｋｂバンドを検出できなかった。これらの多くにおいて、ｕｒａ４に対するハイブリダイゼーションが弱いことから、Ｕｒａ＋表現型はゲノム中のｐＬＴ４５の安定な保守によるものではないであろう。
【００８６】
選択しない場合にインテグラーゼプラスミドを維持する形質転換体の比率を確実にするために、インテグラーゼ遺伝子配列でブロットを再プローブした。Ｕｒａ＋Ｈｉｓ＋として選択されたそれらはプラスミドを維持すると考えられており、かつハイブリダイゼーションが明らかになるにつれてそうなった。Ｈｉｓ表現型に関係なくＵｒａ＋として選択された８つの分離株のうちの５つは、インテグラーゼプローブにハイブリダイズするバンドも与えた。ｉｎｔの損失が安定な組込みに影響を及ぼすことを確認するため、無作為に選択したＵｒａ＋細胞の別の組を数世代にわたり非選択的に成長させ、ｐＬＴ４３を失ったＨｉｓ−子孫に対してスクリーニングをした。８つの代表的Ｕｒａ＋Ｈｉｓ−クローンの分析は、全てが正確に染色体が位置するａｔｔＰ部位に組込まれたｐＬＴ４５の単一コピーを有することを示した。これらの組込み体のＤＮＡはインテグラーゼプローブでハイブリダイズしなかった。対照的に、ｐＬＴ４５単体の形質転換により誘導された背景頻度Ｕｒａ＋クローンにより、ｌｅｕ１遺伝子座にハイブリダイジングバンドの親構造が得られ、かつ５ｋｂおよび７ｋｂに更なる微弱バンドが得られた。これらの知見は、ゲノムのどこかのｐＬＴ４５の組込みまたはＳ．ｐｏｍｂｅ複製原点の欠損にもかかわらずいくつかの細胞中のプラスミドの維持のいずれかと一致している。
【００８７】
保守的部位特異的組み換え
ＰＣＲを用いて、３つの代表的Ｕｒａ＋候補物質からａｔｔＰ／ａｔｔＢ組み換え接合部を回収した。ハイブリッド部位の一つでは、ａｔｔＲ（ＰＢ’）がＴ３およびＴ７プロモーターに隣接していた。他の部位では、ａｔｔＬ（ＢＰ’）がＴ３プロモーターおよびｕｒａ４ＤＮＡに隣接していた（図１Ｃ）。いずれの場合も、プライマー対が、期待される大きさのバンドを増幅したこれらの配列に向けられ、一方、本来のａｔｔＰ（ＰＰ’）はもはや見つからない。ａｔｔＰは検出されるがａｔｔＬおよびａｔｔＲのいずれもが検出されない場合には、これは親株ＦＹ５２７ａａｔＰと対照的である。３つの代表的ａｔｔＬおよびａｔｔＲ ＰＣＲ製品のヌクレオチド配列は、付随的な突然変異体が無いことを示した。したがって、バクテリアおよび哺乳動物細胞において、Ｓ．ｐｏｍｂｅ中のΦＣ３１仲介部位特異的組み換えは保守的組み換え反応である。
【００８８】
ΦＣ３１インテグラーゼは組込みした分子を除去しない。
ＴｈｏｒｐｅとＳｍｉｔｈ（（１９９８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：５５０５〜５５１０）は、ゲル分別ＤＮＡ断片の分析でΦＣ３１インテグラーゼ反応の反転を検出しなかった。発明者らは遺伝学的選択法により反転反応の可能性を調べた。ｐＬＴ４５のＦＹ５２７ａｔｔＰへの正確な組込みが、サザン分析により３つのクローンに対して確認された。次いで、これらの株をｐＬＴ４３で再転換した。ｐＬＴ４５を切り取ることにより、ｕｒａ４＋マーカーの欠損を招いた。Ｕｒａ−表現型を５−ＦＯＡを用いてプレート上に得点することができる（Ｇｒｉｍｍら、（１９８８年）Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．２１５：８１〜８６頁）。３つのＵｒａ＋Ｈｉｓ−前駆体の培養体から得たＵｒａ−分離個体の頻度は５．７×１０−４、７．１×１０−４および５．６×１０−４であった。対照的に、３つのＵｒａ＋Ｈｉｓ＋誘導体から得たＵｒａ−コロニーの頻度はある程度高く、１．１×１０−２、３．８×１０−３および２．３×１０−３であり、それぞれ１９、５および４倍増加した。インテグラーゼ遺伝子を有しない制御ベクターｐＢＧ２を代わりに用いて、５−ＦＯＡ耐性の速度が増大することも分かった。それぞれ１．０×１０−２、１．０×１０−２および８．０×１０−３であった。形質転換プロセス自体は変異原性を示す。
【００８９】
ｐＬＴ４５で形質転換された３つの培養体のそれぞれから得られた３つのＵｒａ−Ｈｉｓ＋クローンをサザンブロッティングにより分析した。１つの分離体が、ｐＬＴ４５のＦＹ５２７ａｔｔＰへの安定な組込みと一致するＤＮＡパターンを有していた。したがって、このクローンにおいて、Ｕｒａ−表現型は、部位特異的組み換え反応の反転によるよりも、むしろ制限パターンが感知可能なほどに変わっていない変異体により引き起こされた。第２クローンはｐＬＴ４５挿入欠損ＦＹ５２７ａｔｔＰのサザンパターン特徴を示し、第３クローンはｐＬＴ４５挿入の無いＦＹ５２７ａｔｔＰ等の細胞とＦＹ５２７ａｔｔＰ前駆体株ＦＹ５２７等の細胞の２つの型の細胞の混合物と一致するパターンを有していた。後者の構造は、ｐＬＴ４４の挿入を反転するｌｅｕ反復の間の染色体内相同組み換えから生じる場合がある（図１Ａ）。組込みしたプラスミドＤＮＡの正確な切り取りが前述の２つの候補物質に現れた場合、ａｔｔＰ部位が再生した。これはＰＣＲで検出可能であった。ＰＣＲ製品の大きさは、完全なハイブリッド部位に期待される大きさであり、ハイブリッド部位の存在はＰＣＲ製品を配列決定することにより確認された。これらの観察は、ｕｒａ４遺伝子の欠損がΦＣ３１仲介切り取り以外の機構により発生するという考えと一致している。
【００９０】
（まとめ）
単一目的部位での環状分子の組込みは、ほとんど全ての形質転換体の正確な挿入を得る効果的な方法であった。発明者らが観察したわずかの異常現象は、おそらくｌｅｕ１反復ＤＮＡに作用するＳ．ｐｏｍｂｅ組み換え系に主として起因する。インテグラーゼ産生がそのプロモーターの発現により制限されていた場合、形質転換体の数を背景レベル付近にまで減らした。この条件下で、ΦＣ３１部位特異的組み換えから誘導された修復形質転換体はほとんどなかった。真核細胞におけるΦＣ３１部位特異的組み換え系の機能的操作により、トランス遺伝子および染色体のマニピュレーションを行う新たな機会が与えられた。ΦＣ３１系をａｔｔＢおよびａｔｔＰ部位の選択的配置と共に用いて、ＤＮＡの削除、反転または挿入を行うことができる。この系の重要な特徴は、ａｔｔＢ×ａｔｔＰ反応が切り取り特異的タンパク質の不存在下で不可逆という点である。
【００９１】
（実施例２）
ΦＣ３１インテグラーゼはＣＨＯ細胞中で安定な組込みを作る役目をする。
この実施例では、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞におけるａｔｔＢ組み換え部位とａｔｔＰ組み換え部位との間の組み換えを仲介する能力に関してΦＣ３１インテグラーゼをテストする実験を説明する。
【００９２】
（方法）
ゼオシン耐性を与える選択マーカーを含んだＣＨＯ細胞株５１ＹＴ２１１をａｔｔＰ含有プラスミドｐＦＹ１で形質転換した（図２）。単一コロニーを２回精製した後、６つのゼオシン耐性細胞株を分離した。サザンＤＮＡハイブリダイゼーションによる分析により、６つの細胞株のそれぞれが、ゲノム内に組込みされたｐＦＹ１の少なくとも一分子を有することが確認された。
【００９３】
６つの細胞株のそれぞれをａｔｔＢ含有プラスミドｐＦＹ９およびｉｎｔ含有プラスミドｐＦＹ６でトランスフェクトし、ｐＦＹ９上のａｔｔＢ部位とｐＦＹ１の染色体コピー上のａｔｔＰ部位との間の部位特異的組み換えに対するテストを行った。コントロールとして、同じ細胞株をｐＦＹ９で形質転換したが、ｉｎｔ含有ｐＦＹ６は用いなかった。ｐＦＹ９プラスミドは、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下でネオマイシン耐性選択マーカーおよびプロモーターに結合していない緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードした配列を含んでいた。したがって、部位特異的組み換えが、ｐＦＹ１に含まれるヒト・サイトメガロウイルス・プロモーターの制御下でＧＦＰコード化配列を配置し、その結果ＧＦＰを発現することが予想された。
【００９４】
（結果）
トランスフェクションの結果：ネオマイシン耐性コロニーを顕微鏡下に置き、ＧＦＰ遺伝子の活性の有無を観察した。ｐＦＴ９＋ｐＦＹ６でトランスフェクションした細胞では大部分が、しかしｐＦＹ９のみでトランスフェクションした細胞ではごく僅かが、ＧＦＰ活性を示した。このことは、ｐＦＹ６でトランスフェクションした場合のｐＦＹ９の部位特異的組込みおよび共トランスフェクションｉｎｔ遺伝子の不存在下のｐＦＹ９の無作為挿入と一致する。
【００９５】
Ｐｃ（ヒト・サイトメガロウイルス・プロモーター）およびＧＦＰ（図２）に対応するプライマー対を用いてＰＣＲ分析を行った。これらのプライマーは、組込み接合に対応する約０．６ｋｂのバンドを増幅すると予想された。部位特異的組込みと無作為組込みの両者からネオマイシン耐性コロニーが生じる場合があり、かつＧＦＰマーカーは選択的形質を与えないので、構成クローンの純粋な培養株を得ることは困難であった。したがって、各トランスフェクション株から得たネオマイシン体制細胞のプールをＰＣＲ分析に供し、ネオマイシン耐性細胞間に組込み接合が存在するか否かを調査した。大きさが約０．６ｋｂと予想されるバンドを２つの株から得た。これは、ａｔｔＢ×ａｔｔＰ組み換え接合により、ＰｃとＧＦＰの結合が形成されることを示している。
【００９６】
（実施例３）
ΦＣ３１インテグラーゼはＣＨＯ細胞中で部位特異的組み換えを触媒する。
本実施例では、ΦＣ３１インテグラーゼをテストして、ａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部位との間の組み換えにより、ＤＮＡ分子をチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の染色体中に組込む能力を調べた。
【００９７】
（方法）
プラスミドコンストラクト
染色体ａｔｔＢ標的コンストラクトｐＦＹ１２、ｐＦＹ１４およびｐＦＹ１５
プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をベクターバックボーンとして用いた。長さの異なるａｔｔＢ部位を含有し、ＨｉｎｄＩＩＩ部位とＫｐｎＩ部位に隣接した合成オリゴヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ／ｌａｃＺのＨｉｎｄＩＩＩ （ＡＡＧＣＴＴ）部位とＫｐｎＩ （ＧＧＴＡＣＣ）部位との間に挿入した。
プラスミドｐＦＹ１２は９０ｂｐのａｔｔＢ 配列（ＡＡＧＣＴＴ ｇａｃｇｇｔｃｔｃｇ ａａｇｃｃｇｃｇｇｔ ｇｃｇｇｇｔｇｃｃａ ｇｇｇｃｇｔｇｃｃｃ ｔｔｇｇｇｃｔｃｃｃ ｃｇｇｇｃｇｃｇｔａ ｃｔｃｃａｃｃｔｃａ ｃｃｃａｔｃｔｇｇｔ ｃｃａｔｃａｔｇａｔ ＧＧＴＡＣＣ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を含有する。
プラスミドｐＦＹ１４は５０ ｂｐのａｔｔＢ部位（ＡＡＧＣＴＴ ｇｃｇｇｇｔｇｃｃａ ｇｇｇｃｇｔｇｃｃｃ ｔｔｇｇｇｃｔｃｃｃ ｃｇｇｇｃｇｃｇｔａ ｃｔｃｃａｃｃｔｃａ ＴＧＧＴＡＣＣ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）を含有する。
プラスミドｐＦＹ１５は３０ ｂｐのａｔｔＢ（ＡＡＧＣＴＴ ｃｃａｇｇｇｃｇｔｇ ｃｃｃｔｔｇｇｇｃｔ ｃｃｃｃｇｇｇｃｇｃ ＡＴＧＧＴＡＣＣ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を含有する。
【００９８】
ａｔｔＰプラスミドｐＦＹ１７、ｐＦＹ１９、ｐＦＹ２０の組込み
ハイグロマイシンに対する耐性のためにコードし、ｐＥＤ１１３から得られた１．６ｋｂのＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ断片として得られたｈｐｔ遺伝子を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫのＢａｍＨＩとＫｐｎＩとの間に挿入してコントロールプラスミドｐＢＳＫ−ｈｐｔを作った。
【００９９】
長さの異なるａｔｔＰ部位を含有する合成オリゴヌクレオチドをｐＢＳＫ−ｈｐｔ中のＳａｃＩ（ＧＴＣＧＡＣ）部位とＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）部位との間に挿入し、 次のプラスミドを作った。
ａ）９０ｂｐのａｔｔＰ部位（ＧＡＧＣＴＣ−ｇａａｇｃｇｇｔｔｔ ｔｃｇｇｇａｇｔａｇｔｇｃｃｃｃａａｃｔ ｇｇｇｇｔａａｃｃｔ ｔｔｇａｇｔｔｃｔｃ ｔｃａｇｔｔｇｇｇｇ ｇｃｇｔａｇｇｇｔｃ ｇｃｃｇａｃａｔｇａ ｃａｃａａｇｇｇｇｔ−ＧＧＡＴＣＣ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を含有するプラスミドｐＦＹ１７。
ｂ）５０ｂｐのａｔｔＰ部位（ＧＡＧＣＴＣ−ｔｇｃｃｃｃａａｃｔ ｇｇｇｇｔａａｃｃｔ ｔｔｇａｇｔｔｃｔｃ ｔｃａｇｔｔｇｇｇｇ ｇｃｇｔａｇｇｇｔｃ−ＧＧＡＴＣＣ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）を含有するプラスミドｐＦＹ１９。
ｃ）３２ｂｐのａｔｔＰ部位（ＧＡＧＣＴＣ−ａｃｔｇｇｇｇｔａａ ｃｃｔｔｔｇａｇｔｔ ｃｔｃｔｃａｇｔｔｇ ｇｇＡＴＣＣ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７） を含有するプラスミドｐＦＹ２０。
【０１００】
インテグラーゼ発現構成ｐＦＹ６
インテグラーゼ遺伝子のほぼ完全なオープンリーディングフレームを含有するＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＥｃｏＲＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間に挿入した。次いで、Ｋｏｚａｃｋ配列およびインテグラーゼ遺伝子の配列をコードするＮ末端アミノ酸を含有する合成オリゴヌクレオチド（ＧＧＧＣＣＣＧＣＣＡＣＧＡＴＧＡＣＡＣＡＡＧＧＧＧＴＴＧＴＧＡＣＣＧＧＧＧＴＧＧＡＣＡＣＧＴＡＣＧＣＧＧＧＴＧＣＴＴＡＣＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＧＣＧＣＧＡＧＣＧＣＧＡＧＡＡＴＴＣ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）をＡｐａＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間に挿入して、オープンリーディングフレームを再構成した。この方向は、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（−）中でＣＭＶ（ヒト・サイトメガロウイルス）プロモーターの制御下で、完全なインテグラーゼコード化領域を配置する。
【０１０１】
トランスフェクション・プロトコール
ＣＨＯ細胞株Ｋ−１をａｔｔＢ標的コンストラクトｐＦＹ１２、ｐＦＹ１４またはｐＦＹ１５でトランスフェクションした（図３）。これらのプラスミドは、ネオマイシン耐性に対する選択マーカー、およびｐＣ（ヒト・サイトメガロウイルス・プロモーター）とｌａｃＺコード化領域との間に位置する種々の長さのａｔｔＢ部位を有する。プラスミドｐＦＹ１２、ｐＦＹ１４およびｐＦＹ１５は、それぞれ９０、５０および３０ｂｐのａｔｔＢ配列を含有する。ネオマイシン耐性細胞株を単一コロニーの連続精製により得た。各コンストラクトの４つの株を組込み実験に用いた。
【０１０２】
１２株のそれぞれに、ΦＣ３１インテグラーゼ発現プラスミドｐＦＹ６を、組込みベクターｐＦＹ１７、ｐＦＹ１９またはｐＦＹ２０と共にトランスフェクションした。プラスミドｐＦＹ１７、ｐＦＹ１９およびｐＦＹ２０は、それぞれ長さ９０、５０および３２ｂｐのａｔｔＰ配列を有する。ａｔｔＰ配列をｈｐｔオープンリーディングフレームの上流に置いた。このａｔｔＰ配列は、ハイグロマイシン耐性を与えるハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼをコードする。ａｔｔＰ−ｈｐｔ部分の上流にプロモーターは無く、したがってｈｐｔコード化領域にゲノムプロモーターを融合するようにプラスミドをゲノムに組込みしない限り、ｈｐｔは発現しない。ｐＢＳＫ−ｈｐｔをコントロールに用いて、ｈｐｔへのプロモーター融合の頻度を監視した。ａｔｔＰ配列が無いという点を除いて、プラスミドｐＢＳＫ−ｈｐｔはｐＦＹ１７、ｐＦＹ１９およびｐＦＹ２０と同一である。ａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部位との間の組み換えは、組込みベクターを染色体標的に挿入し、Ｐｃ−ａｔｔＬ−ｈｐｔ結合を発生すると予想される。ｈｐｔの発現はハイグロマイシン耐性を与える。
【０１０３】
結果
トランスフェクションの結果：１２細胞株にトランスフェクションされた各組込みプラスミドに対して、ハイグロマイシン耐性コロニーを記録した（表２）。１×１０６細胞を塗布したものから、ｐＢＳＫ−ｈｐｔトランスフェクションは顕著に多数の耐性コロニーの産生に失敗した。これは、ゲノムプロモーターに与えるｈｔｐコード化領域の頻度が著しく低いことを示している。対照的に、ｐＦＹ１７、ｐＦＹ１９およびｐＦＹ２０は、特定の組込みプラスミドおよび特定の細胞株によっては、最大で千倍のハイグロマイシン耐性コロニーを生じた。ｐＦＹ１９またはｐＦＹ１７をＦＹ１２中にトランスフェクションしたものから、より多くのハイグロマイシン耐性コロニーが生じた。これは、より長いａｔｔＢ配列とａｔｔＰ配列との間の組み換えは、より短いａｔｔＢ部位とａｔｔＰ部位との間の組換えよりもより効率的であることを示している。
【０１０４】
ＰＣＲを用いて、代表的コロニーから予想される約０．８ｋｂ接合バンドを検出した。ヒト・サイトメラロウイルス・プロモーターおよびｈｐｔコード化領域に対応するプライマーは、予想サイズ（０．８ｋｂ）のＰＣＲ産生物を増幅した。これは、Ｐｃがｈｐｔコード化領域に結合していることを示しており、ゲノムのａｔｔＢ部位とプラスミドａｔｔＰ配列との間の組み換えと一致する。
【０１０５】
【表２】
（実施例４）
ΦＣ３１インテグラーゼは植物染色体中でａｔｔＰ部位およびａｔｔＢ部位を組み換える働きをする。
本実施例は、ΦＣ３１インテグラーゼをテストして、植物染色体中に存在するａｔｔＰ部位およびａｔｔＢ部位を組み換える能力を調べた実験についての説明である。本実験の作成物および方法を図４に示す。
【０１０７】
方法
コンストラクトｐＷＰ２９は、３５Ｓ−ａｔｔＰ−ｎｐｔ−ａｔｔＢ−ｇｕｓからなりＲＢおよびＬＢに隣接した断片を含有する。ここにおいて、３５Ｓはカリフラワー・モザイクウイルス・プロモーターであり、ｎｐｔはネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼをコードする領域であり、ｇｕｓはグルクロニダーゼをコードする領域である。ＲＢおよびＬＢは、それぞれ右および左アグロバクテリウムＴ−ＤＮＡ境界配列である。３５Ｓとｎｐｔとの間のａｔｔＰ部位は非翻訳リーダー配列としての機能を果す。３５Ｓによるｎｐｔの転写によりカナマイシン耐性が与えられる。上流にプロモーターが無いので、ｇｕｓコード化領域は転写されない。
【０１０８】
植物形質転換に用いる第２のコンストラクトはｐＷＰ２４である。このコンストラクトはＲＢおよびＬＢに隣接する断片Ｐｎｏｓ−ｎｐｔ−３５Ｓ−ｉｎｔを含有する。ここにおいて、Ｐｎｏｓはノパリンシンターゼ・プロモーターであり、ｉｎｔはΦＣ３１インテグラーゼコード化領域である。ｎｐｔとｉｎｔの両者が、それぞれ上流のプロモーターから転写される。
【０１０９】
この２つのコンストラクトが同じゲノム中に存在する場合、ｐＷＰ２４を有する染色体からのｉｎｔの発現により、機能性ΦＣ３１インテグラーゼが発生し、ｐＷＰ２９を有する染色体上に位置するａｔｔＢ部位とａｔｔＰ部位との間の組み換えを触媒すると考えられた。組み換え現象により、ｐＷＰ２９構造体からｎｐｔ遺伝子を削除すること、およびｇｕｓに３５Ｓを与えることが予想された。得られる構造は３５Ｓ−ａｔｔＲ−ｇｕｓであり、ここでａｔｔＲは、ａｔｔＰとａｔｔＢとの間の組み換えにより形成されたハイブリッド部位であり、ＰＢ’とも表される（図４）。ｎｐｔの削除により３５Ｓの転写下でｇｕｓが得られ、かつＧＵＳ酵素活性を有する植物を生じると予想された。この活性は、植物組織を組織化学的に染色することにより検出することができる。
【０１１０】
結果
一時発現アッセイを行って、ｐＷＰ２９が組み換えに対して機能的であるか否かを調べた。裸のＤＮＡの遺伝子銃で仲介した送達により、ｐＷＰ２９をトウモロコシＢＭＳ細胞中にｐＷＰ８と共導入した。コンストラクトｐＷＰ８は、単子葉植物細胞中で発現するためのトウモロコシ・ユビキチン・プロモーターの後方に融合したインテグラーゼ遺伝子を有する。両方のプラスミドを共導入した場合には青色点が観察されたが、プラスミドの一方のみを用いた場合には、これは見つからなかった。このことは、トウモロコシ細胞中で部位特異的組み換えが起きたこと、およびｐＷＰ２９中のａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部位とが機能性部位であることを示している。
【０１１１】
カナマイシン耐性タバコ植物体を、ｐＷＰ２９またはｐＷＰ２４を用いてアグロバクテリウムで仲介した形質転換により再生した。もう一度、一時発現アッセイを行って、ｐＷＰ２４株が機能性インテグラーゼを産生するか否かを調べた。コンストラクトｐＷＰ２９を、裸のＤＮＡの遺伝子銃で仲介した送達により、ｐＷＰ２４植物体に導入した。ｐＷＰ２９ＤＮＡを有する細胞は、３５Ｓ−ａｔｔＲ−ｇｕｓ構成の形成の結果、ＧＵＳ酵素活性を発現すると予想された。実際、２つの株２４．３および２４．４は、ａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部位との間の機能性インテグラーゼ仲介部位特異的組み換えと一致した青色点を生じた。
【０１１２】
これら２つのｐＷＰ２４インテグラーゼ株をｐＷＰ２９テスター株と交雑して、ｐＷＰ２９とｐＷＰ２４とを同じゲノムに保有する染色体を有する子孫を作った。インテグラーゼ（２４．３、２４．４）とテスター株（２９．２、２９．４、２９．５、２９．１９）との間の遺伝子交雑から得られた結果を表３にまとめた。いずれの場合も、代表的子孫苗を選択せずに発芽させ、ＧＵＳ酵素活性に対して組織化学的に染色した。青色に染色された子孫の数を表に示した。一次形質転換したｐＷＰ２４およびｐＷＰ２９株は代表的トランス遺伝子に対してヘミ接合性であるので、子孫の４分の１だけが両方のトランス遺伝子型を保有することが期待された。サンプル数が少ないので、期待頻度からの顕著な偏差は異常ではない。
【０１１３】
【表３】
親株として用いた株の組合せにより、染色の強度が変わった。組織の大部分が青色に染まった子孫を有するものは、組み換え現象がより効率的であったことを示している。逆に、染色が均一でない子孫を与えるものは、組み換え現象がより非効率であったことを示している。異なる子孫プールの間のこの偏差は、恐らくトランス遺伝子の組込み位置により生じる効果によるものである。２つのインテグラーゼ株のうち、２４．４は促進部位特異的組み換えにおいてより効率的に現れる。これは、恐らくｉｎｔ遺伝子発現のレベルが高いことによる。２４．４を２９．４および２９．１９に交雑して作った染色パターンは、ａｔｔＢおよびａｔｔＰのｉｎｔ仲介部位特異的組み換えによりｇｕｓ遺伝子活性の活性化を招くという、本実験の目的に一致する。
【０１１５】
（実施例５）
ΦＣ３１インテグラーゼは、植物染色体中への環状プラスミドの組み込みを触媒する。
本実施例は、ΦＣ３１インテグラーゼをテストして、ａｔｔＰ×ａｔｔＢ部位特異的組み換えにより植物染色体中に環状プラスミドを挿入する能力を調べた実験についての説明である。本実験を図５に図示する。
【０１１６】
方法
標的コンストラクトｐＷＰ６は、ＲＢおよびＬＢに隣接し３５Ｓ−ａｔｔＰ−ｎｐｔからなる断片を含む。３５Ｓとｎｐｔとの間のａｔｔＰ部位は非翻訳リーダー配列としての役割を果す。３５Ｓによるｎｐｔの転写によりカナマイシンに対する耐性が得られる。
【０１１７】
組み込んだコンストラクトｐＹＪＣ４３は断片ａｔｔＢ−ｈｐｔを有する。ここで、ｈｐｔはハイグロマイシンに対する耐性をコードしている。インテグラーゼ発現コンストラクトはｐＹＪＣ４１であり、３５Ｓはｉｎｔを転写する。
【０１１８】
標的コンストラクトｐＷＰ６を、ｐＷＰ６ＤＮＡの無作為組込みにより植物染色体中に配置した。次いで、ｐＷＰ６トランス遺伝子の単一コピーを含んだカナマイシン耐性植物をｐＹＪＣ４３およびｐＹＪＣ４１で形質転換した。ｐＹＪＣ４１から得たｉｎｔの一時発現が、ｐＹＪＣ４３のａｔｔＢ部位とｐＷＰ６トランス遺伝子の染色体的に定まったａｔｔＰ部位との間の組み換えを触媒することが期待された。ａｔｔＢ部位とａｔｔＰ部位との間の特異的組み換えにより、ｐＹＪＣ４３環状分子が染色体に挿入され、３５Ｓ−ａｔｔＬ−ｈｐｔ連鎖を作ることが期待された。ａｔｔＰ部位およびａｔｔＢ部位は逆方向に図示されているので、ａｔｔＬ部位も同様に逆方向にするか、または図中のＢＰ’を逆方向にしたものと同じＰ’Ｂで表すことに留意されたい。機能性３５Ｓ−ａｔｔＬ−ｈｐｔ連鎖はハイグロマイシン耐性表現型を与えた。
【０１１９】
結果
ｐＷＰ６を有するカナマイシン耐性タバコ植生を、アグロバクテリウム仲介形質転換により得た。サザンハイブリダイゼーション分析により、ｐＷＰ６トランス遺伝子の単一コピーを有する株を検出した。この株の子孫ＷＰ６．１を無菌的に発芽させ、これらの植物からプロトプラストを作った。このプロトプラストを、ｐＹＪＣ４３とｐＹＪＣ４１ＤＮＡとを組合せ、直接ＤＮＡ形質転換のためのポリエチレングリコール法により形質転換した。次いで、プロトプラストをアガロース中に埋め込み、培養してハイグロマイシン存在下でカルスを形成した。ハイグロマイシンを選択しない場合には、カルス形成速度は４×１０−４であった。これは通常の１０分の１であるが、プロトプラスト形質転換実験で観察される偏差の範囲内である。ハイグロマイシンを選択する場合には、カルス形成速度は７×１０−５であった。これは、プロトプラストから再生されたカルスの約１８％が、標的部位に組込みベクターを含有することを示している。インテグラーゼコンストラクトｐＹＪＣ４１を形質転換から除外した場合、カルス形成速度は１×１０−５未満であった。プラスミドｐＹＪＣ４１を発現するインテグラーゼの封入により作られたハイグロマイシン耐性カルスの頻度がより高いことは、ｐＹＪＣ４３の染色体ａｔｔＰ標的へのインテグラーゼ促進部位特異的組込みと一致する。
【０１２０】
本明細書で説明した実施例および実施態様は例示目的のためだけのものであって、当業者にとってこれらを考慮した種々の変更または修正は示唆されており、かつこれらの変更または修正は本明細書の精神および範囲、ならびに特許請求の範囲に含まれることを理解されたい。本明細書中で引用した刊行物、特許および特許出願書類の全てを、全ての目的のためにここに参照により組み入れる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、S．pombe leul Locusで染色体構造の概略的な外観を示す（縮小）。PLT４４の染色体への相同的挿入（図１A）は、図１Bで示されるようなleul 対立遺伝子間のΦC31 attP標的を設置する。
pLT45の染色体attP標的内へのpLT43促進部位特異的組み込みは、図１Cに示す構造を導入する。矢印は、T7プロモーター（T7）、T3プロモーター（T3）及びura４＋コード化領域（U4）に対応するPCRプライマーを示す。XbalI（X）切断産物の予想される大きさを示す。
【図２】 図２は、ΦC31インテグラーゼが、CHO細胞におけるグリーン蛍光タンパク質（GFP）をコード化するトランス遺伝子の部位特異的組み込みを触媒することを証明する実験の概略を示す。
【図３】 図３は、ΦC31が、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を染色体に位置したプロモーターの下流に挿入するためにattB部位での特異的組み換えを触媒することを証明する実験の概略図を示す。成功した組み込みは、Pc-att-hptリンケージ及びハイグロマイシン耐性表現型を生産する。attP及びattB部位の異なる長さの影響を、指標したプラスミドを使用して分析した。
【図４】 図４は、タバコゲノム由来のattB及びattP部位によって隣接させたDNAの切り取りを触媒することを示す実験の概略的な図表を示す。
【図５】 図５は、ΦC31インテグラーゼがタバコゲノムへのトランス遺伝子の組み込みを触媒したことを示す実験の概略的な図表を示す。
Claims (47)
- 原核リコンビナーゼポリペプチド又は原核リコンビナーゼをコード化する核酸を含有する非ヒト真核細胞であって、リコンビナーゼは、第一の組換え部位と、前記細胞において存在し、そして前記第一の組換え部位との組換えのための基質として作用可能な第二の組換え部位との間の部位特異的分子間組換えを媒介することが可能であるが、真核細胞に存在しない付加的因子の不存在下で第一の組換え部位と第二の組換え部位との間の組換えで形成される2つのハイブリッドリコンビナーゼ組換え部位間の組換えを媒介することが不可能であり、第一の組換え部位がａｔｔＢ部位であり、及び第二の組換え部位がａｔｔＰ部位である、非ヒト真核細胞。
- リコンビナーゼはΦＣ３１リコンビナーゼである、請求項1記載の細胞。
- 植物細胞である、請求項1又は２記載の細胞。
- 動物細胞である、請求項１又は２記載の細胞。
- 酵母細胞である、請求項１又は２記載の細胞。
- さらに、細胞が第一リコンビナーゼ組換え部位を含む、請求項1又は２記載の細胞。
- 細胞が、真核細胞においてリコンビナーゼコード化ポリヌクレオチドの発現を媒介するプロモーターに作用可能に結合した、リコンビナーゼポリペプチドに対するコード化配列を含む核酸を含有する、請求項1又は２記載の細胞。
- さらに、核酸が選択マーカーを含む、請求項７記載の細胞。
- プロモーターが誘導又は抑制プロモーターである、請求項７記載の細胞。
- 核酸がプラスミド核酸である、請求項９記載の細胞。
- 真核細胞が、動物細胞、植物細胞、酵母細胞、及びカビ細胞からなる群から選択される、請求項７記載の細胞。
- 真核細胞が哺乳類の細胞である、請求項１１記載の細胞。
- 非ヒト真核細胞が多細胞生物の一部である、請求項１１記載の細胞。
- 非ヒト真核細胞において部位特異的組換えを得るための方法であって、
第一の組換え部位と、前記第一の組換え部位との組換えのための基質として作用可能な第二の組換え部位とを含む非ヒト真核細胞を供給すること、
第一及び第二の組換え部位を原核生物リコンビナーゼポリペプチドと接触させて、組換え部位間で組換えを生じさせ、それによって一又は二つのハイブリッド組換え部位を形成することを含み、
リコンビナーゼポリペプチドが、第一及び第二の組換え部位の間の部位特異的分子間組換えを媒介することが可能であるが、真核細胞に存在しない付加的因子の不存在下で2つのハイブリッド組換え部位間の組換えを媒介することが不可能であり、第一の組換え部位がａｔｔＢ部位であり、及び第二の組換え部位がａｔｔＰ部位である、方法。 - リコンビナーゼはバクテリオファージΦＣ３１リコンビナーゼである、請求項１４記載の方法。
- 真核細胞が、酵母細胞、カビ細胞、植物細胞、及び動物細胞からなる群から選択される、請求項１４又は１５記載の方法。
- 第一の組換え部位が真核細胞の染色体に存在する、請求項１４又は１５記載の方法。
- 第二の組換え部位が真核細胞の第二の染色体に存在し、第一及び第二の組換え部位をリコンビナーゼと接触させて染色体アームのトランスロケーションを生じさせる、請求項１７記載の方法。
- 第一の組換え部位と第二の組換え部位が単一核酸分子に存在する、請求項１４又は１５記載の方法。
- 第一の組換え部位及び第二の組換え部位が直線方向（direct orientation）である、請求項１９記載の方法。
- 組換えが、第一及び第二の組換え部位の間にある核酸分子の部分の切り取りを生じさせる、請求項２０記載の方法。
- 第一の組換え部位と第二の組換え部位が逆方向である、請求項１９記載の方法。
- 組換えが、第一及び第二の組換え部位の間にある核酸分子の部分の逆位を生じさせる、請求項２２記載の方法。
- 真核細胞が、リコンビナーゼポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含む、請求項１４記載の方法。
- リコンビナーゼコード化ポリヌクレオチドは、真核細胞におけるポリヌクレオチドの発現を媒介するプロモーターに作用可能に結合する、請求項２４記載の方法。
- プロモーターが誘導又は抑制プロモーターである、請求項２５項記載の方法。
- プロモーターがＰｍｎｔプロモーターである、請求項２６記載の方法。
- 安定的に組み込んだトランス遺伝子を有する非ヒト真核細胞を得るための方法であり、
トランス遺伝子及び、第一の組換え部位との組換えのための基質として作用することが可能な第二の組換え部位を含む核酸を、第一の組換え部位を含む真核細胞の中に導入すること、及び
第一及び第二の組換え部位を原核リコンビナーゼポリペプチドに接触させて、リコンビナーゼポリペプチドが、第一及び第二の組換え部位の間の組換えを触媒し、第一の組換え部位で核酸の組み込みを生じさせ、それによって、核酸の各末端でハイブリッド組換え部位を形成することを含み、
リコンビナーゼポリペプチドが、第一及び第二の組換え部位の間の部位特異的分子間組換えを媒介することが可能であるが、真核細胞に存在しない付加的因子の不存在下で2つのハイブリット組換え部位間の組換えを媒介することが不可能であり、第一の組換え部位はａｔｔＢ部位であり、および第二組換え部位はａｔｔＰ部位である、方法。 - リコンビナーゼはバクテリオファージΦＣ３１リコンビナーゼである、請求項２８記載の方法。
- 細胞は植物細胞である、請求項２８又は２９記載の方法。
- 細胞は動物細胞である、請求項２８又は２９記載の方法。
- リコンビナーゼポリペプチドを真核細胞の中へリコンビナーゼポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの発現によって導入する、請求項２８記載の方法。
- リコンビナーゼポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドが、真核細胞において機能するプロモーターに作用可能に結合する、請求項３２記載の方法。
- プロモーターが誘導又は抑制プロモーターである、請求項３３記載の方法。
- 真核細胞において機能するプロモーターに作用可能に結合した細菌性リコンビナーゼポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列を含む核酸であり、リコンビナーゼポリペプチドが第一及び第二の組換え部位の間の部位特異的分子間組換えを媒介することが可能であり、及び付加的因子の不存在下において第一の組換え部位及び第二の組換え部位の間の組換えで形成された2つのハイブリッド組換え部位の間の組換えを媒介することができず、及び第一組換え部位はａｔｔＢ部位であり、および第二組換え部位はａｔｔＰ部位である、核酸。
- リコンビナーゼがバクテリオファージΦＣ３１リコンビナーゼである、請求項３５記載の核酸。
- さらに、核酸がリコンビナーゼポリペプチドによって認識される少なくとも1つの組換え部位を含む、請求項３５記載の核酸。
- 核酸には、プラスミドベクターが含まれる、請求項３５又は３６記載の核酸。
- 非ヒト真核細胞であって、その染色体上の第一のΦＣ３１リコンビナーゼ組換え部位及びトランス遺伝子及び第一の組換え部位と共にΦＣ３１リコンビナーゼによって媒介される分子間組換えのための基質として作用することが可能な第二のΦＣ３１リコンビナーゼ部位を含む導入されたポリヌクレオチドを含有する、細胞。
- さらに、導入された核酸には、選択マーカーが含まれる、請求項３９記載の細胞。
- さらに、真核細胞がΦＣ３１リコンビナーゼポリペプチドを含む、請求項３９記載の細胞。
- さらに、真核細胞がΦＣ３１リコンビナーゼポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを含む核酸を含有する、請求項３９記載の細胞。
- さらに、ΦＣ３１リコンビナーゼをコード化する核酸が選択マーカーを含む、請求項４２記載の細胞。
- さらに、ΦＣ３１リコンビナーゼをコード化する核酸が、細胞においてΦＣ３１リコンビナーゼコード化ポリペプチドの発現を生じるプロモーターを含有する、請求項４２記載の細胞。
- プロモーターが誘導プロモーターである、請求項４４記載の細胞。
- 真核細胞が、酵母細胞、カビ細胞、植物細胞、及び動物細胞からなる群から選択される、請求項３９記載の細胞。
- 非ヒト真核細胞であり、その染色体上のａｔｔＰ組換え部位を含み、及びトランス遺伝子及び、ａｔｔＰ組換え部位との分子間組換えのための基質として作用することが可能なａｔｔＢ組換え部位を含む導入されたポリヌクレオチドを含有する、細胞。
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