JP2003505065A - バクテリオファージｐｈｉｃ３１組み換え系による真核細胞におけるｄｎａ組み換え - Google Patents

バクテリオファージｐｈｉｃ３１組み換え系による真核細胞におけるｄｎａ組み換え

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、核酸の真核細胞への特異的かつ安定した組み込みを得るための方法を提供する。本発明は、組み換え部位間の組み換えを仲介するが、組み換えで形成されたハイブリッド組み換え部位間では仲介しないΦC31インテグラーゼなどの原核リコンビナーゼを使用した部位特異的組み換え系を応用する。それゆえ、組み換えは、追加の因子の不存在下では不可逆である。リコンビナーゼポリペプチド又はリコンビナーゼをコード化する遺伝子を含む真核細胞も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
連邦政府が後援する研究に関する説明 本発明は、政府の指示で米国農務省、農業リサーチサービスによって授与され
た許可No.5335-21000-009-06Sの下でなされた。政府は本発明において一定の権
利を有する。
【０００２】 関連出願への相互参照 本出願は、ここで参照として組み込む1999年7月23日に出願された米国仮出願
番号60/145,469の利益をクレームする。
【０００３】 本発明は、真核細胞の染色体の中への特異的かつ安定した核酸の組み込みを得
るための方法の分野に関する。本発明は、ΦC31インテグラーゼなどの原核リコ
ンビナーゼポリペプチドを使用する部位特異的組み換え系を利用する。
【０００４】
【従来の技術】
原核の遺伝子形質転換は、しばしば重大な短所に苦しむ。例えば、トランス遺
伝子の組み込みを興味ある特定の座で再生産可能に得ることはしばしば困難であ
る。相同組み換えは、一般に非常に低い頻度でのみ生じる。この問題を克服する
ために、部位特異的組み換え系を用いた。これらの方法は、より高等な原核細胞
において機能することが可能な部位特異的組み換え系の使用を含む。多くのバク
テリオファージ及び組み込みプラスミドは、それらのゲノムをそれらの宿主のも
のの中へ安定に組み込むことが可能な部位特異的組み換え系をコード化する。こ
れらの系において、組み換え反応の最小必要条件は、組み換え現象を触媒するリ
コンビナーゼ酵素又はインテグラーゼ、及び2つの組み換え部位である（Sadowsk
i（1986）J.Bacteriol．165：341-347；Sadowski（1993）FASEB J.7:760-767）
。ファージ組み込み系について、これらは、付着（att）部位といい、ファージD
NA由来のattP因子と、バクテリアゲノムによってコード化されるattB因子がある
。2つの付着部位は、２，３の塩基対と同じくらい小さい配列を共有する。リコ
ンビナーゼタンパク質は、両方のatt部位に結合し、宿主への環状ファージ又は
プラスミドDNAの組み込みを生ずる、DNA鎖のコンサーバティブ（保存型）及び相
互作用交換を触媒する。DNAベンディングタンパク質IHF、組み込み宿主因子など
の追加のファージ又は宿主因子波、効率的な反応に対して要求されるかもしれな
い（Freidman （1988）Cell 55:545-554；Finkel ＆ Johnson（1992）Mol.Micro
biol. 6：3257-3265）。逆切り取り反応は、時折、ファージλのxis遺伝子産物
などの追加のファージ因子を必要とする。（Weisberg ＆ Landy（1983）“ファ
ージλにおける部位特異的組み換え”In Lambda II、eds. Hendrix et al．（Co
ld Dpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）pp.211−250；Landy
（1989）Ann.Rev.Biochem. 58：913−949）。
【０００５】 リコンビナーゼは、2つのグループ、λインテグラーゼ（Argos et al.（1986
）EMBO J．5：433-44；Voziyanov et al（1999）Nucl. Acids Res.27:930-941）
、及びリゾルバーゼ/転化酵素属（Hatfull ＆ Grindley （1988）“Resolvases
and DNA−invertase：a family of enzymes active in site-specific recombin
ation” In Genetic Recombination, eds. Kucherlipati, R., & Smith, G.R. (
Am. Soc. Microbiol., Wachington DC), pp. 357-396）に分類される。これらは
、インテグラーゼ酵素の構造、及び触媒のそれらのモードの分子詳細を変える（
Stark et al. （1992）Trends Genetics ８：432−439）。鋳型Streptomyces フ
ァージΦC31は、後者の分類の68kDリコンビナーゼをコード化する。同系の付着
部位を組み換える際にΦC31インテグラーゼ酵素の有効性が、試験官内及び生体
内でrecA突然変異体大腸菌において最近証明された（Thorpe ＆ Smith（1998）P
roc．Nat’ｌ. Acad．Sci．USA95:5505−5510）。ΦC31インテグラーゼ反応は、
おそらく追加のファージタンパク質が切り取りに要求されないために、宿主因子
を必要とせず、不可逆であるようであるという点においてシンプルである。ファ
ージ及びバクテリアatt部位は、クロスオーバー点で相同性の3つの塩基対だけを
共有する。この相同関係は、逆方向反復、おそらくインテグラーゼタンパク質の
結合部位によって隣接する。両方のattB及びattPに対する最小の既知の機能的な
大きさは、〜５０bpである。
【０００６】 バクテリオファージP1のCre-lox系、及びSaccharomyces cerevisiae のFLP−F
RT系は、動物及び植物におけるトランス遺伝子及び染色体工学技術に広く使用さ
れている（Sauer（1994）Curr．Opin．Biotechnol.５：521−527；Ow（1996）Cu
rr.Opin．Biotechnol.７：181−186）。動物又は植物細胞において作用する他の
系は、以下すなわち、１）Zygosaccharomyces rouxii 由来のR−RS系（Onouchi
et al（1995）Mol. Gen．Genet．247:653−660）、２）バクテリオファージMu由
来のGin−gix系（Maeser ＆ Kahmann（1991）Mol．Gen．Genet．230:170−176）
、及び３）バクテリアプラスミドpSM19035 由来のβリコンビナーゼ−six系（Di
az et al．（1999）J．Biol．Chem．274:6634−6640）、を含む。部位特異的リ
コンビナーゼを使用することによって、より高頻度で組み込みを得ることができ
る。
【０００７】 しかしながら、これら5つの系は、重大な短所を有する。各これらの系は、単
一のポリペプチドリコンビナーゼは、同一かほぼ同一の配列の2つの部位間の組
み換えを触媒するという共通した特性を有する。組み換えによって生じた生産部
位は、それ自体次の組み換えに対する基質である。結果として、組み換え反応は
容易に可逆可能である。分子内相互作用の反応速度論は、分子間相互作用に渡っ
て好ましいので、これら組み換え系は、DNAを組み込むよりむしろ削除するのに
有効である。したがって、トランス遺伝子の安定的な部位特異的組み込みを得る
ための方法と系に対する必要性が存在する。本発明は、この及び他の必要性を、
満たす。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、真核細胞において、安定で、部位特異的な組み換えを得るための方
法を提供する。以前に知られた部位特異的組み換え方法と違って、本発明の方法
を使用して得られた組み換え体は、安定である。組み換え反応は、可逆的ではな
い。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本方法は、第一の組み換え部位と、前記第一の組み換え部位との組み換えの基
質として機能することが可能な第二の組み換え部位とを含む真核細胞を提供する
ことを含む。第一及び第二の組み換え部位は、原核リコンビナーゼポリペプチド
と接触し、組み換え部位間に組み換えを生じ、それによって1又は2つのハイブリ
ッド組み換え部位を形成する。有意義なことに、リコンビナーゼポリペプチドは
、第一及び第二の組み換え部位間の部位特異的組み換えを仲介することができる
が、真核細胞において存在しない追加のファージ生産因子の不存在下で2つのハ
イブリッド組み換え部位間の組み換えを仲介することができないものである。組
み換え部位のいずれか又は両方が真核細胞の染色体において存在することができ
る。いくつかの実施態様において、組み換え部位の1つは染色体に存在し、他は
染色体の中へ組み込まれるべき核酸内に含まれる。
【００１０】 本発明は、原核リコンビナーゼポリペプチド又は原核リコンビナーゼをコード
化する核酸を含む真核細胞も提供する。これらの実施態様において、リコンビナ
ーゼは、第一の組み換え部位と、前記第一の組み換え部位との組み換えの基質と
して作用することが可能な第二の組み込み部位との間の部位特異的組み換えを仲
介をすることができるが、第一の組み換え部位と第二の組み換え部位との間の組
み換えに形成された2つのハイブリッド組み換え部位間の組み換えを、真核細胞
に存在しない追加の因子の不存在下では仲介することができないものである。現
在好ましい実施態様において、本発明の細胞は、リコンビナーゼポリペプチドの
コード化配列を有する核酸を含む。リコンビナーゼコード化配列は、真核細胞に
おいてリコンビナーゼコード化ポリヌクレオチドの発現を仲介するプロモーター
と作用可能に結合することが好ましい。本発明の真核細胞は、例えば、動物細胞
、植物細胞、酵母細胞、又はカビ細胞とすることができる。
【００１１】 別の実施態様において、本発明は、安定に組み込んだトランス遺伝子を有する
真核細胞を得るための方法を提供する。これらの方法は、第一の組み換え部位を
含む真核細胞の中へ核酸を導入することを含み、前記核酸は興味あるトランス遺
伝子と前記第一の組み換え部位との組み換えの基質として作用することが可能な
第二の組み換え部位とを含むことを特徴とする。第一及び第二の組み換え部位は
、原核リコンビナーゼポリペプチドと接触する。リコンビナーゼポリペプチドは
、第一及び第二の組み換え部位間の組み換えを触媒し、第一の組み換え部位で核
酸の組み込みを生じ、それによって核酸の各末端でハイブリッド組み換え部位を
形成する。かさねて、リコンビナーゼポリペプチドは、第一及び第二の組み換え
部位間の部位特異的組み換えを仲介するが、真核細胞において存在しない付加的
因子の不存在下では2つのハイブリッド組み換え部位間の組み換えを仲介するこ
とができないものである。
【００１２】 本発明の別の実施態様において、真核細胞において機能するプロモーターと作
用可能に結合するバクテリアリコンビナーゼポリペプチドをコード化するポリヌ
クレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明のこれらの核酸によってコード化
されるリコンビナーゼポリペプチドは、真核細胞において存在しないバクテリオ
ファージ因子の不存在下では第一の組み換え部位と第二の組み換え部位との間の
組み換えで形成された2つのハイブリッド組み換え部位間の組み換えを仲介する
ことができない。いくつかの実施態様において、さらに、核酸は、リコンビナー
ゼポリペプチドによって認識される少なくとも1つの組み換え部位を含む。
【００１３】 本発明によって提供される真核細胞は、また、真核細胞において存在しないバ
クテリオファージ因子の不存在下では第一の組み換え部位と第二の組み換え部位
との間の組み換えで形成された2つのハイブリッド組み換え部位を仲介できない1
又はそれ以上のバクテリオファージΦC31組み換え部位、または他のリコンビナ
ーゼに対する組み換え部位を有するポリヌクレオチドを含む。
【００１４】
【発明の実施の形態】
定義 ここで使用するような「外因性DNA断片」、「異質ポリヌクレオチド」、「ト
ランス遺伝子」、「異質核酸」は、異質の起源から特定の宿主へ創造したものか
、あるいは、もし同じ起源由来ならその原型由来のものから修飾したものである
。したがって、宿主細胞における異質遺伝子は、特定の宿主細胞へ内生的である
が、修飾されていない遺伝子を含む。それゆえ、前記用語は、細胞に対して外来
性か、異質か又は相同であるが、因子が通常見られない宿主細胞核酸内に位置す
るDNA断片を言う。外因性のDNA断片を発現させて外因性ポリペプチドを生産する
。
【００１５】 「遺伝子」の語は、生物学上の機能と関係するいずれのDNA断片を表すものと
して広く使用する。したがって、遺伝子は、それらの発現に要求されるコード化
配列及び／又は調節配列を含む。遺伝子は、例えば、他のタンパク質に対する認
識配列を形成する非発現DNA断片も含むことができる。遺伝子は、種々の起源か
ら得ることができ、興味ある起源由来のクローン、または既知の若しくは予想し
た配列情報からゴウセイしたもの、所望のパラメーターを有するように設計され
た配列を含むことができる。
【００１６】 核酸又はタンパク質に適用するとき、「単離」の語は、核酸又はタンパク質が
自然の状態に関係する他の細胞成分が本質的に存在しないことを表す。乾燥して
いるか水溶液のいずれかとすることができるが、均質な状態が好ましい。純度や
均質性は、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高性能液体クロマトグラ
フィーなどの分析化学技術を使用して典型的に決定される。調製において存在す
る有力種であるタンパク質は、本質的に精製される。特に、遺伝子を隣接させて
、興味ある遺伝子以外のタンパク質をコード化するオープンリーディングフレー
ムから単離した遺伝子を分離する。「精製」の語は、電気泳動ゲルにおいて核酸
又はタンパク質が1つのバンドを本質的に生じることを意味する。特に、核酸又
はタンパク質が少なくとも約50％純粋、より好ましくは少なくとも約85％純粋、
最も好ましくは少なくとも約99％純粋であることを意味する。
【００１７】 「自然に生じる」の語は、ヒトによって人工的に生産されることから区別する
ものとして天然に見出すことができる対象を記述するために使用する。例えば、
実験室においてヒトによって意図的に修飾されていない天然の起源から単離する
ことが可能な（ウイルスを含む）組織において存在するポリペプチド、又はポリ
ヌクレオチド配列は、自然に生じる。
【００１８】 「核酸」又は「ポリヌクレオチド」の語は、一本鎖又は二本鎖型のいずれかに
おけるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、及びその重合体を言う
。特に限定しない場合、前記語は、引用核酸と同様の結合特性を有し、自然に生
ずるヌクレオチドと同様の方法で代謝される自然のヌクレオチドの既知のアナロ
グを含有する核酸を包含する。他に指示しない場合、特定の核酸配列は、伝統的
に修飾したその変異体（例えば、縮退コドン置換）、相補的配列、及び明確に指
示した配列も絶対的に包含する。具体的に、1又はそれ以上選択した（又はすべ
ての）コドンの3つの部分を、混合した塩基及び／又はデオキシイノシン残基で
置換した配列を発生させることによって縮退コドン置換を達成することができる
（Batzer et al.（1991）Nucleic Acid Res. 19：5081；Ohtsuka et al．（1985
）J．Biol．Chem。260：2605−2608；Cassol et al.（1992）；Rossolini et al
．（1994）Mol．Cell．Probes ８：91−98）。核酸の語は、遺伝子、遺伝子によ
ってコード化されたｃDNA及びｍRNAと交互に使用される。
【００１９】 「遺伝子から誘導される核酸」とは、遺伝子又はそのサブ配列（例えば、コー
ド化領域）を合成し、最終的に鋳型として機能する核酸を言う。それゆえ、ｍRN
A、ｍRNAから逆転写されたｃDNA、そのｃDNAから転写されたRNA、ｃDNAから増幅
したDNA、増幅したDNAから転写したRNAなどは、すべて遺伝子から誘導され、そ
のように誘導された産物の検出は、オリジナルの存在及び/又は不存在の指示と
なる。
【００２０】 DNA断片は、別のDNA断片と機能ある関係に置かれたとき、「作用可能に結合
」する。例えば、ポリペプチドの分泌に加わるプレタンパク質として発現するな
ら、ポリペプチドをコード化するDNAに、単一の配列についてのDNAは作用可能に
結合する。プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写を刺激するならコード
化配列に作用可能に結合する。一般に作用可能に結合するDNA配列は、隣接と読
み取り段階の両方のシグナル配列の場合、隣接する。しかしながら、例えば、エ
ンハンサーは、それらが制御する転写のコード化配列と隣接する必要がない。結
合は、従来の制限酵素部位、又はその代わりに挿入したアダプター、リンカーで
のライゲーションによって達成される。
【００２１】 「植物」の語は、全植物、植物組織（例えば、葉、茎、根など）、種子、植物
細胞、及び同様の子孫を含む。本発明の方法で使用可能な植物の分類は、形質転
換技術に修正可能なより高い植物の分類と同様に一般に広く、単子葉、双子葉植
物の両方を含む。
【００２２】 「プロモーター」の語は、転写を開始するためにRNAポリメラーゼとの結合に
関わるDNA領域を言う。「誘導プロモーター」は、発現のレベルを、例えば、温
度、pH、転写因子及び化学薬品などの環境又は開発因子によって変更可能である
遺伝子の発現を導くプロモーターをいう。
【００２３】 細胞に関して使用するとき「組み換え」の語は、細胞が異質核酸を複製するか
、又は異質核酸によってコード化されるペプチド又はタンパク質を発現すること
を表す。組み換え細胞は、細胞の野生型（非組み換え型）内では見出すことがで
きないポリヌクレオチドを含むことができる。組み換え細胞は、ポリヌクレオチ
ドが人工的な手段によって細胞の中へ修正又は再導入される細胞の野生型に見出
されるポリヌクレオチドも含む。語は、細胞から核酸を除去することなしに修飾
された細胞に内在する核酸を含む細胞も包含し、そのような修飾は、遺伝子置換
、部位特異的突然変異体、及び関連技術等によって得られるものを含む。
【００２４】 「組み換え発現カセット」又は単なる「発現カセット」は、構造遺伝子の発現
をそのような配列と両立できる宿主において達成することが可能な核酸因子を持
つ組み換え的、又は合成的に発生させた核酸構築物である。発現カセットは、少
なくともプロモーター、及び選択的に、転写終結シグナルを含む。典型的には、
組み換え発現カセットは、転写すべき核酸（例えば、所望のポリペプチドをコー
ド化する核酸）、及びプロモーターを含む。発現を達成する際に必要な又は役立
つ追加の因子をここで述べたように使用することができる。例えば、発現カセッ
トは、宿主細胞由来の発現タンパク質の分泌を指示するシグナル配列をコード化
するヌクレオチド配列も含むことができる。遺伝子発現に影響する転写終結シグ
ナル、エンハンサー、及び他のヌクレオチド配列も、発現カセットに含まれる。
【００２５】 「リコンビナーゼ」の語は、2つ又はそれ以上の組み換え部位間の組み換えを
触媒する酵素をいう。本発明のおいて役立つリコンビナーゼは、特定のリコンビ
ナーゼによって認識される特異的ポリヌクレオチド配列である特異的組み換え部
位での組み換えを触媒する。「インテグラーゼ」の語は、リコンビナーゼのタイ
プをいう。
【００２６】 「形質転換率」は、異質ポリヌクレオチドをそのゲノム及び残存物の中へ上手
く組み込んだ細胞の割合をいう。
【００２７】 「トランスジェニック」の語は、細胞の中へか、細胞の原型の中へ導入された
特異的修飾を含む細胞をいう。そのような修飾は、一又はそれ以上の点突然変異
、欠失、挿入、又はその組み合わせを含むことができる。動物に言及するとき、
「トランスジェニック」の語は、トランスジェニックである細胞を含む動物を意
味する。トランスジェニック及び非トランスジェニック細胞の両方からなる動物
は、ここでは「キメラ」動物という。
【００２８】 「ベクター」の語は、核酸（又は複数の核酸）を宿主細胞へ運搬するための組
成物を言う。ベクターは、運搬すべき核酸をコード化する核酸を含み、核酸の宿
主細胞内への加入及び／又はベクターの宿主細胞への複製を容易にするために、
ウイルスキャプシド又は他の物質（例えば、キャプシド内、又はキャプシドの一
部としてパッケージされた逆転写酵素又は他の酵素）を選択的に含む。
【００２９】 「組み換え部位」はここで述べるリコンビナーゼ酵素によって認識される特異
的ポリヌクレオチド配列である。典型的には、（相補部位と呼ばれる）２つの異
なる部位を含み、１つは目的の核酸に存在し（例えば、真核の染色体又はエピソ
ームなど）、別のものは、目的の組み換え部位で組み込まれるべき核酸上に存在
する。特別の酵素の組み換え部位が異なる名前を持つかもしれないが、「attB」
及び「attP」の語は、それぞれ、本来的にバクテリアターゲット、及びファージ
ドナー由来の付着（又は組み換え）部位をいう。組み換え部位は、典型的に、コ
ア又スペーサー領域によって分離された左及び右アームを含む。それゆえ、attB
組み換え部位は、BOB‘からなり、B及びB’は、それぞれ左及び右アームであり
、Oはコア領域である。同様に、attPは「POP‘」であり、P及びP’はアームであ
り、Oは重ねてコア領域である。前記attB及びattP部位との間の組み換えでは、
核酸の標的での付随する組み込み、組み込んだDNAに隣接する組み換え部位は、
「attL」及び「attR」という。それゆえ、上述した用語を使用してattL及びattR
は、それぞれBOP’及びPOB‘からなる。ここでのいくつかの表示において、「O
」を省略し、attB及びattPはそれぞれBB’及びPP’と示す。
【００３０】 （好適な態様の説明） 本発明は、真核細胞において部位特異的な組み換えを得るための方法を提供す
るものである。部位特異的な組み換えを得るための過去に知られたシステムとは
異なり、本発明の方法を用いて行われた組み換えの産物は安定である。そこで、
例えば、真核細胞の染色体へトランスジーンを導入するために本方法を用いるこ
とが可能であり、そして既に知られた部位特異的な組み換えシステムを用いる場
合にしばしば起こる、トランスジーンの切除を避けることができる。安定な逆位
（inversion ）、トランスロケーション（translocation ）及び他の転位（rear
rangement ）もまた、得ることができる。
【００３１】 本発明は、バクテリオファージのインテグラーゼの様な原核細胞のリコンビナ
ーゼを採用し、その様な酵素は２つの相補的な組み換え部位の間の組み換えを触
媒するが、この組み換えにより形成されたハイブリッド部位の間の組み換えを触
媒することができない、という点において単方向性である。その様なリコンビナ
ーゼの一つであるΦC31 インテグラーゼは、それ自身ではattB x attP 反応のみ
を触媒する。そのインテグラーゼは、attBとattPの間の組み換えにより形成され
た、attLとattR部位の間の組み換えをを仲介することはできない。ΦC31 インテ
グラーゼの様なリコンビナーゼは単独で逆反応を触媒することはできないために
、ΦC31 のattB x attP 組み換えは安定である。この性質により、真核細胞にお
いて現在使用されている部位特異的な組み換えシステムから、本発明の方法は離
れている。現在使用されているシステムにはCre-lox システム又はFLP-FRT シス
テムの様なものがあり、そこでは組み換え反応は容易に逆転される。本発明の組
み換えシステムの使用により、真核細胞において、安定なトランスジーン及び染
色体転位（rearrangement ）に向けての新たな機会が提供される。
【００３２】 本方法は、対応するリコンビナーゼを用いて、真核細胞に存在している一組の
組み換え部位（例えば、attB及びattP）に接触することを含む。そこでリコンビ
ナーゼは組み換え部位の間の組み換えを仲介する。二つの組み換え部位の相対的
な位置に応じて、組み換えの結果としての数多くのイベントのいずれか一つが起
こることがある。例えば、もし二つの組み換え部位が異なった核酸分子上に存在
しているならば、その組み換えは一つの核酸分子を第二の分子へと組み込む結果
と成り得るであろう。そこで、対応する組み換え部位を含んでいる真核細胞染色
体へ、一つの組み換え部位を含んでいるプラスミドを組み込むことができるであ
ろう。本発明の方法において用いられたリコンビナーゼは逆反応を触媒すること
ができないから、その組み込みは安定である。その様な方法は、例えば、プラス
ミド上に存在しているトランスジーンを、真核細胞の染色体へ安定に組み込むた
めに有用である。
【００３３】 二つの組み換え部位が、同一の核酸分子上に存在することもまたできる。その
様な場合には、得られた産物は典型的には、その部位の相対的な方向性に依存す
る。例えば、直線方向にある部位の間の組み換えは一般的に、その２つの組み換
え部位の間にある任意のDNA が切り出されるという結果となる。対照的に、逆方
向にある部位の間の組み換えは、仲介しているDNA のインバージョンが起こると
いう結果となることがある。再び、付加的因子の非存在下において組み換えは不
可逆的であるという点において、得られた転位した（rearranged）核酸は安定で
あり、付加的因子は一般的にそのリコンビナーゼが由来する特定のバクテリオフ
ァージによってコードされ、正常には真核細胞においては見られないものである
。この方法が有用である適用の一つの例は、２つの組み換え部位の間のプロモー
ターの交換に伴って生じる。もしプロモーターが、そのプロモーターによって発
現されるべきコード配列に関して最初に反対向きであって、そしてそのプロモー
ターをフランク（flank ）する組み換え部位が逆方法であるならば、組み換え部
位を接触させることはプロモーターの逆位（inversion ）が起こる結果となり、
従ってプロモーターを正しい方向に置いてコード配列の発現を駆り立てるであろ
う。同様に、もしプロモーターが最初に発現のために正しい方向性にあり、組み
換え部位が同じ方向性にあるならば、組み換え部位がプロモーターと接触するこ
とによりプロモーターフ断片を切り出して、そしてコード配列の発現を停止させ
るという結果を得ることができる。
【００３４】 本発明の方法は、例えば、染色体のトランスロケーションを得るためにもまた
有用である。これらの態様において、一つの組み換え部位は一つの染色体上に置
かれ、そして第一の組み換え部位と共に組み換えの基質として働くことができる
第二の組み換え部位が第二の染色体上に置かれている。その二つの組み換え部位
をリコンビナーゼと接触させると組み換えが起こって、２つの染色体アームが交
換されるという結果となる。例えば、生物の２つの系統を構築することが可能で
あり、そのうちの一つの系統は第一の組み換え部位を含み、第二の系統は第二の
組み換え部位を含んでいる。その２つの系統は掛け合わされ、その組み換え部位
の両者を含む子孫の系統が得られる。その部位をリコンビナーゼと接触させると
、染色体アームの交換が起こる。
【００３５】 （リコンビナーゼと組み換え部位） 本方法は、真核細胞において、安定な核酸の組み込み又は他の転位（rearrang
ement ）を達成するために、リコンビナーゼのシステムを使用する。リコンビナ
ーゼのシステムは典型的には３つの要素から成り、その要素は２つの特異的なDN
A 配列（「組み換え部位」）及び特異的な酵素（「リコンビナーゼ」）である。
リコンビナーゼは、特異的な組み換え部位の間の組み換え反応を触媒する。
【００３６】 組み換え部位は方向性を有している。言い換えれば、それらは回文（バリンド
ローム）ではない。相互の関連性における組み換え部位の方向性により、どの様
な組み換えイベントが起こるか決定される。組み換え部位は、平行（同じ方向性
）または反対という、２つの方向性をとることが可能である。組み換え部位が単
一の核酸分子上に存在し、そして相互に平行な方向性であるときには、その際に
リコンビナーゼにより触媒される典型的な組み換えイベントは、仲介している核
酸の切り出して単一の組み換え部位を離すことである。組み換え部位が反対の方
向性にあるときには、その際には任意の仲介配列が逆位（inverted）となるのが
典型的である。
【００３７】 本発明の方法において使用されるリコンビナーゼは、第一の組み換え部位と第
二の組み換え部位の間の部位特異的な組み換えを仲介することができ、その第二
の組み換え部位は第一の組み換え部位と共に組み換えのための基質として働くこ
とができる。しかしながら、正常には真核細胞に存在しない、付加的因子の非存
在下では、第一の組み換え部位と第二の組み換え部位の間の組み換えにより形成
される、二つのハイブリッド組み換え部位の間の組み換えを仲介することができ
ない。これらのリコンビナーゼの例には、例えば、バクテリオファージΦC31 イ
ンテグラーゼ（例えばThorpe & Smith (1998) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:5505
-5510 ; Kuhstoss & Rao (1991) J.Mol.Biol.222:897-890 ;米国特許番号5,190,
871 を見よ）、ファージP4リコンビナーゼ（Ow & Ausubel (1983) J.Bacteriol.
155:704-713 ）、リステリアファージリコンビナーゼ、バクテリオファージR4 S
reリコンビナーゼ(Matsuura et al. (1996) J.Bacteriol.178:3374-3376)、CisA
リコンビナーゼ(Sato et al.(1990) J.Bacteriol.172:1092-1098 ; Stragier et
al.(1989) Science 243:507-512) 、XisFリコンビナーゼ(Carrasco et al.(199
4)Genes Dev.8:74-83)、トランスポゾンTn4451 TnpX リコンビナーゼ(Bannam et
al.(1995) Mol.Microbiol. 16:535-551 ; Crelin & Rood (1997) J.Bacteriol.
179:5148-5156)が含まれる。
【００３８】 リコンビナーゼポリペプチド、及びそのリコンビナーゼポリペプチドをコード
する核酸は本技術分野において述べられており、日常的な方法を用いて得ること
が可能である。例えば、ΦC31 インテグラーゼをコードする核酸フラグメントを
含むベクターは米国特許番号5,190,871 の中に述べられており、B-18477 という
アクセッション番号の下でノザンレジョナル リサーチラボラトリー（ぺオリア
、イリノイ 61604）から入手可能である。
【００３９】 任意の適切な方法により、組み換えを望む場所において、組み換え部位を含む
真核細胞へリコンビナーゼを導入することができる。例えばリコンビナーゼをポ
リペプチドの形で、例えばマイクロインジェクション又は他の方法によって導入
することができる。しかしながら、現在において好ましい態様においては、リコ
ンビナーゼをコードする遺伝子が細胞に導入される。遺伝子の発現はリコンビナ
ーゼが作られるという結果となり、そのリコンビナーゼは対応する組み換え部位
の間の組み換えを触媒する。興味の対象である外来性のポリヌクレオチドを導入
する前、後、又はそれと同時に、リコンビナーゼ遺伝子を細胞中に導入すること
ができる。一つの態様において、リコンビナーゼ遺伝子は挿入されるべきポリヌ
クレオチドを運搬するベクター中に存在し、そのリコンビナーゼ遺伝子はポリヌ
クレオチド中に含まれることさえも可能である。他の態様においては、リコンビ
ナーゼ遺伝子は、形質転換した植物、動物、カビ又はその類似物の様な形質転換
した真核生物中へ導入され、その後にそれらは対応する組み換え部位を含む生物
と掛け合わされる。
【００４０】 （標的生物） 本発明の方法は、任意の型の真核細胞において、DNA の安定した組み込み及び
／又は転位（rearrangement ）を得るために有用である。例えば、本方法は動物
、植物、カビ、細菌、及び他の微生物の細胞において有用である。いくつかの態
様において、その細胞は多細胞生物、例えば形質転換植物又は動物等の一部分で
ある。本発明の方法は、形質転換したコムギ、トウモロコシ、及び動物の様な、
形質転換した材料を得ることが困難である状況において特に有用である。これら
の状況において、まれにしかない単一コピー挿入物を見出すには、独立して得ら
れた多数の形質転換したクローンを前もって得ることが必要となるが、それはそ
れ自身非常に多くの労力を払う必要がある。
【００４１】 特に興味が持たれる植物標的には単子葉植物があり、その中には、例えば、イ
ネ、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、オオムギ、バナナ、ヤシ、ユリ、ラン及
びスゲが含まれる。双子葉植物もまた適切な標的であり、例えば、タバコ、リン
ゴ、ジャガイモ、テンサイ、ニンジン、ヤナギ、ニレ、カエデ、バラ、キンポウ
ゲ、ペチュニア、フロックス、スミレ及びヒマワリが含まれる。他の標的には、
動物及びカビ細胞が含まれる。これらのリストは単に説明するためのものであり
、限定するものではない。
【００４２】 （標的細胞内へ外来DNA を導入するためのコンストラクト） 本発明の方法は、標的細胞内へ外来DNA を導入することをしばしば含む。例え
ば、一つ又はそれ以上の組み換え部位を含む核酸が細胞中へしばしば導入される
。細胞内へ導入されるべきポリヌクレオチドコンストラクトは、一つ又は複数の
組み換え部位に加えて、望まれる形質型を細胞に与えるであろう遺伝子又は機能
的な配列を含むことができる。
【００４３】 いくつかの態様において、組み換え部位に加えて、リコンビナーゼをコードす
るポリヌクレオチドコンストラクトが真核細胞内へ導入される。リコンビナーゼ
をコードしているポリペプチドは、一つ又は複数の組み換え部位として同一の核
酸上に含まれることが可能であり、また別個の核酸として細胞内へ導入されるこ
とも可能である。本発明は組み換え部位を含む核酸のみならず、その核酸内にお
いてリコンビナーゼをコードしているポリヌクレオチド配列が標的真核細胞内に
おいて機能しているプロモーターに作用可能に結合している核酸もまた提供する
。
【００４４】 一般的には、発現するべきポリヌクレオチド（例えばリコンビナーゼをコード
しているポリヌクレオチド又は興味の対象であるトランスジーン）は発現カセッ
トに存在しているであろうし、それはそのポリヌクレオチドが発現制御シグナル
に作用可能に結合していることを意味しており、その発現制御シグナルは、例え
ばプロモーターやターミネーターであって興味の対象である宿主細胞において機
能を有する。リコンビナーゼ及び選択可能なマーカーをコードする遺伝子もまた
、宿主細胞内において機能するその様なシグナルの制御下にあるであろう。発現
の制御はプロモーターの選択によって最も容易に達成される。転写ターミネータ
ーは一般的には重要でなく、細胞によって認識される限り種々の既知の因子を使
用することができる。
【００４５】 研究がなされている遺伝子からプロモーターを得ることが可能であり、または
異なった遺伝子または異なった種から得られた異種プロモーターであることも可
能である。形質転換植物又は他の生物の全ての組織において遺伝子の直接的な発
現が望まれる場合には、「構成的な」プロモーターを使用することが可能であり
、「構成的な」プロモーターは多くの環境条件や発達又は細胞分化の状況におい
て一般的に活性である。
【００４６】 植物において使用するために適切な構成的なプロモーターには、例えば、カリ
フラワーモザイクウイルス（CaMV）35S 転写開始領域及び領域VIプロモーター、
アグロバクテリウムツメファシエンスのT-DNA から得られた1'- 又は2'- プロモ
ーター、及び本技術分野の当業者に知られている植物細胞中で活性である他のプ
ロモーターが含まれる。他の適切なプロモーターには、フィグウオート（Figwor
t ）モザイクウイルス由来の全長の転写プロモーター、アクチンプロモーター、
ヒストンプロモーター、チュブリンプロモーター、又はマンノピン合成酵素プロ
モーター（MAS ）が含まれる。
【００４７】 他の構成的な植物プロモーターには、とりわけシロイヌナズナ（Sun and Call
is, Plant J.,11(5):1017-1027(1997)）より得られた、種々のユビキチン又はポ
リユビキチンプロモーター、マス（mas ）、マック（Mac ）又はダブルマック（
DoubleMac ）プロモーター（米国特許番号5,106,739 、及びComai et al によっ
てPlant Mol.Biol.15:373-381 (1990)において述べられている）、及び本技術分
野の当業者に知られている、種々の植物遺伝子に由来する他の転写開始領域が含
まれる。その様な遺伝子には、例えば、シロイヌナズナ由来のACT11 （Huang et
al.,Plant Mol.Biol.33:125-139(1996)）、シロイヌナズナ由来のCat3（（GenB
ank No.U43147,Zhong et al.,Mol.Gen.Genet.251:196-203(1996)）、セイヨウア
ブラナ（Brassica napus）由来のステアロイルアシルキャリア蛋白質不飽和化酵
素をコードしている遺伝子（GenBank No.X74782,Solocombe et al.,Plant Physi
ol.104:1167-1176(1997)）、トウモロコシ由来のGPc1（GenBank No.X15596 Mart
inez et al.,J.Mol.Biol 208:551-565(1989)）、及びトウモロコシ由来のGpc2（
GenBank No.U45855,Manjunath et al.,Plant Mol.Biol.33:97-112(1997) ）が含
まれる。
【００４８】 植物のための有用なプロモーターには、Ti- 又はRi- プラスミドから、植物細
胞から得られたプロモーター、プロモーターが植物中において機能を有すること
が見出されているときには植物ウイルス又は他の宿主が含まれる。植物中で機能
し、そしてそのため本発明の方法において使用するのに適切である細菌プロモー
ターには、オクトピン合成酵素プロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター、
マノピン（manopine）合成酵素プロモーターが含まれる。適切な内在性植物プロ
モーターには、リブロース-1,6- ビスホスファターゼ（RUBP）、カルボキシラー
ゼスモールサブユニット（ssu ）プロモーター、α- コングリチニン（conglyci
nin ）プロモーター、ファゼオリン（phaseolin ）プロモーター、ADH プロモー
ター、及び熱ショックプロモーターが含まれる。
【００４９】 大腸菌において使用するためのプロモーターには、T7、trp 、又はラムダプロ
モーター、リボソーム結合部位を含み、及び好ましくは転写終結シグナルである
。真核細胞のためには、制御配列は典型的にはプロモーターを含み、そのプロモ
ーターは随意にイムノグロブリン遺伝子、SV40、サイトメガロウイルス等に由来
するエンハンサー及びポリアデニレーション配列を含み、そしてスプライスドナ
ー及びアクセプター配列を含むこともできる。酵母において、便利なプロモータ
ーにはGAL1-10 （Johnson and Davies (1984) Mol.Cell.Biol.4:1440-1448 ）、
ADH2（Russell et al.(1983) J.Biol.Chem.258:2674-2682）、PHO5（EMBO J.(19
82) 6:675-680 ）及びMFα（Herskowitz and Oshima (1982) The Molecular Bio
logy of the Yeast Saccharomyces （酵母サッカロミセスの分子生物学）（eds.
Strathem,Jones, and Broach）Cold Spring Harbor Lab.,Cold Spring Haror,N.
Y.,PP181-209の中において）が含まれる。
【００５０】 代わりに、興味の対象である遺伝子の特異的な組織における発現を標的とした
プロモーター、又はさもなければより厳密な環境又は発達による制御の下にある
プロモーターを使用することが可能である。その様なプロモーターをここでは、
「誘導可能な」又は「抑制可能な」プロモーターと称する。誘導可能なプロモー
ターの転写によって転写に影響するかもしれない環境条件の例には、病原体の攻
撃、嫌気性の条件、エチレン、又は光の存在が含まれる。発達による制御下にあ
るプロモーターには、葉、根、果実、種、又は花の様な特定の組織においてのみ
転写を開始するプロモーターが含まれる。プロモーターの操作はゲノム中のそれ
の位置によってもまた変化する可能性がある。そこで、誘導可能なプロモーター
はある位置において完全に又は部分的に構成的となることがある。誘導可能なプ
ロモーターは、リコンビナーゼ遺伝子の発現を制御するためにしばしば使用され
、そこで組み換え反応のタイミングを制御することが可能となる。
【００５１】 発達による制御の下にある組織特異的な植物プロモーターの例には、果実、種
、花の様な特定の組織においてのみ転写を開始するプロモーターが含まれる。ト
マト由来の組織特異的なE8プロモーターは遺伝子発現を方向付けるために特に有
用であり、そのために望まれる遺伝子発現産物は果実の中に位置する。例えば、
Lincoln et al.(1988) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:2793-2797; Deikman et al.
(1988) EMBO J.7:3315-3320; Deikman et al.(1992) Plant Physiol.100:2013-2
017 を見よ。他の適切なプロモーターには胚の貯蔵蛋白質をコードしている遺伝
子が含まれる。
【００５２】 誘導可能なプロモーターによる転写に影響するかもしれな環境条件の例には、
嫌気的な条件、上昇した温度、又は光の存在が含まれる。更なる器官特異的、組
織特異的、及び／又は誘導可能な外来のプロモーターもまた知られており（例え
ば、Kuhlemeier et al (1987) Ann.Rev.Plant Physiol.38:221において引用され
た参考文献を見よ）、それには、光誘導性であって光合成を行う組織においての
み活性である、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の1,5-リブロースビス
ホスフェイトカルボキシラーゼ スモールサブユニット遺伝子類（"ssu" プロモ
ーター）プロモーター、葯特異的なプロモーター（EP 344029 ）、及び例えばシ
ロイヌナズナ由来の（Arabidopsis thaliana）種子特異的なプロモーター（Kreb
bers et al.(1988) Plant Physiol.87:859）が含まれる。見本となる緑色組織特
異的なプロモーターにはトウモロコシのホスフォエノールピルビン酸カルボキシ
ラーゼ（PEPC）プロモーター、スモールサブユニットリブロース ビスカルボキ
シラーゼプロモーター（ssRUBISCO ）及びクロロフィルa/b 結合蛋白質プロモー
ターが含まれる。プロモーターは、国際公開番号WO93/07278の中で述べられた通
りの、植物TrpA遺伝子から単離されたプロモーターの様な樹心（pith）特異的な
プロモーターであることもできる。
【００５３】 他の生物のための誘導可能なプロモーターには、例えば、アラビノースプロモ
ーアー、lacZプロモーター、メタロチオネインプロモーター、及び熱ショックプ
ロモーターのみならず、本技術分野の当業者に知られている他の多くのものが含
まれる。S.pombe の様な酵母において有用な抑制可能なプロモーターは、ビタミ
ンB1によって抑制可能なPmntプロモーターである。
【００５４】 典型的には、これらの細胞へ導入されるコンストラクトは組み換え発現技術を
用いて調製される。組み換え発現技術は、組み換えた核酸の構築と感染した細胞
内での遺伝子の発現を伴う。これらの末端に到達するための分子クローニング技
術は本技術分野において知られている。組み換え核酸の構築に適する広範囲のク
ローニングとインビトロ増幅の方法は本技術部分野の当業者に良く知られている
。これらの技術の例と、多くのクローニング演習を通じて当業者を教示するのに
十分である指示は、Berger and Kimmel,Guide to Molecular Cloning Technique
s, Methods in Enzymology（分子クローニング技術への案内 酵素学における方
法論）, volume 152, Academic Press, Inc.,San Diego,CA (Berger); 及びCurr
ent Protocols in Molecular Biology（分子生物学における現在のプロトコール
） ,F.M. Ausubel et al., eds.,Current Protocols （現在のプロトコール）,
a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wile
y & Sons,Inc.,(1998 Supplement) (Ausubel) の中に見出される。
【００５５】 ポリヌクレオチドコンストラクトの構築には、細菌内で複製可能なベクターを
使用することが通常必要となる。細菌からプラスミドを精製するために使用する
ことができるキットは有り余る程市販されている。それらを適切に使用するため
に製造者の指示に従うこと（例えば、EasyPrepJ,FlexiPrepJ：両者はファルマシ
アバイオテック由来、StrataCleanJ：ストラタジーン由来、及びQIAexpress Exp
ression System：キアゲン、を見よ）。単離されて精製されたプラスミドを更に
操作して他のプラスミドを作製することも可能であり、細胞をトランスフェクト
するか、又はアグロバクテリウムツメファシエンスへ導入して感染させて、植物
を形質転換するのに使用される。アグロバクテリウムが形質転換の手段である場
合にはシャトルベクターが構築される。ストレプトマイセス又はバシラスにおけ
るクローニングもまた可能である。
【００５６】 標的細胞中へ取り込まれるために使用されるポリヌクレオチドコンストラクト
及び／又はベクター中へ、選択可能なマーカーがしばしば導入される。これらの
マーカーによって、興味の対象であるポリヌクレオチドを含んでいる細胞のコロ
ニーを選択することができる。ベクターは、例えば大腸菌又は他の細胞中で機能
する選択マーカーをしばしば有するであろうし、標的細胞へ導入される前にその
細胞中でベクターは複製される。大腸菌内で選択可能なマーカーの例には、例え
ばアンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、エリスロマイシンなどの抗
生物質に対する耐性を特定している遺伝子、又はβ−ガラクトシダーゼの様な他
の型の選択可能な酵素活性を与える遺伝子、又はラクトースオペロンが含まれる
。哺乳細胞において使用するのに適している選択可能なマーカーには、例えば、
ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）、シミジンキナーゼ遺伝子（TK）、又は薬剤耐性
を特定している原核細胞の遺伝子が含まれ、薬剤耐性を特定している原核細胞の
遺伝子には、ミコフェノール酸（mycophenolic acid ）で選択することができる
gpt （キサンチン−グアニン ホスフォリボシルトランスフェラーゼ）; G418、
ハイグロマイシン又はピュロマイシンで選択することができるneo （ネオマイシ
ンホスフォトランスフェラーゼ）; 及びメトトレキサートで選択することができ
るDHFR（ジヒドロ葉酸還元酵素）（Mulligan & Berg (1981) Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 78:2072;Southern & Berg (1982) J.Mol.Appl.Genet.1:327）がある。
【００５７】 植物細胞のための選択マーカーはしばしば、例えば、カナマイシン、G418、ブ
レオマイシン、ハイグロマイシン又はクロラムフェニコールの様な殺生剤又は抗
生物質に対する耐性、又はクロロスルフロン（chlorsulfuron ）又はバスタ（Ba
sta ）の様な除草剤に対する耐性を与える。選択可能なマーカーのための適切な
コード配列の例には、抗生物質カナマイシンに対する耐性を与えるネオマイシン
ホスフォトランスフェラーゼ酵素をコードするneo 遺伝子（Beck et al (1982)
Gene 19:327 ）、ハイグロマイシンホスフォトランスフェラーゼ酵素をコードし
て抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を与えるhyg (hpt) 遺伝子（Gritz an
d Davies (1983) Gene 25:179 ）、及び除草剤物質であるホスフィノスリチン（
phosphinothricin）及びビアラフォス（bialaphos ）に対する耐性をあたえるホ
スフィノスリチンアセチルトランスフェラーゼをコードするbar 遺伝子（EP 242
236 ）がある。
【００５８】 もし一つ以上の外来遺伝子を標的とする真核細胞に導入するならば、通常は、
各々の外来性の核酸について異なった選択可能なマーカーを使用することが望ま
しい。これにより、望まれる外来性の核酸の両者を含む細胞について同時に選択
することができるようになる。
【００５９】 （標的細胞へコンストラクトを導入するための方法） 組み換え部位及び／又はリコンビナーゼをコードする遺伝子を含むポリヌクレ
オチドコンストラクトを、標的細胞及び／又は生物へ、当業者に知られているい
くつかの手段のいずれかを用いて導入することができる。例えば、植物の培養中
又は器官中のいずれかで、種々の通常の技術によって、DNA コンストラクトを植
物細胞中へ導入することができる。例えば、DNA パーティクルボンバートメント
の様なバイオリスティックな方法を用いてDNA コンストラクトを植物細胞へ直接
に導入することが可能であり、又は植物細胞プロトプラストの電気穿孔法及びマ
イクロインジェクションの様な技術を用いてDNA コンストラクトを導入すること
が可能である。パーティクルにより仲介された形質転換技術（「バイオリスティ
ック」としても知られている）は、Klein et al.,Nature,327:70-73 (1987); Va
sil,V.et al.,Bio/Technol.11:1553-1558 (1993)及びBecker,D.et al.,Plant J.
,5:299-307 (1994) において述べられている。これらの方法は、微小ビーズ又は
パーティクルの基質の中又はその表面上のいずれかにおいて核酸を有する小さな
パーティクルにより細胞を穿孔することを伴う。
【００６０】 バイオリスティックなSDS-1000遺伝子銃（バイオラッド、ヘラキュレス、CA）
は、DNA を被覆した金又はタングステンの微小担体を標的細胞へ加速するために
ヘリウムガスの圧力を使用する。その過程は広範囲の生物由来の組織及び細胞に
適用可能であり、その生物には植物、細菌、カビ、藻、無傷動物組織、組織培養
細胞及び動物胚が含まれる。電気パルス送達を用いることも可能であり、それは
動物及び患者の生組織のための、本質的に緩和な電気穿孔の型である。Zhao,Adv
anced Drug Derivery Reviews （進歩した薬物送達の総論）17:257-262 (1995)
。
【００６１】 他の形質転換方法が当業者に知られている。マイクロインジェクションの技術
が本技術分野において知られ、科学及び特許文献において良く述べられている。
ポリエチレングリコール（PEG ）沈殿を用いたDNA コンストラクトの導入は、Pa
szkowski et al.,EMBO J.3:2717 (1984)において述べられている。電気穿孔技術
は、Fromm et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:5824 (1985)において述べられて
いる。PEG により仲介された植物プロトプラストの形質転換及び電気穿孔もまた
、Lazzeri,P.,Methods Mol.Biol.49:95-106 (1995)において議論されている。異
種遺伝子の導入及び発現のための方法は単子葉及び双子葉植物の両者において知
られている。米国特許番号5,633,446, 5,317,096, 5,689,052, 5,159,135及び5,
679,558; Weising et al.(1988) Ann.Rev.Genet.22:421- 477 を見よ。単子葉植
物の形質転換には特に種々の技術を使用することが可能であり、それには電気穿
孔法（例えばShimamoto et al.,Nature (1992),338:274-276）、バイオリスティ
ック（例えば欧州特許出願 270,356）、及びアグロバクテリウム（例えば、Byte
bier et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1987) 84:5345-5349）が含まれる。
【００６２】 植物の形質転換のために、DNA コンストラクトを適切なT-DNA フランキング領
域と結合させて、一般的なアグロバクテリウムツメファシエンス宿主ベクターへ
導入することができる。アグロバクテリウムツメファシエンス宿主の毒性機能に
より、細胞が細菌によって感染した時に、トランスジーン及び隣接したマーカー
遺伝子（もし存在しているならば）が植物細胞DNA へ挿入される。アグロバクテ
リウムツメファシエンスにより仲介された形質転換技術は、科学文献において良
く述べられている。例えば、Horsch et al.Science,233:496 (1984), Fraley et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:4803 (1983)及びHooykaas,Plant Mol.Biol.,1
3:327-336 (1989), Bechtold et al.,Comptes Rendus De L Academie Des Scien
ces Serie Iii-Sciences De La Vie-Life Sciences,316:1194-1199 (1993), Val
vekens et al.,Proc.Natl.Acad.SCI.USA,85:5536-5540 (1988)を見よ。植物及び
細胞培養物の遺伝子移送方法の総論としては、Fisk et al.,Scientia Horticult
urae 55:5-36 (1993) 及びPotrykus,CIBA Found.Symp.154:198 (1990) を見よ。
【００６３】 ポリヌクレオチド配列を細胞内へ送達するための他の方法には、例えば、リポ
ソームに基づいた遺伝子送達（Debs and Zhu (1993) WO93/24640; Mannino and
Gould-Fogerite (1988) BioTechniques 6(7); Rose米国特許番号5,279,833; Bri
gham (1991) WO91/06309; 及びFelgner et al.(1987) Proc.Natl.Acad.Sci.USA
84:7413-7414）のみならず、ウイルスベクターの使用、（例えば、アデノウイル
ス（総論のために、Berns et al.(1995) Ann.NY Acad.Sci.772:95-104; Ali et
al.(1994) Gene Ther.1:367-384;及びHaddada et al.(1995) Curr.Top.Microbio
l.Immunol.199 (Pt3):297-306 を見よ）、パピローマ(papilloma) ウイルス、レ
トロウイルス（例えば、Buchscher et al.(1992) J.Virol.66(5) 2731-2739; Jo
hann et al.(1992) J.Virol.66(5):1635-1640; Sommerfelt et al.,(1990) Viro
l.176:58-59; Wilson et al.(1989)）J.Virol.63:2374-2378; Miller et al.,J.
Virol.65:2220-2224 (1991); Wong-Staal et al.,PCT/US94/05700,及びRosenbur
g and Fauci (1993) in Fundamental Immunology（基本的免疫学）,Third Editi
on Paul (ed) Raven Press,Ltd.,New York及びその中の引用文献、及びYu et al
.,Gene Therapy (1994) supra を見よ）、及びアデノ関連ウイルスベクター（We
st et al.(1987) Virology 160:38-47; Canter et al.(1989) 米国特許番号4,79
7,368; Canter et al.WO93/24641 (1993); Kotin (1994) Human Gene Therapy 5
:793-801; Muzyczka (1994) J.Clin.Invst.94:1351及びSamulski(supra) をAAV
ベクターの概観のために見よ。また、Lebkowski,米国特許番号5,173,414; Trats
chin et al.(1985) Mol.Cell.Biol.,5(11):3251-3260; Tratschin et al.(1984)
Mol.Cell.Biol.,4:2072-2081; Hermonat and Muzyczka (1984) Proc.Natl.Acad
.Sci.USA,81:6466-6470; McLaughlin et al.(1988)及びSamulski et al. (1989)
J.Virol.,63:03822-3828 もまた見よ）及びそれに類似なものが含まれる。
【００６４】 導入された外来DNA が組み込まれたパターンを解析することができる方法は、
当業者に良く知られている。例えば形質転換した細胞からDNA を抽出し、一つ又
はそれ以上の制限酵素によってそのDNA を消化し、そしてポリヌクレオチドコン
ストラクトのラベル化された断片をハイブリダイズさせることができる。挿入さ
れた配列をポリメラーゼ連鎖反応（PCR ）を用いて同定することもまた可能であ
る。例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning - A Laboratory Manual （分
子クローニング、実験室マニュアル）, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, New York,1989を、これら及び他の適切な方法の記載のために見
よ。
【００６５】 （形質転換植物及び動物の再生） 本発明の方法は、安定して組み込まれた外来性ポリヌクレオチド又は他の細胞
内核酸の安定な転位（rearrangement ）を有する、形質転換したキメラ型の多細
胞生物を得るために特に有用である。形質転換したキメラ型の生物を得るための
方法は、植物と動物の両者について当業者に良く知られている。
【００６６】 上記のいずれかの形質転換技術によって得られた形質転換した植物細胞は培養
され、形質転換した遺伝子型及びそのために望みの表現型を有している完全な植
物が再生される。その様な再生技術は組織培養成長培地の中の特定の植物ホルモ
ンの取り扱いに依り、典型的には望みの核酸配列と共に導入された殺生剤及び／
又は除草剤マーカーに依る。培養されたプロトプラストからの植物再生は、Evan
s et al.,Protoplast Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Cultur
e （プロトプラストの単離及び培養、植物細胞培養のハンドブック）,pp.124-17
6, Macmillian Publishing Company, New York (1983);及びその結びつきで、Re
generation of Plants, Plant Protoplast（植物、植物プロトプラストの再生）
,pp.21-73,CRC Press, Boca Raton,(1985)において述べられている。植物カルス
、外植片、体細胞胚（Dandekar et al.,J.Tissue Cult.Meth.,12:145 (1989); M
acGranahan et al.,Plant Cell Rep.,8:512 (1990)）、器官、又はその一部分か
らもまた再生することができる。その様な再生技術は一般的にKlee et al.,Ann.
Rev.of Plant Phys.,38:467-486 (1987)において述べられている。
【００６７】 その方法は大部分の脊椎動物種の形質転換したキメラ型の動物を作製するのに
有用である。その様な種には、それに限定されるものではないが、ネズミ及びラ
ットの様なゲッシ類、ウサギ、ヒツジやヤギの様なヒツジ類（ovines）、ブタの
様なブタ類（porcines）、ウシ（cattle）やバッファローの様なウシ類（bovine
）を含む、非ヒト哺乳類が含まれる。形質転換動物を得る為の方法は、例えば、
Puhler,A.,Ed.,Genetic Engineering of Animals（動物の遺伝工学）VCH Publ.,
1993; Murphy and Carter, Eds.,Transgenesis Techniques:Principles and Pro
tocols（形質転換技術：原理とプロトコール）（Methods in Molecular Biology
, Vol.18）,1993;及びPinkert,CA,Ed.,Transgenic Animal Technology:A Labora
tory Handbook （形質転換動物の技術工学：実験室ハンドブック）,Academic Pr
ess,1994において述べられている。特異的な遺伝的修飾を有している形質転換魚
類もまた、クレイムされた方法を用いて作製することができる。形質転換魚類を
作製するための一般的な方法のためには、例えば、Iyengar et al.(1996) Trans
genic Res.5:147-166 を見よ。
【００６８】 そのゲノム中に特異的な修飾を有している、形質転換した又はキメラ型の動物
を得る一つの方法は、受精した卵母細胞を興味の対象であるポリヌクレオチドを
組み換え部位に隣接して含んでいるベクターと接触させることである。ネズミの
様ないくつかの動物についてインビボで受精が行われ、受精した卵子は手術によ
り移された。他の動物、特にウシおいては、生きた又は屠殺された動物から卵子
を移して来て、そしてその卵子をインビトロで受精させることは好ましい。DeBo
er et al.,WO91/08216を見よ。インビトロで受精させることにより、実質的に同
調した細胞に導入すべき修飾を行うことができる。そして、着床前の胚が約16-1
50個の細胞を含むようになるまで受精した卵母細胞をインビトロで培養した。16
-32 細胞期の胚は桑実胚として述べられている。32細胞以上を含んでいる着床前
の胚を胞胚と称する。これらの胚は、典型的には64細胞期において胞胚腔の空洞
（cavity）の発達を示した。もし望むならば、胚細胞の中における望みの外来性
ポリヌクレオチドの存在を当業者に知られている方法によって検出することがで
きる。
【００６９】 受精した卵母細胞を着床前の段階まで培養するための方法は、Gordon et al.(
1984) Methods Enzymol.101:414; Hogan et al. Manipulation of the Mouse Em
bryo:A Laboartory Manual（マウス胚の操作：実験室マニュアル）C.S.H.L. N.Y
.(1986) （マウス胚）; Hammer et al.(1985) Nature 315:680（ウサギ及びブタ
胚）;Gandolfi et al.(1987) J.Reprod.Fert.81:23-28;Rexroad et al.(1988) J
.Anim.Sci.66:947-953（ヒツジ胚）及びEyestone et al.(1989) J.Reprod.Fert.
85:715-720; Camous et al.(1984) J.Reprod.Fert.72:779-785及びHeyman et al
.(1987) Theriogenology 27:5968（ウシ胚）において述べられている。時々、着
床を待つ間の期間着床前の胚を凍結して保存した。着床前の胚を適切なメスに移
植し、その結果、トランスジーンが組み込まれたときの発達の段階に依って、形
質転換した又はキメラ型の動物が誕生するという結果となった。正しい生殖系列
の形質転換動物を形成するために、キメラ型の哺乳動物を繁殖させることができ
る。
【００７０】 替わりに本方法を用いて、望みの外来性ポリヌクレオチドの単一コピーを有す
る胚幹細胞（ES）を得ることができる。これらの細胞は、インビトロで培養され
た着床前の胚から得られた。例えば、Hooper,ML,Embryonal Stem Cells:Introdu
cing Planned Changes into the Animal Germline （胚性幹細胞；計画された変
化の動物生殖系列への導入）(Modern Genetics,v.1) Int'1.Pub.Distrib.,Inc.,
1993; Bradley et al.(1984) Nature 309,255-258 を見よ。形質転換したES細胞
を非ヒト動物由来の胞胚と結合させた。ES細胞は胚をコロナイズし、いくつかの
胚においては得られたキメラ動物の生殖系列を形成する。Jaenisch,Science,240
:1468-1474 (1988) を見よ。代わりに、生物を再構成することができるES細胞又
は体細胞（”体細胞再集団細胞：somatic repopulating cells”）を、形質転換
した哺乳動物を生み出す、除核された受精卵母細胞へ着床させるための核の起源
として使用することができる。例えば、Wilmut et al.(1997) Nature 385:810-8
13を見よ。
【００７１】 （実施例） 下記の実施例は説明の目的で与えられたものであって本発明を限定するもので
はない。
【００７２】 （実施例１） （シゾサッカロミセス・ボンベ（Schizosaccharomyces pombe ）におけるΦC31
組み換えシステム） この実施例は、ストレプトミセスバクテリオファージΦC31 部位特異的な組み
換えシステムが、真核細胞において機能することを示している。S.Pombe のleu1
遺伝子座において、バクテリオファージ接着部位（attP）をシゾサッカロミセス
・ボンベの染色体において導入した。続いてこの標的株を、ura4＋選択可能なマ
ーカーと連結した細菌接着部位（attB）を含むプラスミドにより形質転換された
。ΦC31 インテグラーゼ遺伝子を有している第二のプラスミドによって共トラン
スフェクトしたとき、インテグラーゼ遺伝子が発現している条件下で、Ura＋へ
高い効率で形質転換していることが観察された。
【００７３】 組み換えイベントのサザン解析により、leu1遺伝子座のattPへ、attB-ura4＋
プラスミドが挿入されていることが示された。ハイブリッドジャンクジョンのヌ
クレオチド配列により、attB x attP 組み換え反応は正確であることが明らかと
なった。
【００７４】 （材料及び方法） （組み換えDNA ） 全体として標準的な方法が用いられた。大腸菌株XL2-Blue（recA1 endA1 gyrA
96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F' proAB lAcIq Z △M15Tn10(Tetr) Amy
Camr、ストラタジーン]がDNA コンストラクトとして働いた。
【００７５】 （培地） 分裂酵母株を、必要に応じて225mg/l のアデニン、ヒスチジン、ロイシン又は
ウラシルを添加した、最小培地（バイオ101 由来EMM-低グルコース）で生育させ
た。5-FOA （5-フロロオロチン酸、ザイモリサーチ社より）を含む最小プレート
をGrimm ら（(1988) Mol.Gen.Genet.215:81-86）に従って調製し、アデニン、ヒ
スチジン及びロイシンを添加した。使用した時、5 μg/mlとなるようにチアミン
を添加した。
【００７６】 （ΦC31 attP標的を有するS.prombe） pHS282からApaI-SacI 断片として単離された（Thorpe & Smith (1998) Proc.N
ATL.Acad.Sci.USA 95:5505-5510 ）84塩基対のΦC31 attP部位（PP' と略称）を
、S.prombe組み込みベクターpJK148の同じ部位にクローン化し（Keeney & Boeke
(1994) Genetics 136:849-856）、pLT44 を作製した。NdeI切断DNA を用いた酢
酸リチウムにより仲介された形質転換により、このプラスミドはS.prombe leu1-
32アリールへ標的化された。pLT44 による相同組み換えによってLeu＋へ変換さ
れた、レシピエント宿主FY527(h-ade6-M216 his3-D1 leu1-32 ura4-D18) を、サ
ザンブロットによって試験した。FY527attP と名付けられた一つのLeu＋型は単
一コピーのpLT44 を含んでいることが見出された。FY527attPx2 と名付けられた
もう一つの形質転換体は直列（tandem）のプラスミド挿入を有していた。
【００７７】 （ΦC31 attB部位を有する組み込み可能なura4＋ベクター） 1.8kb のEcoRI-BamHI 断片上でpTZura4 (S.Forsburg)から切り出した、S.prom
beのura4＋遺伝子を、同じ酵素を用いて切断されたpJK へ挿入し、pLT40 を作製
した。500bp のBamHI-XbaI断片としてpHS21 から単離されたΦC31 attB部位（BB
'と略称）を、それらの酵素を用いて切断されたpLT40 へ連結してpLT42 を作製
した。XhoI断片を削除することによりpLT42 からleu1遺伝子の大部分を除去し、
pLT45 を作製した。これにより、pLT45 からleu1の全部であるが229bp が除去さ
れて、その形質転換効率はleu1相同性を持たないプラスミドの形質転換効率まで
低下した。ura4のすぐ反対側に同じ方向の第二でattB部位を有しているpLT50 が
構築され、それは最初にpLT42 由来のattB BamHI-SacI 断片をpUC19 へサブクロ
ーニングし、それをEcoRI とSalII によって切り出し、続いてそれをEcoRI とXh
oIによって切断したpLT45 へ挿入することにより構築された。最終構築物中の第
二のattB部位を各鎖について一回配列決定し、最初のattB部位と同一であること
が見出された。
【００７８】 （平滑DNA 形質転換） attB-ura4＋-attB 平滑DNA は、pLT50 から精製されたattII-AlwNl 断片とし
て、又はpLT50 を鋳型として用いたPCR 産物として調製された。T3プライマーと
pJK148のプラスミド骨格に対応している第二のプライマー（5' ggc cct gaa att
gtt gct tct gcc 3' ）を用いて、標準的な条件によりPCR は行われた。
【００７９】 （ΦC31 インテグラーゼの抑制的な合成） ビタミンB1によって抑制される、S.prombe Pmntプロモーターは、pMO147から
1.2kb のPstI-SacI 断片として切り出され、同じ酵素を用いて切断されたhis3＋ ,ars1 ベクターpBG2（Ohi et al.(1996)）Gene 174:315-318）へ挿入され、pLT4
1 が作製された。ΦC31 int コード領域を含んでいる2.0kb SacI断片を、pHS33
（Thorpe & Smith (1998) supra ）からpLT41 のSacI部位へ移した。発現がPmnt
の制御下にある様にint コード領域が配向されたクローンを、pLT43 と名付けた
。
【００８０】 （分子解析） ベーリンガーマンハイムのGeniusTMシステムを用いてサザン解析を行った。le
u1の998bp の内部EcoRV 断片、ura4の1.8kb 断片及び2.0kb のΦC31 int 遺伝子
をランダムプライマー法によってジゴキシゲン標識し、プローブとして使用した
。ストラタジーンTurbo PFU 酵素又はVENTポリメラーゼを用いて、パーキンエル
マーCetus Gene Amp PCR 9600 で、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。可能なとこ
ろでは標準的なT3及びT7プライマーを用いた。ura4プライマー（5' gtc aaa aag
ttt cgt caa tat cac 3' ）（配列番号１）及びpJK148プライマーをオペロンテ
クノロジーから購入した。全てのPCR 反応において、51℃のアニーリニング温度
と30秒の伸長時間が用いられた。
【００８１】 （結果と考察） （S.prombeゲノムへの標的部位の挿入） ΦC31 により仲介された組み込みのための標的部位を有する宿主株を作製する
ために、相同組み換えによって、ΦC31 attP部位を分裂酵母ゲノムのleu1遺伝子
座へ挿入し、Leu＋株FY527 attPが形成された（図1 Ａ）。過去の研究により、S
.prombeのDNA をXbaIによって開裂し、leu1＋遺伝子の内部の1kp 断片により検
証したら、そのプローブにより14kbのバンドが検出されることが示されている（
Keeney & Boeke (1994) Genetics 136:849-856）。leu＋プラスミドpJK148がleu
1-32 遺伝子座において挿入されていると、3 と18kbのバンドが検出されるとい
う結果となる（図1 Ａ）。84bpのΦC31 attP因子が封入されている点で、pLT44
はpJK148から異なっているために、leu1-32 におけるpLT44 の組み込みは、FY52
7 attPにおいて、同様の3kb と18kbのハイブリダイゼーションパターンをもたら
した。他のハイブリダイズしている断片が存在しないことは、単一に組み込まれ
たコピーとしてのpLT44 のDNA 残基を示している。
【００８２】 ΦＣ３１インテグラーゼ仲介形質転換 ｕｒａ４＋およびａｔｔＢ配列（ＢＢ’）を有するが、複製の原点を欠くＦＹ
５２７ａｔｔＰをｐＬＴ４５で形質転換した。このコンストラクトを、それ自体
により、またはΦＣ３１インテグラーゼを産生するｈｉｓ３＋複製ベクターｐＬ
Ｔ４３を用いて導入した。ｐＬＴ４３を封入することにより、Ｕｒａ＋形質転換
体の数が平均で１５倍増加した（表１）。この効果はインテグラーゼ遺伝子発現
によるものなので、この増加がｐＬＴ４５と複製にプロフィシエントな（replic
ation-proficient）ｐＬＴ４３との間の組み換えに起因するものではありえない
。インテグラーゼ遺伝子の転写は、高濃度のビタミンＢ１により抑制可能なプロ
モーターＰｍｎｔの支配を受ける（Ｍａｕｎｄｒｅｌｌ，Ｋ．（１９９３年）Ｇ
ｅｎｅ １２３：１２７〜１３０頁）。抑制は完全ではないが（Ｆｏｒｓｂｕｒ
ｇ，Ｓ．Ｌ．（１９９３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２１：２９
５５〜２９５６頁）、インテグラーゼたん白の生成が減少する。発育培地にチア
ミンを加えた場合、Ｕｒａ＋形質転換体の数は背景レベル付近にまで減少した。
培地からヒスチジンを省略することによりインテグラーゼプラスミドを共選択し
てもしなくても、Ｕｒａ＋形質転換体の頻度が顕著に変化することは無かった。
ｐＬＴ４３またはその前駆体プラスミドｐＢＧ２を用いて得たＨｉｓ＋形質転換
体の数から、ＦＹ５２７ａｔｔｔＰの形質転換能力を推定した。両方の複製プラ
スミドの頻度を比較したところ、ＦＹ５２７ａｔｔＰのｐＬＴ４３依存形質転換
は平均で約１５％であった。
【００８３】
【表１】
【００８４】 ΦＣ３１インテグラーゼをプロモートしたａｔｔＰ ｘ ａｔｔＢ組み換え ｐＬＴ４５をコードしたΦＣ３１ａｔｔＢエレメントと染色体的に位置の定ま
ったａｔｔＰ配列との間の組み換えにより、図１Ｂに示すように、環状ＤＮＡが
ｌｅｕ１遺伝子座に組み込まれた。この反応が起きた場合、Ｕｒａ＋形質転換体
から得たＸｂａＩ分別ゲノムのＤＮＡをｌｅｕ１ ＤＮＡでプローブすると、３
ｋｂバンドは変わらないが、一方１８ｋｂバンドは約２３ｋｂまで増大する（図
１Ｃ）。無作為に選択したＵｒａ＋コロニーをハイブリダイゼーション分析によ
り検査した。チアミンの省略によりΦＣ３１インテグラーゼ遺伝子発現を抑制解
除した場合の実験から得られた８つの分離株のうち７つが、この約２３ｋｂバン
ドの存在を示した。この同サイズバンドをｕｒａ４プローブにハイブリダイズし
た。ｕｒａ４−Ｄ１８欠損対立遺伝子から期待されるように、これは親株にｕｒ
ａ４ハイブリダイゼーションしなかったものと対照的である。これら７つの分離
株の一つが、両方のプローブにハイブリタイズする付加的なバンドを示した。部
位に特異的な組み換え現象に加えて、この候補物質がｌｅｕ１遺伝子座にＤＮＡ
再配列を有すると思われる。ｌｅｕ１再配列が、有効なＳ．ｐｏｍｂｅ相同体組
み換え系によりおそらく触媒された。残る分離株は部位特異的組み換え現象を経
験したことが無く、ｐＬＴ４５とｐＬＴ４３との間の組み換えにより、ウラシル
原栄養株が増大したと思われた。これら８つの分離株のうち、半分をＵｒａ＋お
よびＨｉｓ＋の両方として選択したが、このグループとＵｒａ＋のみで選択した
グループとの間に顕著な差は見られなかった。
【００８５】 ビタミンＢ１の存在下で行った形質転換実験から、ＤＮＡハイブリダイゼーシ
ョンにより同数のＵｒａ＋形質転換体を調べた。チアミン抑制可能なＰｎｍｔプ
ロモーターがインテグラーゼ産生を制限し、したがって部位特異的組込みを制限
すると考えられる。この低頻度形質転換から分離された８つのＵｒａ＋候補物質
のうちの２つにより、２３ｋｂバンドがｌｅｕ１およびｕｒａ４プローブにハイ
ブリダイズしていることが示された。しかし、いずれのプローブも付加的バンド
を検出したので、これらは正確な組込み現象を表しておらず、発明者らはこれら
をクラスｂインテグラントとして分類した。他の６つの分離体では、ハイブリダ
イゼーションのパターンを翻訳することは困難である。これらのいくつかにおい
て、遺伝子座は再配列を経験しているが、ｌｅｕ１プローブでは３ｋｂバンドを
検出できなかった。これらの多くにおいて、ｕｒａ４に対するハイブリダイゼー
ションが弱いことから、Ｕｒａ＋表現型はゲノム中のｐＬＴ４５の安定な保守に
よるものではないであろう。
【００８６】 選択しない場合にインテグラーゼプラスミドを維持する形質転換体の比率を確
実にするために、インテグラーゼ遺伝子配列でブロットを再プローブした。Ｕｒ
ａ＋Ｈｉｓ＋として選択されたそれらはプラスミドを維持すると考えられており
、かつハイブリダイゼーションが明らかになるにつれてそうなった。Ｈｉｓ表現
型に関係なくＵｒａ＋として選択された８つの分離株のうちの５つは、インテグ
ラーゼプローブにハイブリダイズするバンドも与えた。ｉｎｔの損失が安定な組
込みに影響を及ぼすことを確認するため、無作為に選択したＵｒａ＋細胞の別の
組を数世代にわたり非選択的に成長させ、ｐＬＴ４３を失ったＨｉｓ−子孫に対
してスクリーニングをした。８つの代表的Ｕｒａ＋Ｈｉｓ−クローンの分析は、
全てが正確に染色体が位置するａｔｔＰ部位に組込まれたｐＬＴ４５の単一コピ
ーを有することを示した。これらの組込み体のＤＮＡはインテグラーゼプローブ
でハイブリダイズしなかった。対照的に、ｐＬＴ４５単体の形質転換により誘導
された背景頻度Ｕｒａ＋クローンにより、ｌｅｕ１遺伝子座にハイブリダイジン
グバンドの親構造が得られ、かつ５ｋｂおよび７ｋｂに更なる微弱バンドが得ら
れた。これらの知見は、ゲノムのどこかのｐＬＴ４５の組込みまたはＳ．ｐｏｍ
ｂｅ複製原点の欠損にもかかわらずいくつかの細胞中のプラスミドの維持のいず
れかと一致している。
【００８７】 保守的部位特異的組み換え ＰＣＲを用いて、３つの代表的Ｕｒａ＋候補物質からａｔｔＰ／ａｔｔＢ組み
換え接合部を回収した。ハイブリッド部位の一つでは、ａｔｔＲ（ＰＢ’）がＴ
３およびＴ７プロモーターに隣接していた。他の部位では、ａｔｔＬ（ＢＰ’）
がＴ３プロモーターおよびｕｒａ４ＤＮＡに隣接していた（図１Ｃ）。いずれの
場合も、プライマー対が、期待される大きさのバンドを増幅したこれらの配列に
向けられ、一方、本来のａｔｔＰ（ＰＰ’）はもはや見つからない。ａｔｔＰは
検出されるがａｔｔＬおよびａｔｔＲのいずれもが検出されない場合には、これ
は親株ＦＹ５２７ａａｔＰと対照的である。３つの代表的ａｔｔＬおよびａｔｔ
Ｒ ＰＣＲ製品のヌクレオチド配列は、付随的な突然変異体が無いことを示した
。したがって、バクテリアおよび哺乳動物細胞において、Ｓ．ｐｏｍｂｅ中のΦ
Ｃ３１仲介部位特異的組み換えは保守的組み換え反応である。
【００８８】 ΦＣ３１インテグラーゼは組込みした分子を除去しない。 ＴｈｏｒｐｅとＳｍｉｔｈ（（１９９８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：５５０５〜５５１０）は、ゲル分別ＤＮＡ断片の分析でΦ
Ｃ３１インテグラーゼ反応の反転を検出しなかった。発明者らは遺伝学的選択法
により反転反応の可能性を調べた。ｐＬＴ４５のＦＹ５２７ａｔｔＰへの正確な
組込みが、サザン分析により３つのクローンに対して確認された。次いで、これ
らの株をｐＬＴ４３で再転換した。ｐＬＴ４５を切り取ることにより、ｕｒａ４ ＋ マーカーの欠損を招いた。Ｕｒａ−表現型を５−ＦＯＡを用いてプレート上に
得点することができる（Ｇｒｉｍｍら、（１９８８年）Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇ
ｅｎｅｔ．２１５：８１〜８６頁）。３つのＵｒａ＋Ｈｉｓ−前駆体の培養体か
ら得たＵｒａ−分離個体の頻度は５．７×１０−４、７．１×１０−４および５
．６×１０−４であった。対照的に、３つのＵｒａ＋Ｈｉｓ＋誘導体から得たＵ
ｒａ−コロニーの頻度はある程度高く、１．１×１０−２、３．８×１０−３お
よび２．３×１０−３であり、それぞれ１９、５および４倍増加した。インテグ
ラーゼ遺伝子を有しない制御ベクターｐＢＧ２を代わりに用いて、５−ＦＯＡ耐
性の速度が増大することも分かった。それぞれ１．０×１０−２、１．０×１０ −２ および８．０×１０−３であった。形質転換プロセス自体は変異原性を示す
。
【００８９】 ｐＬＴ４５で形質転換された３つの培養体のそれぞれから得られた３つのＵｒ
ａ−Ｈｉｓ＋クローンをサザンブロッティングにより分析した。１つの分離体が
、ｐＬＴ４５のＦＹ５２７ａｔｔＰへの安定な組込みと一致するＤＮＡパターン
を有していた。したがって、このクローンにおいて、Ｕｒａ−表現型は、部位特
異的組み換え反応の反転によるよりも、むしろ制限パターンが感知可能なほどに
変わっていない変異体により引き起こされた。第２クローンはｐＬＴ４５挿入欠
損ＦＹ５２７ａｔｔＰのサザンパターン特徴を示し、第３クローンはｐＬＴ４５
挿入の無いＦＹ５２７ａｔｔＰ等の細胞とＦＹ５２７ａｔｔＰ前駆体株ＦＹ５２
７等の細胞の２つの型の細胞の混合物と一致するパターンを有していた。後者の
構造は、ｐＬＴ４４の挿入を反転するｌｅｕ反復の間の染色体内相同組み換えか
ら生じる場合がある（図１Ａ）。組込みしたプラスミドＤＮＡの正確な切り取り
が前述の２つの候補物質に現れた場合、ａｔｔＰ部位が再生した。これはＰＣＲ
で検出可能であった。ＰＣＲ製品の大きさは、完全なハイブリッド部位に期待さ
れる大きさであり、ハイブリッド部位の存在はＰＣＲ製品を配列決定することに
より確認された。これらの観察は、ｕｒａ４遺伝子の欠損がΦＣ３１仲介切り取
り以外の機構により発生するという考えと一致している。
【００９０】 （まとめ） 単一目的部位での環状分子の組込みは、ほとんど全ての形質転換体の正確な挿
入を得る効果的な方法であった。発明者らが観察したわずかの異常現象は、おそ
らくｌｅｕ１反復ＤＮＡに作用するＳ．ｐｏｍｂｅ組み換え系に主として起因す
る。インテグラーゼ産生がそのプロモーターの発現により制限されていた場合、
形質転換体の数を背景レベル付近にまで減らした。この条件下で、ΦＣ３１部位
特異的組み換えから誘導された修復形質転換体はほとんどなかった。真核細胞に
おけるΦＣ３１部位特異的組み換え系の機能的操作により、トランス遺伝子およ
び染色体のマニピュレーションを行う新たな機会が与えられた。ΦＣ３１系をａ
ｔｔＢおよびａｔｔＰ部位の選択的配置と共に用いて、ＤＮＡの削除、反転また
は挿入を行うことができる。この系の重要な特徴は、ａｔｔＢ×ａｔｔＰ反応が
切り取り特異的タンパク質の不存在下で不可逆という点である。
【００９１】 （実施例２） ΦＣ３１インテグラーゼはＣＨＯ細胞中で安定な組込みを作る役目をする。 この実施例では、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞におけるａｔｔ
Ｂ組み換え部位とａｔｔＰ組み換え部位との間の組み換えを仲介する能力に関し
てΦＣ３１インテグラーゼをテストする実験を説明する。
【００９２】 （方法） ゼオシン耐性を与える選択マーカーを含んだＣＨＯ細胞株５１ＹＴ２１１をａ
ｔｔＰ含有プラスミドｐＦＹ１で形質転換した（図２）。単一コロニーを２回精
製した後、６つのゼオシン耐性細胞株を分離した。サザンＤＮＡハイブリダイゼ
ーションによる分析により、６つの細胞株のそれぞれが、ゲノム内に組込みされ
たｐＦＹ１の少なくとも一分子を有することが確認された。
【００９３】 ６つの細胞株のそれぞれをａｔｔＢ含有プラスミドｐＦＹ９およびｉｎｔ含有
プラスミドｐＦＹ６でトランスフェクトし、ｐＦＹ９上のａｔｔＢ部位とｐＦＹ
１の染色体コピー上のａｔｔＰ部位との間の部位特異的組み換えに対するテスト
を行った。コントロールとして、同じ細胞株をｐＦＹ９で形質転換したが、ｉｎ
ｔ含有ｐＦＹ６は用いなかった。ｐＦＹ９プラスミドは、ＳＶ４０初期プロモー
ターの制御下でネオマイシン耐性選択マーカーおよびプロモーターに結合してい
ない緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードした配列を含んでいた。したがって、
部位特異的組み換えが、ｐＦＹ１に含まれるヒト・サイトメガロウイルス・プロ
モーターの制御下でＧＦＰコード化配列を配置し、その結果ＧＦＰを発現するこ
とが予想された。
【００９４】 （結果） トランスフェクションの結果：ネオマイシン耐性コロニーを顕微鏡下に置き、
ＧＦＰ遺伝子の活性の有無を観察した。ｐＦＴ９＋ｐＦＹ６でトランスフェクシ
ョンした細胞では大部分が、しかしｐＦＹ９のみでトランスフェクションした細
胞ではごく僅かが、ＧＦＰ活性を示した。このことは、ｐＦＹ６でトランスフェ
クションした場合のｐＦＹ９の部位特異的組込みおよび共トランスフェクション
ｉｎｔ遺伝子の不存在下のｐＦＹ９の無作為挿入と一致する。
【００９５】 Ｐｃ（ヒト・サイトメガロウイルス・プロモーター）およびＧＦＰ（図２）に
対応するプライマー対を用いてＰＣＲ分析を行った。これらのプライマーは、組
込み接合に対応する約０．６ｋｂのバンドを増幅すると予想された。部位特異的
組込みと無作為組込みの両者からネオマイシン耐性コロニーが生じる場合があり
、かつＧＦＰマーカーは選択的形質を与えないので、構成クローンの純粋な培養
株を得ることは困難であった。したがって、各トランスフェクション株から得た
ネオマイシン体制細胞のプールをＰＣＲ分析に供し、ネオマイシン耐性細胞間に
組込み接合が存在するか否かを調査した。大きさが約０．６ｋｂと予想されるバ
ンドを２つの株から得た。これは、ａｔｔＢ×ａｔｔＰ組み換え接合により、Ｐ
ｃとＧＦＰの結合が形成されることを示している。
【００９６】 （実施例３） ΦＣ３１インテグラーゼはＣＨＯ細胞中で部位特異的組み換えを触媒する。 本実施例では、ΦＣ３１インテグラーゼをテストして、ａｔｔＰ部位とａｔｔ
Ｂ部位との間の組み換えにより、ＤＮＡ分子をチャイニーズハムスター卵巣（Ｃ
ＨＯ）細胞の染色体中に組込む能力を調べた。
【００９７】 （方法） プラスミドコンストラクト 染色体ａｔｔＢ標的コンストラクトｐＦＹ１２、ｐＦＹ１４およびｐＦＹ１５ プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を
ベクターバックボーンとして用いた。長さの異なるａｔｔＢ部位を含有し、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ部位とＫｐｎＩ部位に隣接した合成オリゴヌクレオチドをｐｃＤＮＡ
３．１／Ｈｉｓ／ｌａｃＺのＨｉｎｄＩＩＩ （ＡＡＧＣＴＴ）部位とＫｐｎＩ
（ＧＧＴＡＣＣ）部位との間に挿入した。 プラスミドｐＦＹ１２は９０ｂｐのａｔｔＢ 配列（ＡＡＧＣＴＴ ｇａｃｇ
ｇｔｃｔｃｇ ａａｇｃｃｇｃｇｇｔ ｇｃｇｇｇｔｇｃｃａ ｇｇｇｃｇｔｇ
ｃｃｃ ｔｔｇｇｇｃｔｃｃｃ ｃｇｇｇｃｇｃｇｔａ ｃｔｃｃａｃｃｔｃａ
ｃｃｃａｔｃｔｇｇｔ ｃｃａｔｃａｔｇａｔ ＧＧＴＡＣＣ）（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：２）を含有する。 プラスミドｐＦＹ１４は５０ ｂｐのａｔｔＢ部位（ＡＡＧＣＴＴ ｇｃｇｇ
ｇｔｇｃｃａ ｇｇｇｃｇｔｇｃｃｃ ｔｔｇｇｇｃｔｃｃｃ ｃｇｇｇｃｇｃ
ｇｔａ ｃｔｃｃａｃｃｔｃａ ＴＧＧＴＡＣＣ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）
を含有する。 プラスミドｐＦＹ１５は３０ ｂｐのａｔｔＢ（ＡＡＧＣＴＴ ｃｃａｇｇｇ
ｃｇｔｇ ｃｃｃｔｔｇｇｇｃｔ ｃｃｃｃｇｇｇｃｇｃ ＡＴＧＧＴＡＣＣ）
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を含有する。
【００９８】 ａｔｔＰプラスミドｐＦＹ１７、ｐＦＹ１９、ｐＦＹ２０の組込み ハイグロマイシンに対する耐性のためにコードし、ｐＥＤ１１３から得られた
１．６ｋｂのＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩ断片として得られたｈｐｔ遺伝子を、ｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫのＢａｍＨＩとＫｐｎＩとの間に挿入してコント
ロールプラスミドｐＢＳＫ−ｈｐｔを作った。
【００９９】 長さの異なるａｔｔＰ部位を含有する合成オリゴヌクレオチドをｐＢＳＫ−ｈ
ｐｔ中のＳａｃＩ（ＧＴＣＧＡＣ）部位とＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）部位との
間に挿入し、 次のプラスミドを作った。 ａ）９０ｂｐのａｔｔＰ部位（ＧＡＧＣＴＣ−ｇａａｇｃｇｇｔｔｔ ｔｃｇｇ
ｇａｇｔａｇｔｇｃｃｃｃａａｃｔ ｇｇｇｇｔａａｃｃｔ ｔｔｇａｇｔｔｃ
ｔｃ ｔｃａｇｔｔｇｇｇｇ ｇｃｇｔａｇｇｇｔｃ ｇｃｃｇａｃａｔｇａ
ｃａｃａａｇｇｇｇｔ−ＧＧＡＴＣＣ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を含有する
プラスミドｐＦＹ１７。 ｂ）５０ｂｐのａｔｔＰ部位（ＧＡＧＣＴＣ−ｔｇｃｃｃｃａａｃｔ ｇｇｇｇ
ｔａａｃｃｔ ｔｔｇａｇｔｔｃｔｃ ｔｃａｇｔｔｇｇｇｇ ｇｃｇｔａｇｇ
ｇｔｃ−ＧＧＡＴＣＣ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）を含有するプラスミドｐＦ
Ｙ１９。 ｃ）３２ｂｐのａｔｔＰ部位（ＧＡＧＣＴＣ−ａｃｔｇｇｇｇｔａａ ｃｃｔｔ
ｔｇａｇｔｔ ｃｔｃｔｃａｇｔｔｇ ｇｇＡＴＣＣ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
７） を含有するプラスミドｐＦＹ２０。
【０１００】 インテグラーゼ発現構成ｐＦＹ６ インテグラーゼ遺伝子のほぼ完全なオープンリーディングフレームを含有する
ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（−）（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ）のＥｃｏＲＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間に挿入した。次いで、Ｋ
ｏｚａｃｋ配列およびインテグラーゼ遺伝子の配列をコードするＮ末端アミノ酸
を含有する合成オリゴヌクレオチド（ＧＧＧＣＣＣＧＣＣＡＣＧＡＴＧＡＣＡＣ
ＡＡＧＧＧＧＴＴＧＴＧＡＣＣＧＧＧＧＴＧＧＡＣＡＣＧＴＡＣＧＣＧＧＧＴＧ
ＣＴＴＡＣＧＡＣＣＧＴＣＡＧＴＣＧＣＧＣＧＡＧＣＧＣＧＡＧＡＡＴＴＣ）（
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）をＡｐａＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間に挿入して、
オープンリーディングフレームを再構成した。この方向は、ｐｃＤＮＡ３．１／
Ｚｅｏ（−）中でＣＭＶ（ヒト・サイトメガロウイルス）プロモーターの制御下
で、完全なインテグラーゼコード化領域を配置する。
【０１０１】 トランスフェクション・プロトコール ＣＨＯ細胞株Ｋ−１をａｔｔＢ標的コンストラクトｐＦＹ１２、ｐＦＹ１４ま
たはｐＦＹ１５でトランスフェクションした（図３）。これらのプラスミドは、
ネオマイシン耐性に対する選択マーカー、およびｐＣ（ヒト・サイトメガロウイ
ルス・プロモーター）とｌａｃＺコード化領域との間に位置する種々の長さのａ
ｔｔＢ部位を有する。プラスミドｐＦＹ１２、ｐＦＹ１４およびｐＦＹ１５は、
それぞれ９０、５０および３０ｂｐのａｔｔＢ配列を含有する。ネオマイシン耐
性細胞株を単一コロニーの連続精製により得た。各コンストラクトの４つの株を
組込み実験に用いた。
【０１０２】 １２株のそれぞれに、ΦＣ３１インテグラーゼ発現プラスミドｐＦＹ６を、組
込みベクターｐＦＹ１７、ｐＦＹ１９またはｐＦＹ２０と共にトランスフェクシ
ョンした。プラスミドｐＦＹ１７、ｐＦＹ１９およびｐＦＹ２０は、それぞれ長
さ９０、５０および３２ｂｐのａｔｔＰ配列を有する。ａｔｔＰ配列をｈｐｔオ
ープンリーディングフレームの上流に置いた。このａｔｔＰ配列は、ハイグロマ
イシン耐性を与えるハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼをコードする
。ａｔｔＰ−ｈｐｔ部分の上流にプロモーターは無く、したがってｈｐｔコード
化領域にゲノムプロモーターを融合するようにプラスミドをゲノムに組込みしな
い限り、ｈｐｔは発現しない。ｐＢＳＫ−ｈｐｔをコントロールに用いて、ｈｐ
ｔへのプロモーター融合の頻度を監視した。ａｔｔＰ配列が無いという点を除い
て、プラスミドｐＢＳＫ−ｈｐｔはｐＦＹ１７、ｐＦＹ１９およびｐＦＹ２０と
同一である。ａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部位との間の組み換えは、組込みベクター
を染色体標的に挿入し、Ｐｃ−ａｔｔＬ−ｈｐｔ結合を発生すると予想される。
ｈｐｔの発現はハイグロマイシン耐性を与える。
【０１０３】 結果 トランスフェクションの結果：１２細胞株にトランスフェクションされた各組込
みプラスミドに対して、ハイグロマイシン耐性コロニーを記録した（表２）。１
×１０６細胞を塗布したものから、ｐＢＳＫ−ｈｐｔトランスフェクションは顕
著に多数の耐性コロニーの産生に失敗した。これは、ゲノムプロモーターに与え
るｈｔｐコード化領域の頻度が著しく低いことを示している。対照的に、ｐＦＹ
１７、ｐＦＹ１９およびｐＦＹ２０は、特定の組込みプラスミドおよび特定の細
胞株によっては、最大で千倍のハイグロマイシン耐性コロニーを生じた。ｐＦＹ
１９またはｐＦＹ１７をＦＹ１２中にトランスフェクションしたものから、より
多くのハイグロマイシン耐性コロニーが生じた。これは、より長いａｔｔＢ配列
とａｔｔＰ配列との間の組み換えは、より短いａｔｔＢ部位とａｔｔＰ部位との
間の組換えよりもより効率的であることを示している。
【０１０４】 ＰＣＲを用いて、代表的コロニーから予想される約０．８ｋｂ接合バンドを検
出した。ヒト・サイトメラロウイルス・プロモーターおよびｈｐｔコード化領域
に対応するプライマーは、予想サイズ（０．８ｋｂ）のＰＣＲ産生物を増幅した
。これは、Ｐｃがｈｐｔコード化領域に結合していることを示しており、ゲノム
のａｔｔＢ部位とプラスミドａｔｔＰ配列との間の組み換えと一致する。
【０１０５】
【表２】
【０１０６】 （実施例４） ΦＣ３１インテグラーゼは植物染色体中でａｔｔＰ部位およびａｔｔＢ部位を組
み換える働きをする。 本実施例は、ΦＣ３１インテグラーゼをテストして、植物染色体中に存在する
ａｔｔＰ部位およびａｔｔＢ部位を組み換える能力を調べた実験についての説明
である。本実験の作成物および方法を図４に示す。
【０１０７】 方法 コンストラクトｐＷＰ２９は、３５Ｓ−ａｔｔＰ−ｎｐｔ−ａｔｔＢ−ｇｕｓ
からなりＲＢおよびＬＢに隣接した断片を含有する。ここにおいて、３５Ｓはカ
リフラワー・モザイクウイルス・プロモーターであり、ｎｐｔはネオマイシン・
ホスホトランスフェラーゼをコードする領域であり、ｇｕｓはグルクロニダーゼ
をコードする領域である。ＲＢおよびＬＢは、それぞれ右および左アグロバクテ
リウムＴ−ＤＮＡ境界配列である。３５Ｓとｎｐｔとの間のａｔｔＰ部位は非翻
訳リーダー配列としての機能を果す。３５Ｓによるｎｐｔの転写によりカナマイ
シン耐性が与えられる。上流にプロモーターが無いので、ｇｕｓコード化領域は
転写されない。
【０１０８】 植物形質転換に用いる第２のコンストラクトはｐＷＰ２４である。このコンス
トラクトはＲＢおよびＬＢに隣接する断片Ｐｎｏｓ−ｎｐｔ−３５Ｓ−ｉｎｔを
含有する。ここにおいて、Ｐｎｏｓはノパリンシンターゼ・プロモーターであり
、ｉｎｔはΦＣ３１インテグラーゼコード化領域である。ｎｐｔとｉｎｔの両者
が、それぞれ上流のプロモーターから転写される。
【０１０９】 この２つのコンストラクトが同じゲノム中に存在する場合、ｐＷＰ２４を有す
る染色体からのｉｎｔの発現により、機能性ΦＣ３１インテグラーゼが発生し、
ｐＷＰ２９を有する染色体上に位置するａｔｔＢ部位とａｔｔＰ部位との間の組
み換えを触媒すると考えられた。組み換え現象により、ｐＷＰ２９構造体からｎ
ｐｔ遺伝子を削除すること、およびｇｕｓに３５Ｓを与えることが予想された。
得られる構造は３５Ｓ−ａｔｔＲ−ｇｕｓであり、ここでａｔｔＲは、ａｔｔＰ
とａｔｔＢとの間の組み換えにより形成されたハイブリッド部位であり、ＰＢ’
とも表される（図４）。ｎｐｔの削除により３５Ｓの転写下でｇｕｓが得られ、
かつＧＵＳ酵素活性を有する植物を生じると予想された。この活性は、植物組織
を組織化学的に染色することにより検出することができる。
【０１１０】 結果 一時発現アッセイを行って、ｐＷＰ２９が組み換えに対して機能的であるか否
かを調べた。裸のＤＮＡの遺伝子銃で仲介した送達により、ｐＷＰ２９をトウモ
ロコシＢＭＳ細胞中にｐＷＰ８と共導入した。コンストラクトｐＷＰ８は、単子
葉植物細胞中で発現するためのトウモロコシ・ユビキチン・プロモーターの後方
に融合したインテグラーゼ遺伝子を有する。両方のプラスミドを共導入した場合
には青色点が観察されたが、プラスミドの一方のみを用いた場合には、これは見
つからなかった。このことは、トウモロコシ細胞中で部位特異的組み換えが起き
たこと、およびｐＷＰ２９中のａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部位とが機能性部位であ
ることを示している。
【０１１１】 カナマイシン耐性タバコ植物体を、ｐＷＰ２９またはｐＷＰ２４を用いてアグ
ロバクテリウムで仲介した形質転換により再生した。もう一度、一時発現アッセ
イを行って、ｐＷＰ２４株が機能性インテグラーゼを産生するか否かを調べた。
コンストラクトｐＷＰ２９を、裸のＤＮＡの遺伝子銃で仲介した送達により、ｐ
ＷＰ２４植物体に導入した。ｐＷＰ２９ＤＮＡを有する細胞は、３５Ｓ−ａｔｔ
Ｒ−ｇｕｓ構成の形成の結果、ＧＵＳ酵素活性を発現すると予想された。実際、
２つの株２４．３および２４．４は、ａｔｔＰ部位とａｔｔＢ部位との間の機能
性インテグラーゼ仲介部位特異的組み換えと一致した青色点を生じた。
【０１１２】 これら２つのｐＷＰ２４インテグラーゼ株をｐＷＰ２９テスター株と交雑して
、ｐＷＰ２９とｐＷＰ２４とを同じゲノムに保有する染色体を有する子孫を作っ
た。インテグラーゼ（２４．３、２４．４）とテスター株（２９．２、２９．４
、２９．５、２９．１９）との間の遺伝子交雑から得られた結果を表３にまとめ
た。いずれの場合も、代表的子孫苗を選択せずに発芽させ、ＧＵＳ酵素活性に対
して組織化学的に染色した。青色に染色された子孫の数を表に示した。一次形質
転換したｐＷＰ２４およびｐＷＰ２９株は代表的トランス遺伝子に対してヘミ接
合性であるので、子孫の４分の１だけが両方のトランス遺伝子型を保有すること
が期待された。サンプル数が少ないので、期待頻度からの顕著な偏差は異常では
ない。
【０１１３】
【表３】
【０１１４】 親株として用いた株の組合せにより、染色の強度が変わった。組織の大部分が
青色に染まった子孫を有するものは、組み換え現象がより効率的であったことを
示している。逆に、染色が均一でない子孫を与えるものは、組み換え現象がより
非効率であったことを示している。異なる子孫プールの間のこの偏差は、恐らく
トランス遺伝子の組込み位置により生じる効果によるものである。２つのインテ
グラーゼ株のうち、２４．４は促進部位特異的組み換えにおいてより効率的に現
れる。これは、恐らくｉｎｔ遺伝子発現のレベルが高いことによる。２４．４を
２９．４および２９．１９に交雑して作った染色パターンは、ａｔｔＢおよびａ
ｔｔＰのｉｎｔ仲介部位特異的組み換えによりｇｕｓ遺伝子活性の活性化を招く
という、本実験の目的に一致する。
【０１１５】 （実施例５） ΦＣ３１インテグラーゼは、植物染色体中への環状プラスミドの組み込みを触媒
する。 本実施例は、ΦＣ３１インテグラーゼをテストして、ａｔｔＰ×ａｔｔＢ部位
特異的組み換えにより植物染色体中に環状プラスミドを挿入する能力を調べた実
験についての説明である。本実験を図５に図示する。
【０１１６】 方法 標的コンストラクトｐＷＰ６は、ＲＢおよびＬＢに隣接し３５Ｓ−ａｔｔＰ−
ｎｐｔからなる断片を含む。３５Ｓとｎｐｔとの間のａｔｔＰ部位は非翻訳リー
ダー配列としての役割を果す。３５Ｓによるｎｐｔの転写によりカナマイシンに
対する耐性が得られる。
【０１１７】 組み込んだコンストラクトｐＹＪＣ４３は断片ａｔｔＢ−ｈｐｔを有する。こ
こで、ｈｐｔはハイグロマイシンに対する耐性をコードしている。インテグラー
ゼ発現コンストラクトはｐＹＪＣ４１であり、３５Ｓはｉｎｔを転写する。
【０１１８】 標的コンストラクトｐＷＰ６を、ｐＷＰ６ＤＮＡの無作為組込みにより植物染
色体中に配置した。次いで、ｐＷＰ６トランス遺伝子の単一コピーを含んだカナ
マイシン耐性植物をｐＹＪＣ４３およびｐＹＪＣ４１で形質転換した。ｐＹＪＣ
４１から得たｉｎｔの一時発現が、ｐＹＪＣ４３のａｔｔＢ部位とｐＷＰ６トラ
ンス遺伝子の染色体的に定まったａｔｔＰ部位との間の組み換えを触媒すること
が期待された。ａｔｔＢ部位とａｔｔＰ部位との間の特異的組み換えにより、ｐ
ＹＪＣ４３環状分子が染色体に挿入され、３５Ｓ−ａｔｔＬ−ｈｐｔ連鎖を作る
ことが期待された。ａｔｔＰ部位およびａｔｔＢ部位は逆方向に図示されている
ので、ａｔｔＬ部位も同様に逆方向にするか、または図中のＢＰ’を逆方向にし
たものと同じＰ’Ｂで表すことに留意されたい。機能性３５Ｓ−ａｔｔＬ−ｈｐ
ｔ連鎖はハイグロマイシン耐性表現型を与えた。
【０１１９】 結果 ｐＷＰ６を有するカナマイシン耐性タバコ植生を、アグロバクテリウム仲介形
質転換により得た。サザンハイブリダイゼーション分析により、ｐＷＰ６トラン
ス遺伝子の単一コピーを有する株を検出した。この株の子孫ＷＰ６．１を無菌的
に発芽させ、これらの植物からプロトプラストを作った。このプロトプラストを
、ｐＹＪＣ４３とｐＹＪＣ４１ＤＮＡとを組合せ、直接ＤＮＡ形質転換のための
ポリエチレングリコール法により形質転換した。次いで、プロトプラストをアガ
ロース中に埋め込み、培養してハイグロマイシン存在下でカルスを形成した。ハ
イグロマイシンを選択しない場合には、カルス形成速度は４×１０−４であった
。これは通常の１０分の１であるが、プロトプラスト形質転換実験で観察される
偏差の範囲内である。ハイグロマイシンを選択する場合には、カルス形成速度は
７×１０−５であった。これは、プロトプラストから再生されたカルスの約１８
％が、標的部位に組込みベクターを含有することを示している。インテグラーゼ
コンストラクトｐＹＪＣ４１を形質転換から除外した場合、カルス形成速度は１
×１０−５未満であった。プラスミドｐＹＪＣ４１を発現するインテグラーゼの
封入により作られたハイグロマイシン耐性カルスの頻度がより高いことは、ｐＹ
ＪＣ４３の染色体ａｔｔＰ標的へのインテグラーゼ促進部位特異的組込みと一致
する。
【０１２０】 本明細書で説明した実施例および実施態様は例示目的のためだけのものであっ
て、当業者にとってこれらを考慮した種々の変更または修正は示唆されており、
かつこれらの変更または修正は本明細書の精神および範囲、ならびに特許請求の
範囲に含まれることを理解されたい。本明細書中で引用した刊行物、特許および
特許出願書類の全てを、全ての目的のためにここに参照により組み入れる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、S．pombe leul Locusで染色体構造の概略的な外観を示す（
縮小）。PLT４４の染色体への相同的挿入（図１A）は、図１Bで示されるようなl
eul 対立遺伝子間のΦC31 attP標的を設置する。 pLT45の染色体attP標的内へのpLT43促進部位特異的組み込みは、図１Cに示す
構造を導入する。矢印は、T7プロモーター（T7）、T3プロモーター（T3）及びur
a４＋コード化領域（U4）に対応するPCRプライマーを示す。XbalI（X）切断産物
の予想される大きさを示す。
【図２】 図２は、ΦC31インテグラーゼが、CHO細胞におけるグリーン蛍光タン
パク質（GFP）をコード化するトランス遺伝子の部位特異的組み込みを触媒する
ことを証明する実験の概略を示す。
【図３】 図３は、ΦC31が、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝
子を染色体に位置したプロモーターの下流に挿入するためにattB部位での特異的
組み換えを触媒することを証明する実験の概略図を示す。成功した組み込みは、
Pc-att-hptリンケージ及びハイグロマイシン耐性表現型を生産する。attP及びat
tB部位の異なる長さの影響を、指標したプラスミドを使用して分析した。
【図４】 図４は、タバコゲノム由来のattB及びattP部位によって隣接させたDN
Aの切り取りを触媒することを示す実験の概略的な図表を示す。
【図５】 図５は、ΦC31インテグラーゼがタバコゲノムへのトランス遺伝子の
組み込みを触媒したことを示す実験の概略的な図表を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 デヴィッド ダブリュー オウ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94547−3749 ハーキュリーズ ブレンナ ー ストリート 127 (72)発明者 リチャード カレンダー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94708−1436 バークリー ユークリッド ストリート 940 (72)発明者 リン トマソン アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94706−2282 アルバニー エイチ モン ロー ストリート 1061 ナンバー７ Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA07 CA03 CA04 DA01 DA02 DA12 EA04 FA02 FA10 GA11 HA12 4B065 AA79X AA89X AA91X AA98Y AB01 AC14 BA02 CA27

Claims (47)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 原核リコンビナーゼポリペプチド又は原核リコンビナーゼをコー
    ド化する核酸を含有する真核細胞であり、リコンビナーゼは、第一の組み換え部
    位と前記第一の組み換え部位との組み換えの基質として作用可能な第二の組み換
    え部位との間の部位特異的組み換えを仲介することが可能であるが、真核細胞に
    存在しない付加的因子の不存在下で第一の組み換え部位と第二の組み換え部位と
    の間の組み換えで形成される2つのハイブリッドリコンビナーゼ組み換え部位間
    の組み換えを仲介することが不可能であることを特徴とする真核細胞。
  2. 【請求項２】 リコンビナーゼが、バクテリオファージΦC31インテグラーゼ、
    大腸菌ファージP4リコンビナーゼ、リステリアファージリコンビナーゼ、バクテ
    リオファージR4 Sre リコンビナーゼ、CisA リコンビナーゼ、XisFリコンビナー
    ゼ及びトランスポゾンTn4451 TnpXリコンビナーゼからなる群から選択されるこ
    とを特徴とする請求項1記載の真核細胞。
  3. 【請求項３】 リコンビナーゼがバクテリオファージΦC31インテグラーゼであ
    ることを特徴とする請求項1記載の真核細胞。
  4. 【請求項４】 第一の組み換え部位がattB部位であり、第二の組み換え部位がat
    tP部位であることを特徴とする請求項1記載の真核細胞。
  5. 【請求項５】 さらに、細胞が第一リコンビナーゼ組み換え部位を含むことを特
    徴とする請求項1記載の真核細胞。
  6. 【請求項６】 細胞が、真核細胞においてリコンビナーゼコード化ポリヌクレオ
    チドの発現を仲介するプロモーターに作用可能に結合した、リコンビナーゼポリ
    ペプチドに対するコード化配列を含む核酸を含有することを特徴とする請求項1
    記載の真核細胞。
  7. 【請求項７】 さらに、核酸が選択マーカーを含むことを特徴とする請求項6記
    載の真核細胞。
  8. 【請求項８】 プロモーターが誘導又は抑制プロモーターであることを特徴とす
    る請求項6項記載の真核細胞。
  9. 【請求項９】 核酸がプラスミドpLT43であることを特徴とする請求項8項記載の
    真核細胞。
  10. 【請求項１０】 真核細胞が、動物細胞、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び
    カビ細胞からなる群から選択されることを特徴とする請求項1記載の真核細胞。
  11. 【請求項１１】 真核細胞が、哺乳類の細胞であること特徴とする請求項１０記
    載の真核細胞。
  12. 【請求項１２】 真核細胞が、多細胞生物に存在することを特徴とする請求項１
    ０記載の真核細胞。
  13. 【請求項１３】 真核細胞において部位特異的組み換えを得るための方法であり
    、 第一の組み換え部位と、前記第一の組み換え部位との組み換えの基質として作
    用可能な第二の組み換え部位とを含む真核細胞を供給し、 第一及び第二の組み換え部位を原核リコンビナーゼポリペプチドと接触させて
    、組み換え部位間で組み換えを生じ、それによって一又は二つのハイブリッド組
    み換え部位を形成することからなる方法であって、 リコンビナーゼポリペプチドが、第一と第二の組み換え部位との間の部位特異
    的組み換えを仲介することが可能であるが、真核細胞に存在しない付加的因子の
    不存在下で2つのハイブリッド組み換え部位間の組み換えを仲介することが不可
    能であることを特徴とする方法。
  14. 【請求項１４】 真核細胞が、酵母細胞、カビ細胞、植物細胞、昆虫細胞、及び
    動物細胞からなる群から選択されることを特徴賭する請求項１３記載の方法。
  15. 【請求項１５】 第一の組み換え部位が、真核細胞の染色体に存在することを特
    徴とする請求項１３記載の方法。
  16. 【請求項１６】 第二の組み換え部位が真核細胞の第二の染色体に存在し、第一
    及び第二の組み換え部位をリコンビナーゼと接触させて染色体アームのトランス
    ロケーションを生じることを特徴とする請求項15記載の方法。
  17. 【請求項１７】 第一の組み換え部位と第二の組み換え部位が単一核酸分子に存
    在することを特徴とする請求項13記載の方法。
  18. 【請求項１８】 第一の組み換え部位及び第二の組み換え部位が直線方向（dire
    ct orientation）であることを特徴とする請求項17記載の方法。
  19. 【請求項１９】 組み換えが、第一と第二の組み換え部位との間にある核酸分子
    の部分の切り取りを生じることを特徴とする請求項18記載の方法。
  20. 【請求項２０】 第一の組み換え部位と第二の組み換え部位が逆方向（inverted
    orientation）であることを特徴とする請求項17記載の方法。
  21. 【請求項２１】 組み換えが、第一と第二の組み換え部位との間にある核酸分子
    の部分の逆位を生じることを特徴とする請求項20記載の方法。
  22. 【請求項２２】 真核細胞が、リコンビナーゼポリペプチドをコード化するポリ
    ヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１３記載の方法。
  23. 【請求項２３】 リコンビナーゼコード化ポリヌクレオチドは、真核細胞におけ
    るポリヌクレオチドの発現を仲介するプロモーターに作用可能に結合することを
    特徴とする請求項２２記載の方法。
  24. 【請求項２４】 プロモーターが、誘導又は抑制プロモーターであることを特徴
    とする請求項２３項記載の方法。
  25. 【請求項２５】 プロモーターが、Pmntプロモーターであることを特徴とする請
    求項２４記載の方法。
  26. 【請求項２６】 安定的に組み込んだトランス遺伝子を有する真核細胞を得るた
    めの方法であり、 トランス遺伝子と、第一の組み換え部位との組み換えに対して基質として作用
    することが可能な第二の組み換え部位とを含む核酸を第一の組み換え部位を含む
    真核細胞の中に導入し、 第一及び第二の組み換え部位を原核リコンビナーゼポリペプチドに接触させて
    、リコンビナーゼポリペプチドが、第一と第二の組み換え部位との間の組み換え
    を触媒し、第一の組み換え部位で核酸を組み込みませて、それによって、核酸の
    各末端でハイブリッド組み換え部位を形成することからなる方法であって、 リコンビナーゼポリペプチドが、第一と第二の組み換え部位との間の部位特異
    的組み換えを仲介することが可能であるが、真核細胞に存在しない付加的因子の
    不存在下で2つのハイブリット組み換え部位間の組み換えを仲介することが不可
    能であることを特徴とする方法。
  27. 【請求項２７】 リコンビナーゼポリペプチドが、バクテリオファージΦC31イ
    ンテグラーゼ、大腸菌ファージP4リコンビナーゼ、リステリアファージリコンビ
    ナーゼ、バクテリオファージR4 Sre リコンビナーゼ、CisA リコンビナーゼ、Xi
    sFリコンビナーゼ及びトランスポゾンTn4451 TnpXリコンビナーゼからなる群か
    ら選択されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
  28. 【請求項２８】 リコンビナーゼが、バクテリオファージΦC31インテグラーゼ
    であることを特徴とする請求項２７記載の方法。
  29. 【請求項２９】 リコンビナーゼポリペプチドを真核細胞の中へリコンビナーゼ
    ポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドの発現によって導入することを特
    徴とする請求項２６記載の方法。
  30. 【請求項３０】 リコンビナーゼポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド
    が、真核細胞において機能するプロモーターに作用可能に結合することを特徴と
    する請求項２９記載の方法。
  31. 【請求項３１】 プロモーターが、誘導又は抑制プロモーターであることを特徴
    とする請求項３０記載の方法。
  32. 【請求項３２】 真核細胞において機能するプロモーターに作用可能に結合した
    細菌性リコンビナーゼポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド配列を含む
    核酸であり、リコンビナーゼポリペプチドが付加的因子の不存在下において第一
    の組み換え部位と第二の組み換え部位との間の組み換えで形成された2つのハイ
    ブリッド組み換え部位間の組み換えを仲介できないことを特徴とする核酸。
  33. 【請求項３３】 さらに、核酸がリコンビナーゼポリペプチドによって認識され
    る少なくとも1つの組み換え部位を含むことを特徴とする請求項３２記載の核酸
    。
  34. 【請求項３４】 核酸がプラスミドベクターを含むことを特徴とする請求項３２
    記載の核酸
  35. 【請求項３５】 ベクターがpLT43であることを特徴とする請求項３４記載の核
    酸。
  36. 【請求項３６】 第一のバクテリオファージΦC31インテグラーゼ組み換え部位
    を含むポリヌクレオチドを含有することを特徴とする真核細胞。
  37. 【請求項３７】 組み換え部位がattP及びattBからなる群から選択されることを
    特徴とする請求項36記載の真核細胞。
  38. 【請求項３８】 さらに、真核細胞が、ΦC31インテグラーゼポリペプチドと接
    触したとき、第一のΦC31組み換え部位との組み換えを経た第二のΦC31組み換え
    部位を含む第二のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする請求項36記載の
    真核細胞。
  39. 【請求項３９】 第一の組み換え部位がattBであり、第二の組み換え部位がattP
    であるか、第一の組み換え部位がattPであり、第二の組み換え部位がattBである
    ことを特徴とする請求項３８記載の真核細胞。
  40. 【請求項４０】 さらに、第二のポリヌクレオチドがトランス遺伝子を含むこと
    を特徴とする請求項３８記載の真核細胞。
  41. 【請求項４１】 さらに、第二のポリヌクレオチドが選択マーカーを含むことを
    特徴とする請求項３８記載の真核細胞。
  42. 【請求項４２】 さらに、真核細胞がΦC31インテグラーゼポリペプチドを含む
    ことを特徴とする請求項36記載の真核細胞。
  43. 【請求項４３】 さらに、真核細胞がΦC31インテグラーゼポリペプチドをコー
    ド化するポリヌクレオチドを含む核酸を含有することを特徴とする請求項３６記
    載の真核細胞。
  44. 【請求項４４】 さらに、核酸が選択マーカーを含むことを特徴とする請求項４
    ３記載の真核細胞。
  45. 【請求項４５】 さらに、核酸が、細胞においてΦC31インテグラーゼコード化
    ポリペプチドの発現を生じるプロモーターを含有することを特徴とする請求項４
    ３記載の真核細胞。
  46. 【請求項４６】 プロモーターが誘導プロモーターであることを特徴とする請求
    項４５記載の真核細胞。
  47. 【請求項４７】 真核細胞が、酵母細胞、カビ細胞、植物細胞、及び動物細胞か
    らなる群から選択されることを特徴とする請求項３６記載の真核細胞。
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