JP4797186B2

JP4797186B2 - 末梢血中への造血幹細胞動員剤

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Publication number: JP4797186B2
Application number: JP2004296763A
Authority: JP
Inventors: 剛史汐田; 史人但馬
Original assignee: 剛史汐田; 史人但馬
Priority date: 2004-10-08
Filing date: 2004-10-08
Publication date: 2011-10-19
Anticipated expiration: 2024-10-08
Also published as: JP2006104177A

Description

本発明は、末梢血中に、造血幹細胞を動員するための肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の使用と、この使用を目的とした医薬品に関する。

血液中のすべての血球（赤血球、白血球、血小板等）は、骨髄中に存在する一種類の血液幹細胞から分化して作られている。

成熟した各血球への分化には、それぞれの段階に応じて各種の蛋白因子の刺激が不可欠であり、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は、主要な白血球である好中球への分化を促進する因子である。

好中球は、細菌を殺す作用を有し感染症の防御に不可欠な白血球であるが、その数は、癌の化学療法や白血病における骨髄移植に伴う放射線照射により激減する。好中球の数が１ｍ^３中に、１０００個以下になると、細菌感染の危険性が、非常に高くなる。

このような場合、一般に、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）が投与されている。

しかしながら、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を投与した場合の重大な副作用としては、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）による過剰反応のため脾臓の急激な腫大がみられ脾破裂を合併した例の報告がある。
Becker PS . et al. Spontaneous splenic rupture following administration of granulocyte colony-stimulating factor（G-CSF）: occurrence in an allogeneic donor of peripheral blood stem cells. Biol Blood Marrow Transplant 1997; 3: 45-49 一方、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、それ自体、肝細胞を増殖させるサイトカインとして知られているが、肝細胞を増殖させる以外に、サイトカインネットワークを介して、マトリックス分解酵素（ＭＭＰ）などの他のサイトカインを誘導することが知られている。

また、造血細胞の増殖及び分化を刺激する薬物の調整のために、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を使用することが、提案されている。
特表平１０−５０９９５１号

しかしながら、本発明者等は、本発明者等が作成した肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）発現マウスを解析する中で、末梢血中に、造血幹細胞の指標であるＣＤ３４陽性細胞が、正常マウスより多く出現しているのを発見した。

現時点において、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の造血幹細胞に対する作用効果は不明であるが、癌細胞がまわりの間質に浸潤する過程において重要な働きをすると考えられているマトリックス・メタロプロテエース（ＭＭＰ）のアイソタイプの中の、ＭＭＰ９などが、骨髄より造血幹細胞を末梢血に動員する一躍を担うことが示唆されていることを考えると、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）が、造血幹細胞を末梢血に動員する効果が期待されることに着目し、実験した結果、本発明を完成するに至った。

現在、各種悪性腫瘍に対して、例えば、末梢血中へ臍帯血中に含まれる造血幹胞移植が、一般的な医療として確立し、再生医療においても、注目されている。

その一方、末梢血に、造血幹細胞を動員する機序は明らかでない。

そして、現状では、各種悪性腫瘍に対して、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、または、抗癌剤を投与する以外、現在、臨床応用されている方法はない。

本発明の目的は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）が、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、または、抗癌剤を投与する方法より優れているか、又は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、または、抗癌剤を投与する方法と相加・相乗効果が期待でき、末梢血への幹細胞の動員の機序が明らかにすることが期待でき、また、より効率的で安全な末梢への造血幹細胞動員方法を提供すること、及び、そのような末梢血中への幹細胞動員できる医薬品を市場に提供することにある。

請求項１に記載の末梢血中への造血幹細胞動員剤は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を含有し、前記肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）をドナーに投与することで、ドナーの骨髄から、造血幹細胞を、末梢血中に動員し、末梢血中に動員された造血幹細胞を、末梢血中から採取する用途に用いる。

請求項１に記載の末梢血中への造血幹細胞動員剤では、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を用いることで、末梢血中に、造血幹細胞を動員できるので、本発明に係る医薬品によって、末梢血管中に動員された、造血幹細胞（ヒト造血幹細胞）を、末梢血管中から採取する用途に用いることができる。

また、この医薬品は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、または、抗癌剤を投与する方法より優れているか、又は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、または、抗癌剤を投与する方法と相加・相乗効果が期待でき、末梢血への幹細胞の動員の機序を明らかにすることが期待でき、また、より効率的で安全な末梢血中への幹細胞動員でき、肝不全に対する非常に有用な再生医療への適用が可能である。

次に、本発明を実験に基づいて説明する。

ＣＤ３４陽性細胞は、造血幹細胞の指標として汎用されるマーカーである。

本発明者等は、正常マウスの末梢血中のＣＤ３４陽性細胞を調べた所、ＣＤ３４陽性細胞が、末梢血中に、０．１％が含まれていた。

これに対し、本発明者等が作成した、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）発現マウスでは、末梢血に、このＣＤ３４陽性細胞が、１．１％も出現していた。

そこで、この肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の末梢血中のコロニー形成能を持った細胞の解析を行ったところ、表１に示すように、明らかに、コロニー形成能を持った細胞が多く出現していた。このことから、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）発現マウスの末梢血中には、造血前駆細胞が多く含まれていることが、明らかになった。

また、それぞれのマウスより末梢血を採取した後、フィコールを比重遠心法にて単核球を分離した。

その単核球１×１０^６個／皿の細胞を、各々、４個の培養皿に、幹細胞因子（ｓｔｅｍｃｅｌｌｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ））に、インターロイキン２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ-ＩＩ（ＩＬ-２））、インターロイキン３（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ-ＩＩＩ（ＩL-３））、エリスロポイエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＥＰＯ））存在下のメチルセルロース培地にて培養し、10日後、倒立顕微鏡を用いて、それぞれの培養皿中のコロニー数を計算した。結果は平均±標準差にて表した。

尚、表１中、ＧＭは、顆粒球マクロファージコロニーを意味し、ＧＥＭは、顆粒球赤芽球マクロファージコロニーを意味し、ＧＥＭＭは、顆粒球赤芽球巨核球マクロファージコロニーを意味し、Ｇは、顆粒球コロニーを意味し、また、Ｍは、マクロファージコロニーのことである、
このＣＤ３４陽性細胞が、マウスの系に特異的でないことを証明するために、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）発現マウスと異なった系のマウス、Ｂ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスを用いて検討した。Ｂ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスに、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）発現アデノウイルスを感染させ、末梢血中にＣＤ３４陽性細胞が出現するか、また、その末梢血のコロニー形成能を検討した。

肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）発現アデノウイルスを、１×１０^６ｐｆｕ／マウスの量となるように静脈注射（以下、単に、「静注」という。）したマウス、１×１０^７ｐｆｕ／マウスの量となるように静注したマウス、１×１０^８ｐｆｕ／マウスの量となるように静注したマウス、１×１０^９ｐｆｕ／マウスの量となるように静注したマウス、ＬａｃＺ発現アデノウイルスを、１×１０^７ｐｆｕ／マウスの量となるように静注したマウス、生理食塩水をマウスの尾静脈より静注したマウスの各々について、静注４８時間後、マウスより、末梢血を採取し、ＣＤ３４陽性細胞をフローサイトメトリー法にて解析した。

結果を図１に示す。

また、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）発現アデノウイルスを、１×１０^６ｐｆｕ／マウスの量となるように静注したマウス、１×１０^７ｐｆｕ／マウスの量となるように静注したマウス、１×１０^８ｐｆｕ／マウスの量となるように静注したマウス、１×１０^９ｐｆｕ／マウスの量となるように静注したマウス、ＬａｃＺ発現アデノウイルスを１×１０^７ｐｆｕ／マウスの量となるように静注したマウス、生理食塩水をマウスの尾静脈より静注したマウスの各々について、静注４８時間後、マウスより末梢血を採取し、フィコール比重遠心法にて単核球を分離した。

その単核球１×１０^６個／皿の細胞を、各々、４個の培養皿に、幹細胞因子（ｓｔｅｍｃｅｌｌｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ））に、インターロイキン２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ-ＩＩ（ＩＬ-ＩＩ））、インターロイキン３（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ-ＩＩＩ（ＩＬ-３））、エリスロポイエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＥＰＯ））存在下のメチルセルロース培地にて培養し、１０日後、倒立顕微鏡を用いて、それぞれの培養皿中のコロニー数を計算した。

結果を図２に示す。

図１及び図２に示す通り、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）発現アデノウイルスを、１×１０^６ｐｆｕ／マウスの量となるように静注したマウス、１×１０^７ｐｆｕ／マウスの量となるように静注したマウス、１×１０^８ｐｆｕ／マウスの量となるように静注したマウス、１×１０^９ｐｆｕ／マウスの量となるように静注したマウスの各々のＣＤ３４陽性細胞の比率は、各々、０．５３５±０．２３（ｎ＝４）、０．７１５１±０．１２（ｎ＝４）、０．７１±０．３７（ｎ＝４）、０．８±０．５８（ｎ＝４）％であったのに対し、１×１０^７ｐｆｕ／マウスの量のＬａｃＺ発現アデノウイルスを静注したマウスのＣＤ３４陽性細胞の比率は、０．４７７±０．１６（ｎ＝３）％であり、また、生理用食塩水を静注したマウスのＣＤ３４陽性細胞の比率は、０．２７±０（ｎ=２）であった。

また、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）発現アデノウイルスを、１×１０^６ｐｆｕ／マウスの量となるように静注したマウス、１×１０^７ｐｆｕ／マウスの量となるように静注したマウス、１×１０^８ｐｆｕ／マウスの量となるように静注したマウス、１×１０^９ｐｆｕ／マウスの量となるように静注したマウスの各々のコロニー形成能は、各々、３±２、１３±２２、１５±１６、２±２であったのに対し、ＬａｃＺ発現アデノウイルスを、１×１０^７ｐｆｕ／マウスの量となるように静注したマウスのコロニー形成能は、３±２であり、生理食塩水を静注したマウスのコロニー形成能は、２±２であり、この結果から、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）発現アデノウイルスを感染させたマウスでは、末梢血中に造血前駆細胞が多く出現している可能性があることが示唆された。

次に、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）投与により、造血前駆細胞が、マウス末梢血中に動員されることを、Ｂ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウスに、遺伝子組み換えヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を静脈内投与した。

遺伝子組み換えヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を、１０μｇ／ｋｇの量尾静脈より投与したマウス、１００μｇ／ｋｇの量尾静脈より投与したマウス、２００μｇ／ｋｇの量尾静脈より投与したマウス及び５００μｇ／ｋｇの量尾静脈より投与したマウスの各々について、０時間後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後及び２４時間後の各々において、マウス末梢血中の単核球のＣＤ３４陽性細胞を、フローサイトメトリー法にて検討した。

結果を、図３に示す。

図３の結果から、遺伝子組み換えヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を投与した後、３時間目をピークに、マウス末梢血中に、ＣＤ３４陽性細胞が出現してくることが判明した。また、量依存性に発現比率は高くなってくるが、１００μｇ／ｋｇの量尾静脈より投与したマウス、２００μｇ／ｋｇの量尾静脈より投与したマウス及び５００μｇ／ｋｇの量尾静脈より投与したマウスでは、差が認めなかった。また、以上すべての実験において、マウス末梢白血球数は影響されなかった。

最後に、実際に、生体内（ｉｎｖｉｖｏ）で、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）が造血幹細胞（長期造血再構築能を持った細胞）を末梢血に動員するか否かをＬｙ５．１−Ｌｙ５．２マウスを用いたマウス末梢血造血幹細胞移植モデルを用いて検討した。

遺伝子組み換えヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を、１２時間毎に、２回尾静脈より投与し、最終投与３時間後にマウスより末梢血を採取した。

フィコール比重遠心法にて単核球を分離後、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、Ｂ２２０、Ｔｅｒ１１９、Ｇｒ１陽性細胞を磁器ビーズ法により除去し、分化マーカー陰性（Ｌｉｎ−）細胞を２Ｘ１０^５／マウスを、９．０Ｇｙの放射線照射をしたマウスに移植した。

図４は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）により動員した、末梢血単核球を移植したマウスのキメリズムの図である。

図４に示すように、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を静脈内投与したマウスより得られた単核球を移植した全てのマウスにドナー由来の細胞を認め、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を静脈内投与後のマウス末梢血中には長期造血再構築能を持った細胞、すなわち、造血幹細胞が出現していることが判明した。

以上より、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、マウスにおいて骨髄より末梢血に造血前駆細胞を動員するが、マウス末梢白血球数を増加させないことが明らかになった。しかも、比較的早い時期に、造血前駆細胞が動員されることから、なんらかの機械的な変化をもたらすことが示唆された。

この点に関しては、以前、本発明者等が作成した可溶性ｃ−ｋｉｔ受容体投与モデルと同様の動態を示すことから、なんらかのネットワークを介して、造血前駆細胞のストローマ細胞との接着に効果を示すのではないかと推測する。

また、このことは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を用いた造血幹細胞の末梢血への動員の副作用である白血球増加を回避させ、動員効果の相加・相乗効果を期待させるものである。

更に、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）投与は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）自体の肝細胞の増殖効果と幹細胞の骨髄から肝臓内への動員と相まって、肝不全に対する非常に有用な再生医療の手段となる可能性を示唆した。

以上より、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、マウスにおいて、骨髄より末梢血に造血前駆細胞を動員するが、マウス末梢白血球数を増加させないことが明らかになった。

しかも、比較的早い時期に、造血前駆細胞が動員されることから、なんらかの機械的な変化をもたらすことが示唆された。

ここで、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を投与したマウスは、可溶性ｃ−ｋｉｔ受容体投与モデルにおいてと同様の動態を示すことから、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、なんらかのネットワークを介して、造血前駆細胞のストローマ細胞と接着に効果を示すのではないかと推測される。

さらに、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）投与は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）自体の肝細胞の増殖効果と幹細胞の骨髄から肝臓内への動員と相まって、肝不全に対する非常に有用な再生医療の手段となる可能性を示唆した。

また、本発明は、白血病や重症再生不良性貧血の根治治療への適用や、そのような治療薬（医薬品）として有用である。

また、本発明によって得られた、造血幹細胞（ヒト造血幹細胞）を、例えば、生体外で培養・増殖した後に生体に移植するようにすれば、移植片対宿主病（graft-versus-host disease;GVHD）を生じ難いので、白血病や重症再生不良性貧血の根治治療への適用や、そのような治療薬（医薬品）として有用である。

本発明は、白血病や重症再生不良性貧血の根治治療への適用や、肝不全に対する非常に有用な再生医療への適用や、そのような治療薬（医薬品）として、産業上の利用可能性が高い。

肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）発現アデノウイルスを、１×１０^６ｐｆｕ／マウスの量となるように静注したマウス、１×１０^７ｐｆｕ／マウスの量となるように静注したマウス、１×１０^８ｐｆｕ／マウスの量となるように静注したマウス、１×１０^９ｐｆｕ／マウスの量となるように静注したマウス、ＬａｃＺ発現アデノウイルスを、１×１０^７ｐｆｕ／マウスの量となるように静注したマウス、生理食塩水をマウス尾静脈より静注したマウスの各々について、静注４８時間後、マウスより、末梢血を採取し、ＣＤ３４陽性細胞をフローサイトメトリー法にて解析した結果を示す図である。肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）発現アデノウイルスを、１×１０^６ｐｆｕ／マウスの量となるように静注したマウス、１×１０^７ｐｆｕ／マウスの量となるように静注したマウス、１×１０^８ｐｆｕ／マウスの量となるように静注したマウス、１×１０^９ｐｆｕ／マウスの量となるように静注したマウス、ＬａｃＺ発現アデノウイルスを１×１０^７ｐｆｕ／マウスの量となるように静注したマウス、生理食塩水をマウス尾静脈より静注したマウスの各々について、静注４８時間後、マウスより末梢血を採取し、フィコール比重遠心法にて単核球を分離し、その単核球１×１０^６個／皿の細胞を、各々、４個の培養皿に、ｓｔｅｍｃｅｌｌｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）、にｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ-ＩＩ（ＩＬ-ＩＩ）、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ-ＩＩI（ＩL-３）、ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＥＰＯ）存在下のメチルセルロース培地にて培養し、１０日後、倒立顕微鏡を用いて、それぞれの培養皿中のコロニー数を計算した結果を示す図である。遺伝子組み換えヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を、１０μｇ／ｋｇの量尾静脈より投与したマウス、１００μｇ／ｋｇの量尾静脈より投与したマウス、２００μｇ／ｋｇの量尾静脈より投与したマウス及び５００μｇ／ｋｇの量尾静脈より投与したマウスの各々について、０時間後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後及び２４時間後の各々において、マウス末梢血中の単核球のＣＤ３４陽性細胞を、フローサイトメトリー法にて検討した結果を示す図である。肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）により動員した、末梢血単核球を移植したマウスのキメリズムの図である。

Claims

肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を含有し、前記肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）をドナーに投与することで、ドナーの骨髄から、造血幹細胞を、末梢血中に動員し、末梢血中に動員された造血幹細胞を、末梢血中から採取する用途に用いる、末梢血中への造血幹細胞動員剤。