JP4796612B2 - アラビノフラノシダーゼ - Google Patents

Description

本発明は、（１→５）結合したα−Ｌ−アラビノフラノース残基に特異的に作用し、直鎖（１→５）−α−Ｌ−アラビナンに対する加水分解活性を有するアラビノフラノシダーゼ、および糖転移活性を有するアラビノフラノシダーゼ、当該アラビノフラノシダーゼをコードする遺伝子、当該アラビノフラノシダーゼ生産菌株、および当該アラビノフラノシダーゼの製造法に関する。

Ｌ−アラビノースは天然に存在する五単糖であり、適度な甘みを有する。自然界ではフラノースの形で、アラビノキシランやアラビナン、アラビノガラクタンとして存在している。アラビノースを主な構成糖とするアラビナンは、ある種の種子、果実、野菜、樹皮あるいは木材などから抽出され、構造解析がなされている。基本的にはα−Ｌ−アラビノフラノース残基が（１→５）結合した主鎖のところどころに、Ｏ−３位あるいはＯ−２位でα−Ｌ−アラビノフラノース残基が結合した構造を持つことが示されている。

近年、世利らにより、単糖Ｌ−アラビノースが小腸スクラーゼを阻害すること、また経口投与により砂糖負荷後の血糖上昇、インスリン上昇を抑制することが明らかにされた（非特許文献１）。さらに、讃井らにより、Ｌ−アラビノースはスクロースとともに摂取した場合、スクロースの消化吸収を抑制し、そのエネルギー利用を低減することが示され（非特許文献２）、その生理活性とともに製造法に関して注目が高まっている。

アラビノース含有多糖を分解する酵素がアラビナナーゼであり、現在までその作用様式からエンド型とエキソ型の二系統が知られている。エンド型のアラビナナーゼはエンド−（１→５）−α−Ｌ−アラビナナーゼ（EC.3.2.1.99）と呼ばれており、エキソ型はアラビノフラノシダーゼ（EC.3.2.1.55）と呼ばれている。

アラビノフラノシダーゼはこれまで様々な起源のものが報告されている。現在のところ、以下の２種類に大きく分類されている（非特許文献３）。
（１）α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼＡ
（２）α−Ｌ−アラビノフラノジターゼＢ

この分類は、ビートアラビナンなどのアラビノース含有多糖への作用の有無によるものである。しかしながら、アラビノース含有多糖の構造が未だ不明瞭であり、そのためアラビノフラノシダーゼの分類についてもはっきりしていないのが現状である。アラビノース含有多糖に作用するアラビノフラノシダーゼにおいて、今まで発見されている酵素の多くは、ビートアラビナンから（１→２）または（１→３）結合したα−Ｌ−アラビノース残基を優先的に加水分解し、その結果直鎖（１→５）−α−Ｌ−アラビナンを生じて溶液中から沈殿する（非特許文献４）。アラビナンの主鎖である直鎖（１→５）−α−Ｌ−アラビナンはほとんど分解されないため、これら公知の酵素でビートアラビナンを高収率で単糖まで分解することは困難であった。

ワイン・果汁ジュースなどでしばしば発生する濁りは、この直鎖（１→５）−α−Ｌ−アラビナンを主成分とするものである（非特許文献５）。上述した理由により、公知のアラビノフラノシダーゼによってこれら濁りの発生を防止することや濁りを除去することは困難であった。

様々なグリコシダーゼがその特異性を利用して多糖やオリゴ糖などの構造解析に広く利用されている。アラビノース含有多糖などの構造研究には基質特異性の高い酵素が必須であるが、これまで基質特異性が明確になっているアラビノフラノシダーゼは数少ない。我々は幾つかのアラビノフラノシダーゼの基質特異性について、３種類のメチル−α−Ｌ−アラビノフラノビオシド位置異性体（１→２、１→３、１→５）等を用いて詳細に調べた。これまで（１→２）あるいは（１→３）結合したα−Ｌ−アラビノフラノース残基を優先して切断する酵素の存在はいくつか確認したが、（１→５）結合したα−Ｌ−アラビノフラノース残基に特異的な酵素は得られていない。

近年、グリコシダーゼの糖転位反応により様々なオリゴ糖や配糖体が合成され、食品分野を中心に幅広く利用されている。しかしながら、アラビノフラノシダーゼによる糖転位反応についてはほとんど報告がなく、アラビノオリゴ糖やアラビノース配糖体の応用例も知られていない。

世利他、メタボリズム、４５巻、p．１３６８（１９９６）〔K.Seri et.al.,Metabolism,45,p.1368(1996)〕 讃井他、日本栄養食料学会誌、５０巻、ｐ．１３３（１９９７） G.Beldmanら、アドバンシス・イン・マクロモレキュラー・カーボハイドレート・リサーチ、１巻、ｐ．１（１９９７） McCleary,B.V．、エンザイムズ・イン・バイオマス・コンバージョン、Ｐ．４２２（１９８４）〔McCleary,B.V.,Enzymes In Biomass Conversion,p.422(1984)〕 M.P.Bellevilleら、ファイトケミストリー、３３巻、Ｐ．２２７（１９９３）〔M.P.Belleville et.al.、Phytochemistry、33、P.227(1993)〕

本発明は、（１→５）結合したα−Ｌ−アラビノフラノース残基に高い特異性を有して直鎖（１→５）−α−Ｌ−アラビナンを効率良く分解することができ、またその高い基質特異性から研究用試薬としても利用価値の高いアラビノフラノシダーゼ、および糖転移活性を有し各種アラビノオリゴ糖やアラビノース含有配糖体の製造に利用できるアラビノフラノシダーゼを提供するものである。また、当該アラビノフラノシダーゼをコードする遺伝子を提供するものである。

本発明者らは、新規な性質を有するアラビノフラノシダーゼ、特に直鎖（１→５）−α−Ｌ−アラビナンを効率的に分解できる酵素、および糖転移活性を有する酵素の生産が可能な微生物を見い出すべく鋭意研究を行った結果、ストレプトマイセス属に属する放線菌に由来するアラビノフラノシダーゼが（１→５）結合したα−Ｌ−アラビノフラノース残基に高い特異性を有して直鎖（１→５）−α−Ｌ−アラビナンを効率的に分解できることを見い出し、また本菌に由来する別の酵素が糖転移活性を有することを見い出し、この菌株の培養液から目的とする酵素を取り出してその性質を解明し、発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、直鎖（１→５）−α−Ｌ−アラビナンを効率的に分解できるアラビノフラノシダーゼ、当該アラビノフラノシダーゼを生産する菌および当該アラビノフラノシダーゼをコードする遺伝子を提供するものである。

また、本発明は、糖転移活性を有するアラビノフラノシダーゼ、当該アラビノフラノシダーゼを生産する菌株および当該アラビノフラノシダーゼをコードする遺伝子を提供するものである。

更に、本発明は、これらの遺伝子を有する菌株を培地中に接種し、培養してアラビノフラノシダーゼを菌体内または培地中に蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする、アラビノフラノシダーゼの製造法を提供するものである。

本発明のアラビノフラノシダーゼ１は、糖転移活性を有するため、各種アラビノース含有配糖体やアラビノオリゴ糖の調製に有用である。
また、本発明のアラビノフラノシダーゼ２は、直鎖（１→５）−α−Ｌ−アラビナンによく作用するため、アラビナンの酵素分解や単糖Ｌ−アラビノースの製造などに有効である。さらに、その高い基質特異性から、アラビノース含有多糖の構造研究などのための試薬としても有用である。

本発明のアラビノフラノシダーゼを生産する菌としては、発明者らによって新たに分離され、ＧＳ−９０１と名付けられた株があるが、当該菌株は以下に示すような菌学的性質を有する。

１Ａ．形態的性質
栄養菌糸は、合成寒天培地および天然培地において良く発達し、不規則に分岐する。
胞子は、イースト・麦芽寒天培地、オートミール寒天培地、スターチ・無機塩寒天培地などで良好に形成される。顕微鏡観察によると、胞子形成菌糸の分岐方法は単純分岐で、胞子はらせん状に形成される。胞子は通常３個以上の連鎖が認められ、培養の後期には長い鎖状を呈する。胞子の表面はとげ状で、形状は円筒形である。

１Ｂ．培地上での生育状態
各種培地で３０℃、１４日間培養したときの肉眼的観察結果を表１に示す。

１Ｃ．生理的性質
（１）生育至適温度
２５〜３７℃である。４０℃でもわずかに生育する。
（２）生化学的性質
（ａ）ゼラチンの液化
陽性
（ｂ）デンプンの加水分解
陽性
（ｃ）メラニン様色素生成
陽性
（ｄ）硝酸塩の還元
陽性
（ｅ）食塩に対する耐性
７％まで耐性がある
（３）炭素源の利用性
ＧＳ−９０１株の炭素源の利用性を表２に示した。なお、培地はプリドハム・ゴトリーブ寒天培地（ＩＳＰ９）を使用し、２８℃、１４日間培養後に判定した。

（注）＋＋：顕著に利用、＋：利用する、−：利用しない

（４）細胞壁のジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）のタイプ,・
ＬＬ−ＤＡＰ

以上の性質から、本菌株が放線菌に属することは明らかであって、「放線菌の同定実験法」（日本放線菌研究会編、1985年）等を参照して分類学的位置を検討した結果、Streptomyces sp.と同定した。

この放線菌は下記のとおり命名し、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
Streptomyces sp.GS-901（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１６９１６）

次に上記微生物を培養して、培養物から新規アラビノフラノシダーゼを採取する方法について説明する。
使用可能な培地としては、通常の微生物の培養に用いられる培地で本発明の菌株が生育可能であれば特に制限はないが、例えば、有機炭素源および窒素源としてはグルコース、澱粉、デキストリン、ビートアラビナン、ペプトン、酵母エキスなどが適しており、無機塩類としてはリン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、食塩などの添加が有効である。その他、必要に応じて菌の生育、酵素の生産に必要な各種有機物、無機物を適宣添加することができる。

上記培地での培養方法は、振盪培養または発酵槽等を用いての、通気撹拌培養が適している。培養温度は、生育できる範囲内なら特に限定されないが、30℃付近が望ましい。

上述のようにして培養した後、培養物中から、目的物質であるアラビノフラノシダーゼを採取および精製するには、一般的な酵素の採取および精製方法に準じて行うことができる。すなわち、ろ過あるいは遠心分離等の方法により、まず培養液から菌体等の固形分を除去し、粗酵素液を得る。このようにして得られる粗酵素液はそのまま使用することもできるが、この粗酵素液を通常の酵素精製法、すなわち硫安塩析、アセトン、アルコール等による有機溶媒沈殿、限外ろ過、イオン交換樹脂、ゲルろ過法などの手法を、単独あるいは組み合わせて用いることで、より純度の高いアラビノフラノシダーゼを得ることができる。

アラビノフラノシダーゼの活性は、次に示す方法により測定する。すなわち、２ｍＭ ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシド０．２５ml、マクイルバイン（ＭｃＩｌｖａｉｎｅ）緩衝液（ｐＨ７．０）０．２mlに、酵素液０．０５mlを加え、４０℃で１０分間反応させる。０．５％炭酸ナトリウム０．５mlを加えることにより反応を停止し、４０８nmの吸光度を測定する。酵素活性の表示は、上記条件において、１分間あたり１μmolのパラニトロフェノールを遊離させる酵素量を１単位とした。

次に本発明で得られるアラビノフラノシダーゼの理化学的性質を示す。なお、便宜上、以下の記述においては、糖転移活性を有するアラビノフラノシダーゼをアラビノフラノシダーゼ１、（１→５）結合したα−Ｌ−アラビノフラノース残基に特異的に作用して直鎖（１→５）−α−Ｌ−アラビナンを加水分解するアラビノフラノシダーゼをアラビノフラノシダーゼ２と称する。

（１）分子量
アラビノフラノシダーゼ１：約８０キロダルトン（ＳＤＳ電気泳動による）
アラビノフラノシダーゼ２：約３７キロダルトン（ＳＤＳ電気泳動による）
（２）等電点
アラビノフラノシダーゼ１：ｐＨ６．６付近（等電点電気泳動法による）
アラビノフラノシダーゼ２：ｐＨ７．５付近（等電点電気泳動法による）
（３）作用ｐＨおよびｐＨ安定性
４０℃におけるアラビノフラノシダーゼ１の作用ｐＨはｐＨ５．５近傍に至適がある。３０℃、２時間放置した際のアラビノフラノシダーゼ作用の安定性はｐＨ５．５〜８．５の範囲で安定である。
４０℃におけるアラビノフラノシダーゼ２の作用ｐＨはｐＨ７近傍に至適がある。３０℃、２時間放置した際のアラビノフラノシダーゼ作用の安定性はｐＨ５．０〜９．０の範囲で安定である。
（４）至適温度および安定性
ｐＨ５．５、１０分反応時のアラビノフラノシダーゼ１の作用温度は５５℃近傍に至適がある。ｐＨ７、２時間放置後のアラビノフラノシダーゼ作用の安定性は４０℃までである。
ｐＨ７．０、１０分反応時のアラビノフラノシダーゼ２の作用温度は５０℃近傍に至適がある。ｐＨ７、２時間放置後のアラビノフラノシダーゼ作用の安定性は４０℃までである。

本発明のアラビノフラノシダーゼ１は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するか、またはそのアミノ酸配列の１若くは数個のアミノ酸が欠失、置換若くは付加されたアミノ酸配列を有するものである。また、本発明のアラビノフラノシダーゼ２は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するか、またはそのアミノ酸配列の１若くは数個のアミノ酸が欠失、置換若くは付加されたアミノ酸配列を有するものである。かかる欠失、置換または付加の程度は、前記アラビノフラノシダーゼ活性を有する限り制限されない。なお、配列番号１においてＮ末端側のＭｅｔから２９番目のＡｌａまで、および配列番号２においてＮ末端側のＭｅｔから４３番目のＡｌａまではリーダー配列を示す。

本発明のアラビノフラノシダーゼ１をコードする遺伝子は、たとえば配列番号１に示す塩基配列を有するか、またはその塩基配列の１若くは数個の塩基が欠失、置換若くは付加された塩基配列を有するものであり、アラビノフラノシダーゼ２をコードする遺伝子は、たとえば配列番号２に示す塩基配列を有するかまたはその塩基配列の１若くは数個の塩基が欠失、置換若くは付加された塩基配列を有するものである。該アラビノフラノシダーゼ遺伝子のクローニングは、たとえば以下の方法にしたがって行うことができる。

すなわち、例えばストレプトマイセスのゲノムＤＮＡを用いてゲノムＤＮＡライブラリーを作製する。ここで用いるストレプトマイセスとしては、ストレプトマイセスｓｐ．ＧＳ−９０１またはその変異株が望ましい。次に、精製した該アラビノフラノシダーゼのＮ末端アミノ酸配列から推定される遺伝子を用いてコロニーハイブリダイゼーションを行い、強くハイブリダイズするクローンを得る。得られたクローンより既知のアラビノフラノシダーゼとは異なる性質、すなわち本発明のアラビノフラノシダーゼを発現しているクローンを選択する。

得られたクローンの例としてプラスミド（図１）が挙げられる。

本発明のアラビノフラノシダーゼは、例えば配列番号１および２に示す塩基配列を有するか、またはその塩基配列の１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは負荷された塩基配列を有する菌株を培地中に接種し、培養してアラビノフラノシダーゼを菌体内または培地中に蓄積せしめ、これを採取することによっても製造できる。

本発明のアラビノフラノシダーゼ１について、メチル−α−（１→２）−Ｌ−アラビノフラノビオシドに対して作用させたときの反応生成物のＨＰＬＣチャートを図２に示した。なお、ＨＰＬＣの分析条件は以下の通りであった。すなわちカラム：昭和電工（株）製 Ｓｕｇｅｒ ＫＳ−８０１、溶離液：水、温度：８０℃、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出：示差屈折計である。

アラビノフラノシダーゼ１の作用により、加水分解産物であるＬ−アラビノースとメチル−α−Ｌ−アラビノフラノシド以外に、矢印で示した新たなピークが生じた。本物質を分取し構造研究を行ったところ、構成糖としてＬ−アラビノースのみからなる三糖であることが確認され、本酵素は糖転移活性を有していることが明らかとなった。

本発明のアラビノフラノシダーゼ２について、ビートアラビナン及び直鎖（１→５）−α−Ｌ−アラビナンに対する分解の経時変化を図３（ａ）に、化学合成した３種類のメチル−α−Ｌ−アラビノフラノビオシド位置異性体（１→２、１→３、１→５）に対する分解の経時変化を図３（ｂ）に示した。

アラビノフラノシダーゼ２はビートアラビナンにほとんど作用せずに、直鎖（１→５）−α−Ｌ−アラビナンによく作用することが示されている。また、本酵素はメチル−α−（１→２）−Ｌ−アラビノフラノビオシドやメチル−α−（１→３）−Ｌ−アラビノフラノビオシドにほとんど作用せずに、メチル−α−（１→５）−Ｌ−アラビノフラノビオシドに良く作用することが示されている。
これらのことから、アラビノフラノシダーゼ２は（１→５）結合したα−Ｌ−アラビノフラノース残基に特異的に作用する新規なアラビノフラノシダーゼであることが確認された。

本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例１
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＧＳ−９０１株について、以下の培地を調製し培養を行った。すなわち、ビートアラビナン１．０％、リン酸水素２アンモニウム０．３％、リン酸水素２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％、酵母エキス０．３％である。
上記培地２０mlを含む１００ml容三角フラスコに１白金耳接種し、３０℃、２１０rpmで３日間振とう培養し、種培養液とした。ついで、同培地１００mlを含む５００ml容三角フラスコに種培養液２mlを植菌し、３０℃、２１０rpmで４日間振とう培養を行った。
培養終了時のアラビノフラノシダーゼ活性はおよそ０．０３unit／mlであった。

実施例２
実施例１で得た上清液を硫安塩析により濃縮し、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーにより電気泳動的に単一タンパクにまで精製した。精製したアラビノフラノシダーゼ１の比活性は約１０unit／mg、アラビノフラノシダーゼ２の比活性は約３unit／mgであった。これらのアラビノフラノシダーゼは前記の基質特異性及び酵素学的性質を有していた。

実施例３
クローニング
精製したアラビノフラノシダーゼ１、２のＮ末端、並びにＶ８−プロテアーゼで限定分解した内部ペプチドのＮ末端アミノ酸配列を基に合成したプライマーを用い、斉藤・三浦法（バイオキミカ・バイオフィス・アクタ、７２巻、p.６１９（１９６３）；Biochim.Biophys.Acta,72,p.619(1963)）により抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅した。その結果、精製酵素のＮ末端及び内部アミノ酸配列をコードしている領域を含む増幅断片が得られた。
次に、この断片をプローブとしてジェノミックサザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、アラビノフラノシダーゼ１はＢａｍＨ１およびＢｇｌIIでゲノムＤＮＡを共切断したときに、またアラビノフラノシダーゼ２ではＳａｌ Iで切断したときに単一なバンドが得られた。

以上の結果を基にアラビノフラノシダーゼ１、２遺伝子のクローニングを試みた。まず、Ｔｒｉｇｌｉａらの方法（ヌクレイック・アシッド・リサーチ、１６巻、p.８１８６（１９８８）；Nucleic Acid Research,16,p.8186(1988)）に従いインバースＰＣＲを行ったところアラビノフラノシダーゼ１では約３．５ｋｂｐの、アラビノフラノシダーゼ２では約２．３ｋｂｐのＤＮＡ増幅断片が得られた。これらのシークエンスを確認し、それぞれの全長を含むＤＮＡをＰＣＲ法により増幅した。

本発明の酵素遺伝子を保有するプラスミド、ｐＣＲ−２．１の構造を示す図である。プラスミドの分子量は約６．３ｋｂである。図中、ＡＦａｓｅ１と記した矢印部分が本発明の酵素遺伝子であり、矢印は遺伝子の転写方向を示している。また、図中の引出し線は本プラスミド中の代表的な制限酵素サイトを示す。 本発明のアラビノフラノシダーゼ１について、メチル−α−（１→２）−Ｌ−アラビノフラノビオシドに対して作用させたときの反応生成物のＨＰＬＣチャートである。 本発明のアラビノフラノシダーゼ２について、（ａ）はビートアラビナン及び直鎖（１→５）−α−Ｌ−アラビナンに対する分解の経時変化を、（ｂ）は３種類のメチル−α−Ｌ−アラビノフラノビオシド位置異性体（１→２、１→３、１→５）に対する分解の経時変化を示した図である。それぞれ、縦軸は分解率、横軸は反応時間を示す。

Claims (8)

1. 糖転位活性を有し、次の酵素学的性質を有するものであるストレプトミセス・エスピー由来アラビノフラノシダーゼ。
   （１）分子量
   ８０キロダルトン（ＳＤＳ電気泳動法による）
   （２）等電点
   ｐＨ６．６（等電点電気泳動法による）
   （３）作用ｐＨおよびｐＨ安定性
   ４０℃におけるアラビノフラノシダーゼ作用ｐＨはｐＨ５．５に至適がある。３０℃、２時間放置した際のアラビノフラノシダーゼ作用の安定性はｐＨ５．５〜８．５の範囲で安定である。
   （４）至適温度および安定性
   ｐＨ５．５、１０分反応時のアラビノフラノシダーゼ作用温度は５５℃に至適がある。ｐＨ７．０、２時間放置後のアラビノフラノシダーゼ作用の安定性は４０℃までである。
2. 配列番号３に示すアミノ酸配列からなるか、またはそのアミノ酸配列の１若くは数個のアミノ酸が欠失、置換若くは付加されたアミノ酸配列からなるものである請求項１記載のアラビノフラノシダーゼ。
3. 請求項１または２記載の性質を有するアラビノフラノシダーゼを生産するストレプトミセス・エスピーＧＳ−９０１株（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＧＳ−９０１）。
4. ストレプトミセス・エスピーＧＳ−９０１株（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＧＳ−９０１）またはその変異株由来のものである請求項１または２記載のアラビノフラノシダーゼ。
5. 請求項２記載のアラビノフラノシダーゼをコードする遺伝子。
6. 配列番号１に示す塩基配列からなるか、またはその塩基配列の１若くは数個の塩基が欠失、置換若くは付加された塩基配列からなるものである請求項５記載の遺伝子。
7. ストレプトミセス・エスピーＧＳ−９０１株（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＧＳ−９０１）またはその変異株由来のものである請求項６記載の遺伝子。
8. 請求項５〜７のいずれか１項に記載の遺伝子を有する菌株を培地中に接種し、培養してアラビノフラノシダーゼを菌体内または培地中に生成蓄積せしめ、培養物から該酵素を採取することを特徴とする、請求項１または２記載のアラビノフラノシダーゼの製造方法。

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