JP4770383B2 - 顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、顕微鏡に関するものである。

一般に顕微鏡の解像限界を与える空間周波数は２×(開口数)/(波長)である。例えば、顕微鏡に用いる光の波長が400nm、開口数が１のとき、200nm程度の構造物体が解像限界となる。この制限を打破し、さらに高い解像限界を得るために、２光子吸収や２光子放出を利用する方法が提案されている。例えば、強いレーザ光を一点に絞った状態で物体面上を走査していき、像面上に２光子吸収物質を貼付しておくと、２光子吸収物質が感光し像が得られ、その像は解像限界を超えて超解像となる。（解像限界は従来の２倍まで高められる）。

しかし、２光子吸収や２光子放出を利用する方法では、２光子吸収物質が必要となり、現在有効な物質は見つかっていない。また物体上を光で点照射し、それを走査しなければならないので、撮像に時間がかかるという問題点がある。

本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、従来の１光子を使用した顕微鏡よりも高い解像限界を有する顕微鏡を提供することを課題とする。

前記課題を達成するための第１の手段は、同一位置から２光子の光子対を放出し、被測定物を照明する面光源と、前記被測定物より光学的に後面に設けられ、前記光子対を２つのパスに分けるビームスプリッタと、前記ビームスプリッタにより分けられた光子により形成された前記被測定物の像を、それぞれ撮像面に拡大投影する投影光学系と、前記各撮像面に設けられた２つの２次元フォトン検出器アレイと、前記２次元フォトン検出器アレイのピクセルに対応した複数の計数器を備えた計数装置とを有し、前記計数器は、前記２つの２次元フォトン検出器のそれぞれの対応するピクセルにおいて、同時に光子が検出されたときのみ、計数を行うようにされており、所定撮像時間経過後の、前記計数装置の前記計数器の計数値に基づいて、前記被測定物の像を形成するように構成されていることを特徴とする顕微鏡である。

前記課題を解決するための第２の手段は、前記第１の手段であって、前記面光源は、インコヒーレントな光源と、当該光源で照明される非線形結晶とを含むことを特徴とするものである。

前記課題を解決するための第３の手段は、前記第２の手段であって、前記光源による前記非線形結晶の照明が、ケーラー照明であることを特徴とするものである。

前記課題を解決するための第３の手段は、前記第２の手段又は第３の手段であって、前記非線形結晶が、半導体結晶であることを特徴とするものである。

前記課題を解決するための第５の手段は、前記第１の手段から第４の手段のいずれかであって、前記被測定物を前記面光源と光学的に共役な位置又は前記面光源から、測定に使用される光子の波長以下の位置に配置したことを特徴とするものである。

本発明によれば、従来の顕微鏡よりも高い解像限界を有する顕微鏡を提供することができる。

以下、本発明の実施の形態の例を図を用いて説明する。図１は、本発明の実施の形態の１例である２光子顕微鏡の光学系の概要を示す図である。インコヒーレント光源１から放出された光は、コリメートレンズ２を介して、非線形結晶３をケーラー照明する。最初の光源としてインコヒーレントのものを使用するのは、コヒーレント性を有する光源を使用すると、非線形結晶３をケーラー照明したときに非線形結晶３上に集光点ができてしまい、一様照明性が失われ、かつ、非線形結晶３から放出される２次光源がインコヒーレントとならないからである。

非線形結晶３としては、波長変換に使用される非線形結晶のいくつかが使用可能であり、例えば、ＢＢＯ、ＬＢＯ、ＣＬＢＯを使用することができる。また、非線形結晶以外にも、CuCl等の半導体結晶を使用することができる。CuCl等の半導体結晶を用いると、変換効率が高いので強い２次光源を得ることができ、撮像のスループットを高めることができる。これらの役割は、インコヒーレント光源１から放出される光源を受け、２光子を含む光を放出することであるので、このような性質を有するものであれば、適宜選択して使用することができる。

また、この実施の形態においては、インコヒーレントな光で非線形結晶３のような物質を照明し、２光子を含む光を放出する２次光源として使用しているが、例えば加熱等により、それ自身がインコヒーレントで２光子を含む光を放出するような物質を使用すれば、インコヒーレント光源１とコリメートレンズ２を使用する必要はない。しかしながら、現在においては、インコヒーレント光源１として、インコヒーレント化されたレーザ光源を使用し、図１に示すような構成を採用するのが、最も明るい（２光子放出率が高い）非線形結晶３からの２次光源を得る方法である。

インコヒーレント光源１としては、例えば、レーザ光を拡散板で拡散させたり、フライアイミラーを通したりすることにより、もともとコヒーレントであった強力な光を、インコヒーレント光に変換したような光源を使用することができる。

非線形結晶３から放出された、２光子を含むインコヒーレントな光は、励起光等の余分な光をカットするフィルタ４を通り、照明レンズ５により、被観察物６の表面を照明する。この場合、非線形結晶３と被観察物６とは、照明レンズ５に対して共役な位置とされている。もちろん、照明レンズ５を使用せず、非線形結晶３と被観察物６を密着させるようにしてもよいが、この場合も、非線形結晶３と被観察物６の距離は、観察に使用する光子の波長以下の距離とすることが好ましい。

被観察物６により反射され、又は６を透過した２光子を含む光は、レンズ７、８、９、及び波長板１０、偏光ビームスプリッタ１１を有する光学系に入射する。この実施の形態は、２光子の偏光の振動面が互いに９０度異なっている光を使用するときに用いられる光学系である。

レンズ７を透過した光は、波長板１０により、２光子のうち１つがＳ偏光、他の１つがＰ偏光となるように変換される。このうち、Ｐ偏光（一点鎖線）は１１を透過し、レンズ８の作用により、結像面に設けられた２次元フォトン検出器アレイ１２上に結像する。Ｓ偏光（鎖線）は偏光ビームスプリッタ１１で反射され、レンズ９の作用により、結像面に設けられた２次元フォトン検出器アレイ１３上に結像する。

２次元フォトン検出器アレイ１２、１３は、ＩＣＣＤ等、微小で高感度のフォトン検出器が２次元アレイ状に配列されたものであり、各、フォトン検出器に光子が入射する毎に、そのフォトン検出器からパルス出力を出すようになっている。

２次元フォトン検出器アレイ１２のフォトン検出器の配列をＡ（ｉ，ｊ）とし、２次元フォトン検出器アレイ１３のフォトン検出器の配列をＢ（ｉ，ｊ）とすると、被観察物６の同じ点から放出されて分離された２光子は、１光子ずつに分かれて２次元フォトン検出器アレイ１２，１３の同じ（ｉ，ｊ）のフォトン検出器（幾何光学対応位置）に入射するようになっている。但し、回折効果により、各光子が同じ（ｉ，ｊ）へ入射しない場合もある。

同時計数装置１４は、２次元フォトン検出器アレイ１２，１３の各ピクセルに対応したカウンタ（計数器）を有する。このカウンタを前記フォトン検出器の配列に対応させてＣ（ｉ，ｊ）とする。そして、同時計数装置１４のカウンタＣ（ｉ，ｊ）は、２次元フォトン検出器アレイ１２のフォトン検出器Ａ（ｉ，ｊ）と２次元フォトン検出器アレイ１３のフォトン検出器Ｂ（ｉ，ｊ）（同じ位置）から同時に出力があったとき、カウント値をインクリメントするようにされている。

このようにすると、被観察物６のある点から２光子である光子が飛び出したときのみ、ある点に対応する同時計数装置１４のカウンタＣ（ｉ，ｊ）のカウンタがインクリメントされる。１光子の光は、２次元フォトン検出器アレイ１２、１３の片方にしか入力しないのでカウントされず、無視される。

このようにして、所定時間、非線形結晶３により被観察物６を照射すると、同時計数装置１４のカウンタのカウント値が累算されるが、その累算値は、そのカウンタに対応する位置から放出される２光子からなる光子の累算カウント値となり、これを画像変換して２次元画像として観察すれば、２光子のみを使用して、被観察物６の面を観察していることとなる。よって、解像限界は、従来の１光子を使用した場合の２倍となり、解像限界を高めることができる。又、走査型でなく、２次元検出方式であるので、スループットを高めることができる。

なお、被観察物６に入射する２光子の距離をなるべく小さくすることが好ましく、それには、被観察物６に入射する照射光の開口数ＮＡを大きくする必要がある。しかし、結像光学系の開口数ＮＡ’に対してあまり大きくしても効果は飽和し、ＮＡ／ＮＡ’＝２の場合が最適である。

非線形結晶３の厚さは厚ければ厚いほど光の変換効率が高くなるが、厚くしすぎると２光子が結晶３を通過する過程で離れて、ほぼ同一の位置から放出されなくなるので、一般的には、使用する２光子の波長の１０倍以下の厚さとすることが好ましい。

以上の実施の形態は、２光子の光子同士の偏光状態が異なる場合の例であったが、２光子の光子同士の波長が異なる場合は、２光子を分離するのに、ダイクロイックミラー等を使用すればよい。分離した後、別々の２次元フォトン検出器で検出し、対応する位置の検出器からの出力を同時計数することにより、２光子以外の光の影響を除去する方法は、図１に示したものと本質的に変わらず、当業者は、容易にその構成を推考できるであろう。

また、２光子の偏光状態や波長が同じであり、通常の手段では分離が困難である場合には、図１において、波長板１０を除去し、偏光ビームスプリッタ１１をハーフミラーに変えたものを使用し、２次元フォトン検出器アレイ１２、１３として、２光子のみに反応するものを使用すれば、同様、２光子のみを使用した撮像が可能である。特許請求の範囲及び明細書においてビームスプリッタと称しているものは、単にビームを分割する機能を有すればよく、このようなダイクロイックミラーやハーフミラーを含むものである。

本発明の実施の形態の１例である２光子顕微鏡の光学系の概要を示す図である。

符号の説明

１…インコヒーレント光源、２…コリメートレンズ、３…非線形結晶、４…フィルタ、５…照明レンズ、６…被観察物、７…レンズ、８…レンズ、９…レンズ、１０…波長板、１１…偏光ビームスプリッタ、１２…２次元フォトン検出器アレイ、１３…２次元フォトン検出器アレイ、１４…同時装置

Claims (5)

1. 同一位置から２光子の光子対を放出し、被測定物を照明する面光源と、前記被測定物より光学的に後面に設けられ、前記光子対を２つのパスに分けるビームスプリッタと、前記ビームスプリッタにより分けられた光子により形成された前記被測定物の像を、それぞれ撮像面に拡大投影する投影光学系と、前記各撮像面に設けられた２つの２次元フォトン検出器アレイと、前記２次元フォトン検出器アレイのピクセルに対応した複数の計数器を備えた計数装置とを有し、前記計数器は、前記２つの２次元フォトン検出器のそれぞれの対応するピクセルにおいて、同時に光子が検出されたときのみ、計数を行うようにされており、所定撮像時間経過後の、前記計数装置の前記計数器の計数値に基づいて、前記被測定物の像を形成するように構成されていることを特徴とする顕微鏡。
2. 請求項１に記載の顕微鏡であって、前記面光源は、インコヒーレントな光源と、当該光源で照明される非線形結晶とを含むことを特徴とする顕微鏡。
3. 請求項２に記載の顕微鏡であって、前記光源による前記非線形結晶の照明が、ケーラー照明であることを特徴とする顕微鏡。
4. 請求項２又は請求項３に記載の顕微鏡であって、前記非線形結晶が、半導体結晶であることを特徴とする顕微鏡。
5. 請求項１から請求項４のうちいずれか１項に記載の顕微鏡であって、前記被測定物を前記面光源と光学的に共役な位置又は前記面光源から、測定に使用される光子の波長以下の位置に配置したことを特徴とする顕微鏡。
   
   
   

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