JP4557723B2 - 非走査型時間分解蛍光顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、試料の蛍光像をフェムト秒オーダーの高い時間分解能で観測することのできる時間分解蛍光顕微鏡に関する。

試料が発する蛍光の時間変化を観測できる顕微鏡を一般に時間分解蛍光顕微鏡と呼ぶ。この時間分解蛍光顕微鏡の持つ利点は、蛍光物質の濃度や蛍光強度に左右されない物質固有の寿命というパラメータにより試料のイメージングが可能であるという点にある。従来の時間分解蛍光顕微分光法（Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy：ＦＬＩＭ）における時間分解の手法は大きく３種類に分けることができる。それらは、タイムゲート法（非特許文献１参照）、時間相関単一光子計測法（非特許文献２参照）、及びストリークカメラ法（非特許文献３参照）である。これらの技術は検出器自身の時間分解能を利用して蛍光を時間分解するものであり、時間分解能は、タイムゲート法で十ナノ秒程度、時間相関単一光子計測法で最大４０ピコ秒程度、ストリークカメラ法で最大２０ピコ秒程度である。

"Time-gated fluorescence lifetime imaging and microvolume spectroscopy using two-photon excitation", J. Sytsma, J.M. Vroom, C.J. De Grauw, H.C. Gerritsen, Journal of Microscopy, vol.191, pp.39-51 (1997) "Deep-UV laser-based florescence lifetime imaging microscopy of single molecules", Qiang Li, Thomas Ruckstuhl, Stefan Seeger, Journal of Physical Chemistry B, Vol.108, pp.8324-8329 (2004) "Development of multiphoton fluorescence kifetime imaging microscopy system using a streak camera", R.V. Krishnan, H. Saitoh, H. Terada, V.E. Centonze, B. Herman, Review of Scientific Instruments, Vol.74, pp.2714-2721 (2003)

超高速分光による分子ダイナミクスの研究はこれまで主として均一な系に対して行われてきたが、現実的な系は高い不均一性を有する場合が多い。従って、微小な領域または不均一な環境に存在する分子の励起状態ダイナミクスを位置選択的に観測することが重要である。このような観点から、時間と空間に対して高い分解能を持つ時間分解顕微分光法の必要性が指摘され、すでにこれまでに活発な研究が行われている。特に時間分解蛍光顕微鏡の一つの強力な応用は、試料各点の物性評価を蛍光寿命によって視覚的かつ２次元的に行う、試料の時間分解蛍光２次元イメージの作成である。

従来の時間分解蛍光顕微鏡における時間分解能は検出器の電気的なタイミングジッターに依存してしまい、数十ピコ秒程度が限界であった。この時間分解能は、試料内の蛍光物質の寿命のみを観測し、イメージングを行うには必要十分な時間分解能であるが、時間分解蛍光顕微鏡を用いて物質間の励起エネルギー移動や構造変化、振動緩和（冷却）といった超高速過程を観測しようとする場合には、フェムト秒や数ピコ秒程度の時間分解能が必要であり、従来の検出手法では時間分解能が不十分であった。

また、従来の時間分解蛍光顕微鏡は、時間分解蛍光イメージの作成方法においても問題点があった。すなわち、従来の時間分解蛍光顕微鏡は全て走査型であり、試料の時間分解蛍光２次元イメージの作成に際して、試料の測定位置を一点一点変化させながら時間分解測定を行い、得られた多くのデータから時間分解蛍光２次元イメージを再構築しなければならないため、蛍光イメージを作成するまでに膨大な作業と時間を要することである。このため特に、長時間の露光に弱い試料や測定時間内に性質や形状が変化を起こす（非平衡状態にある）試料などに関しては適用が難しい場合があった。

本発明は、このような従来技術の問題点に鑑み、フェムト秒の高い時間分解能で時間分解された２次元蛍光画像を非走査で一括取得できる非走査型フェムト秒時間分解蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。

本発明者らは、顕微鏡下の試料が発する蛍光像を、光カーゲート法を用いることにより超高速で時間分解し、時間分解された蛍光像をマルチチャンネル検出器により検出する非走査型フェムト秒時間分解蛍光顕微鏡を開発した。

本発明による時間分解蛍光顕微鏡は、パルスレーザ光発生手段と、パルスレーザ光発生手段から出射したレーザ光を２分割する光分割手段と、光分割手段によって分割された一方のレーザ光を励起光として試料に照射する励起光学系と、励起光照射によって試料から発生された蛍光を集光して試料の蛍光像を形成する結像光学系と、結像光学系によって形成された試料の蛍光像を撮像する撮像手段と、結像光学系中に配置された光カー効果を生ずる非線形光学素子と、非線形光学素子の前後に配置された一対の偏光板と、光分割手段によって分割された他方のレーザ光を非線形光学素子に照射する照射光学系と、光分割手段によって分割された２つのレーザ光の間の光路差を調節する光学遅延回路と、を備える。

結像光学系は試料から発生した蛍光を集光する対物レンズと、対物レンズと非線形光学素子の間に配置された第２対物レンズとを備え、非線形光学素子は第２対物レンズによる対物レンズの結像面に配置するのが好ましい。また、励起光学系は試料の比較的広い面積に励起光を照射する。照射光学系は光路中に１／２波長板を有する。パルスレーザ光発生手段は、測定に高次の（三次）非線形光学効果を用いることから、１パルスあたりのエネルギーはマイクロジュール以上、及び試料からの蛍光を他の手法（時間相関単一光子計測法やストリークカメラ法）では測定できない時間領域（フェムト秒、ピコ秒）において時間分解測定する目的から、時間幅２０ピコ秒以下のパルス光を発生するものであるのが好ましい。

本発明によると、従来の時間分解蛍光顕微鏡では不可能だったフェムト秒領域での時間分解蛍光２次元イメージの作成が可能となり、更には時間分解された蛍光像全体を直接マルチチャンネル検出器により検出するため、試料位置の移動なしにかつ画像面内において測定時間差の無い蛍光イメージの作成が可能となる。

以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。図１は、本発明による非走査型フェムト秒時間分解蛍光顕微鏡の概略図である。

フェムト秒レーザー再生増幅システム１０によって再生増幅されたTi:sapphireレーザー（Tsunami，Spectra Physics，８００ｎｍ，１ｋＨｚ，１Ｗ）の基本波をハーフミラー１１によって２分割し、一方のビームをＬＢＯ結晶１２に入射して２倍波（４００ｎｍ，〜２０ｍＷ）を生成した。ＬＢＯ結晶１２からのビームは、基本波を透過し２倍波を反射するダイクロイックミラー１３に入射され、ダイクロイックミラー１３によって反射された２倍波が試料の励起光として用いられる。ハーフミラー１１で分割された他方のビームは、後述するゲート光として用いられる。励起光及びゲート光のパルス時間幅は他の手法（時間相関単一光子計測法やストリークカメラ法）で得られる時間分解能以下であればよいが、ここではそれぞれを１２０フェムト秒、１８０フェムト秒とした。

励起光の光路中に全反射ミラー１４を出し入れ自在に設けた。全反射ミラー１４を励起光の光路中に挿入した場合、励起光は全反射ミラー１４によって反射され、光路１５をたどってスライドグラス上の試料１７を上方から照射する。この場合、励起光は試料１７上に点として集光させるのではなく、集光距離の長いレンズ１６を使って緩くフォーカスさせ、試料一面を広範囲に光励起できるように導入した。このように試料の上方から励起光を導入する方法は簡便であり、光学素子の配置が容易に行えるが、厚みのある試料または自己吸収のある試料では蛍光の測定が難しい場合がある。そのような場合には、全反射ミラー１４を励起光の光路から外す。すると、励起光は光路１８をたどってスライドグラス上の試料１７を下方から照射する。この方法では励起光はビーム径と高さを調節された後、対物レンズ２１の下方に置かれたダイクロイックミラー２０により上方へ反射され、対物レンズ２１を通って試料１７に導かれる。対物レンズ２１は試料に対して無限遠共役系を構成し、平行な入射光を試料１７上に集光する。この際、対物レンズ２１の直前に正の単レンズ１９（ｆ＝１００）を置くことにより、試料１７に空間的な広がり（ダイバージェンス）を持った励起光を入射した。これにより対物レンズ２１を出た励起光は、試料の一点ではなく広い範囲を同時に励起する。

上方あるいは下方からの励起光照射によって試料１７から発生された蛍光は、倒立型に配置した顕微鏡用対物レンズ（CFI Plan Fluor，４０×，N.A.＝０．７５，Nikon）２１によって集光され、ダイクロイックミラー２０を透過して、顕微鏡の外に取り出される。取り出された蛍光は、第２対物レンズ２２により集光され、第１の偏光板２３を通って光カー効果を生ずる非線形光学素子２４に導かれる。光カー効果を生ずる非線形光学素子２４としては、例えば厚さ１ｍｍの溶液セルに封入した二硫化炭素または高屈折率ガラスを用いることができる。

一方、ハーフミラー１１によって反射されたゲート光（８００ｎｍ，〜２００ｍＷ）は、光学遅延回路３０によって励起光との光路差を調整されたのち、１／２波長板３１によって励起光の偏向方向に対して偏光方向を４５゜回転されたのち、レンズ３２によって非線形光学素子２４に照射される。こうして、試料からの蛍光は非線形光学素子２４中において、ゲート光と空間的に重ね合わされる。非線形光学素子中でゲート光と重ねあわされて偏向方向が回転した蛍光は、第２の偏光板２５を通り、カメラレンズ２６によって２次元撮像装置（ＣＣＤカメラ）２９に結像される。カメラレンズ２６と２次元撮像装置の間にはシャッター２７（露光時間調整と露光時間以外に受光面に光が入ることを防ぐ）、及び迷光を除去するための干渉フィルター２８が配置されている。第１の偏光板２３と第２の偏光板２５を、互いの偏向方向が直交する配置とし、光学的遅延回路３０によって励起光に対するゲート光の遅延量を変化させることにより、試料の２次元蛍光像を光カーゲート法によって０．８〜１．５ピコ秒の時間分解能で時間分解測定することができる。

光カーゲート法では、信号光発生効率は蛍光強度I_fluとゲート光強度I_gateの２乗の積によって決まる。従って観測される信号光は蛍光像の分布（強度分布）とガウスビームであるゲート光の強度分布にも敏感に影響するため、信号光強度の強度補正を行う必要性が出てくる。この問題に対応するために、本発明では、第２対物レンズ２２の対物レンズ２１に対する共役面に非線形光学素子２４を配置する構成を採用した。

試料の像を、２枚以上のレンズを用いてリレーし結像させる場合、試料に最も近い対物レンズ２１は試料の実像もしくは虚像を作り出し、第２対物レンズ２２はそれを更にリレーして同様に像を作り出す。しかしそれと同時に、第２対物レンズ２２はその焦点距離ｆ_２以上に対物レンズ２１から離れていれば、対物レンズ２１の実像をも作る。対物レンズ２１と第２対物レンズ２２の距離をＤとすると、この実像は、第２対物レンズ２２から、対物レンズ２１とは逆方向の（１／ｆ_２−１／Ｄ）^−１の距離に作られる。この対物レンズ２１の実像におけるシグナル光の面内強度分布は、対物レンズ２１のレンズ面におけるそれに等しい。すなわち、試料上の各点から発せられた光がほぼ一様に広がっており、この面においては、光強度の空間的不均一がほぼ皆無である。従って、この第２対物レンズ２２による対物レンズ２１の実像面において非線形光学効果などの処理を行えば、画像上の全ての点に関して、均等に効果を掛けることが可能となり、試料実像面で掛けた時に発生するような、補正を必要とする要因は排除される。

図２に、図１に示した非走査型フェムト秒時間分解蛍光顕微鏡を用いて観測した波長５２０ｎｍでの蛍光色素ビーズ（発光極大５２０ｎｍ、粒径４．８５μｍ）の定常蛍光像を示す。この測定では、カーゲート配置における２つの偏光板２３，２５の偏向方向を平行に設定することで、時間積算した蛍光像を観測している。

図２で蛍光ビーズからの発光が、ほぼ均一の強度で観測されていることから、観測する領域において試料が均一の光強度で光励起されていることが分かる。空間分解能は用いる対物レンズにより計算され、最高で約０．３５μｍである。また直径４．８５μｍの蛍光ビーズが、ＣＣＤの２０ピクセルにわたり観測されている。ＣＣＤの１ピクセルが２６μｍであるので、拡大率はＭ＝２０×２６／４．８５≒１００倍程度であることが分かる。

装置の時間分解能を、クマリン色素からの蛍光を観測することにより決定した。クマリン５２２Ｂは４００ｎｍの光でＳ１状態へ励起すると、Ｓ１状態からの蛍光が５２０ｎｍ付近に現れる。この蛍光の時間的な立ち上がり方を観測した。図３に、クマリン５２２Ｂのメタノール及びエチレングリコールの混合溶液から観測される蛍光の時間変化を示す。図３の蛍光強度は、試料全面から得られる蛍光強度の和として表してある。図３によると、光学遅延時間の原点付近で蛍光強度が立ち上がり、その後ほぼ一定の強度を示していることが分かる。従って、この結果の一次微分を計算し、フィッティングにより時間分解能を見積もることができる。カー媒質として厚さ１ｍｍの二硫化炭素を用いた場合、約０．８ｐｓの時間分解能があることが分かる。

上記のような特性を持つ本発明の非走査型フェムト秒時間分解蛍光顕微鏡を用いて、有機分子結晶の一つであるペリレンを測定した。図４に、２つの偏光板２３，２５の偏向方向を平行にして撮像したa−ペリレン微結晶の定常蛍光像を示す。また図５に、カーゲートの２つの偏光板２３，２５の偏向方向を互いに垂直とし、ゲート光の導入によって得たa−ペリレン微結晶のフェムト秒時間分解蛍光像を示す。ここに示す時間分解蛍光像は注目する遅延時間の蛍光像から負の時間（−５ｐｓ）の蛍光像をオフセットとして減算処理することにより求めた。

図から、光励起直後にa−ペリレン微結晶の蛍光像が観測され、遅延時間の増加とともに蛍光強度が減衰する様子が分かる。a−ペリレン微結晶を光励起すると、励起直後に生成する自由励起子からの発光が観測され、これが約２ｐｓの寿命で減衰することが分かっている。従って図５で観測された蛍光強度の時間変化は、結晶中に生成された自由励起子の減衰過程を表しているものと考えられる。負の時間に観測されている像は、装置が持つ有限の時間分解能のための蛍光像（強度）の時間的立ち上がりを示している。このように本発明の非走査型フェムト秒時間分解蛍光顕微鏡により、試料や観測点の移動なしにかつ画像面内において測定時間差の無いフェムト秒時間分解蛍光２次元イメージの作成が可能になった。

本発明による非走査型フェムト秒時間分解蛍光顕微鏡の概略図。 蛍光ビーズの定常蛍光像を示す図。 クマリン色素５２２Ｂから得られた蛍光の時間変化を示す図。 a−ペリレン微結晶の定常蛍光像を示す図。 a−ペリレン微結晶のフェムト秒時間分解像を示す図。

符号の説明

１０：フェムト秒レーザー再生増幅システム、１２：ＬＢＯ結晶、１７：試料、２０：ダイクロイックミラー、２１：対物レンズ、２２：第２対物レンズ、２３：第１の偏光板、２４：非線形光学素子、２５：第２の偏光板、２６：カメラレンズ、２７：シャッター、２８：干渉フィルター、２９：２次元撮像装置、３０：光学遅延回路、３１：１／２波長板

Claims (3)

1. パルスレーザ光発生手段と、
   前記パルスレーザ光発生手段から出射したレーザ光を２分割する光分割手段と、
   前記光分割手段によって分割された一方のレーザ光を励起光として焦点でない位置で試料に照射する励起光学系と、
   励起光照射によって試料から発生された蛍光を集光する対物レンズと試料の蛍光像を形成する結像光学系と、
   前記結像光学系によって形成された試料の蛍光像を撮像する撮像手段と、
   前記結像光学系中に配置された光カー効果を生ずる非線形光学素子と、
   前記非線形光学素子の前後に配置された一対の偏光板と、
   前記光分割手段によって分割された他方のレーザ光を前記非線形光学素子に照射する照射光学系と、
   前記対物レンズと前記非線形光学素子の間に配置された第２対物レンズと、
   前記光分割手段によって分割された２つのレーザ光の間の光路差を調節する光学遅延回路と、
   を備え、前記非線形光学素子は前記第２対物レンズによる前記対物レンズの結像面に配置されている
   ことを特徴とする非走査型時間分解蛍光顕微鏡。
2. 請求項１に記載の非走査型時間分解蛍光顕微鏡において、前記照射光学系は光路中に１／２波長板を有することを特徴とする非走査型時間分解蛍光顕微鏡。
3. 請求項１又は２に記載の非走査型時間分解蛍光顕微鏡において、前記パルスレーザ光発生手段は、時間幅２０ピコ秒以下のパルス光を発生することを特徴とする非走査型時間分解蛍光顕微鏡。

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