JP4762114B2 - ペプチド化合物ｐｙｙ３−３６の存否の確認方法 - Google Patents

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Description

本発明は、ペプチド化合物ＰＹＹ３−３６の存否の確認方法に関する。
近年、肥満が健康に対して与える悪影響について問題となっている。減量を行い、さらにそれを維持するためには、長期間或いは侵襲的な治療が必要となる。米国保健社会福祉省は、年間およそ３０万人の米国人が肥満が原因で死亡していると報告している。アメリカ合衆国内における肥満よる直接費及び間接費は、１０００億ドルを突破している。
従来より、シブトラミン、フェンテルミン、オルリスタット等の食欲抑制剤が市販されている。しかし、これら抑制剤の抑制効果は不十分である。
そこで、近年、食欲の調整に効果的な天然ペプチドホルモンを医学的に応用することに期待が集まっている。製薬会社数社は、天然ペプチドホルモンに関する肥満の臨床試験及び前臨床試験を行っている。
特に、天然のペプチドホルモンとして、下記アミノ酸配列
Ｈ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｘ
（アミノ酸配列中、ＸはＯＨ、又はカルボン酸保護基を示す）
で表されるペプチド化合物ＰＹＹ３−３６（以下「ＰＹＹ３−３６」と略記する場合がある）が注目されており、ＰＹＹ３−３６を鼻内へ注入するという新しい肥満治療の方法がすでに提供されている。ＰＹＹ３−３６は、人間の内臓（特に胃）の内分泌細胞によって作られる分泌物（以下「分泌物」と略記する場合がる）に含まれる。この分泌物は、人間の食物摂取量等に応じて分泌されやすい。
前記分泌物には、通常、下記アミノ酸配列
Ｈ−Ｔｙｒ−Ｐｒｅ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２
で表されるペプチド化合物ＰＹＹ１−３６（以下「ＰＹＹ１−３６」と略記する場合がある）が含まれる。ＰＹＹ１−３６は、ＰＹＹ３−３６のＮ末端にさらに「Ｔｙｒ−Ｐｒｅ−」が結合したものであり、ＰＹＹ３−３６と類似のアミノ酸配列を有する。
また、分泌物にトリプシンが含まれる場合、トリプシンがＰＹＹ１−３６及びＰＹＹ３−３６を分解し、ペプチド分解物が新たに生成することがある。
ＰＹＹ３−３６を含む薬剤は、例えば、前記分泌物からＰＹＹ３−３６を抽出して、製造することができる。しかし、該薬剤を製造する際、ＰＹＹ１−３６並びにＰＹＹ１−３６及びＰＹＹ３−３６由来のペプチド分解物が薬剤に混入するおそれがある。
また、ＰＹＹ３−３６を含有する薬剤が固形状（錠剤、粉末物等）の場合、長期間保存により、ＰＹＹ３−３６が分解し、ＰＹＹ３−３６由来のペプチド分解物が該薬剤中に存在するおそれがある。従来より、固体状のペプチド化合物は、水溶液中のものより不安定であることが知られている（非特許文献１〜４）。固体状のペプチド化合物は、内部のペプチド結合が分解しやすく（非特許文献５）、特に、ペプチド化合物が内部にアルギニン残基を有する場合、アルギニン残基とそれに隣接するアミノ酸残基間の結合は切れやすい（非特許文献６）。
よって、ＰＹＹ３−３６を含む薬剤は、製造時や長期間保存後に、ＰＹＹ３−３６の存否、すなわち、ＰＹＹ３−３６由来のペプチド分解物が存在しているかどうか確認することが重要である。加えて、ＰＹＹ３−３６を分泌物から抽出して薬剤を製造する場合、ＰＹＹ１−３６及びＰＹＹ１−３６由来のペプチド分解物の存否を、薬剤製造時に確認することが望ましい。
確認方法としては、例えば、ＨＰＬＣ法や電気泳動が考えられる。
しかしながら、ＰＹＹ３−３６、ＰＹＹ１−３６及び前記ペプチド分解物は、Ｃ末端からのアミノ酸配列が共通するため、従来の方法によって、ＰＹＹ３−３６の存否を確認することは困難を要する。また、薬剤に含まれるペプチド化合物全ての全アミノ酸配列を決定する場合、時間がかかり煩雑である。
Pearlman, R.; Nguyan, T.J. J.Pharm. Pharmacol.. 1992, 44, 178 Strickley, R.G.; Visor, G.C.; Lin, L.; Gu, L. Pharm. Res. 1989, 6, 971 Bhatt, N.; Patel, K.; Borchart, R.T. Pharm. Res. 1990, 7, 593 Jordan, G.M.; Yoshioka, S.; Terao, T. J. Pharm. Pharmacol. 1994, 46, 182 Lai, M. C.; Topp, E. M. J. Pharm. Sci. 1999, 88 489 Kertscher, U.; Bienert, M.; Krause, E.; Sepetov, N.F.; Mehlis, B. Int. J. Pept. Protein Res. 1993, 41, 207
本発明の主な目的は、薬剤中における下記アミノ酸配列
Ｈ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｘ
（アミノ酸配列中、ＸはＯＨ、又はカルボン酸保護基を示す）
で表されるペプチド化合物ＰＹＹ３−３６の存否を簡便に、且つ、精度良く確認する方法を提供することである。
本発明者は、上記のような従来技術の問題点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、特定の確認方法により上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、下記の定量方法に係る。
１． 被検薬剤中において、下記アミノ酸配列
Ｈ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｘ
（アミノ酸配列中、ＸはＯＨ、又はカルボン酸保護基を示す）
で表されるペプチド化合物ＰＹＹ３−３６の存否を確認する方法であって、
（１）前記被検薬剤及びキューカービチュリル［７］を溶媒とともに混合することにより溶液を調製する工程、及び
（２）工程（１）で得られた溶液を熱分析する工程
を含む、ペプチド化合物ＰＹＹ３−３６の存否の確認方法。
２． さらに、被検薬剤中において、下記アミノ酸配列
Ｈ−Ｔｙｒ−Ｐｒｅ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２
で表されるペプチド化合物ＰＹＹ１−３６及び／又はペプチド化合物ＰＹＹ１−３６が分解することにより生成したペプチド分解物の存否を確認する上記項１に記載の確認方法。
３． ペプチド化合物ＰＹＹ３−３６が分解することにより生成したペプチド分解物を検知する、上記項１に記載の確認方法。
本発明の確認方法によれば、簡便に、且つ、精度良く（誤差１〜２％程度で）、薬剤中における下記アミノ酸配列
Ｈ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｘ
（アミノ酸配列中、ＸはＯＨ、又はカルボン酸保護基を示す）
で表されるペプチド化合物ＰＹＹ３−３６の存否を確認することができる。具体的に、本発明の確認方法によれば、ペプチド化合物ＰＹＹ３−３６が分解することにより生成したペプチド分解物を検知することにより、薬剤を長期保存した場合の薬剤中におけるＰＹＹ３−３６の存否を確認することができる。また、本発明の確認方法によれば、ＰＹＹ１−３６及び／又はペプチド化合物ＰＹＹ１−３６が分解することにより生成したペプチド分解物を検知し、その存否を確認することができる。従って、本発明の確認方法によれば、薬剤製造時に、ＰＹＹ１−３６及びその分解物の混入の有無を簡便に、且つ、精度良く（誤差１〜２％程度で）、確認することができる。
このように、本願発明の確認方法は、ＰＹＹ３−３６を含む薬剤の定性分析手段として極めて有用である。
本発明の確認方法は、被検薬剤中において、下記アミノ酸配列
Ｈ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｘ
（アミノ酸配列中、ＸはＯＨ、又はカルボン酸保護基を示す）
で表されるペプチド化合物ＰＹＹ３−３６の存否を確認する方法であって、
（１）前記被検薬剤及びキューカービチュリル［７］を溶媒とともに混合することにより溶液を調製する工程、及び
（２）工程（１）で得られた溶液を熱分析する工程
を含む。
前記カルボン酸保護基としては、例えば、ＮＨ２、ＮＨ−Ｒ１、ＮＨＣＯＲ２、ＯＲ３、ＳＨ、ＳＲ４等が挙げられる。
前記Ｒ１としては、置換されていてもよい飽和炭化水素基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいヘテロアリール基、又は置換されていてもよいアラルキル基等を例示できる。
置換されていてもよい飽和炭化水素基の飽和炭化水素基としては、特に限定されず、例えばＣ１〜Ｃ２０の直鎖又は分枝鎖状のアルキル基並びにＣ３〜Ｃ１２シクロアルキル基が挙げられる。具体的には、Ｃ１〜Ｃ２０の直鎖又は分枝鎖状のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、イコシル基等を例示できる。また、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル基としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロドデシル基等を例示できる。
置換されていてもよい飽和炭化水素基の置換基としては、特に限定されるものではないが、例えばアルコキシ基、アリールオキシ基、シロキシ基、ジアルキルアミノ基等が挙げられる。アルコキシ基としては、例えばＣ１−６アルコキシ基が挙げられる。具体的には、メトキシ基、エトキシ基、ヘキシルオキシ基等を例示できる。アリールオキシ基としては、例えばＣ６−１２アリールオキシ基が挙げられ、具体的には、フェノキシ基、ナフチルオキシ基等を例示できる。シロキシ基としては、トリメチルシロキシ、トリエチルシロキシ、トリイソプロピルシロキシ、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシロキシ等を例示できる。ジアルキルアミノ基としては、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ等を例示できる。
置換されていてもよい飽和炭化水素基の置換基の置換位置及び置換基の数は、本発明の効果を妨げない範囲であればよく、特に限定されるものではない。
置換されていてもよいアリール基のアリール基としては、特に限定されず、例えばＣ６−１４アリールが挙げられる。具体的には、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、ビフェニリル、アンスリル等を例示できる。
置換されていてもよいアリール基の置換基としては、本発明の効果を妨げない範囲であればよく、特に限定されるものではない。例えばＣ１−６アルキル基、Ｃ６−１４アリール基、５〜１０員芳香族複素環基、アルコキシ基、アリールオキシ基、シロキシ基、ジアルキルアミノ基等が挙げられる。
Ｃ１−６アルキル基としては、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられる。
Ｃ６−１４アリール基としては、例えばフェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、ビフェニリル、２−アンスリル等が挙げられる。
５〜１０員芳香族複素環基としては、例えば２−又は３−チエニル、２−，３−又は４−ピリジル、２−，３−，４−，５−又は８−キノリル、１−，３−，４−又は５−イソキノリル、１−，２−又は３−インドリル、２−ベンゾチアゾリル、２−ベンゾ［ｂ］チエニル、ベンゾ［ｂ］フラニル等が挙げられる。
アルコキシ基としては、例えばＣ１−６アルコキシ基が挙げられる。具体的には、メトキシ基、エトキシ基、ヘキシルオキシ基等を例示できる。
アリールオキシ基としては、例えばＣ６−１２アリールオキシ基が挙げられる。具体的には、フェノキシ基、ナフチルオキシ基等を例示できる。
シロキシ基としては、トリメチルシロキシ、トリエチルシロキシ、トリイソプロピルシロキシ、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシロキシ等を例示できる。
ジアルキルアミノ基としては、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ等を例示できる。
置換されていてもよいアリール基の置換基の置換位置、置換基の数は、本発明の効果を妨げない範囲であればよく、特に限定されるものではない。
置換されていてもよいヘテロアリール基のヘテロアリール基としては、特に限定されず、例えば、硫黄原子、酸素原子及び窒素原子から選ばれる原子を１〜３個含む、縮環していてもよい５〜１４員芳香族複素環基が挙げられる。具体的には、フリル、チエニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、イソチアゾリル、チアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、チアジアゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリル、インダゾリル、プリニル、キノリル、イソキノリル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シノリニル、プテリジニル、カルバゾリル、カリボリニル、フェナンスリジニル及びアクリジニル等を例示できる。
置換されていてもよいヘテロアリール基の置換基の種類、置換基の位置及び置換基の数は、前記置換されていてもよいアリール基で述べた置換基の種類、置換基の位置及び置換基の数と同様である。
置換されていてもよいアラルキル基としては、例えばベンジル基、フェネチル基、フェニルプロピル基等が挙げられる。置換されていてもよいアラルキル基の置換基の種類、置換基の位置及び置換基の数は、前記置換されていてもよいアリール基で述べた置換基の種類、置換基の位置及び置換基の数と同様である。
Ｒ２、Ｒ３及びＲ４としては、上記Ｒ１と同様である。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４としては、特に、メチル基及びエチル基が好ましい。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がメチル基及びエチル基の場合、後述する溶液の調製において、溶媒として水を用いる際、好適にＰＹＹ３−３６を水に溶解させることができる。
特に本発明の確認方法においては、ＸはＮＨ２であることがより好ましい。
本発明の確認方法は、被検薬剤中において、ＰＹＹ３−３６の存否を確認する方法である。ＰＹＹ３−３６は、例えば、人間の内臓（特に胃）の内分泌細胞によって作られる分泌物から抽出することができる。得られた抽出物を用いて前記薬剤を製造する場合、ＰＹＹ１−３６及びその分解物が薬剤に混入するおそれがある。また、ＰＹＹ３−３６を含む薬剤を長期間保存する場合、ＰＹＹ３−３６が分解することにより、ペプチド分解物が生成するおそれがある。特に、ＰＹＹ１−３６及びＰＹＹ３−３６内部のアルギニンとチロシン間の結合は結合力が他のアミノ酸間の結合よりも比較的弱く優先して切れやすい。よって、ＰＹＹ１−３６が分解する（前記結合が切れる）ことにより、Ｎ−末端にチロシン残基を有するペプチド分解物が生成しやすい。また、ＰＹＹ３−３６が分解する（前記結合が切れる）ことにより、Ｎ−末端にチロシン残基を有するペプチド分解物と、Ｎ−末端にイソロイシン残基を有するペプチド分解物が生成しやすい。
Ｎ−末端にチロシン残基を有するＰＹＹ１−３６、ＰＹＹ１−３６由来のペプチド分解物、及びＰＹＹ３−３６由来のペプチド分解物は、キューカービチュリル［７］（以下「ＣＢ［７］ということがある」）と反応する（錯体を形成する）ことにより熱を発する。本発明の確認方法によれば、前記薬剤及びＣＢ［７］を溶液中で混合し、混合液を熱分析することにより、Ｎ−末端にチロシン残基を有するＰＹＹ３−３６由来のペプチド分解物を検知し、ＰＹＹ３−３６の存否を確認することができる。また、Ｎ−末端にチロシン残基を有するＰＹＹ１−３６及びＰＹＹ１−３６由来のペプチド分解物を検知し、被検薬剤中のＰＹＹ３−３６の純度を確認することができる。
＜工程（１）＞
工程（１）では、前記被検薬剤及びキューカービチュリル［７］を溶媒とともに混合することにより溶液を調製する。
被検薬剤
本発明の確認方法によれば、被検薬剤中におけるＰＹＹ３−３６の存否を確認することができる。すなわち、ＰＹＹ３−３６が分解することにより生成したペプチド分解物を検知することにより、ＰＹＹ３−３６の存否（ＰＹＹ３−３６の分解の有無）を確認できる。
ＰＹＹ３−３６が分解することにより生成したペプチド分解物としては、例えばＮ−末端にチロシン残基を有するペプチド分解物、Ｎ−末端にイソロイシン残基を有するペプチド分解物等が挙げられる。
ＰＹＹ３−３６由来のＮ−末端にチロシン残基を有するペプチド分解物（以下「分解物Ａ」と略記する場合がある）としては、例えばＴｙｒ−Ｘ、Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｘ、Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｘ、Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ、Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ、Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ等が挙げられる。これらは、被検薬剤中に１種又は２種以上で含んでいてもよい。
ＰＹＹ３−３６由来のＮ−末端にイソロイシン残基を有するペプチド分解物（以下「分解物Ｂ」と略記する場合がある）としては、Ｈ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ、Ｈ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ、Ｈ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇが挙げられる。これらは、被検薬剤中に１種又は２種以上で含んでいてもよい。
本発明の確認方法によれば、さらに、被検薬剤中において、下記アミノ酸配列
Ｈ−Ｔｙｒ−Ｐｒｅ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２
で表されるペプチド化合物ＰＹＹ１−３６及び／又はペプチド化合物ＰＹＹ１−３６が分解することにより生成したペプチド分解物の存否を確認することができる。
ＰＹＹ１−３６が分解することにより生成したペプチド分解物としては、例えば、Ｎ−末端にチロシン残基を有するペプチド分解物等が挙げられる。
ＰＹＹ１−３６由来のＮ−末端にチロシン残基を有するペプチド分解物（以下「分解物Ｃ」と略記する場合がある）としては、例えば、Ｔｙｒ−ＮＨ２、Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２、Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２、Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ、Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ、Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ、Ｈ−Ｔｙｒ−Ｐｒｅ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ、Ｈ−Ｔｙｒ−Ｐｒｅ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ、Ｈ−Ｔｙｒ−Ｐｒｅ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ等が挙げられる。これらは、被検薬剤中に１種又は２種以上で含んでいてもよい。
被検薬剤中におけるＰＹＹ３−３６、分解物Ａ、分解物Ｂ、ＰＹＹ１−３６及び分解物Ｃの含有量は特に限定されない。本発明の確認方法によれば、Ｎ−末端にチロシン残基を有する分解物Ａ、ＰＹＹ１−３６及び分解物Ｃから選ばれる少なくとも１種を合計で１重量％以上含有する場合、前記分解物Ａ等を好適に検知し、精度良くＰＹＹ３−３６の存否を確認することができる。
被検薬剤には、通常薬剤に含まれる公知の成分をさらに含んでいてもよい。例えば、ＰＹＹ３−３６、分解物Ａ、分解物Ｂ、ＰＹＹ１−３６及び分解物Ｃ以外のペプチド化合物等を含んでいてもよい。
被検薬剤の形態は、特に限定されず、例えば、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤等）等が挙げられる。本発明の検査方法においては、これら形態の薬剤を１種又は２種以上で用いることができる。
ＣＢ［７］
ＣＢ［７］は、図１に示す樽状の分子である。
キューカービチュリル［７］以外のキューカービチュリル［６］、キューカービチュリル［８］等を用いる場合、ＰＹＹ３−３６の存否を精度良く確認することができない。
溶液の調製
前記被検薬剤及びＣＢ［７］を溶媒とともに混合することにより溶液を調製する。
被検薬剤中に、分解物Ａ、ＰＹＹ１−３６、分解物Ｃ等が存在する場合、被検薬剤及びＣＢ［７］を溶液中で混合することにより、分解物Ａ、ＰＹＹ１−３６及び分解物Ｃから選ばれる少なくとも１種のペプチド化合物がＣＢ［７］と反応し（錯体を形成し）、発熱する。
溶媒としては特に限定されないが、水が好ましい。水を用いることにより、好適にＣＢ［７］を溶解させることができる。
溶液中の被検薬剤の濃度は、特に限定されないが、０．０１〜１ｍｍｏｌ／ｌが好ましく、０．０２〜０．５ｍｍｏｌ／ｌがより好ましく、０．０２〜０．０５ｍｍｏｌ／ｌが最も好ましい。
溶液中におけるＣＢ［７］の濃度は、特に限定されないが、０．１〜１０ｍｍｏｌ／ｌが好ましく、０．２〜５ｍｍｏｌ／ｌがより好ましく、０．２〜０．５ｍｍｏｌ／ｌが最も好ましい。
溶液のｐＨは限定的ではないが、１〜８が好ましく、３〜８がより好ましく、５〜７が最も好ましい。特に、ｐＨを３以上とすることにより、ＰＹＹ３−３６、ＰＹＹ１−３６等の分解をより一層防止できる。
本発明の確認方法において、前記溶液中には、塩が存在してもよいが、本発明の確認方法においては、前記溶液中に塩が存在しない方が望ましい。塩は、分解物Ａ等とＣＢ［７］との反応（錯体の形成）を妨げる原因となりやすい。
塩としては、例えば、Ｎａ２ＳＯ４、Ｋ２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＮａＮＯ３、ＫＮＯ３、Ｍｇ（ＮＯ３）２、Ｃａ（ＮＯ３）２、Ｎａ３ＰＯ４、Ｋ３ＰＯ４等の溶液に溶解して中性を呈する塩；ＮａＨ２ＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４等の溶液に溶解して弱酸性を呈する塩；Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、ＫＨＣＯ３、Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ＣＨ３ＣＯＯＮａ、ＣＨ３ＣＯＯＫ等の溶液に溶解して弱塩基性を呈する塩等が挙げられる。これらの塩は１種又は２種以上で存在してもよい。
溶液中の塩の濃度は、通常０．５ｍｏｌ／ｌ以下、好ましくは０．１ｍｏｌ／ｌ以下、より好ましくは１０ｍｍｏｌ／ｌ以下、さらに好ましくは０〜１ｍｍｏｌ／ｌである。溶液中の塩の濃度が０．５ｍｏｌ／ｌを超える場合、分解物Ａ等とＣＢ［７］との反応（錯体の形成）が進行しにくい。溶液中の塩の濃度が１０ｍｍｏｌ／ｌ以下の場合、分解物Ａ等とＣＢ［７］との反応（錯体の形成）が好適に進行し、精度良く、ＰＹＹ３−３６の存否を確認できる。
混合方法は特に限定されない。例えば、工程（２）における熱分析を等温滴定熱量計を用いて行う場合、熱平衡下、前記薬剤を上記溶媒に溶解させた溶液（以下「溶液Ａ」と略記する場合がある）に、ＣＢ［７］及び上記塩を上記溶媒に溶解させた溶液（以下「溶液Ｂ」と略記する場合がある）を一定量ずつ（例えば０．０１ｍｌずつ）滴下することにより混合することができる。
溶液Ａにおける被検薬剤の濃度は、特に限定されないが、０．０１〜１ｍｍｏｌ／ｌが好ましく、０．０２〜０．５ｍｍｏｌ／ｌがより好ましく、０．０２〜０．０５ｍｍｏｌ／ｌが最も好ましい
溶液ＢにおけるＣＢ［７］の濃度は、特に限定されないが、０．１〜１０ｍｍｏｌ／ｌが好ましく、０．２〜５ｍｍｏｌ／ｌがより好ましく、０．２〜０．５ｍｍｏｌ／ｌが最も好ましい。
溶液Ｂにおける塩の濃度は、特に限定されないが、１０ｍｍｏｌ／ｌ以下が好ましく、０〜２ｍｍｏｌ／ｌがより好ましい。
以下、本発明の確認方法を等温滴定熱量計を用いて行う場合を代表例として工程（２）を具体的に説明する。
＜工程（２）＞
工程（２）では、工程（１）で得られた溶液を熱分析する。具体的には、溶液Ｂを滴下するごとに発生する熱量を測定する。
本発明の確認方法では、工程（１）で溶液を調製するのに先だって、予め、純粋なＰＹＹ３−３６及びＣＢ［７］を溶液中で混合する場合に発生する熱量を測定する。すなわち、予め、検量線を作成する。
具体的には、ＰＹＹ３−３６含有溶液及び溶液Ｂを調製した後、熱平衡下、溶液Ｂを一定量ずつ（例えば０．０１ｍｌずつ）、ＰＹＹ３−３６含有溶液に滴下すればよい。
ＰＹＹ３−３６含有溶液は、ＰＹＹ３−３６を上記溶媒に溶解させることにより調製できる。
ＰＹＹ３−３６含有溶液におけるＰＹＹ３−３６の濃度は、上記溶液Ａの濃度と同程度にすればよく、特に限定されないが、０．０１〜１ｍｍｏｌ／ｌが好ましく、０．０２〜０．５ｍｍｏｌ／ｌがより好ましく、０．０２〜０．０５ｍｍｏｌ／ｌが最も好ましい。
ＰＹＹ３−３６と滴下したＣＢ［７］のモル比を横軸とし、滴下するごとに発生する熱量を縦軸としてプロットすることにより検量線を作成することができる。
検量線上の熱量と工程（１）で得られた溶液を熱分析して求めた熱量とを対比することにより、被検薬剤中におけるＰＹＹ３−３６の存否を確認することができる。すなわち、薬剤製造時においては、ＰＹＹ１−３６、分解物Ｃ等が存在するかどうかを確認でき、薬剤を長期保存する場合においては、ＰＹＹ３−３６が分解することなく有効に存在しているかどうかを確認することができる。
以下に参考例及び実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。但し、本発明は実施例に限定されない。
参考例１
０．０３ｍｍｏｌ／ｌのＴｙｒ−ＮＨ２水溶液１．５ｍｌを超高感度等温滴定型カロリメータＶＰ−ＩＴＣ（マイクロキャル社製）の反応セルの中に入れた。
また、０．３ｍｍｏｌ／ｌのＣＢ［７］含有水溶液０．２５ｍｌを前記カロリメータのシリンジの中に入れた。
カロリメータを熱平衡にした後、反応セルの中へ、ＣＢ［７］含有水溶液を０．０１ｍｌずつ、計２５回加えた。得られたデータをＯＲＩＧＩＮ７．０（マイクロキャル社製）によって自動積分した。結果を図２に示す（図中▼）。
図１から、Ｎ−末端にチロシン残基を有するペプチド化合物とＣＢ［７］とが反応する（錯体を形成する）ことにより発熱することがわかる。
実施例１
検量線の作成
下記アミノ酸配列
Ｈ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２
で表されるＰＹＹ３−３６の水溶液（濃度：０．０３ｍｍｏｌ／ｌ）１．５ｍｌを超高感度等温滴定型カロリメータＶＰ−ＩＴＣ（マイクロキャル社製）の反応セルの中に入れた。
また、０．３ｍｍｏｌ／ｌのＣＢ［７］含有水溶液０．２５ｍｌを前記カロリメータのシリンジの中に入れた。
カロリメータを熱平衡にした後、反応セルの中へ、ＣＢ［７］含有水溶液を０．０１ｍｌずつ、計２５回加えた。得られたデータをＯＲＩＧＩＮ７．０（マイクロキャル社製）によって自動積分した。結果を図２に示す（図中■）。
ＰＹＹ ３−３６ の存否の確認
次に、上記ＰＹＹ３−３６及びＴｙｒ−ＮＨ２からなる被検薬剤（ＰＹＹ３−３６及びＴｙｒ−ＮＨ２のモル比が９５：５）を水に溶解させることにより、０．０３ｍｍｏｌ／ｌの被検薬剤含有水溶液を調製した。調製した溶液を上記カロリメータの反応セルの中に入れた。また、上記ＣＢ［７］含有水溶液０．２５ｍｌを前記カロリメータのシリンジの中に入れた。
そして、上記と同様の方法により、熱量を測定し、得られたデータを自動積分した。結果を図３に示す（図中■）。なお、比較のため、作成した検量線も併せて図３に示す（図中○）。
図３から、被検薬剤（ＰＹＹ３−３６及びＴｙｒ−ＮＨ２のモル比が９５：５）を混合する場合、純粋なＰＹＹ３−３６混合する場合に比べ、発生する熱量が高いことがわかる。すなわち、前記被検薬剤は、純粋なＰＹＹ３−３６に比べ、ＰＹＹ３−３６が少ない分Ｔｙｒ−ＮＨ２が存在しているため、熱量に差が生じたことがわかる。
実施例２
検量線の作成
実施例１と同様の方法により検量線を作成した。結果を図４に示す（図中■）。
ＰＹＹ ３−３６ の存否（ＰＹＹ １−３６ の存否）の確認
次に、実施例１で用いたＰＹＹ３−３６及びＰＹＹ１−３６からなる被検薬剤（ＰＹＹ３−３６及びＰＹＹ１−３６のモル比が９５：５）を水に溶解させることにより、０．０３ｍｍｏｌ／ｌの被検薬剤含有水溶液を調製した。調製した溶液を上記カロリメータの反応セルの中に入れた。また、上記ＣＢ［７］含有水溶液０．２５ｍｌを前記カロリメータのシリンジの中に入れた。
そして、上記と同様の方法により、熱量を測定し、得られたデータを自動積分した。結果を図４に示す（図中○）。
図４から、被検薬剤（ＰＹＹ３−３６及びＰＹＹ１−３６のモル比が９５：５）を混合する場合、純粋なＰＹＹ３−３６混合する場合に比べ、発生する熱量が高いことがわかる。すなわち、前記被検薬剤は、純粋なＰＹＹ３−３６に比べ、ＰＹＹ３−３６が少ない分ＰＹＹ１−３６が存在しているため、熱量に差が生じたことがわかる。
図１は、キューカービチュリル［７］の化学構造を示す図である。 図２は、参考例１にて測定した熱量（図中■）及び実施例１の「検量線の作成」において測定した熱量（図中▼）をプロットした図である。 図３は、実施例１の「検量線の作成」において測定した熱量（図中○）及び「ＰＹＹ３−３６の存否の確認」において測定した熱量（図中■）をプロットした図である。 図４は、実施例２の「検量線の作成」において測定した熱量（図中■）及び「ＰＹＹ３−３６の存否の確認」において測定した熱量（図中○）をプロットした図である。

Claims (3)

  1. 被検薬剤中において、下記アミノ酸配列
    Ｈ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｘ
    （アミノ酸配列中、ＸはＯＨ、又はカルボン酸保護基を示す）
    で表されるペプチド化合物ＰＹＹ３−３６の存否を確認する方法であって、
    （１）前記被検薬剤及びキューカービチュリル［７］を溶媒とともに混合することにより溶液を調製する工程、及び
    （２）工程（１）で得られた溶液を熱分析する工程
    を含む、ペプチド化合物ＰＹＹ３−３６の存否の確認方法。
  2. さらに、被検薬剤中において、下記アミノ酸配列
    Ｈ−Ｔｙｒ−Ｐｒｅ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＮＨ２
    で表されるペプチド化合物ＰＹＹ１−３６及び／又はペプチド化合物ＰＹＹ１−３６が分解することにより生成したペプチド分解物の存否を確認する請求項１に記載の確認方法。
  3. ペプチド化合物ＰＹＹ３−３６が分解することにより生成したペプチド分解物を検知する、請求項１に記載の確認方法。
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