JP4657658B2 - 有用微生物固定化生分解マイクロカプセルの製造方法 - Google Patents
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Description
(2) 前記工程(1)で得られたW/Oエマルションを水相に添加して乳化させることによりW/O/Wエマルションを調製する工程、および
(3) 前記工程(2)で得られたW/O/Wエマルションから、加温によるか、または加温及び減圧により、前記有機溶媒を蒸発によって除去して前記癖材ポリマーを結晶化させる工程を含むことを特徴としている。
請求項2の発明は、上記請求項1の発明において、保護材ポリマーがアルギン酸ナトリウム、κ−カラギーナン、ポリビニルピロリドンまたはポリビニルアルコールから選ばれることを特徴としている。
請求項3の発明は、上記請求項1または2の発明において、壁材ポリマーがポリ乳酸、ポリεカプロラクタム、またはポリ乳酸とグリコール酸との共重合体から選ばれることを特徴としている。
請求項4の発明は、上記請求項1〜3のいずれかの発明において、固定化する有用微生物が酵母菌であることを特徴としている。
請求項5の発明は、上記請求項1〜3のいずれかの発明において、固定化する有用微生物が乳酸菌であることを特徴としている。
請求項6の発明は、上記請求項1〜3のいずれかの製造方法において、固定化する有用微生物が酵母菌と乳酸菌との共存であることを特徴としている。
請求項7の発明は、上記請求項1〜6のいずれかの発明において、前記有機溶媒がジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、ジメチルホルムアルデヒド、ジメチルスルホオキサイド、アセトニトリルまたは酢酸エチルから選ばれることを特徴としている。
請求項8の発明は、上記請求項1〜7のいずれかの発明において、前記工程(1)及び(2)において乳化分散安定剤を添加することを特徴としている。
本発明にいう有用微生物である乳酸菌あるいは乳酸菌含有物としては、広義の乳酸発酵に関与する菌であれば、乳酸連鎖球菌、乳酸桿菌などすべてのものが使用可能である。乳酸菌の属としては、Lactobacillus属、Pediococcus属、Tetragenococcus属、Carnobacterium属、Vagococcus属、Leuconostoc属、Weissella属、Oenococcus属、Atopobium属、Streptococcus属、Enterococcus属、Lactococcus属などが例示される。また、具体的な菌株としては、シロタカブ、各種のケフィア菌株およびビフィズス菌株などが例示される。乳酸菌含有物としては、市販の乳酸菌製剤(ケフィア菌錠剤、ビイフィズス菌株錠剤など)の粉砕物を利用することができる。乳酸菌を添加するに際しては、これら乳酸菌の1種あるいは2種以上の異なる乳酸菌を組み合わせて使用すると、種々の土壌との適合性がより高まる。
本発明に従い有用微生物固定化マイクロカプセルを得るには、先ず、目的の有用微生物および水中でゲル形成性を有し微生物の保護材となるポリマーを含有する水溶液(内水相)を、マイクロカプセルの壁材となる疎水性ポリマーを含有する有機溶媒から成る有機相に添加して乳化させることによりW/Oエマルションを調製する。
先願の特願2003−132626で微生物を固定化するマイクロカプセルの製造法が記述されている。先願では、W/Oエマルションを調製する際に、有機溶媒A(マイクロカプセル壁材となるポリマーに対して良溶媒)と有機溶媒B(良溶媒より高沸点であるマイクロカプセル壁材となるポリマーに対して貧溶媒)とを混合し、目的の微生物および水中でゲル形成性を有し微生物の保護材となるポリマーを含有する水溶液(内水相)に分散させ調製することが記載されている。本出願では、マイクロカプセル壁材となるポリマーに対して良溶媒である有機溶媒のみを使用し、微生物入りW/Oエマルションを作成している。これが先願(特願2003−132626)と異なる点である。
上述のようにして得られたW/Oエマルションを水相に添加して乳化させることによりW/O/Wエマルションが調製される。すなわち、攪拌機を用いて、一般的には50〜15000rpmの速度で撹拌されている外水相にW/Oエマルションを添加する。
以上のようにしてW/O/Wエマルションを調製できれば、該エマルションから液中乾燥法により加温もしくは加温及び減圧を行い、有機溶媒を徐々に除去する。
本調製条件に従い上述のように製造される有用微生物内包マイクロカプセルの特徴は、内部がマトリックス状、多核状あるいは単核であり、有機溶媒の種類、組成、液中乾燥速度、昇温温度等をコントロールすることでカプセル形状のコントロールが可能となる。
カプセル外殻は多孔質構造であり、そして、このカプセル内は、微細孔を通してつながっている構造を有する。調製条件により、微細孔は数nm〜10μmの範囲で、自由に制御可能である。この構造は、カプセル内部に内包した微生物が外部に容易く漏出しないために必要である。
図1には、本発明によって得られるマイクロカプセルの構造の典型例として後述の実施例で用いている有用微生物内包マイクロカプセルの走査型電子顕微鏡写真を示している。
本発明によって得られる生分解マイクロカプセルは有用微生物として酵母菌、乳酸菌それぞれを固定化あるいは酵母菌と乳酸菌を共存固定化したものである。これらの有用微生物固定化生分解マイクロカプセル単独あるいは有用微生物固定化生分解マイクロカプセルと堆肥、緑肥、草、稲わら、麦わら、残滓、米ぬか、籾殻、硫安で増量し製剤化した土壌改質資材を用いて土壌に散布あるいは土中埋設する。マイクロカプセル化された有用微生物の効果により、腐敗型土壌を発酵型土壌への土壌改質が可能となる。
内水相は、1wt%(W/V)のアルギン酸ナトリウム水溶液、1.6wt%(W/V)の乳酸菌(ラクトバチルス・ブルガリックス)を含む12.5mlを用意した。有機相は、カプセル壁材であるポリεカプロラクタムを5wt%(W/V)、有機溶媒としてジクロロメタンを92wt%(W/V)、乳化分散安定剤としてソルビタンモノオレエートを3wt%(W/V)の割合で混合したもの25mlを用意した。また、外水相は、蒸留水を69wt%(W/V)、乳化分散安定剤としてポリビニルアルコールを1wt%(W/V)、第三リン酸カルシウム10%スラリーを30wt%(W/V)の割合で混合したもの600mlを用意した。
上記のように調製した内水相をマグネチックスターラーにて攪拌している有機相に加え、5℃にて10分間攪拌することで、W/Oエマルションを形成した。そのW/Oエマルションを攪拌下(100rpm)にある5℃の外水相に添加し、30分間攪拌することで、W/O/Wエマルションを形成した。
その後攪拌しながら、25℃に昇温し1時間攪拌、さらに30℃に昇温、700hPaに減圧し、3時間攪拌させることでジクロロメタンを除去した。
調製したマイクロカプセルは0.5M塩酸水溶液600gを添加し、10分間攪拌後桐山ロートにて濾過し、蒸留水で洗浄した後回収した。マイクロカプセルの全体図および断面図を図1に示す。走査型電子顕微鏡の観察では、粒子径は50〜200μmてあった。
実施例1により得た乳酸菌内包マイクロカプセル1gを正確に量り取り、803培地(0.5wt%(W/W) ポリペプトン、0.5wt%(W/W) 酵母エキス、5wt%(W/W) グルコース、0.2wt%(W/W) ラクトース、0.05wt%(W/W) Tween80、0.1wt%(W/W) MgSO4・7H2Oの組成からなる)100mlに添加する。これをインキュベータ内37℃にて3日間静置させ、3日後の糖質(グルコース)の乳酸への転化率をガスクロマトグラフィーにて分析することで乳酸菌の乳酸生成に基づく活性を評価した。活性評価の結果を図2に示す。
乳酸菌内包マイクロカプセルによる発酵型土壌形成の確認試験を以下の手順により行った。稲わら6gを乾燥土壌0.7kgに添加し、これをオートクレーブで121℃、15分間滅菌後、乳酸菌内包マイクロカプセル2.5gを混ぜ試験用ポットに充填した。これをインキュベーター内で静置させ、24h毎の乳酸生成量をガスクロマトグラフィーにより分析した。サンプリングに関しては、以下の手順に従った。試験用ポット内部には中空糸を通し、中空糸の一端から脱イオン水を流通させた。もう一端を定量ポンプで吸引することで中空糸内部に流通させた溶液を24h毎に採取した(図3)。乳酸生成量の結果を図4以下に示す。
発酵型土壌における植物への成長効果を確認するためにコマツナの種子発芽試験を行った。有用微生物内包マイクロカプセルを滅菌処理した土壌に蒔き、24時間毎(96時間まで)に土壌を1g採取し、蒸留水100mlを加え60℃にて3時間栄養分を抽出した。各時間における抽出した留分を濾過し、得られたろ液をシャーレに10ml入れ、コマツナの種子を30粒蒔き、室温で1−7日後の発芽した種子の累積数を確認し、発酵型土壌の腐熟度を評価した。
市販の微生物資材(有用微生物を土と一緒に混合したもの)1gを正確に計り取り、803培地100mlに添加した。これをインキュベータ内で37度にて3日間静置させ、3日後の糖質(グルコース)の乳酸への転化率をガスクロマトグラフィーにて分析することで市販の微生物資材に存在する乳酸菌の乳酸生成に基づく活性を評価した。活性評価の結果を図2に示す。
乳酸の分析は、ガスクロマトグラフィーを用いて行った。カラムはキャピラリーカラム(長さ30m、直径0.25mm)を用いた。分析条件は、試料気化室温度が250℃、検出器(FID)は250℃、カラムオーブンは、60℃で2℃/minにて84℃まで昇温した。サンプル注入量は1μLとした。
グルコースの乳酸への転化率の決定は、以下の式にて算出した。
転化率(%)=(生成した乳酸の生成量/仕込みのグルコースの量)×100
Claims (8)
- 有用微生物を内包した保護材ポリマーを、生分解性を有する壁材ポリマーが覆う構造を持つ有用微生物固定化生分解マイクロカプセルを製造する方法であって、
(1) 前記有用微生物及び水中でゲル形成性を有する前記保護材ポリマーを含有する水溶液を、前記壁材ポリマーとなる疎水性ポリマーがその良溶媒である有機溶媒に溶解した有機相と乳化させることにより、前記有用微生物を内包する前記保護材ポリマーを含有する水滴微粒子が前記有機相中に分散したW/Oエマルションを調製する工程、
(2) 前記工程(1)で得られたW/Oエマルションを水相に添加して乳化させることによりW/O/Wエマルションを調製する工程、および
(3) 前記工程(2)で得られたW/O/Wエマルションから、加温によるか、または加温及び減圧により、前記有機溶媒を蒸発によって除去して前記癖材ポリマーを結晶化させる工程を含むことを特徴とする方法。 - 保護材ポリマーがアルギン酸ナトリウム、κ−カラギーナン、ポリビニルピロリドン又はポリビニルアルコールから選ばれることを特徴とする請求項1に記載の有用微生物固定化生分解マイクロカプセルの製造方法。
- 壁材ポリマーがポリ乳酸、ポリεカプロラクタム、またはポリ乳酸とグリコール酸との共重合体から選ばれることを特徴とする請求項1または2に記載の有用微生物固定化生分解マイクロカプセルの製造方法。
- 固定化する有用微生物が酵母菌であることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の有用微生物固定化生分解マイクロカプセルの製造方法。
- 固定化する有用微生物が乳酸菌であることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の有用微生物固定化生分解マイクロカプセルの製造方法。
- 固定化する有用微生物が酵母菌と乳酸菌との共存であることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の有用微生物固定化生分解マイクロカプセルの製造方法。
- 前記有機溶媒がジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホオキサイド、アセトニトリルまたは酢酸エチルから選ばれることを特徴とする請求項1〜6のいずれかに記載の有用微生物固定化生分解マイクロカプセルの製造方法。
- 前記工程(1)及び(2)において乳化分散安定剤を添加することを特徴とする請求項1〜7のいずれかに記載の有用微生物固定化生分解マイクロカプセルの製造方法。
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