JP4656541B2 - 二光子励起蛍光プローブの製造方法及び細胞内マグネシウムのリアルタイムモニタリング方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞内マグネシウムのリアルタイムモニタリング用二光子励起蛍光プローブの製造方法、及びそれを用いた細胞内マグネシウムのリアルタイムモニタリング方法に関するものである。より具体的には、染料の分子量が小さくて細胞内の染色性に優れ、二光子蛍光収率が非常に大きく、細胞内マグネシウムイオンのリアルタイム映像に適した二光子励起蛍光プローブ、その製造方法及びそれを用いた細胞内マグネシウムのリアルタイムモニタリング方法に関する。

マグネシウムイオン（Ｍｇ^２＋）は、細胞内に最も多く存在する二価金属イオンであって、数百種余りの酵素活性調節に関与するだけでなく、細胞の増殖及び死滅のような多くの細胞における過程で重要な役割を担う。このような細胞内マグネシウムイオンを検出するために、多様な膜透過性蛍光プローブが開発されており、それらのうち一部は市販されている（例えば、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３参照）。それらのうち大部分は、アセトキシメチル（ＡＭ）エステルとして用いられるが、これは細胞内で酵素加水分解過程を経て金属イオンプローブに変化される（例えば、非特許文献４参照）。しかし、一光子（ＯＰ）蛍光プローブを備えた共焦点顕微鏡は、組職表面（＜１００μｍ）近傍のみに使用が制限される。

従って、組職内部の深い所での細胞現象を観察するためには、二光子顕微鏡（ＴＰＭ）の使用が必須である。励起のために２個の近赤外線光子を吸収させるＴＰＭは、一光子顕微鏡に比べてさまざまな長所を有する。具体的には、透過深度の増加（＞５００μｍ）、組職自己蛍光（auto-fluorescent）及び自己吸収（self-absorption）の低下、及び光損傷（photodamage）及び光脱色（photobleaching）の減少などである（例えば、非特許文献５、非特許文献６参照）。

特に、ＴＰＭの高い透過性は、組職のイメージ化において非常に重要である。これは損傷された細胞のような表面処理結果物は、脳の薄片内部に７０μｍ以上延びるためである（例えば、非特許文献７参照）。しかし、現在ＴＰＭとして用いられる大部分の一光子蛍光プローブは、小さな二光子励起蛍光部（two-photon action cross sections：φｄ）を有するために、その用途がＴＰＭのみに限定される。組織のイメージ化に関連する他の限界点としては、標的ミス（mistargeting）の問題がある。これは細胞膜結合プローブにより引き起こされる（例えば、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０参照）。前記細胞膜結合プローブは、細胞内の任意の細胞膜で囲まれた構造内に蓄積されるので、蛍光量子収率が、大抵は細胞質より細胞膜の方が高くなる。そのため、細胞膜に結合されたプローブからの信号をプローブ−Ｍｇ^２＋複合体の信号から分離することが非常に難しいという不都合がある。

従って、１）より明るいＴＰＭイメージを得るために、改善したφｄ値を有し、２）細胞質内プローブと細胞膜結合プローブとをよりよく区分するために、異なる環境下で、より広いスペクトル移動を示す効率的な二光子励起蛍光プローブを開発する必要性がある。
The Handbooks-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 10th ed, Haugland, R. P. Ed.; MolecularProbes: Eugene, OR, 2005. H. Komatsu, N. Iwasawa, D. Citterio, Y. Suzuki, T. Kubota, K. Tokuno, Y. Kitamura, K. Oka, K. Suzuki, J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 16353-16360. G. Farruggia, S. Iotti, L. Prodi, M. Montalti, N. Zaccheroni, P. B. Savage, V. Trapani, P. Sale, F. I. Wolf, J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 344-350. R. Y. Tsien, Nature 1981, 290, 527-528. W. R. Zipfel,R. M. Williams, W. W. Webb, Nat. Biotechnol. 2003, 21, 1369-1377. F. Helmchen, W. Denk, Nat. Methods, 2005, 2, 932-940. R.M.Williams,W.R.Zipfel,W.W.Webb,Curr.Opin.Chem.Biol.2001,5,603-608. The Handbooks-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies,10thed,Haugland,R.P.Ed.;Molecular Probes:Eugene,OR,2005. J.R.Long,R.S.Drago,J.Chem.Ed.1982,59,1037-1039. K.J.Hirose,Incl.Phenom.Macrocycl.Chem.2001,39,193-209. B.Metten,M.Smet,N.Boens,W.Dehaen,Synthesis 2005,11,1838. J.N.Demas,G.A.Crosby,J.Phys.Chem.1971,75,991. C.Reichardt,Chem.Rev.1994,94,2319-2358. H.A.Benesi,J.H.Hildebrand,J.Am.Chem.Soc.1949,71,2703. H.A.Benesi,J.H.Hildebrand,J.Am.Chem.Soc.1949,71,2703. G.Grynkiewicz,M.Poenie,R.Y.Tsien.J.Biol.Chem.1985,260,3440. G.Grynkiewicz,M.Poenie,R.Y.Tsien.J.Biol.Chem.1985,260,3440. R.Y.Tsien,T.Pozzan,T.J.Rink.J.Cell Biol.1982,94,325. R.Y.Tsien,T.Pozzan,Methods Enzymol.1989,172,230. A.Takahashi,P.Camacho,J.D.Lechleiter,B.Herman.Physiol.Rev.1999,79,1089. J.R.Long,R.S.Drago,J.Chem.Ed.1982,59,1037. K.Hirose,J.Incl.Phenom.Macrocycl.Chem.2001,39,193. The Handbooks-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies,10th ed,; Haugland, R. P. Ed.; Molecular Probes: Eugene, OR, 2005. H. Szmacinski, J. R. Lakowicz, J. Fluoresc. 1996, 6, 83-95. G. Farruggia, S. Iotti, L. Prodi, M. Montalti, N. Zaccheroni, P. B. Savage, V. Trapani, P. Sale, F. I. Wolf, J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 344. I. J. Reynolds, CurrentProtocols in Neuroscience; Wiley: New York; 1998. J. G. Fitz, A. H. Sostman, J. P. Middleton, Am. J. Physiol. (London) 1994, 266, G677-G684. M. R. Cho, H. S. Thatte, M. T. Silvia, D. E. Golan, FASEB J. 1999, 13, 677-683. G. Farruggia, S. Iotti, L. Prodi, M. Montalti, N. Zaccheroni, P. B. Savage, V. Trapani, P. Sale, F. I . Wolf, J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 344-350.

本発明の第１の目的は、生体内に存在する多様な金属の内、特にマグネシウムに対するイオン選択性に優れ、二光子蛍光収率が非常に大きくて細胞内マグネシウムイオンのリアルタイムモニタリングに適した二光子励起蛍光プローブの製造方法を提供することである。

また、本発明の第２の目的は、前記二光子励起蛍光プローブを利用した細胞内マグネシウムのリアルタイムモニタリング方法を提供することである。

本発明は、前記第１の目的を達成するため、細胞内マグネシウムイオンのリアルタイムモニタリング用二光子吸収プローブの製造方法を提供する。
・・・（１）
（式中、Ｒは、ＨまたはＣＨ_２ＯＣＯＣＨ_３である。）

前記製造方法は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド・ＨＣｌと、４−ジメチルアミノピリジンと、化学式２及び３で表わされる化合物とを反応させる段階を含む細胞内マグネシウムイオンのリアルタイムモニタリング用二光子励起蛍光プローブの製造方法を提供する。

本発明の一実施形態によれば、前記化学式２で表わされる化合物は、メチルブロモアセテート、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ＮａＩ及び化学式４で表わされる化合物を反応させて製造することができる。

本発明の更なる実施形態によれば、前記化学式４で表わされる化合物は、ＣＨ_３ＮＨ_２・ＨＣｌ、Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３、ＮａＯＨ、Ｈ_２Ｏ及び化学式５で表わされる化合物を反応させて製造することができる。

本発明の他の実施形態によれば、前記化学式５で表わされる化合物は、化学式６で表わされる化合物と共にＨＢｒを反応させて製造することができる。

本発明は、前記第２の目的を達成するため、前記製造方法により製造した二光子励起蛍光プローブを観察対象となる細胞内に注入した後、該二光子励起プローブから放出される二光子励起蛍光をイメージ化する段階を含む細胞内マグネシウムのリアルタイムモニタリング方法を提供する。

本発明の一実施形態によれば、前記二光子励起蛍光によるイメージは、５００〜６２０ｎｍの範囲の波長を用いて得ることができる。

本発明の更なる実施形態によれば、下記数式１を用いて細胞内マグネシウムイオンの濃度を定量的に測定することもできる。

［Ｍｇ^２＋］＝Ｋ_ｄ［（Ｆ−Ｆ_ｍｉｎ）／（Ｆ_ｍａｘ−Ｆ）］ ・・・（数式１）
数式１において、Ｋ_ｄは、本発明による二光子励起蛍光プローブのマグネシウムイオンに対する解離定数であり、Ｆは、測定された二格子蛍光強度であり、Ｆ_ｍｉｎ及びＦ_ｍａｘは、それぞれ最小蛍光強度及び最大蛍光強度である。

以下、添付した図面及び実施形態を参照して、本発明をより詳細に説明する。

本発明による細胞内マグネシウムのリアルタイムモニタリング用二光子励起蛍光プローブは、二光子蛍光収率が非常に大きいため、細胞を染色する染料の量を顕著に減らすことができる。また、染料の分子量が小さく、細胞内への染色性が非常に優れているため、細胞内マグネシウムイオンのリアルタイムイメージングに適するという特性を有する。

本発明は、具体的には、化学式１で表される細胞内マグネシウムのリアルタイムモニタリング用二光子励起蛍光プローブを提供する。

化学式１における２−アセチル−６−（ジメチルアミノ）ナフタレン部分は、二光子発色団として機能し、ｏ−アミノフェノール−Ｎ，Ｎ，Ｏ−トリ酢酸部分は、Ｍｇ^２＋に対する選択的結合部位として機能する。本発明による二光子励起蛍光プローブは、Ｍｇ^２＋と複合体を形成する場合に、強い二光子励起蛍光（Two-Photon Excited Fluorescence：ＴＰＥＦ）を放出する。前記複合体は、溶媒環境の極性によって非常に異なる波長範囲の光を放出するために、相異なる検出ウインドウ（detection windows）を用いることで細胞膜−結合プローブと前記複合体とを容易に区分することができる。

一方、化学式１で表わされる化合物において、Ｒは、ＨまたはＣＨ_２ＯＣＯＣＨ_３であり得るが、ＲがＣＨ_２ＯＣＯＣＨ_３である場合、本発明による二光子励起蛍光プローブの細胞透過度をさらに向上させることができる。

本発明はまた、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド・ＨＣｌと、４−ジメチルアミノピリジンと、化学式２及び化学式３で表わされる化合物とを反応させて化学式１で表わされる化合物を製造する段階を含む細胞内マグネシウムのリアルタイムモニタリング用二光子励起蛍光プローブの製造方法を提供する。

望ましくは、化学式２で表わされる化合物は、化学式４で表わされる化合物、メチルブロモアセテート、Ｎａ_２ＨＰＯ_４及びＮａＩを反応させて製造することができる。

望ましくは、化学式４で表わされる化合物は、化学式５で表わされる化合物、ＣＨ_３ＮＨ_２・ＨＣｌ、Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３、ＮａＯＨ及びＨ_２Ｏとを反応させて製造することができる。

また、化学式５で表わされる化合物は、化学式６で表わされる化合物とＨＢｒとを反応させて製造することができる。

参考までに、下記反応式１には、化学式６で表わされる化合物から、化学式１で表わされる化合物を製造する典型的な反応を示す。

前述したように、細胞透過度の向上のために、反応式１のＲは、Ｈの代りにＣＨ_２ＯＣＯＣＨ_３に置換されうるが、望ましくは、このような置換過程は、ＲがＨである化学式１で表わされる化合物とブロモ酢酸エチル及びトリエチルアミンとを反応させることで実行される。

一方、本発明は、また前記二光子励起蛍光プローブを観察対象となる細胞内に注入した後、該二光子励起蛍光プローブから放出される二光子励起蛍光をイメージ化する段階を含む細胞内マグネシウムのリアルタイムモニタリング方法を提供する。

特に、後述するように、前記二光子励起蛍光によるイメージを５００〜６２０ｎｍの範囲の波長を用いて得る場合には、細胞膜に結合された二光子励起蛍光プローブによる発光寄与度を最小化しながら、細胞内に遊離状態で存在するＭｇ^２＋イオンのみを選択的に測定することも可能である。

また、本発明による細胞内マグネシウムのリアルタイムモニタリング方法は、従来の技術とは異なって、細胞内マグネシウムの定性的分析だけではなく、これを定量的に測定することも可能であり、望ましくは、細胞内マグネシウムイオン濃度の測定は、下記数式１によって行われる。

［Ｍｇ^２＋］＝Ｋ_ｄ［（Ｆ−Ｆ_ｍｉｎ）／（Ｆ_ｍａｘ−Ｆ）］ ・・・（数式１）
数式１において、Ｋ_ｄは、本発明による二光子励起蛍光プローブのマグネシウムイオンに対する解離定数であり、Ｆは、測定された二光子蛍光強度であり、Ｆ_ｍｉｎ及びＦ_ｍａｘは、それぞれ最小蛍光強度及び最大蛍光強度である。

以下、本発明を実施例を通じてより詳細に説明するが、下記実施例は、本発明の範囲を制限するためのものではなく、本発明の理解を助けるためのものとして記載されたものである。

［製造例１］本発明による二光子励起蛍光プローブの製造
本製造例によって、二光子励起蛍光プローブである化学式７で表わされる化合物を製造した。

［製造例１．１］６−アセチル−２−ヒドロキシナフタレン（化学式８）の製造

酢酸（１００ｍＬ）中の６−アセチル−２−メトキシナフタレン（１０．４ｇ、５２ｍｍｏｌ）溶液に、４８％のＨＢｒ（４３．０ｇ、０．５３ｍｏｌ）を添加し、混合物を得た。前記混合物を１００℃で１２時間撹拌した。過量の酢酸を真空乾固し、残留物を酢酸エチルに溶解させた後、希釈ＮａＨＣＯ_３及び塩水で洗浄した。これによって分離した有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、真空中で溶媒を除去した。最終生成物は、酢酸エチル／ヘキサン（１：１）を溶離液として用いるカラムクロマトグラフィーによって精製した。

収量７．２ｇ（７４％）；融点１７３℃；ＩＲ（ＫＢｒ）：３，３６２、１，６６４ｃｍ^−１；^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：ｄ８．４１（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．９９（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．８７（ｄ，１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．７０（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．２０（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．１８（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、５．７０（ｂｒ ｓ、１Ｈ）、２．７１（ｓ、３Ｈ）．Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ_１２Ｈ_１０Ｏ_２：Ｃ、７７．４０；Ｈ、５．４１．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、７７．５２；Ｈ、５．４６。

［製造例１．２］６−アセチル−Ｎ−メチル−２−ナフチルアミン（化学式９）の製造

前記製造例１．１で製造された化学式８で表わされる化合物（６．５ｇ、３５ｍｍｏｌ）、Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_５（１３．３ｇ、７０ｍｍｏｌ）、ＮａＯＨ（７．０ｇ、０．１７ｍｏｌ）及びＨ_２Ｏ（２００ｍＬ）の混合物をスチールボム反応器（steel‐bomb reactor）内に入れてＭｅＮＨ_２・ＨＣｌ（１４．２ｇ、０．１７ｍｏｌ）を添加して混合した後、該混合物を１４０℃で４８時間撹拌した。得られた生成物を濾過によって収集し、水で洗浄した後、クロロホルム／酢酸エチル（５０：１）を溶離液として用いるフラッシュカラムによって精製した。引き続き、メタノールを用いた再結晶によってさらに精製した。

収量５．９ｇ（８５％）；融点１８１℃；ＩＲ（ＫＢｒ）：３，３４７、１，６６３ｃｍ^−１；^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：ｄ８．３０（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．９３（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．７２（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．６３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、６．９１（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、６．７７（ｄ、１Ｈ，Ｊ＝２Ｈｚ）、４．１７（ｂｒ ｓ、１Ｈ）、２．９７（ｓ、３Ｈ）、２．６７（ｓ、３Ｈ）．Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ_１３Ｈ_１３ＮＯ：Ｃ、７８．３６；Ｈ、６．５８；Ｎ、７．０３．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、７８．３２；Ｈ、６．５６；Ｎ、７．０８。

［製造例１．３］６−アセチル−２−［Ｎ−メチル−Ｎ−（カルボキシ）アミノ］ナフタレン（化学式１０）の製造

前記製造例１．２で製造された化学式９で表わされる化合物（４．５ｇ、２３ｍｍｏｌ）、メチルブロモアセテート（５．２ｇ、３４ｍｍｏｌ）、Ｎａ_２ＨＰＯ_４（４．８ｇ、３４ｍｍｏｌ）及びＮａＩ（１．４ｇ、９．２ｍｍｏｌ）の混合物をＭｅＣＮ（１５０ｍＬ）中に入れて、Ｎ_２下で１８時間還流させた。得られた生成物を酢酸エチルで抽出し、塩水で洗浄した後、クロロホルム／酢酸エチル（３０：１）を溶離液として用いるフラッシュカラムによって精製し、中間体を得た。

収量５．２ｇ（８３％）；融点９２℃；ＩＲ（ＫＢｒ）：１，７５４、１，６７１ｃｍ^−１；^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：ｄ８．３２（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．９２（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．８０（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．６４（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．０８（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、６．８８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、４．２３（ｓ、２Ｈ）、３．７４（ｓ、３Ｈ）、３．２１（ｓ、３Ｈ）、２．６７（ｓ、３Ｈ）；Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ_１６Ｈ_１７ＮＯ_３：Ｃ、７０．８３；Ｈ、６．３２；Ｎ、５．１６．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、７０．８８；Ｈ、６．３５；Ｎ、５．１０。

前記中間体（２．０ｇ、７．４ｍｍｏｌ）及びＫＯＨ（０．８ｇ、１４ｍｍｏｌ）の混合物をエタノール／Ｈ_２Ｏ（５０／１０ｍＬ）に入れて５時間撹拌した。得られた結果物である溶液を氷水（１００ｍＬ）で希釈し、５℃未満の濃塩酸（ａｑ）をｐＨ３までゆっくり添加した。結果物である沈澱を収集し、蒸溜水で洗浄した後、メタノールを用いた再結晶によって精製した。

収量１．６ｇ（８４％）；融点１５８℃；ＩＲ（ＫＢｒ）：２，９０６、１，７３９、１，６７８ｃｍ^−１；^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ）：ｄ８．３９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．８６（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．８４（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．６４（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．１８（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、６．９３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、４．２７（ｓ、２Ｈ）、３．１９（ｓ、３Ｈ）、２．６５（ｓ、３Ｈ）；^１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ）：ｄ＝１９９．３、１７３．２、１４９．８、１３８．２、１３０．９、１３０．９、１３０．８、１２６．４、１２５．７、１２４．１、１１６．０、１０５．５、５３．５、３８．７、２５．４ｐｐｍ；Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ_１５Ｈ_１５ＮＯ_３：Ｃ、７０．０２；Ｈ、５．８８；Ｎ、５．４４．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、７０．０８；Ｈ、５．７９；Ｎ、５．４５。

［製造例１．４］本発明による二光子励起蛍光プローブ（化学式７）の製造

前記製造例１．３で製造された化学式１０で表わされる化合物（０．５０ｇ、１．９ｍｍｏｌ）及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド・ＨＣｌ（０．４４ｇ、２．３ｍｍｏｌ）の混合物をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（２０ｍＬ）に入れて混合した後、２０分間撹拌した。攪拌後の前記混合物に、化学式１１で表わされる化合物（０．７１ｇ、２．１ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（０．０３３ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）を添加してＮ_２下で１２時間撹拌した。下記化学式１１で表わされる化合物は、公知の方法（例えば、非特許文献１１参照）で製造した。

攪拌後の生成物を酢酸エチルで抽出し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させた後、真空中で溶媒を除去した。最終生成物は、クロロホルム／酢酸エチル（１：１）を溶離液として用いるカラムクロマトグラフィーによって精製した。メタノールを用いた再結晶によってさらに精製することで白色固体を得た。

収量０．６４ｇ（５８％）；融点１２０℃；ＩＲ（ＫＢｒ）：３，２６４、１，７５４、１，６６３ｃｍ^−１；^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：ｄ８．３５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、８．１５（ｓ、１Ｈ）、７．９６（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．８６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．６９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．３５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．１２（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．０５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、６．８４（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、６．８０（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、４．６８（ｓ、２Ｈ）、４．１６（ｓ、４Ｈ）、４．０９（ｓ、２Ｈ）、３．７７（ｓ、３Ｈ）、３．６９（ｓ、６Ｈ）、３．２２（ｓ、３Ｈ）、２．６８（ｓ、３Ｈ）；Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ_３０Ｈ_３３Ｎ_３Ｏ_９：Ｃ、６２．１７；Ｈ、５．７４；Ｎ、７．２５．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、６２．２２；Ｈ、５．７６；Ｎ、７．１６。

これによって得られたエステル（０．５ｇ、０．８６ｍｍｏｌ）を前記製造例１．３に記載されたような方法によって加水分解した。前記加水分解の結果物である沈澱を収集し、蒸溜水で洗浄した後、メタノール−ＣＨＣｌ_３−石油エーテルからの結晶化によって精製した。

収量０．３２ｇ（６９％）；融点１４８℃；ＩＲ（ＫＢｒ）：３，２７１、２，９０５、１，７４７、１，６６３ｃｍ^−１；^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ）：ｄ、８．３８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．８４（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．８３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．６３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．２２（ｓ、１Ｈ）、７．１８（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．０３（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、６．９７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、６．８５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．０Ｈｚ）、４．６１（ｓ、２Ｈ）、４．２２（ｓ、２Ｈ）、４．０６（ｓ、４Ｈ）、３．２０（ｓ、３Ｈ）、２．６２（ｓ、３Ｈ）；^１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤ_３ＯＤ）：ｄ＝１９９．２、１７４．３、１７１．１、１６９．７、１５０．２、１４９．９、１３８．０、１３５．９、１３３．３、１３０．９、１３０．８、１３０．７、１２６．３、１２５．８、１２４．０、１２０．０、１１６．２、１１３．８、１０７．１、１０５．８、６５．３、５６．４、５４．３、３９．１、２５．２ ｐｐｍ；Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ_２７Ｈ_２７Ｎ_３Ｏ_９：Ｃ、６０．３３；Ｈ、５．０６；Ｎ、７．８２．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、６０．３１；Ｈ、５．１２；Ｎ、７．７８。

［製造例１．５］本発明による二光子励起蛍光プローブ（化学式１２）の製造

前記製造例１．４で製造された化学式１１で表わされる化合物（０．１５ｇ、０．２８ｍｍｏｌ）、ブロモメチルアセテート（０．３４ｇ、２．２ｍｍｏｌ）及びＥｔ_３Ｎ（０．２２ｇ、１．７ｍｍｏｌ）の混合物をＣＨＣｌ_３（５ｍｌ）に入れてＮ_２下で１５時間撹拌した。真空中で溶液を除去し、粗生成物を酢酸エチル／ヘキサン（３：１）を溶離液として用いるカラムクロマトグラフィーによって精製した。引き続き、メタノールを用いた再結晶によってさらに精製することで白色固体を得た。

収量０．１２ｇ（５８％）；融点１０４℃；ＩＲ（ＫＢｒ）：３，２５７、１，７５４、１，７０８、１，６６３ｃｍ^−１；^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：ｄ８．３５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、８．１８（ｓ、１Ｈ）、７．９７（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．８７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．７０（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、７．３４（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．１５（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、７．０５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝２Ｈｚ）、６．８９（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝９、Ｊ＝２Ｈｚ）、６．８４（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ）、５．８０（ｓ、２Ｈ）、５．７５（ｓ、４Ｈ）、４．７１（ｓ、２Ｈ）、４．１８（ｓ、４Ｈ）、４．０９（ｓ、２Ｈ）、３．２３（ｓ、３Ｈ）、２．６６（ｓ、３Ｈ）、２．０９（ｓ、６Ｈ）、２．０７（ｓ、３Ｈ）；^１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３）：ｄ＝１９７．９、１７０．１、１６９．７、１６９．７、１６８．０、１６７．７、１５０．１、１４９．２、１３７．３、１３５．９、１３３．０、１３２．４、１３１．６、１３０．３、１２７．０、１２６．７、１２５．３、１２１．０、１１６．７、１１４．１、１０７．８、１０７．７、７９．５、７７．４、６５．９、５９．６、５３．７、４０．４、２６．７、２０．９、２０．８ｐｐｍ；Ａｎａｌ．Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ Ｃ_３６Ｈ_３９Ｎ_３Ｏ_１５：Ｃ、５７．３７；Ｈ、５．２２；Ｎ、５．５８．Ｆｏｕｎｄ：Ｃ、５７．３２；Ｈ、５．３１；Ｎ、５．５２。

[実施例１]吸光スペクトル測定
上述したように製造された化学式１３で表わされる化合物に対する吸光スペクトルをＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ８４５３ダイオード整列スペクトロメーター上で測定し、蛍光スペクトルを、１ｃｍ標準石英セルを備えたＡｍｉｃｏ−Ｂｏｗｍａｎ ｓｅｒｉｅｓ２発光スペクトロメーターを用いて測定した。蛍光量子収率は、公知の方法（例えば、非特許文献１２参照）によって、Ｃｏｕｍａｒｉｎ３０７を用いて測定した。

図１は、化学式１３で表わされる化合物の一光子吸収及び発光スペクトルである。多様な溶媒中における化学式１３で表わされる化合物の最大発光波長（λ_ｍａｘ ^(１)）及び最大蛍光波長（λ_ｍａｘ ^ｆｌ）を表１に示す。

図１（ａ）、（ｂ）及び表１から分かるように、溶媒極性が増加するにつれて大きな深色移動が観察されるという点は、本発明による化合物が極性プローブとして非常に有用であるということを示唆する。

［実施例２］Ｍｇ^２＋濃度変化による吸光度変化測定
図２（ａ）及び図２（ｂ）は、化学式７で表わされる化合物のＭｇ^２＋濃度変化に対するスペクトル反応を示すグラフである。図２（ａ）から分かるように、Ｔｒｉｓバッファ溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．０５）中の化学式７で表わされる化合物にＭｇ^２＋を添加した時、吸収スペクトルには軽微な変化が観察された。これとは対照的に、Ｍｇ^２＋濃度が増加するにつれて蛍光度は急激に増加した（図２（ｂ））。これはおそらく、金属イオン複合体による光誘起電子移動（ＰＥＴ）過程が遮断されるためである。１００ｍＭ Ｍｇ^２＋の存在下で、蛍光度向上因子は、１７個観測された。

一方、ほぼ同一の結果が二光子過程に対しても観察された。図２（ｃ）は、多様な濃度のＭｇＣｌ_２（０〜１００ｍＭ）存在下での二光子蛍光スペクトルである。さらに、図３（ａ）乃至図３（ｃ）には、Ｃａ^２＋（０−１０００μＭ）存在下での化学式７で表わされる化合物に対する一光子吸収スペクトル（図３（ａ））、発光スペクトル（図３（ｂ））及び二光子蛍光スペクトル（図３（ｃ））をそれぞれ図示した。

［実施例３］ベネシ−ヒルデブランドプロット（Benesi‐Hildebrand Plot）
化学式７で表わされる化合物のＭｇ^２＋及びＣａ^２＋に対する複合体形態は、ベネシ−ヒルデブランドプロット分析法（非特許文献１４参照）によって決定した。蛍光変化は、化学式７で表わされる化合物（Ｌ）と金属イオン（Ｍ）との間の１：１複合体形成によってのみ誘導されるという前提下で、総プローブ濃度及び蛍光強度は、［Ｌ］_０＝［Ｌ］＋［ＬＭ］及びＦ＝φ_Ｌ［Ｌ］＋φ_ＭＬ［ＭＬ］と定義される。ここで、［Ｌ］_０及び［Ｍ］_０はそれぞれ総濃度であり、［Ｌ］及び［ＬＭ］はそれぞれＬ及びＭの平衡濃度であり、φ_Ｌ及びφ_ＭＬは遊離形態（free forms）及び複合形態の化学式７で表わされる化合物に対する蛍光量子収率である。もし、［Ｍ］_０が［Ｌ］_０より格段に大きい値を有すれば、ベネシ−ヒルデブランド式は、下記数式２で表わすことができる。

化学式７で表わされる化合物と金属イオンとの間で、１：１の金属とプローブとの複合体が形成されるならば、数式２によるデータのベネシ−ヒルデブランドプロットは線形となる（非特許文献１５参照）。図４（ａ）及び図４（ｂ）は、それぞれ化学式７で表わされる化合物のＭｇ^２＋及びＣａ^２＋に対する結合において、１／（Ｆ−Ｆ_ｍｉｎ）ｖｓ１／［Ｍｇ^２＋］のプロットである。前記プロットが線形であることから、１：１複合体が形成されるということが分かる。

［実施例４］解離定数の決定
ｐＨ７．０５である２４℃、１００ｍＭ ＫＣｌ及び２０ｍＭ ＮａＣｌの溶液中のＭｇ^２＋−ＥＧＴＡに対する解離定数（Ｋ_ｄ）を、ＷｉｎＭＡＸＣ（C. Patton, Stanford University, Palo Alto, CA）プログラムを用いて計算し、計算値は略２８ｍＭであった。前記溶液中の遊離［Ｍｇ^２＋］水準は、Ｋ_ｄ＝２８ｍＭであるＭｇ^２＋−ＥＧＴＡ緩衝溶液によって調節した（非特許文献１６参照）。

Ｍｇ^２＋−化学式７で表わされる化合物複合体に対するＫ_ｄを決定するために、２４℃でＨＣｌを用いてｐＨを７．０５に調整した、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＮａＣｌ及び１ｍＭ ＥＧＴＡからなる溶液３．０ｍＬ中に、化学式７で表わされる化合物２μＭを添加した後、蛍光スペクトルを記録した。引き続き、前記溶液１．５μｌを廃棄し、化学式７で表わされる化合物２μＭ、１０３．６ｍＭのＭｇＣｌ_２、４．６ｍＭのＥＧＴＡ及び１０ｍＭのＴｒｉｓを含み、ｐＨが７．０５である溶液１．５μｌと置き換えた後、スペクトルを記録した。

前者の溶液は１ｍＭの遊離ＥＧＴＡを含むが、後者の溶液は１００ｍＭの遊離Ｍｇ^２＋を含むため、９９．９５：０．０５（ｖ／ｖ）の混合により、０．０５ｍＭ遊離Ｍｇ^２＋の溶液となった。

さらに、０．０５ｍＭ遊離Ｍｇ^２＋となった溶液に対して、同様に１．５μｌ、３．０μｌ、６．０μｌ、６．０μｌ、６．０μｌ、６．５μｌ、１５μｌ、１５μｌ、６１μｌ、６３μｌ、１２８μｌ、３６５μｌ、４２０μｌ及び９７０μｌの順に該溶液を廃棄し、該廃棄と同量の高Ｍｇ^２＋濃度溶液と置き換えることによって、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．４ｍＭ、０．６ｍＭ、０．８ｍＭ、１．０ｍＭ、１．５ｍＭ、２．０ｍＭ、４．０ｍＭ、６．０ｍＭ、１０ｍＭ、２１ｍＭ、３２ｍＭ及び５４ｍＭの遊離Ｍｇ^２＋の溶液を得た。

１００ｍＭ ＫＣｌ及び３０ｍＭ ＭＯＰＳ中のｐＨ７．２でのＣａ^２＋−ＥＧＴＡに対する解離定数（Ｋ_ｄ）は、前述したように計算し、その値は略１４４ｎＭであった。多様な［Ｃａ^２＋］を含む一連の補正溶液（calibration solutions）は、２種類の溶液（１０ｍＭ Ｋ_２ＥＧＴＡを含む溶液Ａ及び１０ｍＭ ＣａＥＧＴＡを含む溶液Ｂ）を多様な比率で混合することで得た。但し、５０〜１０００ｍＭ濃度はＣａＣｌ_２を添加することで得た（非特許文献１７、非特許文献１８、非特許文献１９、非特許文献２０参照）。２種類の溶液は共に１００ｍＭ ＫＣｌ及び３０ｍＭ ＭＯＰＳを含み、ｐＨ７．２となるように調整された。

化学式７で表わされる化合物とＭｇ^２＋との間に１：１金属−リガンド複合体が形成される場合、その平衡状態は下記数式３で表される。

ここでＬ及びＭは、それぞれ化学式７で表わされる化合物及びＭｇ^２＋である。

総プローブ及び金属イオン濃度は、それぞれ［Ｌ］_０＝［Ｌ］＋［ＬＭ］及び［Ｍ］_０＝［Ｍ］＋［ＬＭ］と定義され、［Ｌ］_０及び［Ｍ］_０の値が与えられる場合にＫ_ｄは、下記数式４または数式５で表わされる。

ここで、Ｆは、測定された蛍光強度であり、Ｆ_ｍｉｎは、最小蛍光強度であり、Ｆ_ｍａｘは、最大蛍光強度である。数式５による適正曲線（図５（ａ））に最もよく符合されるＫ_ｄ数値を商用のエクセルプログラムによって計算した（非特許文献２１、非特許文献２２参照）。

また、二光子過程に対するＫ_ｄ数値を決定するために、７８０ｎｍの波長及び１２３０ｍＷの出力に設定し（焦点平面からおおよそ１０ｍＷに該当）、モードロックされたチタン−サファイアレーザー光源（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ、９０ＭＨｚ、２００ｆｓ）によって励起されるＤＭ ＩＲＥ２ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｌｅｉｃａ）を用いてＴＰＥＦスペクトルを得た。ＴＰＥＦ適正曲線（図５（ｂ））を得て、これを数式５に近似した。

前述した過程によってＭｇ^２＋及びＣａ^２＋に対する一光子過程における解離定数を測定した結果、それぞれ１．４±０．１ｍＭ及び９．０±０．３ｍＭである。これはＭｇ^２＋及びＣａ^２＋に対する二光子過程における解離定数である１．６±０．１ｍＭ及び１１±１ｍＭと非常に類似した数値であった。この結果は、一光子過程及び二光子過程の両過程において、結合が進行する類似したメカニズムが作動するということを意味する。

［実施例５］金属陽イオンに対する選択性測定
図６（ａ）は、化学式７で表わされる化合物の他の金属陽イオンに対する選択性を表わす図である。化学式７で表わされる化合物は、Ｍｇ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｚｎ^２＋及びＭｎ^２＋に対しては中〜強反応を示すが、Ｆｅ^２＋、Ｃｕ^２＋及びＣｏ^２＋に対しては遥かに弱い反応を示す。化学式７で表わされる化合物の金属イオン選択性は、既存のＭｇＧ及びＭａｇ−Ｆｕｒａ−２（非特許文献２３参照）に対して報告されたものと類似したものである。

一方、遊離Ｍｇ^２＋の細胞内濃度（０．１〜６．０ｍＭ）は、Ｃａ^２＋の細胞内濃度（１０ｎＭ〜１μＭ）より遥かに高く、キレート化可能なＺｎ^２＋は、特定領域を除いて存在しないために、前記化学式７で表わされる化合物は、Ｃａ^２＋及びＺｎ^２＋による干渉なしにＭｇ^２＋を検出することができる。さらに、図６（ｂ）で示すように、化学式７で表わされる化合物及び化学式７で表わされる化合物−Ｍｇ^２＋は、生物学的に関連性あるｐＨ範囲内でｐＨ変化に敏感ではないという特性を有する。

［実施例６］常用プローブとの二光子スペクトル特性比較
緩衝溶液中の化学式７で表わされる化合物、ＭｇＧ及びＭａｇ−ｆｕｒａ−２と、Ｍｇ^２＋との複合体に対する二光子スペクトル特性を図７に比較して図示し、下記表２には各プローブに対する鉱物理学的特性を列挙した。

１）すべてのデータは、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝溶液中から（１００ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、ｐＨ７．０５）、５０ｍＭのＭｇＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ存在下及び不存在下で測定された。

２）一光子吸収及び発光スペクトルのλ_ｍａｘ
３）二光子励起スペクトルのλ_ｍａｘ
４）蛍光量子収率、±１０％
５）１０^−５０ｃｍ^４ｓ／光子（ＧＭ）中のピーク二光子断面、±１５％
６）二光子活動断面
７）不検出。二光子励起蛍光強度が余りにも微弱であり断面を正確に測定できない。

８）ＤＭＦ中において、φ＝０．３２±０．０２
９）非特許文献２４参照
図７及び表２の結果から、従来の通常的なプローブよりも、本発明による化合物を用いる場合に、さらに明るいＴＰＭイメージが得られることが分かる。

［実施例７］本発明による二光子励起蛍光プローブを用いた細胞観察
Ｈｅｐ３Ｂ細胞をペニシリン／ストレプトマイシン及び１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）中で培養した。前記培養は、３７℃ ＣＯ_２インキュベータ中で行った。Ｈｅｐ３Ｂ細胞は、無血清培地で３回洗浄され、その後、化学式１３で表わされる化合物−Ｍｇ^２＋複合体２μＭと共に、３７℃で３０分間、無血清培地中で培養された。前記Ｈｅｐ３Ｂ細胞を無血清培地で３回洗浄し、無血清培地中で１５分間さらに培養した後、観察した。

化学式１３で表わされる化合物で標識されたＨｅｐ３Ｂ細胞の二光子蛍光顕微鏡イメージは、×１００オイル物体、穿孔数（ＮＡ）＝１．３０を有するスペクトル共焦点及び多光子顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ２）を用いて得た。二光子蛍光顕微鏡イメージは、モードロックされたチタン−サファイアレーザー光源（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ、９０ＭＨｚ、２００ｆｓ）として波長７８０ｎｍでプローブを励起させることで得た。３６０〜６２０ｎｍ、３６０〜４６０ｎｍ及び５００〜６２０ｎｍの範囲の波長でイメージを得るために、信号を４００Ｈｚスキャン速度で９ビット、５１２×５１２ピクセルとして収集するために内部ＰＭＴが用いられた。

図８（ａ）乃至図８（ｃ）は、化学式１３で表わされる化合物で標識されたＨｅｐ３Ｂ細胞のＴＰＭイメージである。Ｔｒｉｓ緩衝溶液中の化学式７で表わされる化合物−Ｍｇ^２＋の蛍光量子収率（φ＝０．５８）及びＤＭＦ中の化学式１３で表わされる化合物の蛍光量子収率（φ＝０．３２）は、Ｔｒｉｓ緩衝溶液中の化学式７で表わされる化合物の蛍光量子収率（φ＝０．０４）及び化学式１３で表わされる化合物の蛍光量子収率（φ＝０．０７）より遥かに大きいために（表２）、細胞から発光されたＴＰＥＦは、大部分が細胞内の化学式７で表わされる化合物−Ｍｇ^２＋複合体または細胞膜結合プローブに起因したものである。ＤＭＦ中の化学式１３で表わされる化合物は、後者に対する立派なモデルであり、これはλ_ｍａｘ ^ｆｌ数値が類似しているためである（図８（ｄ）参照）。このような説明に対する追加的な証拠は、２ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸存在下の１０μＭカルシマイシン処理以後に化学式１３で表わされる化合物−Ｈｅｐ３Ｂ細胞から放出される無視できるほどのＴＰＥＦによって示され、前記ＴＰＥＦは、１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２存在下の１０μＭカルシマイシン処理によって増加する。さらに、３６０〜６２０ｎｍの範囲の波長で収集されたイメージは、集中地点（intense spot）及び明るい部位を表わし、このとき、ＴＰＥＦ最大値は、λ＝４４０ｎｍ（符号２１で示す線）及び４９８ｎｍ（符号２２で示す線）で表われる（図８（ｄ））。

表２から分かるように、Ｔｒｉｓ緩衝溶液中で測定された発光スペクトルと比べると、青色バンドは顕著に青色−移動されたが、赤色バンドはほぼ同一であった。２種類のスペクトルは、それぞれ、４３９ｎｍ（図８（ｄ）の符号２３で示す線）及び４８８ｎｍ（図８（ｄ）の符号２４で示す線）、４２６ｎｍ（図８（ｄ）の符号２５で示す線）及び４９８ｎｍ（図８（ｄ）の符号２６で示す線）で最大値を有する２種類のガウス関数（Gaussian functions）で近似することができる。分離されたスペクトルのピーク位置は類似しており、これはプローブが異なる極性を有して２種類の領域に存在することができるということを意味する。さらに、集中地点は、励起状態の寿命が３．３ｎｓであり、これは２．２ｎｓに集中された寿命分布曲線の最上端より遥かに長いものである。このような結果から、本発明によるプローブは２種類の相異なる環境中に存在し、このうちさらに極性が強いものは細胞内に（短寿命を有する赤色発光）、極性が弱いものは細胞膜に結合されて（長寿命を有する青色発光）存在することが推測できる。

本発明による二光子励起蛍光プローブを用いる場合、細胞膜結合プローブから起因する誤差は、細胞内の化学式７で表わされる化合物−Ｍｇ^２＋複合体からのＴＰＥＦを測定することにより最小化することができる。図８（ｄ）に示すように、分離されたガウス関数中で短波長バンド（符号２３で示す線）は、λが５００ｎｍで基線にまで減少する。従って、細胞膜結合プローブから発光されたＴＰＥＦはλ＞５００ｎｍでは無視できるほどである。一方、ＤＭＦ中の化学式１３で表わされる化合物をモデルとして用いる場合には、５００ｎｍを超える発光バンドの尾部分は誤差を誘発することもあるが、λ＞５００ｎｍでの尾部分領域は、全体発光バンドの約５％であるため、重要な考慮事項にならない。結果的に、５００〜６２０ｎｍで収集されたＴＰＥＦイメージは、均等に分布する一方、短波長である３６０〜４６０ｎｍを用いて収集されたＴＰＥＦイメージは集中地点を見せる。従って、５００〜６２０ｎｍ範囲の波長を用いる場合には、細胞膜結合プローブによる寄与度を最小化しながらＭｇ^２＋イオンを測定することができる。

［実施例８］細胞内遊離Ｍｇ^２＋イオン濃度の測定
休止状態の細胞内遊離Ｍｇ^２＋イオン濃度を下記数式１によって測定した。

［Ｍｇ^２＋］＝Ｋ_ｄ［（Ｆ−Ｆ_ｍｉｎ）／（Ｆ_ｍａｘ−Ｆ）］ ・・・（数式１）
ここで、Ｋｄは、本発明による二光子励起蛍光プローブとマグネシウムイオンとの解離定数であり、Ｆは、測定された二光子蛍光強度であり、Ｆ_ｍｉｎ及びＦ_ｍａｘは、それぞれ最小蛍光強度及び最大蛍光強度である。

最小蛍光強度（Ｆ_ｍｉｎ）の測定は、２ｍＭのＥＤＴＡ存在下で１０μＭカルシマイシンを用いて細胞内Ｍｇ^２＋を枯渇させることで決定し、最大蛍光強度（Ｆ_ｍａｘ）は、１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２存在下で１０μＭカルシマイシンを用いて測定した（非特許文献２５、非特許文献２６参照）。

図９（ａ）乃至図９（ｃ）は、それぞれ、化学式１３で表わされる化合物（２μＭ）で標識されたＨｅｐ３Ｂ細胞の二光子蛍光イメージ（Ｆの測定、図９（ａ））、２ｍＭのＥＤＴＡ存在下で１０μＭカルシマイシンを処理した後、化学式１３で表わされる化合物（２μＭ）に標識されたＨｅｐ３Ｂ細胞の二光子蛍光イメージ（Ｆ_ｍｉｎの測定、図９（ｂ））、及び１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２存在下で１０μＭカルシマイシンを処理した後、化学式１３で表わされる化合物（２μＭ）に標識されたＨｅｐ３Ｂ細胞の二光子蛍光イメージ（Ｆ_ｍａｘの測定、図９（ｃ）である。

休止状態のＨｅｐ３Ｂ細胞において、測定された細胞内ガラスＭｇ^２＋イオンの濃度は、０．６５±０．１０ｍＭであり、このような数値は、既存文献に報告されたものとよく一致する値である（例えば、非特許文献２７、非特許文献２８参照）。

近年開発されたプローブである２，３−ジシアノヒドロキノン（ＤＣＨＱ）を用いてＴＰＭによって細胞内マグネシウムイオンを定性的に分析した結果は報告されている（非特許文献２９参照）。しかしながら、ＴＰＭによる細胞内遊離Ｍｇ^２＋の定量的な測定は、本発明が最初の例である。

［実施例９］マウス海馬スライスのイメージ化
本発明による二光子励起蛍光プローブが組職の深層観察に有用であるという点を立証するために、生後３日のマウスから得た海馬スライスを３７℃で３０分間５μＭの化学式１３で表わされる化合物と共に培養した。図１０（ａ）は、新生児マウスの海馬スライスの明背景イメージ（brightfield image）であり、歯状回同様に、ＣＡ１及びＣＡ３領域の拡大図である（１０倍）。図１０（ｂ）は、同一の倍率のＴＰＭイメージであり、１００〜３００μｍの深さで、同一領域にＭｇ^２＋が分布することが分かる。一方、前記ＣＡ３領域の場合、Ｚｎ^２＋が発光に寄与した可能性を排除することはできないが、同一の領域をさらに高い倍率で観察した図１０（ｃ）及び図１０（ｄ）を参照すれば、ＣＡ１領域の錐体ニューロン層でＭｇ^２＋分布が観察され、このような領域には、Ｚｎ^２＋がほとんど存在しないという点を勘案すれば、本発明による二光子励起蛍光プローブがＭｇ^２＋に対して高い選択性を有するということが分かる。さらに、図１０（ｄ）を参照すれば、本発明による二光子励起蛍光プローブは、深層組職内部の核に存在するＭｇ^２＋までも探知することができるという点が分かる。

本発明による二光子励起蛍光プローブは、上述した装置によると、細胞内マグネシウムイオンのリアルタイムイメージングに非常に適する。これはＭｇ^２＋に対する二光子励起蛍光（ＴＰＥＦ）において、１７倍以上の向上効果を示し、これは従来の通常的なプローブに比べて７倍以上の高い数値である。従って、細胞を染色する染料の量を顕著に減らすことができる。また、染料の分子量が小さくて細胞内への染色性に非常に優れ、深層組職内部に存在するＭｇ^２＋のモニタリングにも非常に適し、細胞内Ｍｇ^２＋を定性的だけでなく、定量的にも測定できるという効果がある。

本発明による二光子励起蛍光プローブに対する一光子吸収スペクトル（ａ）及び発光スペクトル（ｂ）を測定した結果を示すグラフ。 本発明による二光子励起蛍光プローブのＭｇ^２＋濃度変化に対する一光子吸収スペクトル（ａ）、発光スペクトル（ｂ）及び二光子蛍光スペクトル（ｃ）のグラフ。 本発明による二光子励起蛍光プローブのＣａ^２＋濃度変化に対する一光子吸収スペクトル（ａ）、発光スペクトル（ｂ）及び二光子蛍光スペクトル（ｃ）を示すグラフ。 それぞれ本発明による二光子励起蛍光プローブのＭｇ^２＋（ａ）及びＣａ^２＋（ｂ）に対する結合において、１／（Ｆ−Ｆ_ｍａｘ）ｖｓ１／［Ｍｇ^２＋］のプロットを示すグラフ。 本発明による細胞内マグネシウムのリアルタイムモニタリング方法において、数式５による適正曲線を示すグラフ（ａ）及び二光子励起蛍光適正曲線（ｂ）を示すグラフ。 本発明による二光子励起蛍光プローブのＭｇ^２＋以外の他の金属陽イオンに対する選択性（ａ）、及びｐＨ変化による蛍光強度（ｂ）を示すグラフ。 本発明による二光子励起蛍光プローブとＭｇ^２＋との複合体及び従来技術によるプローブとＭｇ^２＋との複合体に対する二光子スペクトル特性を比較図示した図面。 Ｈｅｐ３Ｂ細胞を本発明による二光子励起蛍光プローブに標識した後、３６０〜６２０ｎｍ（ａ）、３６０〜４６０ｎｍ（ｂ）及び５００〜６２０ｎｍ（ｃ）の波長を用いて得た二光子顕微鏡写真。 それぞれ本発明による二光子励起蛍光プローブに標識されたＨｅｐ３Ｂ細胞の二光子蛍光イメージ（ａ）、２ｍＭのＥＤＴＡ存在下で１０μＭカルシマイシンを処理した後、本発明による二光子励起蛍光プローブに標識されたＨｅｐ３Ｂ細胞の二光子蛍光イメージ（ｂ）及び１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２存在下で１０μＭカルシマイシンを処理した後、本発明による二光子励起蛍光プローブに標識されたＨｅｐ３Ｂ細胞の二光子蛍光イメージ（ｃ）。 新生児マウスの海馬スライスを本発明による二光子励起蛍光プローブで染色した後観察した１０倍倍率の明背景イメージ（ａ）、１０倍倍率の二光子顕微鏡観察写真（ｂ）、４０倍倍率の二光子顕微鏡観察写真（ｃ）及び１００倍倍率の二光子顕微鏡観察写真（ｄ）。

Claims (7)

1. 化学式１で表わされる化合物からなる細胞内マグネシウムイオンのリアルタイムモニタリング用二光子励起蛍光プローブの製造方法であって、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド・ＨＣｌと、４−ジメチルアミノピリジンと、化学式２で表わされる化合物と、化学式３で表わされる化合物とを反応させる段階を含むことを特徴とする二光子励起蛍光プローブの製造方法。
   ・・・（１）
   （式中、Ｒは、ＨまたはＣＨ_２ＯＣＯＣＨ_３である。）
   ・・・（２）
   ・・・（３）
2. 前記化学式２で表わされる化合物は、メチルブロモアセテートと、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ＮａＩと、化学式４で表わされる化合物とを反応させて製造されるものであることを特徴とする請求項１記載の二光子励起蛍光プローブの製造方法。
   
   ・・・（４）
3. 前記化学式４で表わされる化合物は、ＣＨ_３ＮＨ_２・ＨＣｌ、Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_３、ＮａＯＨ、Ｈ_２Ｏ及び化学式５で表わされる化合物を反応させて製造されるものであることを特徴とする請求項２記載の二光子励起蛍光プローブの製造方法。
   
   ・・・（５）
4. 前記化学式５で表わされる化合物は、化学式６で表わされる化合物と共にＨＢｒを反応させて製造されるものであることを特徴とする請求項３記載の二光子励起蛍光プローブの製造方法。
   
   ・・・（６）
5. 請求項１の製造方法により製造した二光子励起蛍光プローブを観察対象となる細胞内に注入し、該二光子励起蛍光プローブから放出される二光子励起蛍光をイメージ化する段階を含むことを特徴とする細胞内マグネシウムのリアルタイムモニタリング方法。
6. 前記二光子励起蛍光プローブは、波長が５００〜６２０ｎｍの範囲で励起されることを特徴とする請求項５記載の細胞内マグネシウムのリアルタイムモニタリング方法。
7. 数式１を用いて前記細胞内マグネシウムイオンの濃度を定量的に測定することを特徴とする請求項５に記載の細胞内マグネシウムのリアルタイムモニタリング方法。
   ［Ｍｇ^２＋］＝Ｋ_ｄ［（Ｆ−Ｆ_ｍｉｎ）／（Ｆ_ｍａｘ−Ｆ）］ ・・・（数式１）
   （式中、Ｋ_ｄは、前記二光子励起蛍光プローブとマグネシウムイオンとの解離定数、Ｆは、測定された二光子蛍光強度、Ｆ_ｍｉｎ及びＦ_ｍａｘは、それぞれ最小蛍光強度及び最大蛍光強度である。）