JP4653090B2 - Fshグリコシル化突然変異 - Google Patents
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Description
本発明は、濾胞刺激ホルモン活性を示すポリペプチドに、かかるポリペプチドを調製するための方法に、そしてかかるポリペプチドを治療、特に繁殖障害の治療において使用することに関連する。
a.ゴナドトロピン
濾胞刺激ホルモン(FSH)は、ヒトの生殖においてキーとなる役割を果たすゴナドトロピンのファミリーの構成員である。ゴナドトロピン、そしてまた黄体形成ホルモン(LH)及び絨毛性ゴナドトロピン(CG)などは、ヘテロダイマーであり、各々共通するα-サブユニット(92アミノ酸)及び独特のβ-サブユニット(FSH中111アミノ酸)からなる。α及びβサブユニットの成熟形態のアミノ酸配列は、配列番号.1及び配列番号.2にそれぞれ示されている。
ゴナドトロピンは、生殖サイクルにおける重要な役割を果たし、そしてそれらの外来療法における使用は介助保護技術(ART)の、例えば、in vitro生殖(IVF)、細胞質内精子注入(IVF/ICSI)及び胚移植(ET)、並びに排卵誘発(OI)との関係において、天然に又は子宮膣内受精(IUI)のいずれかを介するin vivo生殖を受ける無排卵患者において重要である。
ゴナドトロピンは、糖タンパク質であり、そして各サブユニットは、in vivo活性及び機能のために重要であるアスパラギン結合した(N-結合した)オリゴ糖側鎖を有する。ポリペプチドに対する炭水化物の添加(グリコシル化)は、翻訳後事象であり、それは特異的アスパラギン(N結合)又はセリン/スレオニン(O結合)アミノ酸に対して糖鎖の添加をもたらす。糖タンパク質のタンパク質部分の不変アミノ酸配列とは対照的に、炭水化物構造は、可変であり、微小不均一性に言及される特徴である。例えば、同じタンパク質のN-グリコシル化部位は、様々な炭水化物構造を含みうる。更に、ある糖タンパク質上の同じグリコシル化部位においてさえ、様々な炭水化物構造が発見されうる。この不均一性は、炭水化物の非テンプレート特異的合成の結果である。
半減期の増加したFSHアゴニストは、hCG(CTP)のカルボキシ末端ペプチドを天然組換えヒトFSH(rhFSH)へ融合することによって開発されてきた。CTP成分は112-118〜145アミノ酸からなり、位置121、127、132及び138に4つのO-結合グリコシル化部位を伴う。US5,338,835及びUS5,585,345は、hCGのCTP成分を伴うC末端Gluにおいて広がる修飾FSH /3-サブユニットを開示する。生じる修飾類似体は、天然FSHの生物活性のみならず、長期循環半減期を有すると述べられている。US5,405,945は、hCGp-サブユニット又はその変異体のカルボキシ末端は、CG、FSH、及びLHを一掃することに対する有意な効果を有する。
本発明は、突然変異FSHに関連し、ここで当該FSHα-サブユニットは、配列番号3の配列を含んで成り、そしてここで当該FSHβ-サブユニットは、配列番号4の配列を含んで成る。突然変異FSHは、当該突然変異FSHの0、1、2、3、4、5又は6つのアスパラギン残基においてNグリコシル化されていて良い。突然変異α-サブユニットのN83は、グリコシル化されて良い。突然変異β-サブユニットのN55は、グリコシル化されていて良い。
FSHの炭水化物含量を増加させることは、in-vivo半減期の増加をもたらすことが示されている一方で、FSHの半減期を向上させることは、単に更なるグリコシル化部位を加えることよりも一層複雑である。グリコシル化コンセンサス配列は、炭水化物付加のために欠かせない一方で、炭水化物付加部位が確実に使用されるだろうために十分ではない。他の因子の例えば、生合成の間の局所タンパク質ホールティング及びコンホメーションは、オリゴ糖があるコンセンサス配列部位に結合したかどうかを決定する。加えて、コンセンサス配列は、所定の部位のグリコシル化がレセプター結合と干渉しない、又は糖タンパク質のホールディング、コンホメーション又は安定性を損わないような位置になければならない。
単一FSH 突然変異
候補グリコシル化部位の同定
ヒトFSHの3D結晶構造を、FSHのα-及びβ-サブユニットの候補グリコシル化部位を同定するために使用した。2つのFSH分子(4つのサブユニット)が、結晶構造の各不斉単位に存在する。2つのFSH分子を重ね合わせて比較し、そして各残基を潜在的N-グリコシル化部位を同定するために視覚的に調べる。FSHの結晶構造を、潜在的N-グリコシル化部位の選択を助けるためにFSH/FSHRレセプター相互作用の知見と組み合わせた。主たる設計基準は、3D構造の最小破壊、予測結合及び活性化部位の最小破壊、及びグリコシル化に適合する予測可能3D構造である。
α-サブユニット H83N
β-サブユニット E55N/V57T
各突然変異を、実施例3に記載の方法と類似する方法において部位特異的突然変異誘発によって獲得した。突然変異は、実施例4に記載の方法と類似する方法において相補的野生型サブユニットと一緒にCHO-Dukx細胞において小スケールで一過的に発現した。生ずる培養上清のELISA分析により20の突然変異のうち19か一過的に発現できたことが示された。コントロール及び突然変異の一過的発現量の範囲は、0〜1.95μg/ml、平均0.59及び中央値0.5μg/mlであり、そして、モックトランスフェクションにおいては0μg/mlが繰り返し確認された。
単一FSH突然変異の一過的発現に由来する濃縮培養上清のアリコートを、遊離α-サブユニット及びβ-サブユニットに由来する完全なFSHヘテロダイマーの分解を可能にする、非還元LDS PAGE条件の下で電気泳動により分析した。タンパク質を電気泳動的にPVDFに移しそしてFSHのα及びβサブユニットに対して特異的な一次抗体を使用することで分析した。多くの業者の一次抗体を予備スクリーニングで使用し且つその後、時折、確認検体として使用したが、最も均一に有用な抗体は、1.5μg/mlにおいてChromaprobe BHS 104 (ビオチン化ポリクローナルヤギ抗FSH α-サブユニット)及び1.5μg/mlにおいてChromaprobe BHS 105(マウスモノクローナル抗FSH β-サブユニット)であることが分かった。
一過的発現によって獲得した5つの高度グリコシル化された単一突然変異、例えば、β E55N/V57Tの薬物動態学を、Gonal-Fと比較した。Gonal-Fは、天然hFSHから識別可能であるFSHの組換え形態である。注射物質及び各PK実験のための注射の後に現時点で獲得したラット血清サンプルのFSH含量をELISAによって獲得した。5つの単一突然変異のβ-サブユニット突然変異E55N/V57TなどのどれもがコントロールGonal-Fよりも長い半減期を示さなかった。
E55N/V57T突然変異を含む、4つの高度グリコシル化された単一β-サブユニット突然変異のうち3つを、発現させて免疫親和性クロマトグラフィーによって精製した。活性この3つの高度グリコシル化されたβ-サブユニット突然変異、例えばE55N/V57T 突然変異を以下のものを観察することによって組換えFSHと確認した。(i)ヒトFSHレセプターを含む膜調製物に対して結合する125I放射性標識したFSHと競合する能力(Ki)及びFSHR-結合cAMP生産を刺激する能力(EC50)。
二重グリコシル化突然変異の生産及び分析
FSHの半減期を向上させるために、単一α-サブユニット及びβ-サブユニット単一突然変異を欠損させることにより、2つの単一α-サブユニット突然変異を、3つの単一β-サブユニットと一過的発現において組み合わせ、6つの異なる2重突然変異、例えば、α-サブユニット突然変異H83N及びβ-サブユニット突然変異E55N/V57Tを含んで成る、GM-1を生産した。
GM-1の生産
ヒトFSHのα-サブユニット及びβ-サブユニットのcDNAをpDONRベクター(Invitrogen)中にサブクローン化した。QuikChangeTM 部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene)を使用して、N-結合グリコシル化部位をFSHのα-サブユニット及びβ-サブユニットに導入した。QuikChangeTM システムは、所望の突然変異を含む2つの合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用する。オリゴヌクレオチドの以下のペアを使用し、N-結合グリコシル化部位を導入した。
突然変異FSHの発現
FSHのGM-1グリコシル化突然変異を、最初に、血清フリー培地においてゴナドトロピンの発現を一過的に達成するためpl3251(αH83N)とpl3251(βE551V57T)を共トランスフェクションすることによって獲得した(「GM-1ロット1」)。ラージスケールリポフェクトアミン介在トランスフェクション(12〜24 T175フラスコ)のために、CHO-Dukx細胞を1.3×107細胞/フラスコで増殖培地(MEM a(+)、10%FBS、1% 1-グルタミン)中、トランスフェクション前に18〜24時間に渡り播いた。細胞にトランスフェクションするために、リポフェクトアミン2000/オプチメン混合物をバルク(一部17.6)において調製し且つオプチメン中のDNAの個別のストックでも、式、各サブユニットにつき33mcgのDNA(合計66mcg)/T175フラスコを使用することでも調製した。オプチメン/DNA及びオプチメン/リポフェクトアミン調製物を組み合わせた20分後、オプチメン中のDNA/リポフェクトアミン複合体(約10ml/フラスコ)を、最近供給した(43.8ml/フラスコ)細胞単層に適用した。37℃で4〜6時間後、細胞単層を50mlの増殖培地へ供給した。トランスフェクションのおよそ24時間後、 細胞を生産培地(Sigma CHO PFM、L-グルタミンを補充した又はSerene-proprietary formulation Sigma CHO PFM C0234に対して補充した)に移した。条件生産培地を48時間後に収穫した。
突然変異FSHのクローン
プロトクローン
CHO-DUKX細胞の、Dα(プラスミド#13538)中αH83N及びpCIattR(プラスミド#13252)中βE55N/V57Tの比1:3によるリン酸カルシウム共トランスフェクションンを標準的な方法を使用することで行った。プロトクローンを、96ウェルプレート(合計1596個のウェル)において、細胞を選択培地(MEM α(-), 10% dFBS, 4 mM L-グルタミン)中、10,000個細胞/ウェルで播くことによって、トランスフェクションの48時間後に生じさせた。約2週後、プロトクローンを、0.02μMのMTXを含む選択培地へと1:8に分けた。この分割方法をMTX(0.1μM(192ウェル),0.5μM,1. 0μM(116ウェル))の濃縮を、1.0μMのMTX中で生存する116のプロトクローンにより6〜8週の期間に渡り進めることにより繰り返した。
限界希釈クローニングを、96ウェルプレートへのそれぞれ、0.25、0.5、1.0、及び2.0 GM-1-21 細胞/ウェルの接種により開始した。クローニング培地は、10%cFBS及び1%L-グルタミンをMTXの不在下で含むDMEM/F12であった。全てのウェルを顕微鏡により検査しそして多数の細胞を含む全てのウェルを取り除いた。
突然変異FSHの更なる例
実施例5に記載のプロトクローンGM1-21を、2つの850cm2ローラーボトル(「GM-1 Lot 2」)中で増殖させることによって生産した。このランで条件付けした血清フリー生産培地(DMEM-F12+IFCS) の体積は、2600mlであった。約0.2mgのGM-1を含む小体積13mlの濃縮培養上清をSRBIにおいて-80℃に保存したままにし、何故なら、濃縮培養上清の36mlアリコートを透析移動(dialysis transfer)の間に消失したからだ。定量化は、換算1IU=138ng FSHを使用することでDSL Active(登録商標)FSHELISAによる。
突然変異FSHの精製
サンプルの調製
突然変異FSHを含有する生産培地を収穫してそして0.22μmフィルターユニットを使用することでろ過して-70℃で凍結させた。培地中の標的タンパク質を4℃で一晩解凍し、そしてPall Life ScienceによるUltrasette Screen Channel TFF装置、10K Omega膜, P/N OSOI OC70を使用する限外ろ過によって濃縮した。リテンテートを回収して一晩、0.1Mトリス( pH 7.4、0.5MのNaClを含む、3×5 L)に対して透析した。透析したタンパク質を回収し、0.22μmフィルターに通し、そして 直ぐに精製するかあるいは精製するまで-70℃で保存した。
グリコシル化突然変異GM-1を2.2 mgの抗-FSH抗体/樹脂mlを含む抗FSH免疫親和性樹脂B5 (Serobio)によって精製した。10.2 mlの床体積(bed volume)を1.5cm×10cm OmniFitカラムにおいて調製した。樹脂を0.1Mトリス(pH 7.4、0.5MのNaClを含む)により予め平衡化した。透析された粗製のタンパク質を1ml/分でロードした。カラムを、続いて、5カラム体積の0.1Mトリス(pH7.4、0.5MのNaClを含む)、5カラム体積の100mMの炭酸アンモニウム, pH7.6で洗浄し、そして標的タンパク質を18〜20カラム体積の1M NH4OHで溶出させた。溶出したタンパク質を含む画分をプールし、氷酢酸で中和し、そしてAmicon YM10膜を使用するAmicon撹拌セルによる限外ろ過によって濃縮した。リテンテートをPierce Snakeskin透析チューブ,10K MWCOにおいて、4×5Lの水に対して24時間に渡り透析し。透析したタンパク質を回収してCentriprep YM 10によって濃縮し、体積を1mlに減らす。
このような単一段階免疫親和性法による精製タンパク質GM-1の見かけ上の回収率は、アミノ酸組成分析によって決定したタンパク質濃度を伴い73.8〜80.6%のへテロ二量体純度において、31.4〜52.9%であり、そして本来の式量は、サブユニットのMALDI-TOF 糖形態分布から35,000Daと見積もられた。
突然変異FSHの形態
精製タンパク質の糖形態分布を測定するために、MALDI-TOFマススペクトロメトリーをGM-1及びGonal-Fに行った。図4Aに示されたマススペクトル分析は、Gonal-Fに対して、GM-1における高度グリコシル化形態を含むマスクラスの相対的存在度の26%増加を示し、ここでそれらは、Gonal-Fにおける29.2%のサブユニット糖形態とは反対に36.8%の合計サブユニット糖形態を含む。Gonal-FとGM-1のMALDI-TOFマススペクトルの違いは、銀染色PAGE及びウェスタンブロッティング(図4B)によって確認されるサブユニット及びヘテロ二量体の見かけ分子量分布におけるシフトと一貫している。
突然変異FSHの分析
突然変異FSHのIn vitro結合の分析
GM-1ロット1及びGM-1ロット2の効率をFSHR cAMPアッセイにおいて特定した。FSHレセプター又はヒトLHレセプターを組換え発現するCHO細胞系統の多量のバッチを、0.025Mのトリス(pH 7.4、0.25Mのスクロース、10mMのMgCl2、1mMのEDTA及び1pptのSigma Protease Inhibitorカクテル(p8350)を含む)中で増殖させ且つ窒素キャビテーション(900 psiへの20分平衡、しかる後の迅速な圧力開放)によって中断した。一次清澄化(10分×1000g、4℃)後、膜画分を、遠心によってペレット化させた(60分×100,000g、4℃)。膜画分を結合バッファー(0.01MのトリスpH7.4、5mMのMgCl2)中で再懸濁させ、タンパク質濃度を、Bradford(BioRad)タンパク質アッセイによって見積もり、そして将来使用するために-80℃で保存した。典型的に、FSHR又はLHRを維持する適切に15μgの膜タンパク質を、ウェル当たり、競合アッセイにおいて分析した。
GM-1ロット1及びGM-1ロット2の機能を、上記cAMPゴナドトロピンレセプター-トランスフェクションCHO細胞におけるcAMPの投与量反応曲線を測定することによって測定した。2つの各ロットに関する放出定量化データを、下の表3に残した。
突然変異FSHの安定性
GM-1活性の安定性の3月安定性研究を、4℃で3月に渡りGM-1の滅菌アリコートを維持することによって行った。アリコート中のGM-1をサンプリングしてFSHR cAMPアッセイにおいて、0、7日、32日及び91日に試験した。この研究の条件下で、GM-1のEC50は、4℃で91日保存した間、変化は2倍未満であった。これらのデータは、4℃で保存したGM-1の生物活性は3月に渡り安定であることを示す。
突然変異FSHの活性
図5は、未成熟ラット2日排卵誘導モデルにおけるGM-1の性能を示す。単一投与として投与した、組換えhFSHは、GM-1が排卵反応を起こす一方で、そのように作用しなかった。更に、GM-1 標準Steel-man Pohley排卵重量増アッセイにおけるGM-1の性能は、Gonal-Fに匹敵した(データは示していない)。
Claims (13)
- 組換えFSHであって、組換えFSHαサブユニットが配列番号:3の配列を含んで成り、そしてFSHβサブユニットが配列番号:4の配列を含んで成る、組換えFSH。
- βサブユニットのN55がグリコシル化されている、請求項1に記載の組換えFSH。
- 配列番号:3の配列を含んで成るFSHαサブユニット、及び配列番号:4の配列を含んで成るFSHβサブユニットをコードするベクター。
- 前記ベクターが発現ベクターである、請求項3に記載のベクター。
- 請求項4に記載のベクターを含んで成る細胞。
- 配列番号:3の配列を含んで成るFSHαサブユニットをコードするDNAを含んで成る第一のベクター及び配列番号:4の配列を含んで成るFSHβサブユニットをコードするDNAを含んで成る第二のベクターを含んで成る細胞。
- 前記第一及び第二のベクターが発現ベクターである、請求項6に記載の細胞。
- 前記細胞が哺乳類細胞である、請求項7に記載の細胞。
- FSH突然変異を生産する方法であって:
(a)哺乳類細胞を提供し、ここで当該細胞は、第一の発現ベクター及び第二の発現ベクターを含んで成り;そして
(b)FSH突然変異の発現を誘導する、
ことを含んで成り、ここで当該第一の発現ベクターは、配列番号:3の配列を含んで成るFSHαサブユニットをコードし、そして当該第二の発現ベクターは、配列番号:4の配列を含んで成るFSHβサブユニットをコードし、そして前記細胞はタンパク質をグリコシル化することができる、前記方法。 - 請求項1に記載の組換えFSH及び医薬的に許容できる担体又は賦形剤を含んで成る組成物。
- 生殖力が無い動物の治療における使用のための、請求項10に記載の組成物。
- 哺乳動物の濾胞形成の刺激における使用のための、請求項10に記載の組成物。
- 哺乳動物の卵巣過剰刺激の誘導における使用のための、請求項10に記載の組成物。
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