JP4613320B2 - 結合特性に基づく分析物の特徴の決定 - Google Patents
結合特性に基づく分析物の特徴の決定 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4613320B2 JP4613320B2 JP2007500810A JP2007500810A JP4613320B2 JP 4613320 B2 JP4613320 B2 JP 4613320B2 JP 2007500810 A JP2007500810 A JP 2007500810A JP 2007500810 A JP2007500810 A JP 2007500810A JP 4613320 B2 JP4613320 B2 JP 4613320B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sample
- analyte
- fractions
- mixture
- analytes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Analysing Materials By The Use Of Radiation (AREA)
Description
本出願は、2004年3月1日に出願された米国仮出願第60/549,049号の利益を主張し、この出願は、あらゆる目的のために本明細書において参考として援用される。
本発明の実施形態は、質量分析および示差的な標識試薬を用いる、結合特性に基づく分析物の特徴の決定に関する。
(1.導入):
本発明の実施形態は、示差的な標識試薬としてアイソバリック(isobaric)標識試薬および/またはアイソメリック(isomeric)標識試薬を利用し得、それによって、標識された分析物、または分析物の標識されたフラグメントを生成する。一つ以上のサンプルまたはサンプルの画分は、目的の一つ以上の特徴に基づいて特定のサンプル成分を分離する目的のために、分離され得るか、または固定相(例えば、親和性支持体)へ適用され得る。この分離から得られる画分は、考慮の上で選択される様式において、あるセットのアイソバリック標識試薬および/またはアイソメリック標識試薬の異なる試薬を用いて標識され得、それによって、その後の分析のためにその画分の一部または全てをコード化(encode)し得る。標識化分析物またはその分析物の標識されたフラグメントを含む一つ以上のサンプルは、各々が個別に分析され得るか、または、いくつかの実施形態においては、二つ以上のサンプルが混合され得、多重様式において分析され得る。標識化分析物を含むサンプルまたは混合物は、必要に応じてさらに分離され得、次いで、質量分析によって分析され得る。分析物の娘フラグメントイオンは、サンプルの各々の分析物を同定するために用いられ得る。標識化分析物の標識の分析またはそのフラグメントイオンの分析は、サンプル混合物をもたらすために用いられるサンプルまたはサンプルフラクションの各々の中の分析物を(相対的または絶対的に)定量するために用いられ得る。このように、一つ以上の目的のサンプル(複合サンプルを含む)の成分についての情報が、目的の特徴(単数または複数)を有する成分に関して求められ得る。この手順は、プロテオームの分析を行う場合に分析されるタンパク質およびペプチドのような、複合サンプル中のタンパク質およびペプチドの翻訳後修飾の分析のために、特に有用であり得る。
本明細書の理解を目的として、以下の定義が適用され、適切であるときは常に、単数形で使用される用語はまた複数形を含み、逆もまた然りである。以下に示される定義のいずれかが、本明細書において参考として援用される文書いずれかと矛盾する場合、以下に示される定義が支配する。
(標識試薬):
本発明の実施形態において使用される標識試薬は、アイソバリック組成物および/または異性体組成物であり得る。代表的には、アイソメリック標識試薬またはアイソバリック標識試薬のセットが使用され得る。あるセットの標識試薬は、特有であるレポーターを含むように選択され得、そして例えば、MS/MS分析において独立して決定され得る。アイソバリック標識試薬および/またはアイソメリック標識試薬は、WO2004/070352(任意の目的およびあらゆる目的のために参考として援用される)において開示される標識試薬であり得る。アイソバリック標識試薬および/またはアイソメリック標識試薬は、同時係属であり共通して所有される米国特許出願第10/765,458号、同10/765,264号、同10/765,267号、または同10/765,458号(これらの全てが任意の目的および全ての目的のために本明細書において参考として援用される)において開示される標識試薬であり得る。アイソバリック標識試薬および/またはアイソメリック標識試薬は、WO02/14867または米国公開特許出願番号US2003−0045694A1(あらゆる目的のために本明細書において参考として援用される)において記載される標識試薬のような、重合体に基づく標識試薬であり得る。標識試薬は、WO01/68664(あらゆる目的のために本明細書において参考として援用される)において開示されるアイソバリック標識試薬またはアイソメリック標識試薬であり得る。4種の適切なアイソバリック試薬のセットの例は、図4に示される。アイソバリック試薬のセットは、Applied Biosystemsから市販されており、iTRAQTM標識試薬として販売されている(実施例4を参照のこと)。
標識試薬は、反応基を含む。本発明の実施形態において使用される標識試薬(単数または複数)の反応基は、求電子体または求核体のいずれかであり得、これはサンプルのうちの一つ以上の反応性分析物と反応し得る。この反応基は、もともと存在し(preexist)得るか、またはインサイチュで調製され得る。いくつかの実施形態において、反応基のインサイチュでの調製は、反応性の分析物が存在しない場合に手掛けられ得る。いくつかの実施形態において、インサイチュでの調製は、反応性の分析物が存在する場合に手掛けられ得る。例えば、カルボン酸基は、アミン基(アリールアミン基を含む)のような求核体と反応し得る求電子基を調製するように、インサイチュで水溶性のカルボジイミド(例えば、1−(3−ジメチルアミノプロピル−3−塩酸エチルカルボジイミド;EDC)で改変され得る。いくつかの実施形態において、EDCによる標識試薬のカルボン酸基の活性化は、アミン(求核体)含有分析物の存在下で行われ得る。あるいは、アミン(求核体)含有分析物はまた、EDCによる最初の反応が行われた後で加えられ得る。他の実施形態において、反応基は、インサイチュでの保護基の除去によってインサイチュで生成され得る。その後、求核体および/または求電子体の反応による分析物の誘導体化をもたらし得る、任意の、存在しているかまたは新たに作製される試薬(単数または複数)は、本発明の方法の実施形態、混合物の実施形態、キットの実施形態、および/または組成物の実施形態によって企図される。
本発明の実施形態は、分子イオンを選択してフラグメント化する能力を有するタンデム質量分析計、および他の質量分析計を用いて実行され得る。タンデム質量分析計(および、より低い程度までの、ポストソース崩解(post source decay)を示す質量分析計のような一段(single−stage)質量分析計)は、分子イオンをその分子イオンの質量対電荷(m/z)比に従って選択してフラグメント化し、次いで、結果として生じるフラグメント(娘)イオンのスペクトルを記録する能力を有する。さらに具体的には、娘フラグメントイオンのスペクトルは、選択されるイオンを解離エネルギーのレベル(例えば、衝突誘起性解離(collision−induced dissociation)(CID))に供することによって生成され得る。例えば、特定のm/z比の標識ペプチドに対応するイオンは、第一の質量分析から選択され、第二の(MS/MS)質量分析においてフラグメント化されて再分析される。そのようなタンデム質量分析を行い得る代表的な装置として、四扇形磁場型(magnetic four sector)質量分析計、タンデム飛行時間型質量分析計、三連四重極(triple quadrupole)質量分析計、イオントラップ質量分析計、ハイブリッド四重極飛行時間型(Q−TOF)質量分析計が挙げられるが、それらに限定されない。
質量分析計内で起こる過程の結果として結合がフラグメント化し得ることはよく認められる。さらに、結合のフラグメント化は、イオンを解離エネルギーレベルに供することによって、質量分析計内で誘導され得る。例えば、解離エネルギーレベルは、衝突誘起性解離(CID)によって、質量分析計内でもたらされ得る。質量分析の分野の当業者は、フラグメント化を引き起こす解離エネルギーレベルを課すための他の例示的技術として、光解離、電子捕獲(electron capture)、表面誘導性解離(surface induced dissociation)が挙げられるが、それらに限定されないことを、理解する。
いくつかの実施形態において、分析物は、公知の分析物のスペクトルまたは「理論上の」分析物のスペクトルとのコンピュータに補助される比較によって分析される、娘イオンのフラグメント化のパターンに基づいて決定され得る。例えば、低エネルギーCIDの条件下でフラグメント化されるペプチドイオンの娘フラグメントイオンのスペクトルは、多数の不連続なフラグメント化の現象の合計と見なされる。共通の命名法は、開裂するアミド結合および結合の開裂後に電荷を維持するペプチドフラグメントに従って、娘フラグメントイオンを区別する。この開裂したアミド結合のN末端側での電荷保持は、b型イオンの形成をもたらす。この電荷が開裂したアミド結合C末端側に残る場合、フラグメントイオンはy型イオンとして言及される。b型イオンおよびy型イオンに加えて、CID質量スペクトルは、他の識別用フラグメントイオン(娘フラグメントイオン)を含み得る。この識別用フラグメントイオンとして、グルタミン、リシン、およびアルギニンからのアンモニアの中性子の損失(−17amu)、またはセリンおよびスレオニンのようなヒドロキシル基含有アミノ酸からの水の損失(−18amu)によって生成されるイオンが挙げられる。特定のアミノ酸は、低エネルギーCIDの条件下で、他のアミノ酸より容易にフラグメント化することが観察されている。このことは、プロリン残基またはアスパラギン酸残基を含むペプチドについて、特に明らかであり、アスパルチル−プロリン結合でさらにより明らかである(Mak,M.ら、Rapid Commun.Mass Spectrom.,12:837−842(1998))。従って、Z−proダイマーまたはZ−aspダイマーのペプチド結合(ここで、Zは任意の中性アミノ酸であり、proはプロリンであり、aspはアスパラギン酸である)は、全ての他のアミノ酸ダイマーの組合せの間のペプチド結合と比較される場合、より不安定である傾向がある。
本発明の特定の実施形態において、サンプルは、分析物の標識の前、ならびに分析物の標識の後で、処理され得る。処理はサンプルの全てまたはその一部に対して適用され得る。処理は、サンプル混合物またはその一部に対して適用され得る。処理は、サンプルを複雑でなくするために用いられ得るか、またはサンプルを分析のためにより好ましい形態にするために用いられ得る。この処理は、分析物の標識を容易にし得る。この処理は、サンプル成分の分析を容易にし得る。この処理は、サンプルの取り扱いを簡略化し得る。この処理は、上記のもののうちの二つ以上を容易に進し得る。
いくつかの実施形態において、分析物(標識されていようと未標識であろうと)を含むサンプルまたはサンプル混合物の処理は、分離の工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、この分離の工程は、固定相に結合するサンプルの成分と固定相に結合しない成分との間でのサンプル(または、その画分)の分画の工程を包含し得る。そのような処理は、しばしばアフィニティークロマトグラフィーとして言及される。いくつかの実施形態において、この分離の工程は、サンプルもしくはサンプル混合物(またはそれらの一画分または複数の画分)の成分の相対的な親和力に基づいて、サンプルもしくはサンプル混合物の分画の工程を包含し得る。
サンプル混合物の、示差的に標識された同一分析物の相対的な定量は、アイソバリック標識試薬および/またはアイソメリック標識試薬のセットを用いて可能となる。示差的に標識された同一分析物の相対的な定量は、第一(MS)の質量分析において観察される選択されて標識化分析物について、第二(MS/MS)の質量分析において決定されるレポーターの相対量(例えば、記録されるピークの面積または高さ)を比較することによって、可能となる。言い換えると、各々のレポーターが、サンプル混合物を生成するために用いられる特定のサンプル(またはサンプル画分)に関する情報と相関し得る場合、第二の質量分析において観察される他のレポーターに対するそのレポーターの相対量は、そのサンプル混合物中のその分析物の相対量である。サンプル混合物を構成するために用いられる各々のサンプルまたはそれらの画分の量が公知である場合、このサンプル混合物を調製するために用いられる各々のサンプル中の分析物の相対量は、第一の質量分析から選択される標識化分析物のイオンについて観察されるレポーターの相対量に基づいて逆算され得る。この過程は、第一の質量分析において観察される異なる標識化分析物の全てについて、繰り返され得る。このように、サンプル混合物を生成するために用いられる異なるサンプル(またはサンプル画分)の各々の中の、各々の反応性分析物の相対量(しばしば濃度および/または分量に換算して表される)が、決定され得ることが可能である。
サンプルは、多重化され得(すなわち、サンプル混合物を作製することによって)、分析され得、質量分析技術を用いて迅速かつ反復的な様式で再分析され得る。例えば、サンプル混合物は、一つ以上のサンプル中の個々の分析物の量について分析され得る。これらの分析物の量(しばしば濃度および/または分量で表される)は、サンプル混合物が構成された元のサンプル(またはサンプル画分)について決定され得る。サンプル処理および質量分析は迅速に行われ得るので、これらの方法は多数回にわたり繰り返され得、それによって、サンプル混合物の示差的に標識された多数の分析物の量が、これらの分析物が由来する元のサンプル中のこれらの分析物の相対量および/または絶対量に関連して決定され得る。
本発明の実施形態は、修飾が目的のものであり得る場合の、修飾された分析物または未修飾の分析物の存在および/または非存在について、一つ以上の目的のサンプルの分析を可能にする。クロマトグラフィー技術(例えば、アフィニティークロマトグラフィー)は、修飾された分析物を未修飾の分析物から分離するために用いられ得る。いくつかの実施形態において、修飾の存在は、親和性支持体との特異的な相互作用と非特異的な相互作用とを識別することによって、独立して確認され得る。アイソバリック標識試薬および/またはアイソメリック標識試薬のセットは、異なるサンプルまたはサンプル画分の分析物をコード化するために用いられ得る。種々のサンプル中の修飾された分析物および未修飾の分析物の相対量は、種々の標識試薬と結合したレポーター(サインイオン)の比から決定され得、必要であれば、標識された(キャリブレーション)標準が用いられる場合、絶対的定量が可能である。概して、一つ以上のサンプルの修飾された分析物および未修飾の分析物は、以下の一般的な手順に従って決定され得る。
以下に示される議論は、一つ以上のサンプルまたはその画分の中のリンペプチドの相対的定量および/または絶対的定量を決定することに焦点を当てる。リンペプチドは、翻訳後修飾(PTM)の結果として細胞において生成される。従って、リンペプチドのリン酸基の存在は、本発明の実施形態によって決定され得る、目的の特徴である。しかし、以下に論議される具体的な手順は、分析物の任意の目的の修飾または他の特徴を決定するために採用され得、ここで、この修飾(または修飾に関連する特徴)は、天然の(未修飾)分析物を生成するように、酵素的手段または化学的手段によって除去され得る。以下に論議される手順としてはまた、特異的相互作用を非特異的相互作用から区別するためにコード化が用いられ得る、特定のタンパク質またはタンパク質複合体のアフィニティー(または抗体)プルダウン法が挙げられ得るが、それに限定されない。広範囲に考慮して、タグ付けは、実験的結果とコントロールの結果との間を確実に区別することを望む任意の状況において、サンプルをコード化するために用いられ得る。多重化によって、タグ付けは、実験および複数のコントロールを含み得る。従って、以下の実施例は、本発明を説明することを意図され、決して限定することを意図されない。
図1a、1b、および実施例1を参照して、翻訳後修飾、または分析物の他の特徴的特性を決定する様式の一つの記載が説明される。図1aの説明に従って、(例えば、細胞溶解物由来の)タンパク質のような分析物を含む二つのサンプル(すなわち、サンプル1およびサンプル2)が、成分であるタンパク質を消化するために、タンパク質分解酵素(例えば、トリプシン)を用いる処理によって処理され得る。この消化物は、未修飾ペプチドおよび修飾ペプチド(例えば、リンペプチド、糖ペプチド、または金属ペプチド(metallopeptide))の両方を含み得る。各々の修飾ペプチドについて、相関する天然の(未修飾)ペプチドが、修飾ペプチドと比較した場合に、より多くの量またはより少ない量で存在し得る。
図2a、図2b、および実施例2を参照して、分析物の特徴的な特性が固定相への特異的な結合をもたらすか否かを決定する様式の一つの記載が説明される。この方法に従って、分析物(例えば、細胞溶解物由来のタンパク質)を含むサンプルが、サンプルの成分を消化するために、タンパク質分解酵素(例えば、トリプシン)を用いる処理によって処理され得る。タンパク質について、その消化物は、未修飾ペプチドおよび修飾ぺプチド(例えば、リンペプチド、糖ペプチド、または金属ペプチド)の両方を含み得る。各々の修飾ペプチドについて、関係する天然の(未修飾)ペプチドが、修飾ペプチドと比較した場合により多いまたはより少ない量で存在し得る。
図3a、3b、および実施例3を参照して、サンプル成分中の修飾の存在、および、その修飾が固定相への特異的結合をもたらすか否かの両方を決定する様式の一つの記載が説明される。この方法に従って、分析物(例えば、細胞溶解物由来のタンパク質)を含む二つのサンプルが、サンプルの成分を消化するために、タンパク分解酵素(例えば、トリプシン)を用いる処理によって処理され得る。タンパク質について、その消化物は、未修飾ペプチドおよび修飾ぺプチド(例えば、リンペプチド、糖ペプチド、または金属ペプチド)の両方を含み得る。各々の修飾ペプチドについて、関係する天然の(未修飾)ペプチドが、修飾ペプチドと比較した場合により多いまたはより少ない量で存在し得る。
修飾(または除去可能な修飾に関連する目的の特徴)を除去するための化学物質または酵素を用いる処理、および必要であれば分離の後、サンプル混合物またはその画分は、質量分析計で分析され得る。上で論議したように、MS/MS様式において、各々の分析物の娘イオンが、サンプルのペプチドおよび/またはタンパク質をMS分析からのイオンの選択によって決定するために用いられ得る。さらに、各々の分析物(例えば、ペプチド)について、サンプル混合物をもたらすために用いられる画分の各々の中のそのペプチドの相対量が、各々の標識試薬のレポーターの各々のサインイオンピークに基づいて決定され得る。
上記に開示される実施形態の各々において、分析物の絶対的定量は、その分析物についての基準がサンプル混合物に添加される場合、相対的定量に基づいて決定され得る。
(実施例1:(予測的(prophetic))
(アフィニティークロマトグラフィーを用いるPTMの簡単な多重分析(図1aおよび1b))
本実施例を、図1aおよび図1bを参照して説明する。図1aに関して、サンプル1およびサンプル2は、比較のために選択された細胞または組織に由来する総タンパク質溶解物である。この非限定的な例は、病的な細胞または組織に対する正常な細胞または組織、薬物または他の低分子を用いて処理された(あるいは処理されていない)細胞または組織、および疾患の進行もしくは疾患の処置の経過の間に同じ患者もしくは異なる患者から採取された生物学的体液(血清、尿、脊髄液)の複数のサンプルである。
1)最初のサンプル中でリン酸化されたペプチドのみが、試薬Aおよび/または試薬Bについてのサインイオンを有する。ピークAおよびピークBが存在しないことは、このペプチドが元のサンプル中でリン酸化されなかったことを示す。
1)この方法は、複雑なサンプル混合物中のリンペプチドを同時に同定および定量することを可能にする。この方法は時間およびサンプル消費に関して非常に効率的である。なぜなら、全ての(非リン酸化)ペプチドの相対的ペプチド濃度に関係するデータと平行して、このデータもまた収集するからである。
(特異的親和性結合と非特異的親和性結合との間の区別(図2a、2b))
リンタンパク質のサンプルをプロテアーゼ(例えば、トリプシン)を用いて消化し、消化されたペプチドのプールを、二つの画分へ分ける(図2aを参照されたい)。いかなる容積の差も既知でありMS/MS分析におけるレポーターのピーク強度と相関関係があり得る限り、これらの画分が等しい容積であることは重要でない。一つの画分を、このサンプル画分の成分の全ての共有結合したリン酸を除去するために、ホスファターゼを用いて酵素的に(または化学的に)処理する。従って、この画分がコントロールサンプルとして役立つことを意図する。この二つのサンプルを、次いで、リン酸基を含むペプチドを選択的に結合させるためにIMACカラムを用いるクロマトグラフィー分離に各々を供する。フロースルー(非リン酸化)ペプチドを収集し、次いで、結合(潜在的に、リン酸化されているかまたは非特異的に結合する)ペプチドを選択的に脱着し、各々のIMACカラムから収集する。このことは潜在的に4個の分離したサンプル画分を生成する(図2aを参照されたい)。
(複数の分析物の結合親和力の分析(図3aおよび図3b))
アイソバリック試薬セットのメンバーの一つを使用して、真のリン酸化を非特異的なリン酸化と区別するための「フラグ」として機能させるこの概念を、上記のように、単一のリンタンパク質分析から完全なプロテオーム分析へと拡張し得る(図3a、図3b)。
モデルリンタンパク質(ウシのa−カゼイン)を還元し(TCEP、37℃)、アルキル化し(MMTS、2時間、室温)そしてトリプシン分解した(1:20 w/w、37℃、16時間)。
Claims (26)
- 以下:
i)一つより多くの分析されるべきサンプルを選択する工程であって、該サンプルは、各々が一つ以上の分析物を含み、該分析物の一部は、目的の修飾を含み得る、工程;
ii)必要に応じて、該サンプルの一つ以上またはその一画分を処理する工程;
iii)必要に応じて、該サンプルの一つ以上またはその一画分を、酵素または化学物質を用いて、目的の修飾をそのように修飾された分析物から取り除く条件下で処理する工程であって、但し、該サンプルまたはその画分の全てが該酵素または化学物質を用いて処理されるわけではない、工程;
iv)各々のサンプルまたはその一画分を、親和性支持体に適用する工程であって、該親和性支持体は未修飾分析物から修飾分析物を分離し得、そして、全ての親和性支持体は同じ固定相を含むが、各々のサンプルまたはその画分は異なる親和性支持体に適用される、工程;
v)必要に応じて、各々の親和性支持体を貫流する分析物を一画分として別々に収集する工程;
vi)各々の親和性支持体に結合する分析物を、適切な条件下で結合した分析物を溶出させることによって、一画分として別々に収集する工程;
vii)該親和性支持体に結合する一つ以上の分析物を含む各々の目的の画分を、一つのセットのアイソバリック標識試薬および/またはアイソメリック標識試薬のうちの、独特のアイソバリック標識試薬および/またはアイソメリック標識試薬との反応によってコード化する工程;
viii)必要に応じて、該親和性支持体を貫流した一つ以上の分析物を含む各々の目的の画分を、該一つのセットのアイソバリック標識試薬および/またはアイソメリック標識試薬のうちの、独特のアイソバリック標識試薬および/またはアイソメリック標識試薬との反応によってコード化する工程;
ix)アイソバリック標識試薬および/またはアイソメリック標識試薬を用いてコード化された二つ以上の画分を混合する工程;
x)必要に応じて、既知量の一つ以上のキャリブレーション標準を該混合物に添加する工程;
xi)該混合物を、酵素または化学物質を用いて、目的の修飾をそのように修飾された分析物から取り除く条件下で処理する工程;
xii)必要に応じて、該混合物を分離する工程;
ならびに、
xiii)該混合物または一つ以上のその画分を質量分析によって分析し、これによって該混合物の一つ以上の分析物についての娘イオンフラグメントおよび各々の独特の標識試薬と関連するサインイオンを得る工程;
を包含する、分析方法。 - 請求項1に記載の方法であって、以下:
a)前記の修飾を含む分析物が、親和性支持体と特異的に相互作用するか否かを決定する工程、
をさらに包含する、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、以下:
a)前記混合物中の一つ以上の前記分析物を、娘イオンフラグメントの分析によって同定する工程;ならびに/あるいは
b)前記サンプルの各々の中の特定の修飾された分析物および該分析物に対応する未修飾の分析物の、相対量および/または絶対量を決定する工程、
をさらに包含する、方法。 - 請求項3に記載の方法であって、以下:
a)工程a)および工程b)を一回以上繰り返して、異なる分析物について、前記サンプルの各々の中の特定の修飾された分析物ならびに該分析物に対応する未修飾の分析物の、相対量および/または絶対量を決定する工程、
をさらに包含する、方法。 - 請求項1に記載の方法であって、各々が一種以上のタンパク質および/またはリンタンパク質を分析物として含む二つ以上のサンプルが選択される、方法。
- 請求項5に記載の方法であって、各々のサンプルは、トリプシンを用いる処理によって処理され、これによって前記タンパク質および/またはリンタンパク質をペプチドおよび/またはリンペプチドに消化する、方法。
- 請求項6に記載の方法であって、各々の処理されたサンプルが、リンペプチドを未修飾のペプチドから分離し得る親和性支持体に適用される、方法。
- 請求項7に記載の方法であって、各々の親和性支持体に結合する分析物を含む画分が回収され、各々の異なるカラムから得られる該画分が、前記アイソメリック標識試薬および/またはアイソバリック標識試薬のセットからの、独特の標識試薬を用いてコード化される、方法。
- 請求項8に記載の方法であって、親和性支持体の各々を貫流した分析物を含む画分が回収され、各々の異なるカラムから得られる画分は、前記アイソメリック標識試薬および/またはアイソバリック標識試薬のセットからの、特有の標識試薬を用いてコード化される、方法。
- 請求項9に記載の方法であって、前記のコード化された画分は混合されて混合物を形成し、該混合物は、一種以上のホスファターゼ酵素を用いて処理され、これによって前記リンペプチドを脱リン酸化する、方法。
- 請求項10に記載の方法であって、以下:
a)前記混合物中のペプチドの一種以上を、娘イオンフラグメントの分析によって同定する工程;ならびに/あるいは
b)二つ以上の前記サンプルの各々の中の特定のリンペプチドおよび該リンペプチドに対応する未修飾のペプチドの、相対量および/または絶対量を決定する工程、
をさらに包含する、方法。 - 請求項11に記載の方法であって、以下;
a)工程a)および工程b)を一回以上繰り返し、これによって、異なるペプチドについて、二つ以上の前記サンプルの各々の中の特定のリンペプチドおよび該リンペプチドに対応する未修飾のペプチドの、同一性および/または相対量および/または絶対量を決定する工程、
をさらに包含する、方法。 - 第一サンプルおよび第二サンプルが選択され、各々のサンプルが一種以上のタンパク質および/またはリンタンパク質を分析物として含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第一サンプルおよび前記第二サンプルは、各々がトリプシンを用いる処理によって処理されて、これによって前記タンパク質および/またはリンタンパク質をペプチドおよび/またはリンペプチドに消化する、請求項13に記載の方法。
- 各々の処理されたサンプルの画分は、混合されて特異性コントロール混合物を形成する、請求項14に記載の方法。
- 前記特異性コントロール混合物は、一種以上のホスファターゼ酵素を用いて処理され、これによって前記リンペプチドを脱リン酸化する、請求項15に記載の方法。
- 請求項16に記載の方法であって、各々の画分は、リンペプチドを未修飾のペプチドから分離し得る親和性支持体に適用され、該画分は:
a)前記の第一サンプルの残りの、全てまたは一部;
b)前記の第二サンプルの残りの、全てまたは一部;および
c)前記の特異性コントロール混合物の全てまたは一部
である、方法。 - 請求項17に記載の方法であって、各々の親和性支持体に結合する分析物を含む画分が回収され、各々の異なるカラムから得られる各々の画分は、前記アイソメリック標識試薬および/またはアイソバリック標識試薬のセットからの独特の標識試薬を用いてコード化される、方法。
- 請求項18に記載の方法であって、各々の親和性支持体を貫流した分析物を含む画分が回収され、前記第一サンプルおよび前記第二サンプルから得られる少なくともフロースルー画分は、前記アイソメリック標識試薬および/またはアイソバリック標識試薬のセットからの独特の標識試薬を用いてコード化される、方法。
- 請求項19に記載の方法であって、前記コード化された画分は混合されて混合物を形成し、該混合物は、一種以上のホスファターゼ酵素を用いて処理され、これによって前記リンペプチドを脱リン酸化する、方法。
- 前記リン酸修飾を含む一種以上のペプチドが前記親和性支持体と特異的に相互作用するか否かを決定する工程をさらに含む、請求項20に記載の方法。
- 請求項21に記載の方法であって、以下:
a)前記混合物中のペプチドの一種以上を、娘イオンフラグメントの分析によって同定する工程;ならびに/あるいは
b)前記第一サンプルおよび前記第二サンプルの各々の中の、該同定されたペプチドおよび該ペプチドに対応するリンペプチドの、相対量および/または絶対量を決定する工程、
をさらに含む、方法。 - 請求項22に記載の方法であって、以下;
a)工程a)および工程b)を一回以上繰り返し、これによって、異なるペプチドについて、前記第一サンプルならびに前記第二サンプルの中の、特定のリンペプチドおよび該リンペプチドに対応する未修飾のペプチドの、相対量および/または絶対量を決定する工程、
をさらに含む、方法。 - 請求項22に記載の方法であって、前記第一サンプルならびに前記第二サンプルの各々の中の、各々が前記の同定されたペプチドおよび関連するリンペプチドに関連するタンパク質およびリンタンパク質の、相対量および/または絶対量を決定する工程をさらに含む、方法。
- 前記第一サンプルおよび前記第二サンプルの各々は細胞溶解物である、請求項24に記載の方法。
- 前記分析物(単数または複数)は、核酸、炭水化物、脂質、ステロイド、または、分子量が1500ダルトンより小さい他の低分子である、請求項1に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US54904904P | 2004-03-01 | 2004-03-01 | |
PCT/US2005/006457 WO2005085869A2 (en) | 2004-03-01 | 2005-03-01 | Determination of analyte characteristics based upon binding properties |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010045968A Division JP2010156706A (ja) | 2004-03-01 | 2010-03-02 | 結合特性に基づく分析物の特徴の決定 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2007525671A JP2007525671A (ja) | 2007-09-06 |
JP4613320B2 true JP4613320B2 (ja) | 2011-01-19 |
Family
ID=34919429
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007500810A Expired - Fee Related JP4613320B2 (ja) | 2004-03-01 | 2005-03-01 | 結合特性に基づく分析物の特徴の決定 |
JP2010045968A Withdrawn JP2010156706A (ja) | 2004-03-01 | 2010-03-02 | 結合特性に基づく分析物の特徴の決定 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010045968A Withdrawn JP2010156706A (ja) | 2004-03-01 | 2010-03-02 | 結合特性に基づく分析物の特徴の決定 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7868547B2 (ja) |
EP (1) | EP1623234B1 (ja) |
JP (2) | JP4613320B2 (ja) |
AT (1) | ATE364178T1 (ja) |
CA (1) | CA2557997C (ja) |
DE (1) | DE602005001302T2 (ja) |
WO (1) | WO2005085869A2 (ja) |
Families Citing this family (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20070054345A1 (en) * | 2004-05-19 | 2007-03-08 | Hunter Christie L | Expression quantification using mass spectrometry |
US20080206737A1 (en) * | 2004-05-19 | 2008-08-28 | Hunter Christie L | Expression quantification using mass spectrometry |
CA2567459A1 (en) * | 2004-05-19 | 2005-12-01 | Applera Corporation | Expression quantification using mass spectrometry |
US20060183238A1 (en) * | 2005-02-09 | 2006-08-17 | Applera Corporation | Amine-containing compound analysis methods |
US20070037286A1 (en) * | 2005-02-09 | 2007-02-15 | Subhasish Purkayastha | Thyroxine-containing compound analysis methods |
JP4659831B2 (ja) * | 2005-07-29 | 2011-03-30 | エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 | 化合物に対するタンパク質の結合力を解析する方法 |
US8975404B2 (en) | 2006-01-24 | 2015-03-10 | Dh Technologies Development Pte. Ltd. | Labeling reagents for analyte determination and methods and compounds used in making the same |
WO2008048345A2 (en) * | 2006-02-14 | 2008-04-24 | Perkinelmer Las, Inc. | Detection systems for mass labels |
WO2008146100A1 (en) * | 2007-06-01 | 2008-12-04 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Method for absolute quantification of polypeptides |
JP4836875B2 (ja) * | 2007-06-13 | 2011-12-14 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 修飾ペプチドの分析方法および装置 |
EP2062910A1 (en) * | 2007-11-26 | 2009-05-27 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Selective enrichment of post-translationally modified proteins and/or peptides from complex samples |
EP2062911A1 (en) * | 2007-11-26 | 2009-05-27 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Selective enrichment of post-translationally modified proteins |
EP2108654A1 (en) * | 2008-04-07 | 2009-10-14 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Selective enrichment of n-terminally modified peptides from complex samples |
US20110301063A1 (en) * | 2009-02-24 | 2011-12-08 | Netzel Brian C | Multiplexing derivatized anayltes using mass spectroscopy |
EP2406634A4 (en) | 2009-03-10 | 2013-06-19 | Univ Maryland | ISOBARE DEUTERIUM REACTIVE MARKERS USED FOR QUANTITATIVE ANALYZES |
EP2548015A1 (en) | 2010-03-15 | 2013-01-23 | Anderson Forschung Group, Inc. | Improved mass spectrometric assays for peptides |
US8492163B2 (en) | 2011-01-31 | 2013-07-23 | Dh Technologies Development Pte. Ltd. | Methods, mixtures, kits and compositions pertaining to analyte determination |
CA2868705A1 (en) * | 2012-04-05 | 2013-10-10 | Micromass Uk Limited | Ms/ms analysis using ecd or etd fragmentation |
EP3384518B1 (en) * | 2015-11-30 | 2023-08-02 | DH Technologies Development PTE. Ltd. | Isomeric reagent tags for differential mobility spectrometry |
CN106093224B (zh) * | 2016-06-01 | 2018-10-26 | 同济大学 | 一种多糖同时富集与近同重标记的定量分析方法 |
CN110114667B (zh) | 2016-12-23 | 2023-07-25 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于在分析系统中的过程期间标识试剂的方法 |
EP3559655B1 (en) * | 2016-12-23 | 2024-07-03 | Roche Diagnostics GmbH | Method for identifying a reagent during a process in an analysis system |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5800992A (en) * | 1989-06-07 | 1998-09-01 | Fodor; Stephen P.A. | Method of detecting nucleic acids |
US5252296A (en) * | 1990-05-15 | 1993-10-12 | Chiron Corporation | Method and apparatus for biopolymer synthesis |
US6027890A (en) * | 1996-01-23 | 2000-02-22 | Rapigene, Inc. | Methods and compositions for enhancing sensitivity in the analysis of biological-based assays |
ES2213823T3 (es) * | 1996-04-08 | 2004-09-01 | Glaxo Group Limited | Codificacion y analisis cualitativo de bibliotecas combinatorias basadas en masa. |
ATE340869T1 (de) | 1997-01-15 | 2006-10-15 | Xzillion Gmbh & Co Kg | Massenmarkierte hybridisierungssonden |
GB9823646D0 (en) * | 1997-12-19 | 1998-12-23 | Brax Genomics Ltd | Compounds for mass spectrometry |
US6270976B1 (en) * | 1998-09-15 | 2001-08-07 | Brax Group Limited | Characterizing nucleic acid by mass spectrometry |
GB0006141D0 (en) * | 2000-03-14 | 2000-05-03 | Brax Group Ltd | Mass labels |
US20030153007A1 (en) * | 2001-12-28 | 2003-08-14 | Jian Chen | Automated systems and methods for analysis of protein post-translational modification |
US7473535B2 (en) | 2002-08-20 | 2009-01-06 | The Institute For Systems Biology | Chemical reagents and methods for detection and quantification of proteins in complex mixtures |
JP4613299B2 (ja) | 2003-01-30 | 2011-01-12 | ディーエイチ テクノロジーズ デベロップメント プライベート リミテッド | 分析物分析に関する方法、混合物、キット、および組成物 |
US20050148771A1 (en) | 2004-01-05 | 2005-07-07 | Applera Corporation. | Active esters of N-substituted piperazine acetic acids, including isotopically enriched versions thereof |
-
2005
- 2005-03-01 EP EP05724075A patent/EP1623234B1/en not_active Not-in-force
- 2005-03-01 JP JP2007500810A patent/JP4613320B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2005-03-01 CA CA2557997A patent/CA2557997C/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-03-01 US US11/069,277 patent/US7868547B2/en active Active
- 2005-03-01 AT AT05724075T patent/ATE364178T1/de not_active IP Right Cessation
- 2005-03-01 DE DE602005001302T patent/DE602005001302T2/de active Active
- 2005-03-01 WO PCT/US2005/006457 patent/WO2005085869A2/en active IP Right Grant
-
2010
- 2010-03-02 JP JP2010045968A patent/JP2010156706A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2010156706A (ja) | 2010-07-15 |
CA2557997C (en) | 2012-01-31 |
WO2005085869A3 (en) | 2005-11-03 |
US20050208550A1 (en) | 2005-09-22 |
JP2007525671A (ja) | 2007-09-06 |
US7868547B2 (en) | 2011-01-11 |
WO2005085869A2 (en) | 2005-09-15 |
ATE364178T1 (de) | 2007-06-15 |
EP1623234A2 (en) | 2006-02-08 |
CA2557997A1 (en) | 2005-09-15 |
DE602005001302T2 (de) | 2008-02-14 |
EP1623234B1 (en) | 2007-06-06 |
DE602005001302D1 (de) | 2007-07-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4613320B2 (ja) | 結合特性に基づく分析物の特徴の決定 | |
JP5548447B2 (ja) | 検体の決定に関する方法、混合物、キットおよび組成物 | |
Guerrera et al. | Application of mass spectrometry in proteomics | |
US7947513B2 (en) | Sets and compositions pertaining to analyte determination | |
EP2286237B1 (en) | Mass spectrometric analysis | |
JP5468391B2 (ja) | 質量分析定量法 | |
Schneider et al. | Stable isotope methods for high-precision proteomics | |
JP2009543069A5 (ja) | ||
Leitner | A review of the role of chemical modification methods in contemporary mass spectrometry-based proteomics research | |
JP2003532900A (ja) | タンパク質を同定及び定量化するための親和性により選択されるサインペプチド | |
US8492163B2 (en) | Methods, mixtures, kits and compositions pertaining to analyte determination | |
US20070148721A1 (en) | Compositions, methods, systems, and kits for affinity purification | |
EP1798557A2 (en) | Determination of analyte characteristics based upon binding properties | |
Henry et al. | Introduction to sample preparation for proteomics and mass spectrometry | |
Schluter et al. | Protein species-the future challenge for enzymology | |
WO2006026416A1 (en) | Compositions, methods, systems, and kits for affinity purification |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20090618 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090903 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20091202 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20091209 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20091221 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100104 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100302 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20100302 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100827 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20100922 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100924 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131029 Year of fee payment: 3 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |