CN106093224B - 一种多糖同时富集与近同重标记的定量分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种多糖同时富集与近同重标记的定量分析方法。将两组不同生理或病理条件的多糖分别作为控制组与疾病组,分别进行N‑乙酰葡糖胺醛基的全部氨基化同重标记,分别标记为‑CH2 15NHCH2COORf和‑CH2NHCH2 13COORf,其中Rf为C3F7CH2CH2PhCH2‑,其标记后含氟标签的多糖的质量差异为6.32mDa;同重标记后两组多糖按等比例混合进行质谱分析得到一个数据组;对数据组进行定性、定量数据库搜索,得到多糖的拓扑结构及疾病组每一个多糖相对于控制组的相对比例,即疾病条件下所有多糖的上调或下调情况。本发明不仅标记效率高,准确度高,便宜易得;而且自带氟富集标签,将大大增强带标记多糖的富集效率、电喷雾电离效率和质谱分析灵敏度和效率,适用于N‑多糖基于高分辨串级质谱分析的定量。
Description
技术领域
本发明涉及一种多糖同时富集与近同重标记的定量分析方法,主要涉及与生物质谱相关的系统生物学、糖组学等技术领域。
背景技术
糖基化是蛋白质最广泛、最重要的翻译后修饰之一;哺乳动物细胞中50%以上的蛋白都有糖基化修饰;这些修饰跟许多病理过程息息相关。由于糖基化蛋白的丰度非常低(2%-5%),多糖结构异常复杂,多糖定性定量分析目前仍然是一个巨大的挑战。N-多糖是糖基化多糖中最普遍的一种。N-多糖具有由2个N-乙酰葡糖胺和3个甘露糖组成的核心结构;其中1个N-乙酰葡糖胺与蛋白相连。蛋白上的N-多糖可以由肽-N-糖苷酶F(PNGase)酶切释放。这些被释放的N-多糖目前有许多独立的富集和定量技术。其中N-多糖的富集技术包括硼酸化学、酰阱化学、还原胺化化学、肟点击化学、TiO2配位化学、炔点击化学等;N-多糖的定量技术包括同位素标记(GRIL、IDAWG、INLIGHT、Girard’s Reagent P、GREDIL、GRIAL),同重标记(QUANTITY、SimGlycan)等。目前尚未见近同重标记定量;同时也没有集富集和定量标记于一体的报道。
申请人前期在整体蛋白质定性定量分析方面已经做了较多的工作,有较好的基础。
在定量数据挖掘方面,公布号为CN103389335A的中国专利公布了一种鉴定生物大分子的分析装置和方法。公布号为CN 104765984A的中国专利公布了一种生物质谱数据库快速建立与搜索的方法。公布号为CN104359967A的中国专利公布了一种生物质谱重叠同位素轮廓的解析方法。上述专利中公布了同位素轮廓指纹比对算法(isotopic envelopefingerprinting,iEF),直接在原始数据上进行匹配离子的搜索和蛋白质的鉴定。该算法无需对实验数据进行“去同位素”预处理,可以节省相应的时间;根据各个离子中是否有同位素峰缺失和同位素峰相对强度的偏差对理想及非理想实验数据进行很好的区分,保证蛋白鉴定的可信度;根据已知重叠离子的同位素峰相对强度关系对重叠实验数据进行有效的解析。基于该算法申请人成功地开发了整体蛋白数据库搜索引擎ProteinGoggle,在单个标准蛋白(泛素、肌红蛋白)及整体蛋白质组混合物(组蛋白H4家族翻译后修饰异构体、大肠杆菌)的定性鉴定中,表现出较高的可信度和较好的应用前景。在定量分析方面,ProteinGoggle有着它内在的和独特的潜在优势;一方面基于同位素轮廓及其中每个同位素的指纹比对可以快速精确地搜索同位素或同重标记的定量离子对;另一方面,搜索过程中每个离子中每个同位素峰的实验强度都被记录和输出,可以用来直接计算相对定量比。
在定量标记方面,公布号为CN105137088A的中国专利公布了一种整体蛋白质定量分析方法。公布号为CN105242050A的中国专利公布了一种不同生理或病理条件下整体蛋白质的定量分析方法,该专利对N端氨基进行同重标记,分别标记为-N(CH2D)2和-N(13CH3)2。上述两份专利均是基于重同位素的定量标记方法。
发明内容
本发明的目的就是为了提供一种多糖同时富集与近同重标记的定量分析方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
一种多糖同时富集与近同重标记的定量分析方法,包括以下步骤:
(1)将两组不同生理或病理条件的多糖分别作为控制组与疾病组,分别进行N-乙酰葡糖胺醛基的全部氨基化同重标记,分别标记为-CH2 15NHCH2COORf和-CH2NHCH2 13COORf,其中Rf为C3F7CH2CH2PhCH2-,其标记后含氟标签的多糖的质量差异为6.32mDa;
(2)同重标记后两组多糖按等比例混合进行高效液相色谱分离,高分辨质谱和串级质谱分析得到一个数据组;
(3)对数据组进行定性、定量数据库搜索,得到多糖的拓扑结构及疾病组每一个多糖相对于控制组的相对比例,即疾病条件下所有多糖的上调或下调情况,上调或下调倍数最大的多糖即为与该疾病发生、发展相关的多糖。
优选地,步骤(1)中,控制组多糖或疾病组多糖,一组多糖用氰基硼氢化钠(NaCNBH3)和H2 15NCH2COORf标记,另一组多糖用氰基硼氢化钠和H2NCH2 13COORf标记,其中Rf为C3F7CH2CH2PhCH2-。
H2NCH2 13COORf和C3F7CH2CH2PhCH2-均为带多氟基团的近同重标记试剂。
含13C的H2NCH2 13COORf的合成采用13C标记甘氨酸(如Sigma-Aldrich公司,产品代码279420-1G),含15N的H2 15NCH2COORf的合成采用15N标记的甘氨酸(如Sigma-Aldrich公司,产品代码299294)。两个反应中都用到的含氟基团的苯甲醇(C3F7CH2CH2PhCH2OH)则可以由FLUOROUS TECHNOLOGIES公司(产品代码F007026-0002)获得。反应过程和条件如下:酸性条件下65℃反应1小时。
优选地,步骤(1)中进行同重标记的反应过程和条件如下:酶切后的含N-多糖的溶液溶解在乙睛、水、乙酸的混合溶剂中,加入含氟试剂H2 15NCH2COORf或H2NCH2 13COORf,随后加入新配制的氰基硼氢化钠溶液,进行反应。
优选地,所述的混合溶剂中,乙睛、水、乙酸的体积比为50:45:5。
优选地,含氟试剂H2 15NCH2COORf或H2NCH2 13COORf的加入量与多糖的摩尔比为10:1。
优选地,步骤(1)中进行同重标记的反应条件是65℃反应2小时。
步骤(2)所述的等比例混合指:按照控制组与疾病组的重量、体积或摩尔量以1:1比例进行混合。
步骤(3)中对数据组进行定性、定量数据库搜索,得到蛋白质的ID及疾病组每一个蛋白质相对于控制组的相对比例为本领域的常规技术,优选使用背景技术中介绍的整体蛋白数据库搜索引擎ProteinGoggle,同时也可以使用其他数据解析工具。
本发明涉及的方法同样适用于N-乙酰葡糖胺上醛基其他基于氨基化反应的同位素标记、同重标记和近同重标记。
本发明发展了一组集近同重标记和富集于一体的化学标签。对N-乙酰葡糖胺醛基进行标记后,可以同时实现标记后多糖的富集,以及相对或绝对定量;同时该类标签还有利于提高标记多糖的疏水性和电喷雾电离效率。最终实现N-多糖高灵敏度、高准确度定性定量分析。
本发明的解析方法基于所述质谱的原始二级质谱,通过计算含标记基团碎片离子的平均相对强度从而计算标记多糖在不同生理或病理条件下的相对强度。本发明的富集和定量方法对N-多糖N-乙酰葡糖胺醛基的近同重标记和其高分辨串级质谱标记碎片离子同位素轮廓指纹比对原位数据解析,标记效率高,准确度高,适用于多糖基于高分辨串级质谱的定量分析。
与现有技术相比,本发明的定量标记试剂不仅标记效率高,准确度高,便宜易得;而且自带氟富集标签,将大大增强带标记多糖的富集效率、电喷雾电离效率和质谱分析灵敏度和效率,适用于N-多糖基于高分辨串级质谱分析的定量。
附图说明
图1、定量分析流程图。
图2、近同重标记试剂合成路线及N-乙酰葡糖胺醛基的全部氨基化同重标记过程示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例
一种多糖同时富集与近同重标记的定量分析方法,如图1所示,包括以下步骤:
(1)将两组不同生理或病理条件的多糖分别作为控制组与疾病组,分别进行N-乙酰葡糖胺醛基的全部氨基化同重标记,一组多糖用氰基硼氢化钠(NaCNBH3)和H2 15NCH2COORf标记,另一组多糖用氰基硼氢化钠和H2NCH2 13COORf标记,其中Rf为C3F7CH2CH2PhCH2-,分别标记为-CH2 15NHCH2COORf和-CH2NHCH2 13COORf,其中Rf为C3F7CH2CH2PhCH2-,其标记后含氟标签的多糖的质量差异为6.32mDa;进行同重标记的反应过程和条件如下:酶切后的含N-多糖的溶液溶解在乙睛、水、乙酸的混合溶剂(乙睛、水、乙酸的体积比为50:45:5)中,加入含氟试剂H2 15NCH2COORf或H2NCH2 13COORf,含氟试剂H2 15NCH2COORf或H2NCH2 13COORf的加入量与多糖的摩尔比为10:1,随后加入新配制的氰基硼氢化钠溶液,65℃反应2小时。
(2)同重标记后两组多糖按等比例混合进行高效液相色谱分离,高分辨质谱和串级质谱分析得到一个数据组,等比例混合指:按照控制组与疾病组的重量、体积或摩尔量以1:1比例进行混合。
(3)对数据组进行定性、定量数据库搜索,得到多糖的拓扑结构及疾病组每一个多糖相对于控制组的相对比例,即疾病条件下所有多糖的上调或下调情况,上调或下调倍数最大的多糖即为与该疾病发生、发展相关的多糖。对数据组进行定性、定量数据库搜索,得到蛋白质的ID及疾病组每一个蛋白质相对于控制组的相对比例为本领域的常规技术,优选使用背景技术中介绍的整体蛋白数据库搜索引擎ProteinGoggle,同时也可以使用其他数据解析工具。
其中,H2NCH2 13COORf和C3F7CH2CH2PhCH2-均为带多氟基团的近同重标记试剂。合成方法如图2中(1)、(2)所示,含13C的H2NCH2 13COORf的合成采用13C标记甘氨酸(如Sigma-Aldrich公司,产品代码279420-1G),含15N的H2 15NCH2COORf的合成采用15N标记的甘氨酸(如Sigma-Aldrich公司,产品代码299294)。两个反应中都用到的含氟基团的苯甲醇(C3F7CH2CH2PhCH2OH)则可以由FLUOROUS TECHNOLOGIES公司(产品代码F007026-0002)获得。反应过程和条件如下:酸性条件下65℃反应1小时。N-乙酰葡糖胺醛基的全部氨基化同重标记过程如图2中(3)、(4)所示。
本发明涉及的方法同样适用于N-乙酰葡糖胺上醛基其他基于氨基化反应的同位素标记、同重标记和近同重标记。
本发明发展了一组集近同重标记和富集于一体的化学标签。对N-乙酰葡糖胺醛基进行标记后,可以同时实现标记后多糖的富集,以及相对或绝对定量;同时该类标签还有利于提高标记多糖的疏水性和电喷雾电离效率。最终实现N-多糖高灵敏度、高准确度定性定量分析。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改,并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此,本发明不限于上述实施例,本领域技术人员根据本发明的揭示,不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种多糖同时富集与近同重标记的定量分析方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将两组不同生理或病理条件的多糖分别作为控制组与疾病组,分别进行N-乙酰葡糖胺醛基的全部氨基化同重标记,分别标记为-CH2 15NHCH2COORf和-CH2NHCH2 13COORf,其中Rf为C3F7CH2CH2PhCH2-,其标记后含氟标签的多糖的质量差异为6.32mDa;
(2)同重标记后两组多糖按等比例混合进行高效液相色谱分离,高分辨质谱和串级质谱分析得到一个数据组;
(3)对数据组进行定性、定量数据库搜索,得到多糖的拓扑结构及疾病组每一个多糖相对于控制组的相对比例,即疾病条件下所有多糖的上调或下调情况,上调或下调倍数最大的多糖即为与该疾病发生相关的多糖。
2.根据权利要求1所述的一种多糖同时富集与近同重标记的定量分析方法,其特征在于,步骤(1)中,控制组多糖或疾病组多糖,一组多糖用氰基硼氢化钠和H2 15NCH2COORf标记,另一组多糖用氰基硼氢化钠和H2NCH2 13COORf标记,其中Rf为C3F7CH2CH2PhCH2-。
3.根据权利要求2所述的一种多糖同时富集与近同重标记的定量分析方法,其特征在于,含13C的H2NCH2 13COORf的合成采用13C标记甘氨酸,含15N的H2 15NCH2COORf的合成采用15N标记的甘氨酸。
4.根据权利要求2所述的一种多糖同时富集与近同重标记的定量分析方法,其特征在于,步骤(1)中进行同重标记的反应过程和条件如下:酶切后的含N-多糖的溶液溶解在乙睛、水、乙酸的混合溶剂中,加入含氟试剂H2 15NCH2COORf或H2NCH2 13COORf,随后加入新配制的氰基硼氢化钠溶液,进行反应。
5.根据权利要求4所述的一种多糖同时富集与近同重标记的定量分析方法,其特征在于,所述的混合溶剂中,乙睛、水、乙酸的体积比为50:45:5。
6.根据权利要求4所述的一种多糖同时富集与近同重标记的定量分析方法,其特征在于,含氟试剂H2 15NCH2COORf或H2NCH2 13COORf的加入量与多糖的摩尔比为10:1。
7.根据权利要求4所述的一种多糖同时富集与近同重标记的定量分析方法,其特征在于,反应的条件是65℃反应2小时。
8.根据权利要求1所述的一种多糖同时富集与近同重标记的定量分析方法,其特征在于,步骤(2)所述的等比例混合指:按照控制组与疾病组的重量、体积或摩尔量以1:1比例进行混合。
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