JP4578682B2 - 微生物をカウントおよび特徴決定するためのカード - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生物学的サンプルにおける、微生物または、核酸または抗体のような他のあらゆる生物学的物質をカウントおよび特徴決定することを可能にするための分析カードに関する。また、本発明は、かかるカードを満たす方法、並びに、かかるカードの使用にも関する。
用語“生物学的サンプル”とは、物理学的処理、例えばホモジナイゼーションまたは溶媒における溶解によって得られる液体サンプル、あるいは、生物学的処理、例えば食品、水、または血液からなる固体または液体産物の酵素分解から得られる液体サンプルを意味する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
ペトリ皿における従来のカウント方法を除いて、自動化されていない方法が、微生物を定量する従来技術に見られる。これらの方法は、主に、最も確からしい数（ＭＰＮ(Most probable number)）を決定することに基づく。
米国特許US-A-5700655は、液体サンプルにおける生物物質の定量のための装置を記載する。この装置は、熱成形によって得られたプラスチックシートからなり、このシート自体は、同じサイズの分析空洞と無菌性を維持するカバーからなる。この方法は、先ず、シートの中心に分析されるサンプルを添加し、次いで、反応混合物をこの装置に供給する。かくして調製されたこの装置は、同一の方法で空洞の全てを満たすように振り動かされ、過剰な反応混合物が除かれる。最後に、このシートを一以上のウェル中の微生物の存在を現すのに十分な時間インキュベートする。
【０００３】
しかしながら、従来のペトリ皿のようなこの装置は、サンプルを一回希釈させるだけに過ぎない。前記サンプルに含まれる微生物の濃度を確実に決定するために、サンプルが数回希釈される必要があることが分かっているので、少なくとも一度この操作を繰り返す必要がある。
さらに、この装置は、別の大きな欠点を有する。その欠点とは、過剰の反応混合物を除去する必要性にある。この操作は、シートを傾かせることによって行われ、一部の空洞はその内容物の一部を失うこともある。空洞の液体の量は、それゆえ、同一といえるものではなく、結果的に、微生物の量の決定に誤りが生じる。
【０００４】
さらに、過剰の反応混合物を除去することは、再処理される必要のある潜在的に汚染された排出物を生じる。同様に、過剰分の除去が装置の外側を汚染し、実験者とその者に接触する他の全ての表面を生物学的に汚染する原因になる。
さらに、空洞が集中的に配置されているので、読み出しも集中的に行われ、誤りの源となり、特に、陽性の空洞がしばしばシート上にわたって分布する。
最後に、上記装置は、ペトリ皿の基本的な欠点を備えている。すなわち、サンプルが、ある空洞から別の空洞に漏れまたは通過することを妨げるために、ゲル化機能が付与される場合、媒体がゲル化する間、慎重かつ水平に取り扱われなければならない。
【０００５】
米国特許US-A-5518892は、液体媒体における微生物の定量のための別の装置を開示する。これは、その一方の側に開口部を備えた、ある材料からなる、熱成形によって得られたバッグを備える。この方法は、加熱することによって、バッグの下面に不浸透性の仕切りまたは空洞を形成することからなり、種々の量のサンプルを分離可能にする。ウェルが形成されたら、反応混合物は、装置に供給された反応混合物に分析されるサンプルを添加することによって調製される。この反応混合物は、この目的のために設けられた開口部を介してバッグに注がれる。全ての空洞が適切に満たされたことを確認し、熱で密封した後、バッグを一以上の空洞の微生物の存在を現すのに十分な時間インキュベートさせる。この空洞は、同じ大きさまたは三つの連続した異なる大きさとすることができる。かくして、単一のバッグを用いて、いくつかの希釈に従ったシーディングを行うことが可能である。
【０００６】
しかしながら、このシステムは、ある欠点を有する。先ず、自動化された、非常に正確な産業上の注入成形システムとは異なって、この装置は、完全に同一の容量のウェルを得ることを可能にする最適成形能力を保証することができない。なぜなら、熱成形によって成形される基本的に単純なプラスチックシートが用いられるからである。これは、成形が、種々の量の連続したウェルを有するように製造される場合、特にこれらが少量である場合に、特に重要である。第二に、反応混合物は、手で導入され、それゆえ、ウェルへの分散が不規則に生じる。かくして、ウェルの大きさが完全に同一であったとしても、各ウェルに導入される反応混合物の量が同じであることに確実性はない。それゆえ、結果が誤る可能性がある。第三に、ウェルは、１８０℃以上の温度で熱密封によって隔離される。これは、ウェルに含まれるサンプル画分を不可逆的に損傷（分析される生物学的物質を破壊および／または前記物質を含む液体の全部または一部を蒸発）する危険性を有する。これは、ウェルが小さく、かつ、それが含む液体の量が少なくなるほど、敏感になる。この操作は、それゆえ、カウントおよび特徴決定の結果を誤る。
米国特許 US-A-4077845 は、各空洞がサイホンを介して溝に連結された分析カードを提案する。これは、必須ではないが、空洞間の液体の流れを妨げつつ、微生物が空洞に導入されることを可能にする。
独国出願 DE-U-29500587 は、血液サンプルを分類するための分析カードを記載する。このカードは、二つのプラスチックシートを組み合わせることによって得られ、これらの間に、溝のシステム、注入口、輸送ウェル、および種々の抗体を含む複数の分析空洞を規定している。空洞は、貫通空洞または通り抜けできない溝を備えることができるが、組み合わせられた二つのシートの前面および／または後面を被覆する一方または両方の透明フィルムが、微生物のカウントを可能にしない。
実際、上記の二つの文献では、本発明と同一の技術的課題を解決する試みはない。なぜなら、これらの文献の目的は、最初の生物学的サンプル中に存在する微生物の増殖を可能にすることであり、これらの微生物をカウントすることではな いからである。それゆえ、この問題は、質的なものであって、量的なものではない。
さらに、ウェル間のサンプルの分離は刊行物 US-A-4077845 に言及されているが、ウェル間の分離は必ずしも必要ではないことが記載されている。それゆえ、生物学的サンプル中に存在する微生物をカウントするためには適用できない。
米国特許 US-A-4018652 は、実施態様の一つにおいて、微生物の増殖を観察可能にする二つの異なる量のウェルを含む分析カードを提案する。統計的に、最初のサンプルに存在する微生物の数を調べることが可能である。このカードは、別の実施態様によれば、それぞれ小中大の量の三つのウェルを提案することによって、この統計学的測定の範囲をさらに増大可能にする。
欧州特許出願 EP-A-0745856 公報は、ほぼ同じタイプの分析カードを記載するが、唯一の主な差異は、前記空洞間の交差汚染の危険性を低減する目的で、空洞間の十分に長い溝が存在することである。
米国特許 US-A-4318994 も、上記二つの刊行物に類似している。基本的な差異は、空洞に入る溝の特定の形状にあり、これが、吸引効果により液体の流れを妨げることを可能にする。
本発明と異なって、これらの刊行物は、生物学的液体を輸送し、また、空洞を相互に分離する不活性流体を貯蔵する手段を形成するウェルを用いない。かくして、米国特許 US-A-4018652 では、記載されたカセットが、カセットのウェルおよび溝のシステム全体に液体サンプルを導入することによって満たされる。それゆえ、サンプルが導入されると、カードの全てのウェル間に、ウェルの大きさによらず、液体が連続して存在する。液体がカセットに存在すると、微生物は、なんの問題もなく、ウェルからウェルに移動することができ、また、溝の中で増殖することができる。
本発明では、各ウェルは、液体サンプルを輸送するが、それを貯蔵しない。なぜなら、貯蔵が、空洞に存在する液体画分を分離するための不活性流体に関連するものだからである。それゆえ、微生物はウェルからウェルに移動できない。それゆえ、ウェル間での汚染の危険性が無く、微生物の最初の濃度の統計学的計算を誤る危険性がない。
さらに、欧州特許出願 EP-A-0745856 公報は、気泡の存在が後の分析を不可能にすることを記載している。かかる記載は、当業者に、この種の分析カードに空気または他の不活性流体を導入することを促すものではない。しかしながら、本発明では、上述したように、気体状流体、例えば空気の存在が、種々のウェルを分離するために必要である。それゆえ、かかる構成とすることは自明ではない。
本発明によれば、提案された分析カードは、上記欠点の全てを克服するのに役立つ。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
このカードは、ウェルがいかなる大きさであっても、あるウェルから別のウェルに比例的であっても、全てのウェルを満たすことを可能にし、そして、それを満たす場合にとられる配置に注意を必要としない。“あるウェルから別のウェルに比例的”とは、同じ寸法を有する二つのウェルの間に比例関係が存在し、その比率が約１対１であるか、あるいは、異なる寸法のウェルでは、その比率は１対１とは異なることを意味すると解する。さらに、液体が閉じ込められたままなので、外側と試料の汚染の危険性が無く、その一方で、前記カードの各ウェル間に仕切りが設けられているので、カードの種々のウェル間にも汚染の危険性がない。
【０００８】
この目的のために、本発明は、好ましい第一の態様によれば、
−分析される生物学的液体をカードに注入するための領域、
−前記注入領域から来る生物学的液体の主要フィード溝、
−主要溝の延長に存在する少なくとも二つの第二溝、および
−それぞれの第二溝に対応する少なくとも一つのウェル
からなるボディを備えた分析カードであって、各ウェルが、各分析空洞の末端溝を介して、少なくとも二つの末端分析空洞に前記生物学的液体の所定量を輸送する手段を構成すること、並びに、分析される全体量が全ての分析空洞の全体量未満であることを特徴とする分析カードに関する。
【０００９】
本発明の第二の好ましい実施態様によれば、
−分析される生物学的液体をカードに注入するための領域、
−前記注入領域から来る生物学的液体の少なくとも二つのフィード溝、および
−それぞれのフィード溝に対応する少なくとも一つのウェル
からなるボディを備えた分析カードであって、各ウェルが、各分析空洞の末端溝を介して、少なくとも二つの末端分析空洞に前記生物学的液体の所定量を輸送する手段を構成すること、並びに、分析される量が全ての分析空洞の全体量未満であることを特徴とする分析カードに関する。
上記二つの実施態様によれば、生物学的液体の末端分析空洞への輸送は平行して行われる。
【００１０】
本発明の第三の好ましい実施態様によれば、
−分析される生物学的液体をカードに注入するための領域、
−前記注入領域から来る生物学的液体の主要フィード溝、
−主要溝の延長に存在する少なくとも二つの第二溝、および
−それぞれの第二溝に対応する少なくとも一つの空洞
からなるボディを備えた分析カードであって、各空洞が、前記生物学的液体の所定量を受ける手段を構成すること、並びに、分析される、カードに導入される量が全ての分析空洞の全体量より大きいことを特徴とする分析カードに関する。
先の実施態様によれば、分析空洞への生物学的液体の輸送は、連続して起こり、その後にパージされる。第一の実施態様によれば、生物学的液体を輸送する主要な手段として作用するウェルが、主要溝と第二溝との間に存在する。
【００１１】
二つの実施態様の一方によれば、第二溝の量は全て同一である。
これら三つの実施態様の一つの好ましいバージョンでは、末端分析空洞は、少なくとも二つの異なる量とされる。
好ましくは、末端分析空洞は三つの異なる量とされる。
異なる量の二つの空洞間に存在する比率は、１／５〜１／２０、１／５０〜１／２００、または１／５００〜１／２０００の間、特に１／１０、１／１００または１／１０００とされる。
同じ量の空洞は、手動および／または自動的な光学読み出しを容易にするために、幾何学的、例えば、一直線状または同心円状に並べられる。
【００１２】
また、本発明は、最初の二つの実施態様に示されているように、分析カードを満たす方法にも関し、
−所定量の分析される生物学的サンプルにこのカードの注入領域を連結する、
−前記カードの内部および／または近傍に真空を形成する、
−一方で、分析空洞に生物学的液体を移し、他方で、生物学的液体に由来し、前記分析空洞に存在する、サンプルの種々の画分を不活性流体を用いて単離するように真空を破壊し、かつ、
−得られた結果を分析して、最初の生物学的サンプルに存在する微生物または核酸、抗体のような他の生物学的物質の量を調べる
ことからなることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明は、第三の実施態様に示されるような分析カードを満たす方法にも関し、
−所定量の分析される生物学的サンプルにこのカードの注入領域または出口を連結する、
−前記カードの内部および／または近傍に真空または加圧を形成して、生物学的液体を空洞に移す、
−真空または加圧を停止する、
−生物学的液体に由来し、前記分析空洞に存在する、サンプルの種々の画分を不活性流体を用いて単離するように主要溝をパージする、かつ
−得られた結果を分析して、最初の生物学的サンプルに存在する微生物または核酸、抗体のような他の生物学的成分の量を調べる
ことからなることを特徴とする。
【００１４】
最初の二つのカードの実施態様によれば、真空が破壊されると、隔離流体が第二溝またはフィード溝、あるいは分析空洞の、生物学的液体と接触する。
好ましくは、分析される生物学的液体の量は、全ての分析空洞の全体量未満である。
第三の実施態様のカードによれば、分析される生物学的液体の量は、分析空洞の全て、流体回路（fluid circuit）の全て、およびオーバーフローの全体量よりも多いか等しい。
好ましくは、分析される生物学的液体の量は、全ての分析空洞および全ての流体回路の全体量よりも多いか等しい。
最初の二つの実施態様のカードによれば、全ての分析空洞の全体量に対する分析される生物学的サンプルの量の比率は、例えば、１／１０〜９／１０、特に４／１０〜６／１０、好ましくは５／１０である。
最後に、本発明は、最も確からしい数の技術を用いた微生物をカウントするための、上記分析カードの使用に関する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
添付の図面は例示であって、本発明の範囲を制限する性格を有するものではない。これらは、上記発明のいくつかの特別な実施態様を構成する。
本発明は、本質的に、添付図面に記載された分析カード１、２１または１０１に関する。
三つの特定の実施態様が記載されている。すなわち、図１、３、４、５、および１０の分析カード１の第一の実施態様、図２の分析カード２１の第二の実施態様、並びに、図１１ないし１６の分析カード１０１の第三の実施態様である。
【００１６】
図１および３を参照すると、分析カード１は、本質的に、分析カード１のボディ２によって形成された単一のモノブロック部材からなる。このボディ２は、分析される生物学的サンプル４を注入するための領域３を備える。
この注入領域３は、ボディ２のいずれの面にあっても良く、図１または３の前面、あるいは後面、あるいは側壁にあっても良い。これは、例えば、注入領域１３が側面にある、図５および６の場合である。図５において、カード１はチューブ３２に含まれたサンプル４で満たされていないが、前記サンプルに柔軟なパイプ３３を介して連結されている。かくして形成された組立物は真空チャンバーに配置される準備が整った状態にある。
図６は、図５のＡ-Ａ断面を示す。主要フィード溝５は、シケインを形成してカード１のボディ２の中心に向けられ、次いで、一方の側面に向けて前記カード１内を延びて注入領域３を構成する。カード１のボディ２とパイプ３３との間に存在するリンクは、ボディ２に配置された環状の溝１４と、この溝１４に適合するパイプ３３のショルダー１５によって与えられる。
【００１７】
当然、このために、ボディ２は、実質的に平行六面体形を有する。それゆえ、このボディ２は、モノブロックであり、内部に、ある数の溝と空洞９、１０または１１を有する。これらの空洞は、図７のような貫通ホール(through-hole)であっても、図８のような非貫通ホール(blind hole)であってもよい。
これらの溝および非貫通ホールは、前記ボディ２の表面に接着される透明な付着性フィルム３５を適用することにより外側から隔離される。
溝に関して、まず、注入領域３の下流にある、主要フィード溝５が存在することに注意すべきである。この溝５の下流にはウェル１２が存在し、これは分析される生物学的液体４を輸送するための主な手段として作用する。実際、主要溝５は、注入領域３とウェル１２の間に存在する。同様に、このウェル１２を一連のウェル７にリンクさせる第二溝６があり、各ウェル７が溝６に対応している。これらのウェル７は輸送手段として作用する。これらの各ウェル７には、所定の数の末端溝８が設けられ、各溝８はウェル７を末端分析空洞９、１０または１１に連結している。
【００１８】
これらの図には三種類の末端分析空洞が存在する。すなわち、大きな末端分析空洞９、中位の大きさの末端分析空洞１０、最後に、小さい末端分析空洞１１である。
それゆえ、分析カード１のボディ２に設けられた空洞は、一方で主要溝５、第二溝６および末端溝８によって形成された溝であり、他方、注入領域３、ウェル１２、ウェル７および一連の分析空洞９、１０および１１によって形成される非貫通ホールである。
異なる大きさの分析空洞９、１０および１１は、希釈を実施する必要に応じて分配することを可能にする。かくして、この分析空洞９、１０または１１に存在する液体の量に依存して、多数または少数の微生物が存在する。添加される培養培地に依存して、一部の微生物を増殖させることができ、各空洞９、１０または１１に存在するか否かに依存して、光学密度を変更可能にするか、蛍光または色（発色効果）が見えるようにするかあるいは見えなくする。これは、微生物の存在または不在を検出可能にし、それらをカウント可能にもする。例を以下に記載する。
【００１９】
【実施例】
特定の実施態様に従ると、このカード１の寸法は以下の通りである：
−カード１の長さは１３５ｍｍ；
−カード１の幅は８５．５ｍｍ；
−カード１の厚みは４ｍｍ；
−５、６および８の全ての溝の幅は０．５ｍｍ；
−主要溝５の深さは０．５ｍｍ；
−末端溝６の深さは、ウェル１２を通る仮想軸から各溝６の距離に従って変化する；この深さは、
・外側溝６の場合には０．５ｍｍ、
・中心および外側溝６の場合には０．５８ｍｍ、
・中心溝６の場合には０．６８ｍｍ、
・中心および内側溝６の場合には０．７９ｍｍ、
・内側溝６の場合には０．８７ｍｍ；
−末端溝８の深さは０．５ｍｍ；
−主要輸送手段１２の直径および深さは、それぞれ３ｍｍおよび１ｍｍ；
−輸送手段７の直径および深さは、それぞれ２ｍｍおよび１ｍｍ；
−注入領域３の位置は、前記カード１の基底部から４７．５ｍｍ、前記カード１内に５ｍｍに設けられ、この領域３は、この図１では示されていないが、カード１のエッジに溝を介して連結されても良いことに注意すべきであり、その直径は２ｍｍである；
−空洞９の深さは５００圧カードの場合には３．５６ｍｍであり、２５０圧カードの場合には２．３４ｍｍであり、これらの空洞９の長さおよび幅は一定であって、それぞれ１５ｍｍおよび４．５ｍｍである；
−空洞１０の深さは５００圧カードの場合には２ｍｍであり、２５０圧カードの場合には１．２７ｍｍであり、これらの空洞１０の長さおよび幅は一定であって、それぞれ６．５ｍｍおよび２ｍｍである；かつ、
−空洞１１の深さは５００圧カードの場合には０．８８ｍｍであり、２５０圧カードの場合には０．５３ｍｍであり、これらの空洞１１の長さおよび幅は一定であって、それぞれ４ｍｍおよび０．８ｍｍである。
【００２０】
“５００圧カード”とは、５００ｍｂａｒ、すなわち絶対真空に対して５００ｍｂａｒの絶対圧の真空に処された分析カード１を意味する。“２５０圧カード”の場合には、分析カード１は７５０ｍｂａｒ、すなわち絶対真空に対して２５０ｍｂａｒの絶対圧の真空に処される。これは、以下に定義するカード２１についても同様である。
【００２１】
全ての溝５、６および８は、球形ミリングカッターによって形成され、空洞９、１０および１１およびウェル３、７および１２は、柱状ミリングカッターによって形成される。これは、別のカード２１および１０１についても同様である。
図２に記載されている第二の実施態様によれば、分析カード２１のモノブロックボディ２２の中心に設けられた注入領域２３を備えた星形で示されていることから、分析カード２１はより単純である。実際、この注入領域２３は、図１のウェル１２に対応する。この領域２３から、所定の数のフィード溝２５が別れ、これらのフィード溝は、図２には示されていないが、分析される生物学的液体４を、分析カード２１の周辺部に分配するからである。
各フィード溝２５は、注入領域２３を輸送手段として作用するウェル２７に連結する。このウェル２７の後に、いくつかの末端溝２８が存在し、各末端溝２８は、ウェル２７を直接的に末端分析空洞２９、３０または３１に連結し、図１の実施態様と同様に、３０とラベルされた中位の大きさを挟んで、２９とラベルされた大きいものから３１とラベルされた小さいものまで、三つの異なる大きさを備えている。
【００２２】
特別な実施態様によれば、このカード２１の寸法は以下の通りである：
−カード２１の側面は１３５ｍｍ；
−カード１の厚みは４ｍｍ；
−２５および２８の全ての溝の幅および深さは同一で０．５ｍｍ；
−注入領域２３は、直径２ｍｍの貫通ホールとすることができるホールである；
−輸送手段２７の直径および深さはそれぞれ１．５ｍｍおよび１ｍｍ；
−空洞２９の深さは５００圧カードの場合には２．８５ｍｍであり、２５０圧カードの場合には１．８８ｍｍであり、これらの空洞２９の直径は１０ｍｍである；
−空洞３０の深さは５００圧カードの場合には１．８８ｍｍであり、２５０圧カードの場合には１．２０ｍｍであり、これらの空洞３０の直径は４ｍｍである；
かつ、
−空洞３１の深さは５００圧カードの場合には０．８５ｍｍであり、２５０圧カードの場合には０．４９ｍｍであり、これらの空洞３１の長さおよび幅は、それぞれ４ｍｍおよび０．８ｍｍである。
【００２３】
この図２では、分析空洞２９、３０および３１は環状の弓形に存在し、自動システムによる読み出しを容易にする。かくして、カード２１は、空洞２９、３０または３１が、図示されていないが、読み出しヘッドに交替で向き合うように回転される。
対照的に、図１および３では、種々の分析空洞９、１０および１１が整列していることから、読み出しは直線的である。さらに、大きな空洞９、中位の空洞１０および小さい空洞１１の間には、上に重なる仕切りがある。これは、自動読み取りシステムに対する適性を維持したまま、視覚的読み出しを容易にする。
図７および８によれば、空洞９、１０および１１は、異なる形状であっても良い。かくして、図７によれば、空洞は貫通空洞であり、すなわち各空洞の仕切りには、二つの透明な付着フィルム３５の存在が必要である。また、カード１を挟む単一のフィルム３５を有することもできる。この構造は、特に、光学密度の自動読み出しに適している。図８の場合では、空洞は、非貫通ホールからなる。単一のフィルム３５のみが前記空洞において空間を仕切るために用いられる。
【００２４】
透明な付着フィルム３５は、切断または収縮した後に、空洞９から１１（図１）および２９から３１（図２）の内容物に使用者が直接アクセス可能にすることから、有益に使用できる。
図１および３の実施態様を簡素化するために、分析される生物学的サンプル４をウェル１２に直接注入することができ、かくして、注入領域３と主要フィード溝５を有する必要性が無くなる。
以下、図１を参照するが、以下に説明されることは、図２に示される別の実施態様にも関連する。
各分析空洞９、１０または１１に導入される量が、同一または異なる量の各空洞９、１０または１１に同一または比例的になるように、種々の第二溝６の全てが同一の量を備える。かくして、図１に明確に記載されているように、分析カード１の中心に位置する第二溝６は、端にあるものよりも短い。それゆえ、全ての溝６の間で量が一定になるようにその広さまたは深さを変化させるのが適切である。同様に、末端溝８の長さは、同一量の各分析空洞９、１０または１１について同一である。
【００２５】
実際、小さい空洞１１と大きい空洞９、および中位の空洞１０との間には、比例関係が存在する。かくして、異なる量の二つの空洞の間に存在する比率は、図示した図面では、空洞１０と９そして空洞１１と１０の間では１ないし１０、空洞１１と９との間では１ないし１００である。この比例関係は、末端溝８にも適用され、これらの末端溝８は、大きな空洞９、中位の空洞１０または最後に小さい空洞１１のいずれに供給するかに基づいて、異なる寸法を有する。
分析カード１および２１の構造に関して、全ての溝、すなわち主要溝５、フィード溝２５、第二溝６または末端溝８または２８は、一つの分析空洞に存在する所定量のサンプルと別の分析空洞に存在する所定量のサンプルとの混入を避けるために互いに交わらない。このために、これらの種々の溝の交差点は、輸送手段としてのみではなく、サンプル４の導入後の混入を妨げる緩衝ボリューム(buffer volume)としても作用する、ウェルを常に介して成される。これらのウェルにおいて、分析される液体４の輸送は、全ての下流溝において平行に行われる。
【００２６】
分析カード１または２１を満たす方法は、
−一定量の分析される生物学的サンプル４に、カード１または２１の注入領域３または２３を連結する；
−前記カード１または２１の内部および／または近傍に真空を形成する、
−一方で、分析空洞９、１０および／または１１、あるいは２９、３０および／または３１に生物学的液体を移し、他方で、生物学的サンプル４に由来し、前記分析空洞９、１０および／または１１、あるいは２９、３０および／または３１に存在するサンプルの種々の画分を空気が仕切るように真空を徐々に破壊することからなる。
結果的に、真空が破壊されれば、図１および３の末端溝８または図２および４の末端溝２８において、あるいは分析空洞９、１０および１１（図１）、あるいは２９、３０および３１（図２）において、空気が生物学的サンプル４の画分と接触するようになる。これは、細菌間の物理的仕切りを形成する。もちろん、これは、生物学的サンプル４の量が、分析空洞の全体量、そして任意に、末端溝８または２８の量と一定の比率になる場合にのみ達成される。
【００２７】
空気の代わりに、この仕切り機能を付与するあらゆる流体、気体または液体を用いることができる。サンプルに含まれる生物学的化合物に関して前記流体が実質的に不活性であること、並びに前記サンプルと不混和性であることが確実となるように注意しなければならない。流体が例えば油のような液体である場合には、生物学的サンプルよりも低い密度を有する必要がある。
この場合、カード１は、図５に示されているように、実質的に垂直な位置に維持しなければならない。仕切り液は、図示されていないが、各空洞に含まれた生物学的サンプルの上に位置する。
しかしながら、空洞９、１０および１１、あるいは２９、３０および３１を物理的に仕切るまたは分けるためのその他の技術を使用することができる。かくして、微生物を増殖させる培養の途中で生物学的サンプル４にペプチン(peptine)のようなゲル化剤を添加することができる。この場合、そして、ゲル化剤が作用した場合、カード１を実質的に垂直な位置に維持する必要はない。
【００２８】
最後に、前記空洞９、１０および１１、あるいは２９、３０および３１が、末端溝８を遮断することによって仕切られても良い。例えば、仕切り流体のような接着剤を用いることができ、また、末端溝が物理的加圧によって遮断されても良い。
本発明に係る方法を用いて満たす特定の有利な方法では、分析される生物学的サンプル４の量は分析空洞９、１０および１１（図１）、あるいは２９、３０および３１（図２）の全ての全体量よりも少ない。分析空洞９、１０および１１の全ての全体量に対する生物学的液体４の量の比率は、好ましくは１ないし２である。
さらに、空洞９、１０および１１、あるいは２９、３０および３１を満たすことは、所定の充填時間で、同時に行われ、各サイズの空洞、小、中、大の全体量に対する、各小、中、大の大きさの空洞に存在する液体の量の比率は、カード１または２１の空洞９、１０および１１、あるいは２９、３０および３１の全てについて一定である。
【００２９】
第三の実施態様は、図１１ないし１６に明確に記載されている。最初の二つの実施態様とは、構造と機能において区別される。かくして、この実施態様の特定の構造は、分析される液体４の輸送を可能にし、これは最初の二つの実施態様のケースのように平行的でなく、連続的に行われる。
図１１は、この構造に結びついた機能を明確に理解可能にするものである。この分析カード１０１は、先のカード１および２１と類似して、側部に注入領域１０３が設けられたボディ１０２を含む。ある特定の実施態様によれば、この領域１０３は、主要フィード溝１０５の延長にあり、オーバーフロー１０４として作用するリザーバーに達する前にカード１０１全体を通り、このオーバーフロー１０４自体は、出口１２７を介して外部と連結されている。分析空洞１０９、１１０および１１１の全てが主要溝１０５から分岐していることに注意すべきである。これらの分岐はそれぞれ、前記空洞１０９、１１０および１１１において１１５とラベルされており、これは、それらが主要溝１０５の構成要素であっても適用される。カード１０１の構造および構成要素は、空洞１０９、１１０および１１１の充填が行われるようにその移動において液体４に影響し、分離によって前記空洞１０９、１１０および１１１に分注量を存在させる。かかる構造および操作は、すでに本出願人の研究の主題を形成しており、これは１９９９年３月９日に出願された仏国特許出願９８／０３０３３に出願されている。
【００３０】
このカード１０１は、１０の大きな末端分析空洞１０９、１０の中位の末端分析空洞１１０および１０の小さい末端分析空洞１１１を含む。空間的理由から、同一の大きさの空洞１０９、１１０または１１１の各グループは二列に分配され、それによって前記カード１０１の視覚的読み出しを容易にしている。大きな空洞１０９と中位の空洞１１０はほとんど同じ構造を備え、サンプル４を向けるために、出口１２７において適用された真空または入り口１０３において（主要溝１０５において）適用された加圧のいずれかと関連すると共に、重力（空洞１０９および１１０において）を必須に使用するが、小さい空洞１１１は異なる構造を備え、前記サンプルで満たすために毛細管効果を必須に用いる。出口１２７で適用された真空または入り口１０３で適用された加圧は、約５〜２０ｍｂａｒ、好ましくは１０ｍｂａｒとされる。
【００３１】
図１１を参照すると、中位の空洞１１０、および大きな空洞１０９は、主要溝１０５と第二溝１０６、および１０７との間に交差を備える。各第二溝１０６および１０７は、問題の空洞１０９または１１０の上および横の位置において終点になる。前記空洞１０９または１１０の上および中心端は、主要フィード溝１０５に連結させる。溝１０５は、上方分岐１１３を介して次の空洞１０９、１１０または１１１に向けられている。この主要溝１０５の上流／上方分岐１１３リンクには、二つのウェル１１２と１１４がある。主要溝１０５は、各空洞１０９と１１０をバイパスするための分岐１１５において、サンプル４の流れを減速するウェル１１２を有する。好ましい方向は、重力による、第二溝１０６または１０７の向きである。上方分岐１１３も、サンプル４の流れを妨げるウェル１１４を有する。好ましい方向は、吸引による、主要溝１０５を介した他の空洞への液体４の流れである。
【００３２】
以下、図１３を参照すると、小さい空洞１１１は主要溝１０５と第二溝１０８との間に、交差点を有する。各第二溝１０８は、問題の空洞１１１の上および中心の位置において終結する。前記空洞１１１の下方かつ中心の端は、主要フィード溝１０５に連結され、これは下方の分岐１１７により次の空洞１１１または出口１２７へと向けられる。この主要溝１０５の上流／下方分岐１１７リンクには二つのウェル１１６と１１８がある。ウェル１１６は溝１０５の上流に存在し、ウェル１１８は分岐１１７の上流に存在する。主要溝１０５は、各空洞１１１において、サンプル４の流れを減速するウェル１１６を備える。好ましい方向は、毛細管効果により、第二溝１０８の向きである。下方分岐１１７も、サンプル４の流れを妨げるウェル１１８を有する。好ましい方向は、吸引による、主要溝１０５を介した他の空洞への液体４の流れである。
【００３３】
主要溝１０５は、
−主要溝１０５／第二溝１０６リンクと主要溝１０５／上方分岐１１３リンクとの間の空洞１０９；
−主要溝１０５／第二溝１０７リンクと主要溝１０５／上方分岐１１３リンクとの間の空洞１１０；
−主要溝１０５／第二溝１０８リンクと主要溝１０５／下方分岐１１７リンクとの間の空洞１１１；
において、１１５とラベルされている。
また図１１は、種々の遅延ウェル１２１、１２２、１２３、１２４、１２５および１２６の存在を示す。空洞１０９、または１０９と１１０、または１０９、１１０および１１１の全てまたは一部が満たされることが望まれる場合に、これらの遅延ウェル１２１、１２２、１２３、１２４、１２５および１２６は、液体４の移動の可能性のある制御を分析可能にする。図１１には示されていないが、カード１０１の内部汚染の危険性を顕著に低減すべく、第一の空洞１０９の前と最後の空洞１１１の後に、主要溝１０５に適合した、さらに二つのバルブを有することができる。バルブの一方は、遅延ウェル１２１に設けられ、他方は、オーバーフロー１０４の前に設けられる。かかるバルブは、本件特許出願人により、それぞれ１９９８年９月８日および１９９９年６月１４日付で出願された仏国特許出願９８／１１３８３および９９／０７６８９に記載されている。
【００３４】
図１２および１３は、カード１０１に含まれた流体（液体４と空気）の移動をより詳細に示す。
図１２によれば、液体４はＦ１の向きで主要溝１０５を介して到達し、好ましくはＦ２の向きで、第二溝１０６を介して空洞１１０に流入する。液体４が上方分岐１１３における下方開口と接触するまで空洞１１０が満たされる。この点において、空気のみが主要溝１０５へＦ３の向きに放出される。次いで、液体４は、他の空洞１１０または１１１にＦ５の向きで流出するようにバイパス分岐１１５の方向をＦ４の向きに向ける。バイパス分岐１１５は、このポイントで圧力降下を生じるウェル１１２を有し、それによって液体に容易な通路、すなわち第二溝１０７を選択させ、このポイントで流れを減速させる。また上方分岐１１３も、このポイントで圧力降下を生じ、前記流体４の流れを妨げるウェル１１４を有し、液体に容易な通路、すなわちバイパス分岐１１５を選択させる。
【００３５】
図１３によれば、液体４はＦ１の向きで主要溝１０５を介して到達し、好ましくはＦ２の向きで、第二溝１０８を介して空洞１１１に流入する。それゆえ、空洞１１１が完全に満たされ、次いで液体４がＦ６の向きに下方分岐１１７に流れ始める。言うまでもなく、圧力降下がこのポイントにおいて非常に大きいことから、液体４は、他の空洞１１１またはオーバーフロー１０４に向けて、そしてその後の出口１２７に向けて、Ｆ５の向きで流出するようにバイパス分岐１１５の方向をＦ４の方向に向ける。この分岐１１７において、前記液体４が主要溝１０５に戻ることを妨げるウェル１１８が存在する場合には圧力降下はより大きくなる。このポイントにおいて、空気も主要溝１０５にＦ６の向きで排出される。バイパス分岐１１５は、このポイントで圧力降下を生じるウェル１１６を有し、それによって、液体４に容易な通路、第二溝１０８を選択させる。
【００３６】
カード１０１内に移された液体４の全体量は、空洞１０９、１１０および１１１の全ての全体量よりも多く、前記空洞１０９、１１０および１１１の全て、溝および分岐の全て、並びにオーバーフロー１０４の量の全体量の合計以下である。一部の実施態様では、前記オーバーフロー１０４に存在し、重力の下でこのポイントで流出する液体４のレベルは、オーバーフロー１０４の出口１２７の挿入ポイント以下である。この目的は、前記空洞１０９、１１０および１１１の間に仕切りを生じるために、液体４が全ての空洞１０９、１１０および１１１を満たした後で、空気を主要フィード溝１０５の液体４と置換することである。
【００３７】
好ましくは、カード１０１内に移された液体４の全体量は、前記空洞１０９、１１０および１１１の全ての全体量の合計以下である。結果的に、実施される必要のある分析に関して不活性な流体または空気を用いて、空洞１０９、１１０および１１１の全てが満たされた後に、主要溝１０５からあらゆる液体４をパージすることが可能である。このパージは、全ての空洞の内容物を互いから仕切る。
上述したように、大きい空洞１０９と中位の空洞１１０は、重力の下で液体４が流れることによって操作されるが、小さい空洞１１１は毛細管効果によって操作される。さらに、カード１０１の内部および外部寸法に関して記載された大きさがこれらの現象を明らかにする。
【００３８】
図１４、１５および１６では、大きな空洞１０９と中位の空洞１１０への輸送をさらに容易にするために、これらの空洞１０９と１１０は、第二溝１０６または１０７に対応する、前記空洞１０９または１１０の流入口からの距離に依存した特異的な形状をした水切り手段１１９を備えていることに注意すべきである。かくして、水切り手段１１９は、この手段１１９と空洞１０９または１１０の側壁との間にエッジを備えた、この流入口にできるだけ近い肩の形状を有するが、この角は徐々に消滅して曲線に変わり、カード１０１のボディ１０２の底部１２０と接合する。
【００３９】
カード１０１の寸法は、非限定的な例で与えられている。かくして、カード１０１は１０８ｍｍの幅、１１８ｍｍの長さおよび４ｍｍの厚みを有する。他の寸法は以下の通り：
−主要溝１０５、それゆえ分岐１１５は、Ｕ形断面を備え、その開口はフィルム３５によって閉じられ、このＵ字の幅および深さは０．５ｍｍである；
−上方分岐１１３と下方分岐１１７は、Ｕ形断面を備え、その開口はフィルム３５によって閉じられ、このＵ字の幅および深さは０．２ｍｍである；
−大きな空洞１０９の深さ、長さおよび幅は、それぞれ、３．１ｍｍ、２０ｍｍおよび５．５ｍｍである；
−中位の空洞１１０の深さ、長さおよび幅は、それぞれ、１．８ｍｍ、６ｍｍおよび３．５ｍｍである；
−小さな空洞１１１の深さ、長さおよび幅は、それぞれ、１ｍｍ、３ｍｍおよび１ｍｍである；
−オーバーフロー１０４の深さ、長さおよび幅は、それぞれ、３．６ｍｍ、２５ｍｍおよび２４ｍｍである；
−空洞１０９におけるウェル１１２の直径は２ｍｍであり、各ウェルは直径２ｍｍの球状のミリングカッターによって形成された深さが１ｍｍの球形キャップである；
−空洞１１０におけるウェル１１２の直径は１．５ｍｍであり、空洞１０９と１１０におけるウェル１１４の直径および空洞１１１におけるウェル１１６と１１８の直径と同じであり、各ウェルは直径１．５ｍｍの球状のミリングカッターによって形成された深さが０．７５ｍｍの球形キャップである；
−出口溝１２７は、Ｕ形断面を備え、その開口はフィルム３５で閉じられ、Ｕ字の幅と深さはそれぞれ１ｍｍと０．５ｍｍである；かつ、
−遅延ウェル１２２、１２３、１２４、１２５および１２６は、全て３ｍｍの直径を備え、各ウェルは直径３ｍｍの球状のミリングカッターによって形成された深さが１．５ｍｍの球形キャップである。
【００４０】
生物学的サンプル４に含まれる微生物がカウントされる方法は、食品分野において用いることができる。以下に記載された例において、この方法は以下の通りである。
先ず、液体サンプル４を調製することからなる。かくして、約１０ｇの食品に対して、９０ｍｌのペプトン水が、フィルターを備えたストマチャー(Stomacher)バッグに添加される。ストマチャーバッグ中のサンプルを１〜２分間ホモジナイズする。かくして、１０-1の第一希釈物が得られる。さらなる希釈は、４９ｍｌの培養培地を含むフラスコにストマチャーバッグ中の１ｍｌの液体を移すことによって調製され、この混合物をホモジナイズする。それゆえ、希釈は２ｘ１０3、すなわち１／５００である。
【００４１】
大きな空洞９の量が２００μｌ、中位の空洞１０の量が２０μｌ、かつ小さい空洞１１の量が２μｌであることが分かるので、各サイズとも２０の空洞９、１０または１１があれば、空洞９、１０または１１の全体量は４４４０μｌである。これらの例は例示として与えられていることに注意すべきである。例えば、ある大きさの空洞から別のものにかけて変化する、多数の空洞９、１０および１１を有することができる。
１ないし２という全ての空洞の全体量に対する生物学的液体４の量の予め確立された比率に従うために、２２２０μｌが前記フラスコからチューブ３２に移される。柔軟なパイプ３３がカード１に存在して共に消耗品を形成するか、あるいは使用前に前記カードに連結される。チューブ３２は、支持体に垂直に配置され、チューブ３２の内容物が柔軟なパイプ３３を介してカード１の注入領域３に連結される。かくして形成され、図５に記載された組立物全体が、分析空洞９、１０または１１に前記チューブ３２中のサンプル４が完全に移される準備のために真空に配置される。次いで、真空が徐々に、すなわち、少なくとも１０秒で、破壊される。
【００４２】
かくして、図９は、適切な真空を与えるために用いた減圧が、部分的な真空であっても、ほぼ８５０ミリバールでなければならず、かつ、１分で達成されることを明確に示す。同様に、通常の圧力への復帰は、徐々に一分で行われる。次いで、装置全体が真空チャンバーから除かれる。分析カード１は、パイプ３３において切断および開封することによって密封され、このポイントにおいて、前記カード１の側面で急に流れ、次いでチューブ３２が取り除かれる。カードは垂直な位置に放置される。これは絶対に必要というものではない。この位置において、種々のカード１が３０℃で約２４時間インキュベートされる。
かくして、１００、１０および１μｌの生物学的サンプルが各空洞９、１０および１１に分配された。
最後に、蛍光または色素マーカーを使用した場合には、その光学密度またはその着色に関して変更された分析空洞９、１０および／または１１の総数をカウントすることによってカード１を読みとることができる。いずれの状況においても、これは、現れることが望まれる微生物のタイプの顕色に対応する。外観に変化の現れた、大きな分析空洞９、中位の分析空洞１０および小さい分析空洞１１の総数に従って、最初のサンプルに含まれる微生物の正確な量を調べるために、後述する表１を参照することができる。
【００４３】
サンプルにおける細菌の最も確からしい数（ＭＰＮ）は、R.J.Parnow (1972); Cf.PARNOW RJ, 1972-Computer program estimates bacterial densities by means of the most probable numbers, Food Technology 7, 56-62に説明されている、統計学的な方法を用いて算出される。しかしながら、この方法は、陽性チューブの三つの数に関して現存する組合せの全てを与え、ありそうもない、または統計学的に誤った組合せがある。例えば、１００μｌのサンプルを含む空洞（第一希釈）における陽性チューブがないこと、および１μのサンプルを含む空洞（第三希釈）においてそれが２０もあることは信じ難い。
かくして、みかけ確率は、陽性の組合せに関連する。これを行うために、J.C.De Man (1975)の方法が用いられる；Cf. DE MAN J.,1975-The probability of most probable numbers, European Journal of Applied Microbiology, 1, 67-68、次いで、この著者に従って、陽性の種々の組合せが定義される：
・カテゴリー１は、最高確率組合せの全てを含み、その確率の合計は９５％である；
・カテゴリー２は、組合せの全てを含み、その確率の合計は次の４％を示す；
・カテゴリー３は、全ての組合せを含み、その確率の合計は残りの１％を示す。
以下の表１では、カテゴリー１の組合せのみが、それらと関連するＭＰＮと共に記載されている。この表は希釈を考慮に入れていないので、表１に見られるＭＰＮは、最初のサンプルの汚染レベルを得るために全希釈係数をかける必要がある。
【００４４】
表１：最も確からしい数（ＭＰＮ）技術によりサンプルにおける最初の濃度を調べるための陽性空洞の種々の組合せの表
【表１】
微生物の分布が、特にそれらがあまり多数でなければ、以下の例と同じように均一とならない可能性が高い。
図３に関して、分析空洞９の全てにおいて微生物の増殖があることがわかる。一方、小さい分析空洞１１には、増殖が見られない。中位の空洞１０の場合には、２０の内の１１の空洞のみが何らかの増殖を示す。表１を参照すれば、２０／１１／０の組合せは、７０ＣＦＵ／ｇという、産物のグラム当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｇ）を与える。最初の希釈が１／５００なので、微生物の最初の濃度が７０ｘ５００、すなわち３５０００ＣＦＵ／ｇであったことが推定できる。
【００４５】
図４では、１８の分析空洞が微生物の増殖を示している。同様に、３つの分析空洞１０と、一つの分析空洞１１が増殖を示している。このことから、先の例と同様に、最初の濃度は２２ｘ５００、すなわち１１０００ＣＦＵ／ｇであったことが推定できる。
図１０では、２０のうちの６つの分析空洞９が微生物の増殖を示している。一方、空洞１１は全く変更されていないが、分析空洞１０の二つだけが増殖を示している。このことから、５００倍に希釈されたこのサンプルにつき、最初の濃度が２１００ＣＦＵ／ｇであったことが推定される。
この表を参照することによって、５００倍に希釈されたサンプルにつき、単一の分析カード１または２１を用いて２２５〜１．５ｘ１０6ＣＦＵ／ｇの最初の微生物濃度を調べることが可能であることが分かる。一方、従来の技術は、一般に、この結果における範囲を得るためには４つの消耗品を用いる。また、正確な濃度は分からないが、これらの値よりも小さいまたは大きい濃度を決定することもできる。次いで、正確な最終結果を知るために、先の結果に合わせて調節されたさらなる希釈をすることができる。
【００４６】
当然、カードの調査範囲を増大するために、４または５、あるいはそれ以上の異なる大きさの空洞を含む異なる分析カードを有することができる。
もちろん、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、抗体または抗原のような他の生物学的分子または物質をカウントすることができる。これらは、ラベルされている抗生物学的物質抗体によって現されてもよい。
チューブ３２に、サンプル４より低密度の不混和性液体を添加することもできる。これは、前記サンプル４の後に吸い込まれ、各空洞に分配された種々の量を隔離する。また、一方が生物学的サンプル、他方が隔離液を含有する二つのチューブ３２を有し、第一のチューブ３２と第二のチューブ３３に交互にパイプ３３を浸すこともできる。最後に、カード１に二つのパイプ３３を有することもできる。空洞９、１０および１１の全体量が４４４０μｌであり、サンプル４の量が２２２０μｌなの出、隔離液の量は２２２０μｌであってもよい。密封されたらカード１に空気が存在することが望まれるのであればより少なく、また、カードがサンプル４と隔離液で完全に満たされることが望まれるのであればより多くすることができる。後者の場合には、この技術は、嫌気性微生物の増殖に有利である。
【００４７】
カード１に移されるサンプル４の量が正確に測定されるように、自動化を利用しない三つの選択がある。
第一の選択は、チューブ３２を正確な量のサンプル４で満たすことに関する。柔軟なパイプ３３が自由端３４を前記サンプル４の最下レベルに有するから、サンプル４の全てが移される。
第二の選択は、チューブ３２の内部において、前記サンプル４に浸された自由端３４の位置によってあらかじめ決められる所定量のサンプル４でカード１を満たすことに関する。吸い込まれたサンプル４は、前記端３４の上に存在する液体カラム４に対応し、この上のカラムの液体のみが移される。
【００４８】
最後に、第三の選択は、非常に大量のサンプルでチューブ３２を満たすことに関する。真空を破壊することによって、輸送は、操作する者が、サンプル４から柔軟なパイプ３３の端３４を直接または間接的に取り除くまで行われ、サンプル４から空洞９、１０および１１へのフラクションの輸送が続けられる。
それゆえ、サンプル４を輸送する際に、前記サンプル４と同一水準でサンプリングが行われることが容易に理解できる。それゆえ、柔軟なパイプ３３の自由端３４が隔離流体にあるまで低減する、サンプル４のレベルである。それゆえ、第二に、カード１に輸送されるこの流体である。サンプル４よりも低いその密度により、そして、図５に示されているような、カード１の位置により、前記流体は、空洞９、１０および１１に輸送された種々の少量のサンプル４の物理的かつ生物学的なバリアとして作用する。
【００４９】
また、ゲル化剤を媒体中に用いることもできる。この技術は、空気のような気体状流体を用いた、種々の空洞９、１０および１１（図１）または２９、３０および３１（図２）間の仕切りを容易にすることができる。
空洞９、１０および１１に輸送された量が、同じ大きさの空洞間、および異なる大きさの空洞間でほぼ同じであることをチェックするために、テストが行われた。
かくして、小さい空洞１１を用いて、三回のテストが２０のウェルに対して行われた。このテストは８７５ミリバールの真空を用いて、２２２０μｌの脱塩水を用いて行われた。結果は、以下の表２に記載されている。
【００５０】
表２：小さい空洞における生物学的サンプルの分配のテスト
【表２】
中位の空洞１０を用いて同様に、三回のテストが２０のウェルに対して行われた。このテストは８７５ミリバールの真空を用いて、２２２０μｌの脱塩水を用いて行われた。結果は、以下の表３に記載されている。
【００５１】
表３：中位の空洞における生物学的サンプルの分配のテスト
【表３】
先の二つの場合と同様に、大きい空洞９を用いて、三回のテストが２０のウェルに対して行われた。このテストは先の条件と同じ条件下、すなわち８７５ミリバールの真空を用いて、２２２０μｌの脱塩水を用いて行われた。結果は、以下の表４に記載されている。
【００５２】
表４：大きい空洞における生物学的サンプルの分配のテスト
【表４】
三回のテストの平均がほぼ一定であったことから各ウェルまたは同じ大きさの空洞９、１０または１１に存在する量が比較的一定であること、並びに、標準偏差と変動係数が小さいことに注意すべきである。
実際、標準偏差は、いかなる量でも一定であり、このため、変動係数の減少があり、これはサンプルに含まれる液体の量の増加に比例する。実際、これらの結果は、最初のサンプルを輸送した後に各ウェルまたは空洞９、１０または１１に存在する液体の測定における正確さの問題による。
言うまでもなく、これらの結果は、特に有利であり、最初の生物学的サンプル４に存在する核酸、抗体または微生物のようなあらゆる生物学的物質の濃度を測定する方法の使用を可能にする。
【００５３】
分析カード１は、生物学的液体における微生物をカウントするための医学分野においても使用できる。
以下の例は、尿の微生物をカウントするために尿を分析する状況で用いられるプロトコルを記載する。採取された尿は、５ｍｌの培養培地を含むチューブに１０μｌの投与量をサンプリング容器から輸送（ホモジナイゼーション後）することによって希釈される。
ホモジナイゼーション後、２ｘ１０-3、すなわち１／５００希釈が得られる。次いで、２２２０μｌのこの希釈物をチューブ３２に移す。次いで、カード１を満たし、インキュベートし、最後に上記の例と同様に読みとる。しかしながら、インキュベーション温度はより高く、３７℃に近い。
尿の汚染が２２５ＣＦＵ／ｍｌから１．５ｘ１０6ＣＦＵ／ｍｌの間である場合には、このプロトコールを用いて、尿の微生物をカウントすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 生物学的サンプルにおける微生物をカウントおよび特徴決定することを可能にする、本発明に係るカードの第一の実施態様の平面図を示す。
【図２】 生物学的サンプルにおける微生物をカウントおよび特徴決定することを可能にする、本発明に係るカードの第二の実施態様の平面図を示す。
【図３】 図１と同一であるが、部分的な図を示す。このカードは、ある微生物集団をカウントおよび特徴決定するために用いられた。
【図４】 図１と同一であるが、部分的な図を示す。このカードは、別の微生物集団をカウントおよび特徴決定するために用いられた。
【図５】 生物学的サンプルを含む容器にチューブを介して連結されている、図１および図３に示された分析カードの遠近法による図を示す。
【図６】 図５のＡ-Ａの断面図を示す。
【図７】 図５のＢ-Ｂの断面図を示す。
【図８】 図７と同じ断面図を示すが、分析カードが空洞において異なる別の実施態様からなる。
【図９】 カード、サンプル、チューブおよびパイプによって形成された組立物を前記サンプルを前記カードの空洞に輸送することを可能にする位置に配置した、真空ベル(vacuum bell)内における、圧力の変化を示す曲線を示す。
【図１０】 図１と同一であるが、部分的な図を示す。このカードは、別の微生物を含有するサンプルをカウントおよび特徴決定するために用いられた。
【図１１】 生物学的サンプルにおける微生物をカウントおよび特徴決定することを可能にする、本発明に係るカードの第三の実施態様の平面図を示す。
【図１２】 中位の大きさの分析空洞の詳細な図を示す。
【図１３】 小さい分析空洞の詳細な図を示す。
【図１４】 図１１のＣ-Ｃの断面図を示す。
【図１５】 図１１のＤ-Ｄの断面図を示す。
【図１６】 図１１のＥ-Ｅの断面図を示す。
【符号の説明】
１ 分析カード
２ 分析カード１のボディ
３ カード１の注入領域
４ 分析される生物学的液体またはサンプル
５ 主要フィード溝
６ 第二溝
７ 輸送手段または各溝６に対応するウェル
８ 末端溝
９ 溝８に対応する大きな末端分析空洞
１０ 溝８に対応する中位の末端分析空洞
１１ 溝８に対応する小さい末端分析空洞
１２ 主要輸送ウェルまたは手段
１３ 側面注入領域
１４ ボディ２における環状の溝
１５ 溝１４に適したパイプ３３のショルダー
２１ 分析カード
２２ 分析カード２１のボディ
２３ カード２１の注入領域
２５ フィード溝
２７ 輸送手段または各溝２５に対応するウェル
２８ 末端溝
２９ 溝２８に対応する大きな末端分析空洞
３０ 溝２８に対応する中位の末端分析空洞
３１ 溝２８に対応する小さい末端分析空洞
３２ サンプル４を含有するチューブ
３３ チューブ３２に領域３を連結するパイプ
３４ パイプ３３の自由端
３５ 透明な付着フィルム
１０１ 分析カード
１０２ 分析カード１０１のボディ
１０３ カード１０１の注入領域
１０４ オーバーフロー
１０５ 主要フィード溝
１０６ 空洞１０９の第二溝
１０７ 空洞１１０の第二溝
１０８ 空洞１１１の第二溝
１０９ 溝１０６に対応する大きな末端分析空洞
１１０ 溝１０７に対応する中位の末端分析空洞
１１１ 溝１０８に対応する小さい末端分析空洞
１１２ 空洞１０９または１１０において主要溝１０５におけるサンプル４の流れを遅延させるためのウェル
１１３ 空洞１０９または１１０の上方分岐
１１４ サンプル４の分岐１１３への流れを妨げるウェル
１１５ 空洞１０９、１１０または１１１をバイパスする分岐
１１６ 空洞１１１における主要溝１０５へのサンプル４の流れを遅延させるウェル
１１７ 空洞１１１の下方分岐
１１８ 分岐１１７へのサンプル４の流れを妨げるウェル
１１９ サンプル４を水切りする手段
１２０ 空洞１０９、１１０または１１１においてカード１０１のボディ１０２の底部
１２１ 注入領域１０３と主要溝１０５の間のバルブ
１２２ 空洞１０９の二つのレベルの間のバルブ
１２３ 空洞１０９と空洞１１０の間のバルブ
１２４ 空洞１１０の二つのレベルの間のバルブ
１２５ 空洞１１０と空洞１１１との間のバルブ
１２６ 空洞１１１の二つのレベルの間のバルブ
１２７ オーバーフロー１０４の出口
Ｆ１ 主要溝５を介したサンプル４の第二溝１０６、１０７または１０８への流入
Ｆ２ 第二溝１０６、１０７または１０８を介したサンプル４の空洞１０９、１１０または１１１への流入
Ｆ３ 空洞１０９または１１０の上方分岐１１３を介した空気の輸送
Ｆ４ 空洞１０９、１１０または１１１における主要溝５を介したサンプル４の輸送
Ｆ５ 空洞１０９、１１０または１１１における主要溝５を介したサンプル４の流出
Ｆ６ 空洞１１１の下方分岐１１７を介した空気および／またはサンプル４の輸送
【発明の属する技術分野】
本発明は、生物学的サンプルにおける、微生物または、核酸または抗体のような他のあらゆる生物学的物質をカウントおよび特徴決定することを可能にするための分析カードに関する。また、本発明は、かかるカードを満たす方法、並びに、かかるカードの使用にも関する。
用語“生物学的サンプル”とは、物理学的処理、例えばホモジナイゼーションまたは溶媒における溶解によって得られる液体サンプル、あるいは、生物学的処理、例えば食品、水、または血液からなる固体または液体産物の酵素分解から得られる液体サンプルを意味する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
ペトリ皿における従来のカウント方法を除いて、自動化されていない方法が、微生物を定量する従来技術に見られる。これらの方法は、主に、最も確からしい数（ＭＰＮ(Most probable number)）を決定することに基づく。
米国特許US-A-5700655は、液体サンプルにおける生物物質の定量のための装置を記載する。この装置は、熱成形によって得られたプラスチックシートからなり、このシート自体は、同じサイズの分析空洞と無菌性を維持するカバーからなる。この方法は、先ず、シートの中心に分析されるサンプルを添加し、次いで、反応混合物をこの装置に供給する。かくして調製されたこの装置は、同一の方法で空洞の全てを満たすように振り動かされ、過剰な反応混合物が除かれる。最後に、このシートを一以上のウェル中の微生物の存在を現すのに十分な時間インキュベートする。
【０００３】
しかしながら、従来のペトリ皿のようなこの装置は、サンプルを一回希釈させるだけに過ぎない。前記サンプルに含まれる微生物の濃度を確実に決定するために、サンプルが数回希釈される必要があることが分かっているので、少なくとも一度この操作を繰り返す必要がある。
さらに、この装置は、別の大きな欠点を有する。その欠点とは、過剰の反応混合物を除去する必要性にある。この操作は、シートを傾かせることによって行われ、一部の空洞はその内容物の一部を失うこともある。空洞の液体の量は、それゆえ、同一といえるものではなく、結果的に、微生物の量の決定に誤りが生じる。
【０００４】
さらに、過剰の反応混合物を除去することは、再処理される必要のある潜在的に汚染された排出物を生じる。同様に、過剰分の除去が装置の外側を汚染し、実験者とその者に接触する他の全ての表面を生物学的に汚染する原因になる。
さらに、空洞が集中的に配置されているので、読み出しも集中的に行われ、誤りの源となり、特に、陽性の空洞がしばしばシート上にわたって分布する。
最後に、上記装置は、ペトリ皿の基本的な欠点を備えている。すなわち、サンプルが、ある空洞から別の空洞に漏れまたは通過することを妨げるために、ゲル化機能が付与される場合、媒体がゲル化する間、慎重かつ水平に取り扱われなければならない。
【０００５】
米国特許US-A-5518892は、液体媒体における微生物の定量のための別の装置を開示する。これは、その一方の側に開口部を備えた、ある材料からなる、熱成形によって得られたバッグを備える。この方法は、加熱することによって、バッグの下面に不浸透性の仕切りまたは空洞を形成することからなり、種々の量のサンプルを分離可能にする。ウェルが形成されたら、反応混合物は、装置に供給された反応混合物に分析されるサンプルを添加することによって調製される。この反応混合物は、この目的のために設けられた開口部を介してバッグに注がれる。全ての空洞が適切に満たされたことを確認し、熱で密封した後、バッグを一以上の空洞の微生物の存在を現すのに十分な時間インキュベートさせる。この空洞は、同じ大きさまたは三つの連続した異なる大きさとすることができる。かくして、単一のバッグを用いて、いくつかの希釈に従ったシーディングを行うことが可能である。
【０００６】
しかしながら、このシステムは、ある欠点を有する。先ず、自動化された、非常に正確な産業上の注入成形システムとは異なって、この装置は、完全に同一の容量のウェルを得ることを可能にする最適成形能力を保証することができない。なぜなら、熱成形によって成形される基本的に単純なプラスチックシートが用いられるからである。これは、成形が、種々の量の連続したウェルを有するように製造される場合、特にこれらが少量である場合に、特に重要である。第二に、反応混合物は、手で導入され、それゆえ、ウェルへの分散が不規則に生じる。かくして、ウェルの大きさが完全に同一であったとしても、各ウェルに導入される反応混合物の量が同じであることに確実性はない。それゆえ、結果が誤る可能性がある。第三に、ウェルは、１８０℃以上の温度で熱密封によって隔離される。これは、ウェルに含まれるサンプル画分を不可逆的に損傷（分析される生物学的物質を破壊および／または前記物質を含む液体の全部または一部を蒸発）する危険性を有する。これは、ウェルが小さく、かつ、それが含む液体の量が少なくなるほど、敏感になる。この操作は、それゆえ、カウントおよび特徴決定の結果を誤る。
米国特許 US-A-4077845 は、各空洞がサイホンを介して溝に連結された分析カードを提案する。これは、必須ではないが、空洞間の液体の流れを妨げつつ、微生物が空洞に導入されることを可能にする。
独国出願 DE-U-29500587 は、血液サンプルを分類するための分析カードを記載する。このカードは、二つのプラスチックシートを組み合わせることによって得られ、これらの間に、溝のシステム、注入口、輸送ウェル、および種々の抗体を含む複数の分析空洞を規定している。空洞は、貫通空洞または通り抜けできない溝を備えることができるが、組み合わせられた二つのシートの前面および／または後面を被覆する一方または両方の透明フィルムが、微生物のカウントを可能にしない。
実際、上記の二つの文献では、本発明と同一の技術的課題を解決する試みはない。なぜなら、これらの文献の目的は、最初の生物学的サンプル中に存在する微生物の増殖を可能にすることであり、これらの微生物をカウントすることではな いからである。それゆえ、この問題は、質的なものであって、量的なものではない。
さらに、ウェル間のサンプルの分離は刊行物 US-A-4077845 に言及されているが、ウェル間の分離は必ずしも必要ではないことが記載されている。それゆえ、生物学的サンプル中に存在する微生物をカウントするためには適用できない。
米国特許 US-A-4018652 は、実施態様の一つにおいて、微生物の増殖を観察可能にする二つの異なる量のウェルを含む分析カードを提案する。統計的に、最初のサンプルに存在する微生物の数を調べることが可能である。このカードは、別の実施態様によれば、それぞれ小中大の量の三つのウェルを提案することによって、この統計学的測定の範囲をさらに増大可能にする。
欧州特許出願 EP-A-0745856 公報は、ほぼ同じタイプの分析カードを記載するが、唯一の主な差異は、前記空洞間の交差汚染の危険性を低減する目的で、空洞間の十分に長い溝が存在することである。
米国特許 US-A-4318994 も、上記二つの刊行物に類似している。基本的な差異は、空洞に入る溝の特定の形状にあり、これが、吸引効果により液体の流れを妨げることを可能にする。
本発明と異なって、これらの刊行物は、生物学的液体を輸送し、また、空洞を相互に分離する不活性流体を貯蔵する手段を形成するウェルを用いない。かくして、米国特許 US-A-4018652 では、記載されたカセットが、カセットのウェルおよび溝のシステム全体に液体サンプルを導入することによって満たされる。それゆえ、サンプルが導入されると、カードの全てのウェル間に、ウェルの大きさによらず、液体が連続して存在する。液体がカセットに存在すると、微生物は、なんの問題もなく、ウェルからウェルに移動することができ、また、溝の中で増殖することができる。
本発明では、各ウェルは、液体サンプルを輸送するが、それを貯蔵しない。なぜなら、貯蔵が、空洞に存在する液体画分を分離するための不活性流体に関連するものだからである。それゆえ、微生物はウェルからウェルに移動できない。それゆえ、ウェル間での汚染の危険性が無く、微生物の最初の濃度の統計学的計算を誤る危険性がない。
さらに、欧州特許出願 EP-A-0745856 公報は、気泡の存在が後の分析を不可能にすることを記載している。かかる記載は、当業者に、この種の分析カードに空気または他の不活性流体を導入することを促すものではない。しかしながら、本発明では、上述したように、気体状流体、例えば空気の存在が、種々のウェルを分離するために必要である。それゆえ、かかる構成とすることは自明ではない。
本発明によれば、提案された分析カードは、上記欠点の全てを克服するのに役立つ。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
このカードは、ウェルがいかなる大きさであっても、あるウェルから別のウェルに比例的であっても、全てのウェルを満たすことを可能にし、そして、それを満たす場合にとられる配置に注意を必要としない。“あるウェルから別のウェルに比例的”とは、同じ寸法を有する二つのウェルの間に比例関係が存在し、その比率が約１対１であるか、あるいは、異なる寸法のウェルでは、その比率は１対１とは異なることを意味すると解する。さらに、液体が閉じ込められたままなので、外側と試料の汚染の危険性が無く、その一方で、前記カードの各ウェル間に仕切りが設けられているので、カードの種々のウェル間にも汚染の危険性がない。
【０００８】
この目的のために、本発明は、好ましい第一の態様によれば、
−分析される生物学的液体をカードに注入するための領域、
−前記注入領域から来る生物学的液体の主要フィード溝、
−主要溝の延長に存在する少なくとも二つの第二溝、および
−それぞれの第二溝に対応する少なくとも一つのウェル
からなるボディを備えた分析カードであって、各ウェルが、各分析空洞の末端溝を介して、少なくとも二つの末端分析空洞に前記生物学的液体の所定量を輸送する手段を構成すること、並びに、分析される全体量が全ての分析空洞の全体量未満であることを特徴とする分析カードに関する。
【０００９】
本発明の第二の好ましい実施態様によれば、
−分析される生物学的液体をカードに注入するための領域、
−前記注入領域から来る生物学的液体の少なくとも二つのフィード溝、および
−それぞれのフィード溝に対応する少なくとも一つのウェル
からなるボディを備えた分析カードであって、各ウェルが、各分析空洞の末端溝を介して、少なくとも二つの末端分析空洞に前記生物学的液体の所定量を輸送する手段を構成すること、並びに、分析される量が全ての分析空洞の全体量未満であることを特徴とする分析カードに関する。
上記二つの実施態様によれば、生物学的液体の末端分析空洞への輸送は平行して行われる。
【００１０】
本発明の第三の好ましい実施態様によれば、
−分析される生物学的液体をカードに注入するための領域、
−前記注入領域から来る生物学的液体の主要フィード溝、
−主要溝の延長に存在する少なくとも二つの第二溝、および
−それぞれの第二溝に対応する少なくとも一つの空洞
からなるボディを備えた分析カードであって、各空洞が、前記生物学的液体の所定量を受ける手段を構成すること、並びに、分析される、カードに導入される量が全ての分析空洞の全体量より大きいことを特徴とする分析カードに関する。
先の実施態様によれば、分析空洞への生物学的液体の輸送は、連続して起こり、その後にパージされる。第一の実施態様によれば、生物学的液体を輸送する主要な手段として作用するウェルが、主要溝と第二溝との間に存在する。
【００１１】
二つの実施態様の一方によれば、第二溝の量は全て同一である。
これら三つの実施態様の一つの好ましいバージョンでは、末端分析空洞は、少なくとも二つの異なる量とされる。
好ましくは、末端分析空洞は三つの異なる量とされる。
異なる量の二つの空洞間に存在する比率は、１／５〜１／２０、１／５０〜１／２００、または１／５００〜１／２０００の間、特に１／１０、１／１００または１／１０００とされる。
同じ量の空洞は、手動および／または自動的な光学読み出しを容易にするために、幾何学的、例えば、一直線状または同心円状に並べられる。
【００１２】
また、本発明は、最初の二つの実施態様に示されているように、分析カードを満たす方法にも関し、
−所定量の分析される生物学的サンプルにこのカードの注入領域を連結する、
−前記カードの内部および／または近傍に真空を形成する、
−一方で、分析空洞に生物学的液体を移し、他方で、生物学的液体に由来し、前記分析空洞に存在する、サンプルの種々の画分を不活性流体を用いて単離するように真空を破壊し、かつ、
−得られた結果を分析して、最初の生物学的サンプルに存在する微生物または核酸、抗体のような他の生物学的物質の量を調べる
ことからなることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明は、第三の実施態様に示されるような分析カードを満たす方法にも関し、
−所定量の分析される生物学的サンプルにこのカードの注入領域または出口を連結する、
−前記カードの内部および／または近傍に真空または加圧を形成して、生物学的液体を空洞に移す、
−真空または加圧を停止する、
−生物学的液体に由来し、前記分析空洞に存在する、サンプルの種々の画分を不活性流体を用いて単離するように主要溝をパージする、かつ
−得られた結果を分析して、最初の生物学的サンプルに存在する微生物または核酸、抗体のような他の生物学的成分の量を調べる
ことからなることを特徴とする。
【００１４】
最初の二つのカードの実施態様によれば、真空が破壊されると、隔離流体が第二溝またはフィード溝、あるいは分析空洞の、生物学的液体と接触する。
好ましくは、分析される生物学的液体の量は、全ての分析空洞の全体量未満である。
第三の実施態様のカードによれば、分析される生物学的液体の量は、分析空洞の全て、流体回路（fluid circuit）の全て、およびオーバーフローの全体量よりも多いか等しい。
好ましくは、分析される生物学的液体の量は、全ての分析空洞および全ての流体回路の全体量よりも多いか等しい。
最初の二つの実施態様のカードによれば、全ての分析空洞の全体量に対する分析される生物学的サンプルの量の比率は、例えば、１／１０〜９／１０、特に４／１０〜６／１０、好ましくは５／１０である。
最後に、本発明は、最も確からしい数の技術を用いた微生物をカウントするための、上記分析カードの使用に関する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
添付の図面は例示であって、本発明の範囲を制限する性格を有するものではない。これらは、上記発明のいくつかの特別な実施態様を構成する。
本発明は、本質的に、添付図面に記載された分析カード１、２１または１０１に関する。
三つの特定の実施態様が記載されている。すなわち、図１、３、４、５、および１０の分析カード１の第一の実施態様、図２の分析カード２１の第二の実施態様、並びに、図１１ないし１６の分析カード１０１の第三の実施態様である。
【００１６】
図１および３を参照すると、分析カード１は、本質的に、分析カード１のボディ２によって形成された単一のモノブロック部材からなる。このボディ２は、分析される生物学的サンプル４を注入するための領域３を備える。
この注入領域３は、ボディ２のいずれの面にあっても良く、図１または３の前面、あるいは後面、あるいは側壁にあっても良い。これは、例えば、注入領域１３が側面にある、図５および６の場合である。図５において、カード１はチューブ３２に含まれたサンプル４で満たされていないが、前記サンプルに柔軟なパイプ３３を介して連結されている。かくして形成された組立物は真空チャンバーに配置される準備が整った状態にある。
図６は、図５のＡ-Ａ断面を示す。主要フィード溝５は、シケインを形成してカード１のボディ２の中心に向けられ、次いで、一方の側面に向けて前記カード１内を延びて注入領域３を構成する。カード１のボディ２とパイプ３３との間に存在するリンクは、ボディ２に配置された環状の溝１４と、この溝１４に適合するパイプ３３のショルダー１５によって与えられる。
【００１７】
当然、このために、ボディ２は、実質的に平行六面体形を有する。それゆえ、このボディ２は、モノブロックであり、内部に、ある数の溝と空洞９、１０または１１を有する。これらの空洞は、図７のような貫通ホール(through-hole)であっても、図８のような非貫通ホール(blind hole)であってもよい。
これらの溝および非貫通ホールは、前記ボディ２の表面に接着される透明な付着性フィルム３５を適用することにより外側から隔離される。
溝に関して、まず、注入領域３の下流にある、主要フィード溝５が存在することに注意すべきである。この溝５の下流にはウェル１２が存在し、これは分析される生物学的液体４を輸送するための主な手段として作用する。実際、主要溝５は、注入領域３とウェル１２の間に存在する。同様に、このウェル１２を一連のウェル７にリンクさせる第二溝６があり、各ウェル７が溝６に対応している。これらのウェル７は輸送手段として作用する。これらの各ウェル７には、所定の数の末端溝８が設けられ、各溝８はウェル７を末端分析空洞９、１０または１１に連結している。
【００１８】
これらの図には三種類の末端分析空洞が存在する。すなわち、大きな末端分析空洞９、中位の大きさの末端分析空洞１０、最後に、小さい末端分析空洞１１である。
それゆえ、分析カード１のボディ２に設けられた空洞は、一方で主要溝５、第二溝６および末端溝８によって形成された溝であり、他方、注入領域３、ウェル１２、ウェル７および一連の分析空洞９、１０および１１によって形成される非貫通ホールである。
異なる大きさの分析空洞９、１０および１１は、希釈を実施する必要に応じて分配することを可能にする。かくして、この分析空洞９、１０または１１に存在する液体の量に依存して、多数または少数の微生物が存在する。添加される培養培地に依存して、一部の微生物を増殖させることができ、各空洞９、１０または１１に存在するか否かに依存して、光学密度を変更可能にするか、蛍光または色（発色効果）が見えるようにするかあるいは見えなくする。これは、微生物の存在または不在を検出可能にし、それらをカウント可能にもする。例を以下に記載する。
【００１９】
【実施例】
特定の実施態様に従ると、このカード１の寸法は以下の通りである：
−カード１の長さは１３５ｍｍ；
−カード１の幅は８５．５ｍｍ；
−カード１の厚みは４ｍｍ；
−５、６および８の全ての溝の幅は０．５ｍｍ；
−主要溝５の深さは０．５ｍｍ；
−末端溝６の深さは、ウェル１２を通る仮想軸から各溝６の距離に従って変化する；この深さは、
・外側溝６の場合には０．５ｍｍ、
・中心および外側溝６の場合には０．５８ｍｍ、
・中心溝６の場合には０．６８ｍｍ、
・中心および内側溝６の場合には０．７９ｍｍ、
・内側溝６の場合には０．８７ｍｍ；
−末端溝８の深さは０．５ｍｍ；
−主要輸送手段１２の直径および深さは、それぞれ３ｍｍおよび１ｍｍ；
−輸送手段７の直径および深さは、それぞれ２ｍｍおよび１ｍｍ；
−注入領域３の位置は、前記カード１の基底部から４７．５ｍｍ、前記カード１内に５ｍｍに設けられ、この領域３は、この図１では示されていないが、カード１のエッジに溝を介して連結されても良いことに注意すべきであり、その直径は２ｍｍである；
−空洞９の深さは５００圧カードの場合には３．５６ｍｍであり、２５０圧カードの場合には２．３４ｍｍであり、これらの空洞９の長さおよび幅は一定であって、それぞれ１５ｍｍおよび４．５ｍｍである；
−空洞１０の深さは５００圧カードの場合には２ｍｍであり、２５０圧カードの場合には１．２７ｍｍであり、これらの空洞１０の長さおよび幅は一定であって、それぞれ６．５ｍｍおよび２ｍｍである；かつ、
−空洞１１の深さは５００圧カードの場合には０．８８ｍｍであり、２５０圧カードの場合には０．５３ｍｍであり、これらの空洞１１の長さおよび幅は一定であって、それぞれ４ｍｍおよび０．８ｍｍである。
【００２０】
“５００圧カード”とは、５００ｍｂａｒ、すなわち絶対真空に対して５００ｍｂａｒの絶対圧の真空に処された分析カード１を意味する。“２５０圧カード”の場合には、分析カード１は７５０ｍｂａｒ、すなわち絶対真空に対して２５０ｍｂａｒの絶対圧の真空に処される。これは、以下に定義するカード２１についても同様である。
【００２１】
全ての溝５、６および８は、球形ミリングカッターによって形成され、空洞９、１０および１１およびウェル３、７および１２は、柱状ミリングカッターによって形成される。これは、別のカード２１および１０１についても同様である。
図２に記載されている第二の実施態様によれば、分析カード２１のモノブロックボディ２２の中心に設けられた注入領域２３を備えた星形で示されていることから、分析カード２１はより単純である。実際、この注入領域２３は、図１のウェル１２に対応する。この領域２３から、所定の数のフィード溝２５が別れ、これらのフィード溝は、図２には示されていないが、分析される生物学的液体４を、分析カード２１の周辺部に分配するからである。
各フィード溝２５は、注入領域２３を輸送手段として作用するウェル２７に連結する。このウェル２７の後に、いくつかの末端溝２８が存在し、各末端溝２８は、ウェル２７を直接的に末端分析空洞２９、３０または３１に連結し、図１の実施態様と同様に、３０とラベルされた中位の大きさを挟んで、２９とラベルされた大きいものから３１とラベルされた小さいものまで、三つの異なる大きさを備えている。
【００２２】
特別な実施態様によれば、このカード２１の寸法は以下の通りである：
−カード２１の側面は１３５ｍｍ；
−カード１の厚みは４ｍｍ；
−２５および２８の全ての溝の幅および深さは同一で０．５ｍｍ；
−注入領域２３は、直径２ｍｍの貫通ホールとすることができるホールである；
−輸送手段２７の直径および深さはそれぞれ１．５ｍｍおよび１ｍｍ；
−空洞２９の深さは５００圧カードの場合には２．８５ｍｍであり、２５０圧カードの場合には１．８８ｍｍであり、これらの空洞２９の直径は１０ｍｍである；
−空洞３０の深さは５００圧カードの場合には１．８８ｍｍであり、２５０圧カードの場合には１．２０ｍｍであり、これらの空洞３０の直径は４ｍｍである；
かつ、
−空洞３１の深さは５００圧カードの場合には０．８５ｍｍであり、２５０圧カードの場合には０．４９ｍｍであり、これらの空洞３１の長さおよび幅は、それぞれ４ｍｍおよび０．８ｍｍである。
【００２３】
この図２では、分析空洞２９、３０および３１は環状の弓形に存在し、自動システムによる読み出しを容易にする。かくして、カード２１は、空洞２９、３０または３１が、図示されていないが、読み出しヘッドに交替で向き合うように回転される。
対照的に、図１および３では、種々の分析空洞９、１０および１１が整列していることから、読み出しは直線的である。さらに、大きな空洞９、中位の空洞１０および小さい空洞１１の間には、上に重なる仕切りがある。これは、自動読み取りシステムに対する適性を維持したまま、視覚的読み出しを容易にする。
図７および８によれば、空洞９、１０および１１は、異なる形状であっても良い。かくして、図７によれば、空洞は貫通空洞であり、すなわち各空洞の仕切りには、二つの透明な付着フィルム３５の存在が必要である。また、カード１を挟む単一のフィルム３５を有することもできる。この構造は、特に、光学密度の自動読み出しに適している。図８の場合では、空洞は、非貫通ホールからなる。単一のフィルム３５のみが前記空洞において空間を仕切るために用いられる。
【００２４】
透明な付着フィルム３５は、切断または収縮した後に、空洞９から１１（図１）および２９から３１（図２）の内容物に使用者が直接アクセス可能にすることから、有益に使用できる。
図１および３の実施態様を簡素化するために、分析される生物学的サンプル４をウェル１２に直接注入することができ、かくして、注入領域３と主要フィード溝５を有する必要性が無くなる。
以下、図１を参照するが、以下に説明されることは、図２に示される別の実施態様にも関連する。
各分析空洞９、１０または１１に導入される量が、同一または異なる量の各空洞９、１０または１１に同一または比例的になるように、種々の第二溝６の全てが同一の量を備える。かくして、図１に明確に記載されているように、分析カード１の中心に位置する第二溝６は、端にあるものよりも短い。それゆえ、全ての溝６の間で量が一定になるようにその広さまたは深さを変化させるのが適切である。同様に、末端溝８の長さは、同一量の各分析空洞９、１０または１１について同一である。
【００２５】
実際、小さい空洞１１と大きい空洞９、および中位の空洞１０との間には、比例関係が存在する。かくして、異なる量の二つの空洞の間に存在する比率は、図示した図面では、空洞１０と９そして空洞１１と１０の間では１ないし１０、空洞１１と９との間では１ないし１００である。この比例関係は、末端溝８にも適用され、これらの末端溝８は、大きな空洞９、中位の空洞１０または最後に小さい空洞１１のいずれに供給するかに基づいて、異なる寸法を有する。
分析カード１および２１の構造に関して、全ての溝、すなわち主要溝５、フィード溝２５、第二溝６または末端溝８または２８は、一つの分析空洞に存在する所定量のサンプルと別の分析空洞に存在する所定量のサンプルとの混入を避けるために互いに交わらない。このために、これらの種々の溝の交差点は、輸送手段としてのみではなく、サンプル４の導入後の混入を妨げる緩衝ボリューム(buffer volume)としても作用する、ウェルを常に介して成される。これらのウェルにおいて、分析される液体４の輸送は、全ての下流溝において平行に行われる。
【００２６】
分析カード１または２１を満たす方法は、
−一定量の分析される生物学的サンプル４に、カード１または２１の注入領域３または２３を連結する；
−前記カード１または２１の内部および／または近傍に真空を形成する、
−一方で、分析空洞９、１０および／または１１、あるいは２９、３０および／または３１に生物学的液体を移し、他方で、生物学的サンプル４に由来し、前記分析空洞９、１０および／または１１、あるいは２９、３０および／または３１に存在するサンプルの種々の画分を空気が仕切るように真空を徐々に破壊することからなる。
結果的に、真空が破壊されれば、図１および３の末端溝８または図２および４の末端溝２８において、あるいは分析空洞９、１０および１１（図１）、あるいは２９、３０および３１（図２）において、空気が生物学的サンプル４の画分と接触するようになる。これは、細菌間の物理的仕切りを形成する。もちろん、これは、生物学的サンプル４の量が、分析空洞の全体量、そして任意に、末端溝８または２８の量と一定の比率になる場合にのみ達成される。
【００２７】
空気の代わりに、この仕切り機能を付与するあらゆる流体、気体または液体を用いることができる。サンプルに含まれる生物学的化合物に関して前記流体が実質的に不活性であること、並びに前記サンプルと不混和性であることが確実となるように注意しなければならない。流体が例えば油のような液体である場合には、生物学的サンプルよりも低い密度を有する必要がある。
この場合、カード１は、図５に示されているように、実質的に垂直な位置に維持しなければならない。仕切り液は、図示されていないが、各空洞に含まれた生物学的サンプルの上に位置する。
しかしながら、空洞９、１０および１１、あるいは２９、３０および３１を物理的に仕切るまたは分けるためのその他の技術を使用することができる。かくして、微生物を増殖させる培養の途中で生物学的サンプル４にペプチン(peptine)のようなゲル化剤を添加することができる。この場合、そして、ゲル化剤が作用した場合、カード１を実質的に垂直な位置に維持する必要はない。
【００２８】
最後に、前記空洞９、１０および１１、あるいは２９、３０および３１が、末端溝８を遮断することによって仕切られても良い。例えば、仕切り流体のような接着剤を用いることができ、また、末端溝が物理的加圧によって遮断されても良い。
本発明に係る方法を用いて満たす特定の有利な方法では、分析される生物学的サンプル４の量は分析空洞９、１０および１１（図１）、あるいは２９、３０および３１（図２）の全ての全体量よりも少ない。分析空洞９、１０および１１の全ての全体量に対する生物学的液体４の量の比率は、好ましくは１ないし２である。
さらに、空洞９、１０および１１、あるいは２９、３０および３１を満たすことは、所定の充填時間で、同時に行われ、各サイズの空洞、小、中、大の全体量に対する、各小、中、大の大きさの空洞に存在する液体の量の比率は、カード１または２１の空洞９、１０および１１、あるいは２９、３０および３１の全てについて一定である。
【００２９】
第三の実施態様は、図１１ないし１６に明確に記載されている。最初の二つの実施態様とは、構造と機能において区別される。かくして、この実施態様の特定の構造は、分析される液体４の輸送を可能にし、これは最初の二つの実施態様のケースのように平行的でなく、連続的に行われる。
図１１は、この構造に結びついた機能を明確に理解可能にするものである。この分析カード１０１は、先のカード１および２１と類似して、側部に注入領域１０３が設けられたボディ１０２を含む。ある特定の実施態様によれば、この領域１０３は、主要フィード溝１０５の延長にあり、オーバーフロー１０４として作用するリザーバーに達する前にカード１０１全体を通り、このオーバーフロー１０４自体は、出口１２７を介して外部と連結されている。分析空洞１０９、１１０および１１１の全てが主要溝１０５から分岐していることに注意すべきである。これらの分岐はそれぞれ、前記空洞１０９、１１０および１１１において１１５とラベルされており、これは、それらが主要溝１０５の構成要素であっても適用される。カード１０１の構造および構成要素は、空洞１０９、１１０および１１１の充填が行われるようにその移動において液体４に影響し、分離によって前記空洞１０９、１１０および１１１に分注量を存在させる。かかる構造および操作は、すでに本出願人の研究の主題を形成しており、これは１９９９年３月９日に出願された仏国特許出願９８／０３０３３に出願されている。
【００３０】
このカード１０１は、１０の大きな末端分析空洞１０９、１０の中位の末端分析空洞１１０および１０の小さい末端分析空洞１１１を含む。空間的理由から、同一の大きさの空洞１０９、１１０または１１１の各グループは二列に分配され、それによって前記カード１０１の視覚的読み出しを容易にしている。大きな空洞１０９と中位の空洞１１０はほとんど同じ構造を備え、サンプル４を向けるために、出口１２７において適用された真空または入り口１０３において（主要溝１０５において）適用された加圧のいずれかと関連すると共に、重力（空洞１０９および１１０において）を必須に使用するが、小さい空洞１１１は異なる構造を備え、前記サンプルで満たすために毛細管効果を必須に用いる。出口１２７で適用された真空または入り口１０３で適用された加圧は、約５〜２０ｍｂａｒ、好ましくは１０ｍｂａｒとされる。
【００３１】
図１１を参照すると、中位の空洞１１０、および大きな空洞１０９は、主要溝１０５と第二溝１０６、および１０７との間に交差を備える。各第二溝１０６および１０７は、問題の空洞１０９または１１０の上および横の位置において終点になる。前記空洞１０９または１１０の上および中心端は、主要フィード溝１０５に連結させる。溝１０５は、上方分岐１１３を介して次の空洞１０９、１１０または１１１に向けられている。この主要溝１０５の上流／上方分岐１１３リンクには、二つのウェル１１２と１１４がある。主要溝１０５は、各空洞１０９と１１０をバイパスするための分岐１１５において、サンプル４の流れを減速するウェル１１２を有する。好ましい方向は、重力による、第二溝１０６または１０７の向きである。上方分岐１１３も、サンプル４の流れを妨げるウェル１１４を有する。好ましい方向は、吸引による、主要溝１０５を介した他の空洞への液体４の流れである。
【００３２】
以下、図１３を参照すると、小さい空洞１１１は主要溝１０５と第二溝１０８との間に、交差点を有する。各第二溝１０８は、問題の空洞１１１の上および中心の位置において終結する。前記空洞１１１の下方かつ中心の端は、主要フィード溝１０５に連結され、これは下方の分岐１１７により次の空洞１１１または出口１２７へと向けられる。この主要溝１０５の上流／下方分岐１１７リンクには二つのウェル１１６と１１８がある。ウェル１１６は溝１０５の上流に存在し、ウェル１１８は分岐１１７の上流に存在する。主要溝１０５は、各空洞１１１において、サンプル４の流れを減速するウェル１１６を備える。好ましい方向は、毛細管効果により、第二溝１０８の向きである。下方分岐１１７も、サンプル４の流れを妨げるウェル１１８を有する。好ましい方向は、吸引による、主要溝１０５を介した他の空洞への液体４の流れである。
【００３３】
主要溝１０５は、
−主要溝１０５／第二溝１０６リンクと主要溝１０５／上方分岐１１３リンクとの間の空洞１０９；
−主要溝１０５／第二溝１０７リンクと主要溝１０５／上方分岐１１３リンクとの間の空洞１１０；
−主要溝１０５／第二溝１０８リンクと主要溝１０５／下方分岐１１７リンクとの間の空洞１１１；
において、１１５とラベルされている。
また図１１は、種々の遅延ウェル１２１、１２２、１２３、１２４、１２５および１２６の存在を示す。空洞１０９、または１０９と１１０、または１０９、１１０および１１１の全てまたは一部が満たされることが望まれる場合に、これらの遅延ウェル１２１、１２２、１２３、１２４、１２５および１２６は、液体４の移動の可能性のある制御を分析可能にする。図１１には示されていないが、カード１０１の内部汚染の危険性を顕著に低減すべく、第一の空洞１０９の前と最後の空洞１１１の後に、主要溝１０５に適合した、さらに二つのバルブを有することができる。バルブの一方は、遅延ウェル１２１に設けられ、他方は、オーバーフロー１０４の前に設けられる。かかるバルブは、本件特許出願人により、それぞれ１９９８年９月８日および１９９９年６月１４日付で出願された仏国特許出願９８／１１３８３および９９／０７６８９に記載されている。
【００３４】
図１２および１３は、カード１０１に含まれた流体（液体４と空気）の移動をより詳細に示す。
図１２によれば、液体４はＦ１の向きで主要溝１０５を介して到達し、好ましくはＦ２の向きで、第二溝１０６を介して空洞１１０に流入する。液体４が上方分岐１１３における下方開口と接触するまで空洞１１０が満たされる。この点において、空気のみが主要溝１０５へＦ３の向きに放出される。次いで、液体４は、他の空洞１１０または１１１にＦ５の向きで流出するようにバイパス分岐１１５の方向をＦ４の向きに向ける。バイパス分岐１１５は、このポイントで圧力降下を生じるウェル１１２を有し、それによって液体に容易な通路、すなわち第二溝１０７を選択させ、このポイントで流れを減速させる。また上方分岐１１３も、このポイントで圧力降下を生じ、前記流体４の流れを妨げるウェル１１４を有し、液体に容易な通路、すなわちバイパス分岐１１５を選択させる。
【００３５】
図１３によれば、液体４はＦ１の向きで主要溝１０５を介して到達し、好ましくはＦ２の向きで、第二溝１０８を介して空洞１１１に流入する。それゆえ、空洞１１１が完全に満たされ、次いで液体４がＦ６の向きに下方分岐１１７に流れ始める。言うまでもなく、圧力降下がこのポイントにおいて非常に大きいことから、液体４は、他の空洞１１１またはオーバーフロー１０４に向けて、そしてその後の出口１２７に向けて、Ｆ５の向きで流出するようにバイパス分岐１１５の方向をＦ４の方向に向ける。この分岐１１７において、前記液体４が主要溝１０５に戻ることを妨げるウェル１１８が存在する場合には圧力降下はより大きくなる。このポイントにおいて、空気も主要溝１０５にＦ６の向きで排出される。バイパス分岐１１５は、このポイントで圧力降下を生じるウェル１１６を有し、それによって、液体４に容易な通路、第二溝１０８を選択させる。
【００３６】
カード１０１内に移された液体４の全体量は、空洞１０９、１１０および１１１の全ての全体量よりも多く、前記空洞１０９、１１０および１１１の全て、溝および分岐の全て、並びにオーバーフロー１０４の量の全体量の合計以下である。一部の実施態様では、前記オーバーフロー１０４に存在し、重力の下でこのポイントで流出する液体４のレベルは、オーバーフロー１０４の出口１２７の挿入ポイント以下である。この目的は、前記空洞１０９、１１０および１１１の間に仕切りを生じるために、液体４が全ての空洞１０９、１１０および１１１を満たした後で、空気を主要フィード溝１０５の液体４と置換することである。
【００３７】
好ましくは、カード１０１内に移された液体４の全体量は、前記空洞１０９、１１０および１１１の全ての全体量の合計以下である。結果的に、実施される必要のある分析に関して不活性な流体または空気を用いて、空洞１０９、１１０および１１１の全てが満たされた後に、主要溝１０５からあらゆる液体４をパージすることが可能である。このパージは、全ての空洞の内容物を互いから仕切る。
上述したように、大きい空洞１０９と中位の空洞１１０は、重力の下で液体４が流れることによって操作されるが、小さい空洞１１１は毛細管効果によって操作される。さらに、カード１０１の内部および外部寸法に関して記載された大きさがこれらの現象を明らかにする。
【００３８】
図１４、１５および１６では、大きな空洞１０９と中位の空洞１１０への輸送をさらに容易にするために、これらの空洞１０９と１１０は、第二溝１０６または１０７に対応する、前記空洞１０９または１１０の流入口からの距離に依存した特異的な形状をした水切り手段１１９を備えていることに注意すべきである。かくして、水切り手段１１９は、この手段１１９と空洞１０９または１１０の側壁との間にエッジを備えた、この流入口にできるだけ近い肩の形状を有するが、この角は徐々に消滅して曲線に変わり、カード１０１のボディ１０２の底部１２０と接合する。
【００３９】
カード１０１の寸法は、非限定的な例で与えられている。かくして、カード１０１は１０８ｍｍの幅、１１８ｍｍの長さおよび４ｍｍの厚みを有する。他の寸法は以下の通り：
−主要溝１０５、それゆえ分岐１１５は、Ｕ形断面を備え、その開口はフィルム３５によって閉じられ、このＵ字の幅および深さは０．５ｍｍである；
−上方分岐１１３と下方分岐１１７は、Ｕ形断面を備え、その開口はフィルム３５によって閉じられ、このＵ字の幅および深さは０．２ｍｍである；
−大きな空洞１０９の深さ、長さおよび幅は、それぞれ、３．１ｍｍ、２０ｍｍおよび５．５ｍｍである；
−中位の空洞１１０の深さ、長さおよび幅は、それぞれ、１．８ｍｍ、６ｍｍおよび３．５ｍｍである；
−小さな空洞１１１の深さ、長さおよび幅は、それぞれ、１ｍｍ、３ｍｍおよび１ｍｍである；
−オーバーフロー１０４の深さ、長さおよび幅は、それぞれ、３．６ｍｍ、２５ｍｍおよび２４ｍｍである；
−空洞１０９におけるウェル１１２の直径は２ｍｍであり、各ウェルは直径２ｍｍの球状のミリングカッターによって形成された深さが１ｍｍの球形キャップである；
−空洞１１０におけるウェル１１２の直径は１．５ｍｍであり、空洞１０９と１１０におけるウェル１１４の直径および空洞１１１におけるウェル１１６と１１８の直径と同じであり、各ウェルは直径１．５ｍｍの球状のミリングカッターによって形成された深さが０．７５ｍｍの球形キャップである；
−出口溝１２７は、Ｕ形断面を備え、その開口はフィルム３５で閉じられ、Ｕ字の幅と深さはそれぞれ１ｍｍと０．５ｍｍである；かつ、
−遅延ウェル１２２、１２３、１２４、１２５および１２６は、全て３ｍｍの直径を備え、各ウェルは直径３ｍｍの球状のミリングカッターによって形成された深さが１．５ｍｍの球形キャップである。
【００４０】
生物学的サンプル４に含まれる微生物がカウントされる方法は、食品分野において用いることができる。以下に記載された例において、この方法は以下の通りである。
先ず、液体サンプル４を調製することからなる。かくして、約１０ｇの食品に対して、９０ｍｌのペプトン水が、フィルターを備えたストマチャー(Stomacher)バッグに添加される。ストマチャーバッグ中のサンプルを１〜２分間ホモジナイズする。かくして、１０-1の第一希釈物が得られる。さらなる希釈は、４９ｍｌの培養培地を含むフラスコにストマチャーバッグ中の１ｍｌの液体を移すことによって調製され、この混合物をホモジナイズする。それゆえ、希釈は２ｘ１０3、すなわち１／５００である。
【００４１】
大きな空洞９の量が２００μｌ、中位の空洞１０の量が２０μｌ、かつ小さい空洞１１の量が２μｌであることが分かるので、各サイズとも２０の空洞９、１０または１１があれば、空洞９、１０または１１の全体量は４４４０μｌである。これらの例は例示として与えられていることに注意すべきである。例えば、ある大きさの空洞から別のものにかけて変化する、多数の空洞９、１０および１１を有することができる。
１ないし２という全ての空洞の全体量に対する生物学的液体４の量の予め確立された比率に従うために、２２２０μｌが前記フラスコからチューブ３２に移される。柔軟なパイプ３３がカード１に存在して共に消耗品を形成するか、あるいは使用前に前記カードに連結される。チューブ３２は、支持体に垂直に配置され、チューブ３２の内容物が柔軟なパイプ３３を介してカード１の注入領域３に連結される。かくして形成され、図５に記載された組立物全体が、分析空洞９、１０または１１に前記チューブ３２中のサンプル４が完全に移される準備のために真空に配置される。次いで、真空が徐々に、すなわち、少なくとも１０秒で、破壊される。
【００４２】
かくして、図９は、適切な真空を与えるために用いた減圧が、部分的な真空であっても、ほぼ８５０ミリバールでなければならず、かつ、１分で達成されることを明確に示す。同様に、通常の圧力への復帰は、徐々に一分で行われる。次いで、装置全体が真空チャンバーから除かれる。分析カード１は、パイプ３３において切断および開封することによって密封され、このポイントにおいて、前記カード１の側面で急に流れ、次いでチューブ３２が取り除かれる。カードは垂直な位置に放置される。これは絶対に必要というものではない。この位置において、種々のカード１が３０℃で約２４時間インキュベートされる。
かくして、１００、１０および１μｌの生物学的サンプルが各空洞９、１０および１１に分配された。
最後に、蛍光または色素マーカーを使用した場合には、その光学密度またはその着色に関して変更された分析空洞９、１０および／または１１の総数をカウントすることによってカード１を読みとることができる。いずれの状況においても、これは、現れることが望まれる微生物のタイプの顕色に対応する。外観に変化の現れた、大きな分析空洞９、中位の分析空洞１０および小さい分析空洞１１の総数に従って、最初のサンプルに含まれる微生物の正確な量を調べるために、後述する表１を参照することができる。
【００４３】
サンプルにおける細菌の最も確からしい数（ＭＰＮ）は、R.J.Parnow (1972); Cf.PARNOW RJ, 1972-Computer program estimates bacterial densities by means of the most probable numbers, Food Technology 7, 56-62に説明されている、統計学的な方法を用いて算出される。しかしながら、この方法は、陽性チューブの三つの数に関して現存する組合せの全てを与え、ありそうもない、または統計学的に誤った組合せがある。例えば、１００μｌのサンプルを含む空洞（第一希釈）における陽性チューブがないこと、および１μのサンプルを含む空洞（第三希釈）においてそれが２０もあることは信じ難い。
かくして、みかけ確率は、陽性の組合せに関連する。これを行うために、J.C.De Man (1975)の方法が用いられる；Cf. DE MAN J.,1975-The probability of most probable numbers, European Journal of Applied Microbiology, 1, 67-68、次いで、この著者に従って、陽性の種々の組合せが定義される：
・カテゴリー１は、最高確率組合せの全てを含み、その確率の合計は９５％である；
・カテゴリー２は、組合せの全てを含み、その確率の合計は次の４％を示す；
・カテゴリー３は、全ての組合せを含み、その確率の合計は残りの１％を示す。
以下の表１では、カテゴリー１の組合せのみが、それらと関連するＭＰＮと共に記載されている。この表は希釈を考慮に入れていないので、表１に見られるＭＰＮは、最初のサンプルの汚染レベルを得るために全希釈係数をかける必要がある。
【００４４】
表１：最も確からしい数（ＭＰＮ）技術によりサンプルにおける最初の濃度を調べるための陽性空洞の種々の組合せの表
【表１】
図３に関して、分析空洞９の全てにおいて微生物の増殖があることがわかる。一方、小さい分析空洞１１には、増殖が見られない。中位の空洞１０の場合には、２０の内の１１の空洞のみが何らかの増殖を示す。表１を参照すれば、２０／１１／０の組合せは、７０ＣＦＵ／ｇという、産物のグラム当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｇ）を与える。最初の希釈が１／５００なので、微生物の最初の濃度が７０ｘ５００、すなわち３５０００ＣＦＵ／ｇであったことが推定できる。
【００４５】
図４では、１８の分析空洞が微生物の増殖を示している。同様に、３つの分析空洞１０と、一つの分析空洞１１が増殖を示している。このことから、先の例と同様に、最初の濃度は２２ｘ５００、すなわち１１０００ＣＦＵ／ｇであったことが推定できる。
図１０では、２０のうちの６つの分析空洞９が微生物の増殖を示している。一方、空洞１１は全く変更されていないが、分析空洞１０の二つだけが増殖を示している。このことから、５００倍に希釈されたこのサンプルにつき、最初の濃度が２１００ＣＦＵ／ｇであったことが推定される。
この表を参照することによって、５００倍に希釈されたサンプルにつき、単一の分析カード１または２１を用いて２２５〜１．５ｘ１０6ＣＦＵ／ｇの最初の微生物濃度を調べることが可能であることが分かる。一方、従来の技術は、一般に、この結果における範囲を得るためには４つの消耗品を用いる。また、正確な濃度は分からないが、これらの値よりも小さいまたは大きい濃度を決定することもできる。次いで、正確な最終結果を知るために、先の結果に合わせて調節されたさらなる希釈をすることができる。
【００４６】
当然、カードの調査範囲を増大するために、４または５、あるいはそれ以上の異なる大きさの空洞を含む異なる分析カードを有することができる。
もちろん、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、抗体または抗原のような他の生物学的分子または物質をカウントすることができる。これらは、ラベルされている抗生物学的物質抗体によって現されてもよい。
チューブ３２に、サンプル４より低密度の不混和性液体を添加することもできる。これは、前記サンプル４の後に吸い込まれ、各空洞に分配された種々の量を隔離する。また、一方が生物学的サンプル、他方が隔離液を含有する二つのチューブ３２を有し、第一のチューブ３２と第二のチューブ３３に交互にパイプ３３を浸すこともできる。最後に、カード１に二つのパイプ３３を有することもできる。空洞９、１０および１１の全体量が４４４０μｌであり、サンプル４の量が２２２０μｌなの出、隔離液の量は２２２０μｌであってもよい。密封されたらカード１に空気が存在することが望まれるのであればより少なく、また、カードがサンプル４と隔離液で完全に満たされることが望まれるのであればより多くすることができる。後者の場合には、この技術は、嫌気性微生物の増殖に有利である。
【００４７】
カード１に移されるサンプル４の量が正確に測定されるように、自動化を利用しない三つの選択がある。
第一の選択は、チューブ３２を正確な量のサンプル４で満たすことに関する。柔軟なパイプ３３が自由端３４を前記サンプル４の最下レベルに有するから、サンプル４の全てが移される。
第二の選択は、チューブ３２の内部において、前記サンプル４に浸された自由端３４の位置によってあらかじめ決められる所定量のサンプル４でカード１を満たすことに関する。吸い込まれたサンプル４は、前記端３４の上に存在する液体カラム４に対応し、この上のカラムの液体のみが移される。
【００４８】
最後に、第三の選択は、非常に大量のサンプルでチューブ３２を満たすことに関する。真空を破壊することによって、輸送は、操作する者が、サンプル４から柔軟なパイプ３３の端３４を直接または間接的に取り除くまで行われ、サンプル４から空洞９、１０および１１へのフラクションの輸送が続けられる。
それゆえ、サンプル４を輸送する際に、前記サンプル４と同一水準でサンプリングが行われることが容易に理解できる。それゆえ、柔軟なパイプ３３の自由端３４が隔離流体にあるまで低減する、サンプル４のレベルである。それゆえ、第二に、カード１に輸送されるこの流体である。サンプル４よりも低いその密度により、そして、図５に示されているような、カード１の位置により、前記流体は、空洞９、１０および１１に輸送された種々の少量のサンプル４の物理的かつ生物学的なバリアとして作用する。
【００４９】
また、ゲル化剤を媒体中に用いることもできる。この技術は、空気のような気体状流体を用いた、種々の空洞９、１０および１１（図１）または２９、３０および３１（図２）間の仕切りを容易にすることができる。
空洞９、１０および１１に輸送された量が、同じ大きさの空洞間、および異なる大きさの空洞間でほぼ同じであることをチェックするために、テストが行われた。
かくして、小さい空洞１１を用いて、三回のテストが２０のウェルに対して行われた。このテストは８７５ミリバールの真空を用いて、２２２０μｌの脱塩水を用いて行われた。結果は、以下の表２に記載されている。
【００５０】
表２：小さい空洞における生物学的サンプルの分配のテスト
【表２】
【００５１】
表３：中位の空洞における生物学的サンプルの分配のテスト
【表３】
【００５２】
表４：大きい空洞における生物学的サンプルの分配のテスト
【表４】
実際、標準偏差は、いかなる量でも一定であり、このため、変動係数の減少があり、これはサンプルに含まれる液体の量の増加に比例する。実際、これらの結果は、最初のサンプルを輸送した後に各ウェルまたは空洞９、１０または１１に存在する液体の測定における正確さの問題による。
言うまでもなく、これらの結果は、特に有利であり、最初の生物学的サンプル４に存在する核酸、抗体または微生物のようなあらゆる生物学的物質の濃度を測定する方法の使用を可能にする。
【００５３】
分析カード１は、生物学的液体における微生物をカウントするための医学分野においても使用できる。
以下の例は、尿の微生物をカウントするために尿を分析する状況で用いられるプロトコルを記載する。採取された尿は、５ｍｌの培養培地を含むチューブに１０μｌの投与量をサンプリング容器から輸送（ホモジナイゼーション後）することによって希釈される。
ホモジナイゼーション後、２ｘ１０-3、すなわち１／５００希釈が得られる。次いで、２２２０μｌのこの希釈物をチューブ３２に移す。次いで、カード１を満たし、インキュベートし、最後に上記の例と同様に読みとる。しかしながら、インキュベーション温度はより高く、３７℃に近い。
尿の汚染が２２５ＣＦＵ／ｍｌから１．５ｘ１０6ＣＦＵ／ｍｌの間である場合には、このプロトコールを用いて、尿の微生物をカウントすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 生物学的サンプルにおける微生物をカウントおよび特徴決定することを可能にする、本発明に係るカードの第一の実施態様の平面図を示す。
【図２】 生物学的サンプルにおける微生物をカウントおよび特徴決定することを可能にする、本発明に係るカードの第二の実施態様の平面図を示す。
【図３】 図１と同一であるが、部分的な図を示す。このカードは、ある微生物集団をカウントおよび特徴決定するために用いられた。
【図４】 図１と同一であるが、部分的な図を示す。このカードは、別の微生物集団をカウントおよび特徴決定するために用いられた。
【図５】 生物学的サンプルを含む容器にチューブを介して連結されている、図１および図３に示された分析カードの遠近法による図を示す。
【図６】 図５のＡ-Ａの断面図を示す。
【図７】 図５のＢ-Ｂの断面図を示す。
【図８】 図７と同じ断面図を示すが、分析カードが空洞において異なる別の実施態様からなる。
【図９】 カード、サンプル、チューブおよびパイプによって形成された組立物を前記サンプルを前記カードの空洞に輸送することを可能にする位置に配置した、真空ベル(vacuum bell)内における、圧力の変化を示す曲線を示す。
【図１０】 図１と同一であるが、部分的な図を示す。このカードは、別の微生物を含有するサンプルをカウントおよび特徴決定するために用いられた。
【図１１】 生物学的サンプルにおける微生物をカウントおよび特徴決定することを可能にする、本発明に係るカードの第三の実施態様の平面図を示す。
【図１２】 中位の大きさの分析空洞の詳細な図を示す。
【図１３】 小さい分析空洞の詳細な図を示す。
【図１４】 図１１のＣ-Ｃの断面図を示す。
【図１５】 図１１のＤ-Ｄの断面図を示す。
【図１６】 図１１のＥ-Ｅの断面図を示す。
【符号の説明】
１ 分析カード
２ 分析カード１のボディ
３ カード１の注入領域
４ 分析される生物学的液体またはサンプル
５ 主要フィード溝
６ 第二溝
７ 輸送手段または各溝６に対応するウェル
８ 末端溝
９ 溝８に対応する大きな末端分析空洞
１０ 溝８に対応する中位の末端分析空洞
１１ 溝８に対応する小さい末端分析空洞
１２ 主要輸送ウェルまたは手段
１３ 側面注入領域
１４ ボディ２における環状の溝
１５ 溝１４に適したパイプ３３のショルダー
２１ 分析カード
２２ 分析カード２１のボディ
２３ カード２１の注入領域
２５ フィード溝
２７ 輸送手段または各溝２５に対応するウェル
２８ 末端溝
２９ 溝２８に対応する大きな末端分析空洞
３０ 溝２８に対応する中位の末端分析空洞
３１ 溝２８に対応する小さい末端分析空洞
３２ サンプル４を含有するチューブ
３３ チューブ３２に領域３を連結するパイプ
３４ パイプ３３の自由端
３５ 透明な付着フィルム
１０１ 分析カード
１０２ 分析カード１０１のボディ
１０３ カード１０１の注入領域
１０４ オーバーフロー
１０５ 主要フィード溝
１０６ 空洞１０９の第二溝
１０７ 空洞１１０の第二溝
１０８ 空洞１１１の第二溝
１０９ 溝１０６に対応する大きな末端分析空洞
１１０ 溝１０７に対応する中位の末端分析空洞
１１１ 溝１０８に対応する小さい末端分析空洞
１１２ 空洞１０９または１１０において主要溝１０５におけるサンプル４の流れを遅延させるためのウェル
１１３ 空洞１０９または１１０の上方分岐
１１４ サンプル４の分岐１１３への流れを妨げるウェル
１１５ 空洞１０９、１１０または１１１をバイパスする分岐
１１６ 空洞１１１における主要溝１０５へのサンプル４の流れを遅延させるウェル
１１７ 空洞１１１の下方分岐
１１８ 分岐１１７へのサンプル４の流れを妨げるウェル
１１９ サンプル４を水切りする手段
１２０ 空洞１０９、１１０または１１１においてカード１０１のボディ１０２の底部
１２１ 注入領域１０３と主要溝１０５の間のバルブ
１２２ 空洞１０９の二つのレベルの間のバルブ
１２３ 空洞１０９と空洞１１０の間のバルブ
１２４ 空洞１１０の二つのレベルの間のバルブ
１２５ 空洞１１０と空洞１１１との間のバルブ
１２６ 空洞１１１の二つのレベルの間のバルブ
１２７ オーバーフロー１０４の出口
Ｆ１ 主要溝５を介したサンプル４の第二溝１０６、１０７または１０８への流入
Ｆ２ 第二溝１０６、１０７または１０８を介したサンプル４の空洞１０９、１１０または１１１への流入
Ｆ３ 空洞１０９または１１０の上方分岐１１３を介した空気の輸送
Ｆ４ 空洞１０９、１１０または１１１における主要溝５を介したサンプル４の輸送
Ｆ５ 空洞１０９、１１０または１１１における主要溝５を介したサンプル４の流出
Ｆ６ 空洞１１１の下方分岐１１７を介した空気および／またはサンプル４の輸送
Claims (22)
- −分析される生物学的液体（４）をカード（１）に注入するための領域（３）、
−前記注入領域（３）から来る生物学的液体（４）の主要フィード溝（５）、および
−主要溝（５）の延長に存在する少なくとも二つの第二溝（６）
からなるボディ（２）を備えた分析カード（１）であって、さらに
−各第二溝（６）に対応する少なくとも一つのウェル（７）
［各ウェル（７）は、一方で、各分析空洞（９、１０または１１）の末端溝（８）を介して、少なくとも二つの末端分析空洞（９、１０または１１）に前記生物学的液体（４）の所定量を輸送する手段を構成し、かつ、他方で、分析空洞（９、１０および１１）を互いから分離する所定量の不活性流体を貯蔵する手段を構成する］
を備えることを特徴とする分析カードであって、
前記領域（３）を介してカード（１）内に真空を形成することにより、前記分析空洞（９、１０及び１１）中に生物学的液体（４）を輸送することが可能であることを特徴とするカード。 - −分析される生物学的液体（４）をカード（２１）に注入するための領域（２３）、および
−前記注入領域（２３）から来る生物学的液体の少なくとも二つのフィード溝（２５）
からなるボディ（２２）を備えた分析カード（２１）であって、さらに
−各フィード溝（２５）に対応する少なくとも一つのウェル（２７）
［各ウェル（２７）は、一方で、各分析空洞（２９、３０または３１）の末端溝（２８）を介して、少なくとも二つの末端分析空洞（２９、３０または３１）に前記生物学的液体の所定量を輸送する手段を構成し、かつ、他方で、分析空洞（２９、３０および３１）を互いから分離する所定量の不活性流体を貯蔵する手段を構成する］
を備えることを特徴とする分析カードであって、
前記領域（２３）を介してカード（２１）内に真空を形成することにより、前記分析空洞（２９、３０および３１）中に生物学的液体（４）を輸送することが可能であることを特徴とするカード。 - 生物学的液体（４）の末端分析空洞（９、１０および１１、または、２９、３０もしくは３１）への輸送が平行して起こることを特徴とする、請求項１または２記載のカード。
- −分析される生物学的液体（４）をカード（１０１）に注入するための領域（１０３）、
−前記注入領域（１０３）から来る生物学的液体（４）の主要フィード溝（１０５）、および
−主要溝（１０５）の延長に存在する少なくとも二つの第二溝（１０６、１０７および／または１０８）、
からなるボディ（１０２）を備えた分析カード（１０１）であって、
当該カード（１０１）が、さらに
−各第二溝（１０６、１０７または１０８）に対応する少なくとも一つの空洞（１０９、１１０および／または１１１）
［各空洞（１０９、１１０または１１１）は、一方で、所定量の前記生物学的液体（４）を受け入れる手段を構成し、他方で、所定量の不活性流体を貯蔵する手段を構成する］、および
−分析空洞（１０９、１１０および１１１）を互いから分離する、溝（１０５）に存在する液体（４）に対応するオーバーフロー容量を受け入れるためのリザーバー（１０４）、
−リザーバーと連結してオーバーフロー容量を排出するための出口（１２７）
を備えることを特徴とする分析カードであって、
前記出口（１２７）を介してカード（１０１）内に真空を形成するかもしくは前記領域（１０３）を介してカード（１０１）内に加圧を適用することにより、前記分析空洞（１０９、１１０および１１１）中に生物学的液体（４）を輸送することが可能であることを特徴とするカード。 - 生物学的液体（４）の分析空洞（１０９、１１０または１１１）への輸送が連続して起こり、その後にパージされることを特徴とする、請求項４記載のカード。
- 生物学的液体（４）を輸送する主要な手段として作用するウェル（１２）が、主要溝（５）と第二溝（６）との間に存在することを特徴とする請求項１記載のカード。
- 第二溝（６）の容量またはフィード溝（２５）の容量が全て同一であることを特徴とする、請求項１、２および６のいずれか一項に記載のカード。
- 末端分析空洞（９、１０および／または１１、あるいは２９、３０および／または３１、あるいは１０９、１１０および／または１１１）が、少なくとも二つの異なる容量であることを特徴とする、請求項１ないし７のいずれか一項に記載のカード。
- 末端分析空洞（９、１０および／または１１、あるいは２９、３０および／または３１、あるいは１０９、１１０および／または１１１）が、三つの異なる容量であることを特徴とする、請求項１ないし８のいずれか一項に記載のカード。
- 異なる容量の二つの空洞（９と１０または１０と１１または９と１１、あるいは２９と３０または３０と３１または２９と３１、あるいは１０９と１１０または１１０と１１１または１０９と１１１）の間に存在する比率が、１／５〜１／２０、１／５０〜１／２００、または１／５００〜１／２０００であることを特徴とする、請求項８または９に記載のカード。
- 前記比率が、１／１０、１／１００または１／１０００であることを特徴とする請求項１０に記載のカード。
- 同一の容量の空洞（９、１０および／または１１、あるいは２９、３０および／または３１、あるいは１０９、１１０および／または１１１）が、読み出しを容易にするために幾何学的に直線状または同心円状に配置されていることを特徴とする、請求項１ないし１１のいずれか一項に記載のカード。
- −所定量の分析される生物学的液体（４）にカード（１または２１）の注入領域（３または２３）を連結する、
−前記カード（１または２１）の内部に真空を形成する、
−一方で、分析空洞（９、１０および／または１１、あるいは２９、３０および／または３１）に生物学的液体（４）を移し、他方で、生物学的液体（４）に由来し、前記分析空洞（９、１０または１１、あるいは２９、３０または３１）に存在する、サンプルの種々の画分を不活性流体を用いて分離するように真空を破壊し、かつ、
−得られた結果を分析して、初期の生物学的液体（４）に存在する微生物または核酸、抗体のような他の生物学的成分の量を調べる
ことからなることを特徴とする、請求項１ないし３、６および７のいずれか一項に記載の分析カード（１または２１）を満たす方法。 - −所定量の分析される生物学的液体（４）にカード（１０１）の注入領域（１０３）または出口（１２７）を連結する、
−前記カード（１０１）の内部に真空または加圧を形成して、生物学的液体（４）を分析空洞（１０９、１１０および／または１１１）に移す、
−真空または加圧を停止する、
−生物学的液体（４）に由来し、前記分析空洞（１０９、１１０または１１１）のそれぞれに存在する、サンプルの種々の画分を不活性流体を用いて分離するように主要溝（１０５）をパージする、かつ
−得られた結果を分析して、初期の生物学的液体（４）に存在する微生物または核酸、抗体のような他の生物学的成分の量を調べる
ことからなることを特徴とする、請求項４または５に記載の分析カード（１０１）を満たす方法。 - 真空が破壊されたら、分離流体が第二溝（６）またはフィード溝（２５）、あるいは分析空洞（９、１０および／または１１、あるいは２９、３０および／または３１）の、生物学的液体（４）と接触することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
- 分析される生物学的液体（４）の容量が、全ての分析空洞（９、１０および１１、あるいは２９、３０および３１）の全体容量未満であることを特徴とする、請求項１３または１５に記載の方法。
- 分析される生物学的液体（４）の容量が、分析空洞（１０９、１１０および１１１）の全て、流体回路（１０５ないし１０８および１１２ないし１１８）の全て、およびオーバーフロー（１０４）の全体容量以上であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
- 分析される生物学的液体（４）の容量が、全ての分析空洞（１０９、１１０および１１１）および全ての流体回路（１０５ないし１０８および１１２ないし１１８）の全体容量以上であることを特徴とする請求項１４または１７記載の方法。
- 全ての分析空洞（９、１０および１１、あるいは２９、３０および３１）の全体容量に対する分析される生物学的液体（４）の容量の比率が、１／１０〜９／１０であることを特徴とする、請求項１３、１５および１６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記比率が、４／１０〜６／１０であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
- 前期比率が、５／１０であることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
- サンプルの一部中の生物学的物質の数をカウントすることにより、サンプル中の生物学的物質の総数を決定するための統計学的な技術を用いて微生物をカウントするための、請求項１ないし１２のいずれか一項に記載の分析カード（１、２１または１０１）の使用。
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