JP3732230B2 - 試料中の生物学的物質の定量化方法 - Google Patents

Description

関連出願
本出願は、１９９６年２月２３日にCroteau等により出願された米国特許出願第08/606,229の一部継続出願であり、当該一部継続出願は１９９５年１１月１３日にCroteau等により出願された米国特許出願第08/557,529の一部継続出願であり、双方の発明の名称は「試料中の生物学的物質の定量化方法"Method for Quantification of Biological Material in a Sample"」である。（これらの出願を参照として本明細書中に含める。）
発明の分野
本発明は、試料中の生物学的物質の定量化方法に関する。
発明の背景
多くの産業において試料中の生物学的物質の濃度およびレベルを検出し、そして定量することが必要である。例えば、食品や水中の細菌濃度を決定することは食品や水の品質試験の非常に重要な部分をなす。ＥＰＡ規則は、Escherichia coli のような大腸菌型（Coliform）を飲料水中に存在してはならないことを要求する。例えば、Escherichia coliやすべての大腸菌型細菌のための試験培地として使用されるColilert▲Ｒ▼ケミカル混合物（IDEXX Laboratoies, ME）のような「有／無"presence/absence"」形式の試験培地はこの決定を行うのに非常に有用である。Colilert▲Ｒ▼ケミカル混合物は、Edbergの米国特許第４，９２５，７８９号および第５，４９２，９３３号の「汚染されている可能性のある物質の現場における標本試料中の目標微生物を検出するのに使用する方法および培地"Method and Medium for use in Detecting Target Microbes In Situ in A Specimen Sample of A Possibly Contaminated Material"」に記載されている画定基質法（Defined Substrate Technology）を基礎としている。さらに、食品および水試料中の細菌の検出用の培地を記載する、Townsend等により１９９５年６月７日に出願された米国特許出願第08/484,593号の発明の名称「食品中の細菌汚染の検出法および組成物"Method and Composition for Detecting Bacterial Contamination in Food Products"」も参照されたい。この特許出願を参照として本明細書に含める。
しかし、細菌の濃度の単に検出ではなく定量化が重要である被験領域がある。このような被験領域の例には、廃水、浄化水システムの入水、表面水（surface water）および食品試験等がある。例えば、多くのレストランチェーンは、一定濃度の細菌汚染未満しか含有しない生の挽肉（牛肉または豚肉）のみを受け入れるであろう。したがって、食品加工工場は、顧客に食品を出荷する前に、これらの食品の細菌濃度を決定するのに必要な微生物試験を行わなければならない。
生物学的物質の定量化の従来の方法として、標準平板計数法（standard plate count method）または多数試験管発酵（multiple tube fermentation:MTF）法がある。微生物汚染について試験しようとする一定量の試料をまずペトリ皿に分配する。次いで、１５ｍｌの適当な培地を試料上に注ぐ。次いで、ペトリ皿を渦巻かせるようにして試料を培地中に混合し、このペトリ皿をおおよそ２０分間室温で放置して凝固させる。次いで、培地を特定の時間特定の温度でインキュベートさせ、生じたコロニーを計数する。
多数試験管発酵法は、Recles等の「食品の微生物学的試験法の概論（"Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods"」第３版１９９２年第１０５頁〜第１９９頁に発表されている「最も可能性の高い数技法（"Most Probable Number Techniques"）」、ならびにGreenberg等の「水および廃水の標準試験法（"Standard Methods For the Examination of Water and Wastewater"）第８版１９９２年に記載されている。この方法では、希釈範囲を代表する数個の試験管中に一定量の試料を分配する。次いで、適切な温度で試験管をインキュベートし、各試験管中の細菌を生長させる。特定の時間特定の温度でインキュベートした後、陽性試験管の数を数える。上掲のRecles等に記載されている式から最も可能性の高い数を決定できる。
水質試験ではメンブラン濾過により最も行われている。この試験では、一定量の水をメンブランに通過させ、一定期間培地中でメンブランをインキュベートさせる。適切なインキュベート後コロニーを計数する。
発明の概要
本発明は、試料中の微生物の数の一層正確な定量化のため、または試料内のその他の種類の離散微粒子状生物学的物質の定量化のための簡単な方法を提供する。このような生物学的物質には、真菌もしくはその他の生物体、ならびに酵素のようなタンパク質の集合体、または当業者に周知の反応混合物を使用する補助因子（co-factor）でさえ含まれる。概して、本発明は、化学的および／または微生物学的反応物を与える液体試料を保持するように設計された新規な物品の使用をする。例えば、このような化学反応物は細菌のための特定の生長培地であることができる。使用される器具は、概して、液体の別個のアリコートを保持できる多数のウエルを有するインキュベート用平板の形態である。概して、この器具は総量で５〜１００ｍｌの液体を保持するように設計されており、ウエルは試料の各アリコートについて別個のインキュベート用チャンバーを形成するように設計されている。ウエルは、同じ大きさであっても異なる大きさであってもよく、計数範囲を増加するおよび／または希釈効果をシミユレートするような形状をしていてもよい。Naqui等により１９９４年２月２３日に出願された米国特許出願第08/201,110号、発明の名称「液体試料中の生物学的物質の定量化装置および方法（"Apparatus and Method for Quantification of Biological Material in a Liquid Sample"）」を参照されたい。当該特許出願を参照として本明細書に含める。
したがって、第１の局面では、本発明は試料中の生物学的物質の検出法を特徴とする。この方法は、試料を液体化すること（必要な場合）ならびに液体化試料および試薬をインキュベート用平板中に注ぐことの工程を含む。インキュベート用平板は概ね平らな水平表面を有し、当該表面は複数の少なくとも２０個の窪んだウエル（recessed well）に分割されている。各ウエルは液体のアリコートを保持するようになっており、表面張力によりウエル内にアリコートを保持するような、大きさ、形状および適当な材料から形成されている。平板を形成するのに使用した材料の疎水性のために、液体化試料からの過剰の液体がある場合には平板の表面から流れ出る。次いで、この方法は、生物学的物質の有無が決定されるまで、そのインキュベート用平板をインキュベートすることを含む。好適な実施態様では、液体（水平平板より上にある）を流れ出しやすいようにウエルは面取りがされている（図３を参照）。
上述から分かるように、検出できる生物学的物質は、微生物のような離散粒子を形成するいずれかの物質であり、インキュベート用平板の各ウエル内のこのような生物学的物質の有無を決定することにより定量化されることができる。試料は、例えば、廃水、食品、表面スワッブ（swab）、もしくは咽喉のようなその他の表面からのスワッブ、または当業者に周知の他の試料のようないずれかの生物学的または環境上にある試料であることができる。この試料は液体試料であることができ、または液体に溶解して液体化された試料を形成するものであってもよい。したがって、上記のパラグラフの「液体化する」という用語は、微生物学的試薬と合わされるとインキュベート用平板内で迅速にアリコート化できる液体状の試料を与えることを意味する。液体化された試料はウエル中で液体として残ってもよくまたは固化してもよい。
インキュベート用平板は所望の任意の材料から形成されてもよいが、しかし、特に、液体化試料の別個のアリコートがウエル同士の交差汚染がなく各ウエル内で表面張力により保持できるプラスチックを使用するのが望ましい。好ましくは、材料は疎水性である。表面は未処理であってもよく、またはウエル内の液体の保持性を増強するために化学的にもしくは物理的に処理されていてもよい。
インキュベート用平板の形状は関連性がなく、そして好適な実施態様ではその形状は概ね円形である（例えば、ペトリ皿の形状のような）。事実、ペトリ皿に代わってインキュベート用平板を使用できる。具体的には、本発明の方法は、細菌のコロニーの数を評価するためにペトリ皿上で一般的に行われるような現存の試験に代えて使用することができる。インキュベート用平板中に試料の別々のアリコートが与えられるので、当業者はこの平板内の陽性ウエルの数を評価するのみですみ、上述のＭＰＮ試験と同様に、元の試料中の生物学的物質の量を決定できる。
概ね平らな水平表面は液体をウエル同士間で容易にアリコート化でき、次いで過剰の液体をこの平板から流出するように設計されている。好適な実施態様では、該平板に流出口（lip or pouring spout）が設けられている。ウエルの深さと形状ならびにウエルおよびこの平板を製造するのに使用される材料は、液体化試料中で使用される液体の種類に依存した各ウエル内のアリコートを保持するために表面張力が利用できるように選択することを当業者は認識するであろう。
他の好適な実施態様では、表面は少なくとも４０，６０，８０または２００個もしくはそれ以上の窪んだウエルを画定し；インキュベート用平板は成形可能な任意のプラスチックから形成され；ウエル内で液体が汚染するのを防止するために蓋が与えられ；そして該平板は無菌状態にされており、その結果、試料中に少なくとも一種の生物学的物質粒子が存在しない限り陽性アリコートが認識されない。
さらに他の好適な実施態様では、インキュベート用平板は透明かまたは、例えば、白色もしくは黄色に着色（インキュベート用平板内の着色（例えば、青色）の外観を増強するため）され、ウエルの直径は約０．３８１ｃｍ（０．１５インチ）であり、この平板の直径は約７．６２ｃｍもしくは１２．７ｃｍ（３もしくは５インチ）である。
なおさらに他の好適な実施態様では、インキュベート用平板は、この平板の表面に隣接して「流出用ポケット（"pour-off pocket"）」を有する。このポケットは、平板表面から除かれるべき過剰の液体を含有するのに足る容量を有する。過剰の流体が平板表面上にあふれて戻るのを防止するために、ポケットは、例えば、ガーゼ様材料のような吸収剤材料を含有することが好ましい。特殊の実施態様では、この平板は流出用ポケットと「ランデイングパッド（"landing pad"）」の双方を有する。「ランデイングパッド」については後述する。
関連した局面では、本発明は概ね平らな水平表面を持つ無菌インキュベート用平板を特徴とする。この表面は複数の少なくとも２０個の窪んだウエル（好適な実施態様では、少なくとも４０，６０，９０個のウエルまたは２００個のウエルさえ与えられる）を画定し、各ウエルは上述したように表面張力により液体のアリコートを保持するようになっている。
好適な実施態様では、上述した無菌インキュベート用平板とほぼ同様であるがしかしその中に「ランデイングパッド」を組み入れたものを特徴とする。「ランデイングパッド」は平板のウエルのない概ね中央領域にあり、試料が、例えば、インキュベート用培地で希釈される前に当該試料を受け入れることができる。したがって、「ランデイングパッド」領域に（その大きさおよび形状に依存して）０．０１〜５ｍｌの一定量の試料液体を施用でき、次いで、希釈用および生長支持用培地（例えば、上記したColilert^TM化学混合物）を施用することにより試料液体を各ウエル中に分配できる。かかる液体は試料を希釈すると共にウエル全体にわたって試料を分散させる。
さらに、流出口をインキュベート用平板内に設けることができ、この平板内の過剰の液体を流し出すことができる。このような流出口はスリットを有する適当な蓋とマッチさせることができ、後述するように、当該スリットが流出口と整合したときにかぎり、インキュベート用平板中の液体がインキュベート用平板から流れることができる。
上記の方法について示したように、インキュベート用平板は当該平板の表面に隣接して「流出用ポケット」を備えることもできる。このポケットは平板の表面から除かれるべき過剰の液体を含有するのに足る容量を有し、好ましくは、このポケットはガーゼ用材料のような吸収剤材料を含む。特殊な実施態様では、この平板は、「流出用ポケット」と「ランデイングパッド」との双方を有する。
出願人は、熟達していないヒトが試料内の生物学的物質の量を迅速に決定できる非常に有用な方法を提供する。微生物学にそんなに訓練されていない人々により試料を容易に液体化でき、いずれかの特定の試験のための材料を製造者により与えられることができるので、このような人々でも正確性をもって容易に試験をできる。インキュベート用平板は概ね無菌状態で与えられるので生物学的物質の不適切な検出は起こり得ない。
複数の窪み内に液体を保持できるプラスチック容器を与えることは公知であるが、出願人は、本器具は新規な自動アリコート化方法を提供するものと信じている。これは微生物を検出し定量するのに使用される既存の製品に比べて改良されている。何故なら、液体が個々の分配をすることなく個々のウエルに移動するからである。
本発明の器具はペトリ皿の使用に取って代わることができ、特に、食品の分析におよび臨床試料の試験に使用できる。本器具のウエルの分離は各アリコート間のクロストーク（crosstalk）すなわち汚染を防ぐ。この理由で、試験の多くを、蛍光を観察することにより行うことができる（この蛍光観察は寒天含有ペトリ皿においては容易に行うことができない）。本器具は、例えば、１ｍｌまたは１０ｍｌ当たり１個を超える微生物のような試料中に大量の微生物が存在するときに特に有用である。
本発明の他の特徴および利点は下記のその好適な実施態様からまたは請求の範囲から明らかになるであろう。
好適な実施態様の記述
まず図面について簡単に説明する。
図面
図１および２は成形プラスチック製インキュベート用平板の線図である。
図３は面取りのあるまたは無いウエルの断面図を示す。
図４は流出口および対応するスリットならびに「ランデイングパッド」を備えた成形プラスチック製インキュベート用平板の線図である。
図５は「ランデイングパッド」および「流出用ポケット」を備えた成形プラスチック製インキュベート用平板の線図である。
構造
図１および２に言及すると、各々直径約０．４０６４ｃｍ（０．１６インチ）の複数のウエル１２を備えたインキュベート用平板１０が示されている。このインキュベート用平板１０の直径は約１２．７ｃｍ（５インチ）である。インキュベート用平板は成形プラスチックから製造されている。ウエル１２はウエル同士間でクロストークを避けるのに充分空間を置いて離れている。これらのウエルは、ウエルの上縁に液体が残らないことが望まれる場合面取りを有することができる（図３）。インキュベート用平板を標準的な手順により容易に形成でき、ペトリ皿についての一般的な形状に製造できる（流出口の有無、および蓋１４の有無を伴って）ことを当業者は認識するであろう。この蓋は、当該蓋と平板１０との接触を避けるために凹部（dimple）１６を備えている。
図４に言及すると、上述と同様の複数のウエルを備えたインキュベート用平板１０が示されている。このインキュベート用平板は、単に所定量の液体を保持できる領域である約３．８１ｃｍ（１．５インチ）直径の大きさの「ランデイングパッド」も含む。インキュベート用平板内には、インキュベート用平板から過剰の液体を除くことのできる流出口２４も備えている。さらに、インキュベート用平板から液体を除去できるように流出口とマッチできるスリットを備えた対応する蓋１４を与えられている。スリットが流出口と整合していないとき、平板内の液体の蒸発を、ウエル内の液体の上方の空気流を減少させることにより減らす。蓋の表面がウエルに触れないようにし、したがって、ウエル同士間の交叉汚染を防ぐために蓋に凹部１６を備えることもできる。
図５に言及すると、上述したと同様の複数のウエルを備えたインキュベート用平板が示されており、当該インキュベート用平板は直径約２．５４ｃｍ（１インチ）の「ランデイングパッド」２２も含有する。インキュベート用平板内には、過剰の液体がインキュベート用平板から除ける「流出用ポケット」２６もインキュベート用平板の表面に隣接して備える。断面図から分かるように、「流出用ポケット」はポケットと平板表面との間に高くされたバリヤー２８により形成される。このバリヤーはより低いバリヤー部分３０を有し、過剰の流体が平板表面からポケットに流出させる流路として作用する。典型的には、ポケットは吸収剤材料を含有し、ポケット内の流体を維持し、平板表面上にあふれて戻るのを防止する。
使用
使用する際、生物学的物質の検出に適した試薬粉末を適切な量の無菌液体で再水和させ、次いで、これに既知量の試験試料を接種する。例えば、２０ｍｌの無菌水に、１０〜１，０００マイクロリットルの試料を接種できる。次いで、接種済み試薬をインキュベート用平板１０に添加でき、接種済み液体試薬を各ウエル１２に分配するためにインキュベート用平板１０内でその液体を渦巻かせることができる。次いで、インキュベート用平板１０をおおよそ９０度の角度に保ち、過剰の接種済み液体試薬が平板から除去されるようにする。次いで、インキュベート用平板上に蓋をし、インキュベーター中に当該平板を適切な時間、例えば、１８〜４８時間保持できる。その時間経過後、陽性結果の有無を平板の各ウエル１２で評価する。さらに、「流出用ポケット」を備えた平板について、このポケット中に含まれた大量の流体のため、ポケット中の陽性結果は高細菌数の早期兆候として役立たせることができる。
実施例１：バルク試験についてのインキュベート用平板の使用
総平板数（total place count）のために、上述したような平板を食品の総細菌濃度の検出と定量のために使用する。酵素活性を食品中の生存可能細菌の存在に関連付ける多酵素技術（Multiple Enzyme Technology:TownsendおよびChenの米国特許出願第08/484,593号、食品中の細菌汚染を検出するための方法および組成物：Method and Composition for Bacterial Contamination in Food Products；本特許出願を参照として本明細書に含める）を基準にしている。それは、細菌により代謝されると青の蛍光色を生じる多酵素基質を利用する。液体試薬に調製した食品試料を接種し、上述した平板中に分配すると、２４時間インキュベート後にその食品の生存可能総細菌濃度を決定できる。ここで使用される実際の培地は本発明に重要でないが、例証の目的のためにのみ与える。
貯蔵および処分
光から離し室温（４〜２５℃）でバルク粉末および未使用Simplateを貯蔵する。使用後、Simplate器具は、適切に取り扱われ、処分される生存可能細菌を含有しうる。一旦粉末が再水和されると、４〜２５℃で貯蔵されるとき最高２４時間まで安定である。
試験手順
１．無菌脱イオン水の入った容器に適切な量のバルク粉末を注ぐ。１バイアルに１０試験分に足る粉末を含む。各試験の最終容量は１０ｍｌである。例えば、粉末１バイアルを１００ｍｌの無菌水に加え、１０試験分に足る培地を作る。
２．試験試料を、図４に示されている平板１０の中央「ランデイングパッド」２２上に入れる。この手順が完了すると試験試料の半分が流出され処分され得るので、接種物の大きさは考慮されなければならない。例えば、０．１ｍｌの試験試料の細菌濃度の測定を望む場合、「ランデイングパッド」上に０．２ｍｌの試験試料を入れなければならない。中央「ランデイングパッド」上に２ｍｌ以下入れる。
３．平板から蓋を取り、平板中に１０ｍｌのＴＰＣ培地を分配し、中央「ランデイングパッド」上の試験試料上に当該培地液体を注ぐのを確実にする。試験試料が０．１ｍｌを超える場合、平板中に最終容量が１０ｍｌになるのに足るＴＰＣを加える。液体が「ランデイングパッド」上に分配されない場合、液体がはね飛ぶ可能性があることに注意する。
４．平板に蓋を戻す。Simplate中の液体残分が、蓋のスリットと流出口とが整合していないということを確実にするということを確保することに注意する。
５．標準的な注入平板に行うと同様に平板を渦巻かせることによりウエル中に液体を分配する。
６．蓋のスリットを流出口と整合させ、最終的にウエル中に入らなかった過剰の液体を注意深く流出させる。平板を作業台からおおよそ９０°の角度に保持し、過剰の液体の適切な流出を確保する。平板を穏やかにたたくことにより完全にウエル同士間の液体の「クロスブリッジ（"cross bridges"）」が除かれるのを確実にする。過剰の液体を適当に処分する。
７．蓋をスライドさせ、インキュベート中にウエル中の液体が乾燥するのを防ぎ、開放により外部からの汚染物を避けるために流出口から離す。
８．インキュベーター中に２４時間平板を入れる。所望の場合、平板を逆にすることができる。３７℃を超えるインキュベート温度は推薦できない。
９．２４時間後平板の１２．７ｃｍ（５インチ）内で６ワット３６ｎｍｕｖ光を置くことにより蛍光ウエルの数を計数する。２４時間経過前に平板を読んではならない。結果は４８時間まで安定である。
１０．蛍光ウエルの数をＭＰＮチャートと比較し、平板中に存在する細菌の最も可能性のある数を決定する。
「流出用ポケット」を備えた平板を使用する試験手順
１．無菌脱イオン水の入った容器に適切な量のバルク粉末を注ぐ。１バイアルに１０試験分に足る粉末を含む。各試験の最終容量は１０ｍｌである。例えば、粉末１バイアルを１００ｍｌの無菌水に加え、１０試験分に足る培地を作る。
２．試験試料を、図５に示されている平板１０の中央「ランデイングパッド」２２上に入れる。この手順が完了すると試験試料の半分がポケット中に流出され得るので、接種物の大きさは考慮されなければならない。例えば、０．０１ｍｌの試験試料の細菌濃度の測定を望む場合、「ランデイングパッド」上に０．２ｍｌの試験試料を入れなければならない。中央「ランデイングパッド」上に２ｍｌ以下入れる。
３．平板から蓋を取り、平板中に１０ｍｌの培地を、中央「ランデイングパッド」上の試験試料上に液体を注ぐのを確実にするように分配する。試験試料が０．１ｍｌを超える場合、平板中に最終容量が１０ｍｌになるのに足る培地を加える。液体が「ランデイングパッド」上に分配されない場合、液体がはね飛ぶ可能性があることに注意する。
４．標準的な注入平板で行うと同様に平板を渦巻かせることによりウエル中に液体を分配する。流体が「流出用ポケット」に入らないように注意する。
５．「流出用ポケット」のバリヤー流路より最終的にウエル中に入らなかった過剰の液体を注意深く流出させる。平板を作業台からおおよそ９０°の角度に保持し、過剰の液体の適切な注ぎ出しを確保する。平板を穏やかにたたくことにより完全にウエル同士間の液体の「クロスブリッジ」が除かれるのを確実にする。
６．インキュベーター中に２４時間平板を入れる。「流出用」ポケットが吸収剤材料を含む場合で所望する場合、平板を逆にすることができる。
７．２４時間後平板の１２．７ｃｍ（５インチ）内で６ワット３６ｎｍのｕｖ光を置くことにより蛍光ウエルの数を計数する。２４時間経過前に平板を読んではならない。結果は４８時間まで安定である。
８．蛍光ウエルの数をＭＰＮチャートと比較し、平板中に存在する細菌の最も可能性のある数を決定する。
実施例２：単位用量試験についてのインキュベート用平板の使用
本試験について実施例１で記載した平板および培地を使用する。
試験手順
１．予め調合した粉末の入った試験管に１０ｍｌの無菌水を加える。０．１ｍｌを超える食品試料を試験管中に接種しなければならない場合、試験管中の最終用量が１０ｍｌになるように適当に無菌水の量を減らす。
２．液体試薬に試験をしようとしている食品試料を接種する。
３．粉末と接種した食品試料が完全に混合されるまで試験管を数回振る。液体試薬が泡立つ傾向にある過剰の混合は避ける。泡立ちすぎると平板中への液体の分布を複雑にする可能性がある。残りの手順は実施例１と同様である。
その他の実施態様は請求の範囲内にある。

Claims (49)

1. 試料中の生物学的物質の量の検出法であって、
   前記試料を液体化させ（必要の場合）、そして概ね平らな水平の表面を有するインキュベート用平板中に液体化試料を注ぐこと、ここで、前記表面は複数の少なくとも２０個の窪んだウエルを画定し、各ウエルは液体のアリコートを保持するようになっておりしかも表面張力によりまたは前記液体のゲル化により前記アリコートを各ウエル内に保持するような大きさおよび形状にされならびにそれに適した材料から形成されている；ここで、前記インキュベート用平板が、前記ウエルへの試料の分散前に液体化試料を保持するのに足る大きさの「ランデイングパッド」領域を含み；
   前記インキュベート用平板から過剰の液体を流出させること；そして
   前記インキュベート用平板を、前記ウエルの１以上中で前記生物学的物質の有無が決定されるまでインキュベートし、その結果前記生物学的物質の量を決定できる、各工程を含む前記試料中の生物学的物質の量の検出法。
2. 前記表面が少なくとも４０個の窪んだウエルを画定する請求の範囲第１項に記載の方法。
3. 前記表面が少なくとも６０個の窪んだウエルを画定する請求の範囲第１項に記載の方法。
4. 前記表面が少なくとも９０個の窪んだウエルを画定する請求の範囲第１項に記載の方法。
5. 前記表面が少なくとも２００個の窪んだウエルを画定する請求の範囲第１項に記載の方法。
6. 前記平板がプラスチックから形成される請求の範囲第１項に記載の方法。
7. 前記プラスチックがＰＶＣである請求の範囲第６項に記載の方法。
8. 前記プラスチックが疎水性材料から形成される請求の範囲第６項に記載の方法。
9. 前記平板の形状が概ね円形である請求の範囲第１項に記載の方法。
10. 前記平板がウエル中の液体の汚染を防止するために蓋を備えている請求の範囲第１項に記載の方法。
11. 前記平板が透明である請求の範囲第１項に記載の方法。
12. 前記平板が着色されている請求の範囲第１項に記載の方法。
13. 着色が黄色である請求の範囲第１２項に記載の方法。
14. 前記各ウエルが直径約０．３８１ｃｍ（０．１５インチ）である請求の範囲第１項に記載の方法。
15. 前記各ウエルが過剰の液体の除去を促進させるために面取りがされている請求の範囲第１項に記載の方法。
16. 前記平板が直径約７．６２ｃｍ（３インチ）である請求の範囲第１項に記載の方法。
17. 前記平板が直径約１２．７ｃｍ（５インチ）である請求の範囲第１項に記載の方法。
18. 前記平板が、当該平板からウエル中に存在しない過剰の液体の除去を促進させる口を有する請求の範囲第１項に記載の方法。
19. 前記ウエルが全部で５〜１００ｍｌ保持する請求の範囲第１項に記載の方法。
20. 前記平板が無菌である請求の範囲第１項に記載の方法。
21. 前記平板がその表面に隣接して流出用ポケットをさらに含み、このポケットが前記過剰の液体を含有するようになっており、そして
    前記過剰の液体がインキュベート前に前記インキュベート用平板の表面から前記流出用ポケット中に注がれる請求の範囲第１項に記載の方法。
22. 前記流出用ポケットが吸収剤材料を含有する請求の範囲第２１項に記載の方法。
23. 前記方法が、前記試料を前記「ランデイングパッド」に施用し、次いでさらに液体を与え、前記試料を希釈すると共に前記試料を前記ウエル中に分散することを含む請求の範囲第１項に記載の方法。
24. 前記平板がその表面に隣接して流出用ポケットをさらに含み、このポケットが前記過剰の液体を含有するようになっており、そして
    前記過剰の液体がインキュベート前に前記インキュベート用平板から前記流出用ポケット中に注がれる請求の範囲第１項に記載の方法。
25. 前記インキュベート用平板が流出口を含み、当該平板が前記流出口と協同するようになっているスリットを有する蓋をさらに含み、過剰の液体が前記インキュベート用平板から流出させることができ、前記蓋中の前記スリットおよび前記インキュベート用平板中の前記流出口の分離ができ、それにより蒸発による前記ウエルからの液体の顕著な損失がなくてインキュベート用平板のインキュベートができる請求の範囲第１項に記載の方法。
26. 概ね平らな水平の表面を有し、生物学的物質の量を決定するための無菌インキュベート用平板であり、ここで、前記表面は複数の少なくとも２０個の窪んだウエルを画定し、各ウエルは液体のアリコートを保持するようになっておりしかも前記アリコートを各ウエル内に表面張力により保持するような大きさおよび形状にされならびにそれに適した材料から形成されており；
    前記インキュベート用平板は前記ウエルへの試料のアリコート化前に試料を保持するようになっている「ランデイングパッド」を含み；
    前記インキュベート用平板は当該平板に施用された試料中に存在する前記生物学的物質の不存在下では当該生物学的物質のいずれの陽性応答をも与えない無菌インキュベート用平板。
27. 前記表面が少なくとも４０個の窪んだウエルを画定する請求の範囲第２６項に記載の平板。
28. 前記表面が少なくとも６０個の窪んだウエルを画定する請求の範囲第２６項に記載の平板。
29. 前記表面が少なくとも９０個の窪んだウエルを画定する請求の範囲第２６項に記載の平板。
30. 前記表面が少なくとも２００個の窪んだウエルを画定する請求の範囲第２６項に記載の平板。
31. 前記平板がプラスチックから形成される請求の範囲第２６項に記載の平板。
32. 前記プラスチックがＰＶＣである請求の範囲第３１項に記載の平板。
33. 前記プラスチックが疎水性材料から形成される請求の範囲第３１項に記載の平板。
34. 前記平板の形状が概ね円形である請求の範囲第２６項に記載の平板。
35. 前記インキュベート用平板が前記ウエル中の液体の汚染を防止するために蓋を備えている請求の範囲第２６項に記載の平板。
36. 前記平板が透明である請求の範囲第２６項に記載の平板。
37. 前記平板が着色されている請求の範囲第２６項に記載の平板。
38. 着色が白色または黄色である請求の範囲第３７項に記載の平板。
39. 前記各ウエルが直径約０．３８１ｃｍ（０．１５インチ）である請求の範囲第２６項に記載の平板。
40. 前記平板が直径約７．６２ｃｍ（３インチ）である請求の範囲第２６項に記載の平板。
41. 前記平板が直径約１２．７ｃｍ（５インチ）である請求の範囲第２６項に記載の平板。
42. 前記平板が当該平板からウエル中に保持されない過剰の液体を除去できる蓋を有する請求の範囲第２６項に記載の平板。
43. 前記ウエルが全部で５〜１００ｍｌ保持する請求の範囲第２６項に記載の平板。
44. 前記平板の表面に隣接して流出用ポケットをさらに含み、このポケットが前記平板の前記表面から除去される過剰の液体を含有するようになっている請求の範囲第２６項に記載の無菌インキュベート用平板。
45. 前記「ランデイングパッド」の直径が少なくとも２．５４ｃｍ（１インチ）である請求の範囲第２６項に記載の無菌インキュベート用平板。
46. 前記平板が流出口を有する請求の範囲第２６項に記載の無菌インキュベート用平板。
47. 前記平板が前記流出口と協同するようになっているスリットを有する蓋をさらに含み、インキュベート用平板から液体の除去ができる請求の範囲第４６項に記載の無菌インキュベート用平板。
48. 前記平板の表面に隣接して流出用ポケットをさらに含み、このポケットが前記平板の前記表面から除去される過剰の液体を含有するようになっている請求の範囲第２６項に記載の無菌インキュベート用平板。
49. 前記流出用ポケット内に吸収剤材料をさらに含有する請求の範囲第４８項に記載の無菌インキュベート用平板。

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