JP4564714B2 - 診断用腫瘍マーカー、腫瘍形成の阻害のための薬物スクリーニング、並びにがん治療用の組成物及び方法 - Google Patents
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Description
この本出願は、米国特許法第119条(e)項に基づいて、係属中の米国仮出願第60/253,361号(2000年11月27日出願)、米国仮出願第60/255,370号(2000年12月13日出願)、米国仮出願第60/256,027号(2000年12月15日出願)、米国仮出願第60/258,157号(2000年12月22日出願)、米国仮出願第60/259,615号(2001年1月3日出願)、米国仮出願第60/260,186号(2001年1月5日出願)、米国仮出願第60/266,169号(2001年2月2日出願)、米国仮出願第60/289,444号(2001年5月7日出願)、米国仮出願第60/266,929号(2001年2月6日出願)、米国仮出願第60/278,093号(2001年3月23日出願)、米国仮出願第60/294,887号(2001年5月31日出願)、及び米国仮出願第60/298,272号(2001年6月14日出願)の利益(優先権)を主張し、これらの各出願は引用によって本明細書に援用する。
発明の属する技術分野
本発明は、脱落した細胞表面受容体の鎖間結合領域及び切断産物を用いるがんの診断及びがん治療の評価のためのアッセイ、並びに細胞に残存した受容体の部分をがん治療薬の分子標的として使用することに関する。
発明の背景
腫瘍形成を促進する生体分子間相互作用の多くは、細胞内及び細胞間シグナリングを媒介する細胞表面タンパク質が関与している。“腫瘍マーカー”は、新生物形成状態への移行の結果、独占的に発現された、過剰発現された、又は変化した発現パターンを示す細胞表面上のタンパク質である。ある腫瘍マーカーの表面濃度はがんの進行と相関している。例えば、細胞表面受容体αVβ3と細胞接着分子のビトロネクチン間の相互作用は血管形成に関与し(Varner J,Cheresh D:Integrin and Cancer(インテグリンとがん),Curr Opin Cell Biol,1996,8(5):724−730;Vailhe B,Ronot X,Tracqui P,Usson Y,Tracqui L:In vitro angiogenesis is modulated by the mechanical properties of fibrin gels and is related to αVβ3 integrin localization(インビトロにおける血管形成はフィブリンゲルの機械的性質によって調節され、αVβ3インテグリンの局在に関係する),In Vitro Cell Dev Biol Anim,1997,33(10):763−773;Horton M:The aVb3 integrin“vitronectin receptor”(aVb3インテグリン“ビトロネクチン受容体”),Int J Biochem Cell Biol,1997,29(5):721−725)、黒色腫細胞上のαVβ3の濃度増加は予後不良と相関している(Hieken T,Farolan M,Ronan S,Shilkaitis A,Wild L,Das Gupta T:β3 integrin expression in melanoma predicts subsequent metastasis(黒色腫におけるβ3インテグリンの発現はその後の転移を予言する),J Surg Res,1996,63(1):169−173)。
本発明は、細胞増殖、特にがんに関わる様々なキット、方法、組成物、ペプチド種及びアーティクルを提供する。本発明は、主としてがんの診断及び治療のための技術及び構成要素に関する。
本発明の別の方法は、患者の試料中の細胞表面受容体の切断部位を判定し、そして該判定ステップに基づいてがんの徴候又はがんの可能性を評価することを含む。
本発明の別の方法は、MUC1の異常発現を特徴とするがんを有する患者の治療に関し、該患者に腫瘍成長を削減するのに有効な量のL−α−メチル−ドパを投与することを含む。
MUC1の異常発現を特徴とするがんを有する患者を治療するための別の方法は、該患者に腫瘍成長を削減するのに有効な量のブチルインダゾールを投与することを含む。
発明の詳細な説明
定義:
“MUC1成長因子受容体(MGFR)”という用語は、細胞増殖を促進する成長因子のような活性化リガンドと相互作用するMUC1受容体の部分を意味する機能的定義である。MUC1のMGFR領域は、細胞表面に最も近い部分で、PSMGFRの大部分又はすべてによって規定される。MGFRは、非修飾ペプチドと、例えばリン酸化、グリコシル化などのような酵素修飾を受けたペプチドの両方を含む。本発明の結果は、腫瘍形成に関わる部位で細胞からのIBR放出をもたらすMUC1の切断が起こると、この部分がリガンドにアクセス可能になるという機構と合致する。
“MUC1成長因子受容体の主配列”(PSMGFR)という用語は、MGFRの大部分又はすべてを規定する、以下に定義した(表1−配列番号7参照)ペプチド配列のことである。PSMGFRは、非修飾ペプチドと、例えばリン酸化、グリコシル化などのような酵素修飾を受けたペプチドの両方を含む。ヒスチジンタグ標識PSMGFR(表1−配列番号2参照)は、本明細書中ではHis−PSMGFRと略す。
“分離”という用語は、細胞からの物理的分離を意味する。すなわち、細胞に対して固定されていたMUC1の部分が該細胞に対してもはや固定されていない状態をいう。例えば、MUC1の部分の切断の場合、切断された部分が細胞から離れて自由に移動し、その後体液中に検出されたり、切断された細胞から離れた場所、例えば別の細胞、リンパ節などに固定されれば、“分離した”ことになる。
“MUC1提示細胞”とは、MUC1及び/又はMGFRを表面に発現している非がん性及びがん性細胞のことである。“MUC1腫瘍細胞”又は“MUC1がん細胞”又は“がん性MUC1細胞”とは、MUC1及び/又はMGFRをその表面に異常発現しているがん性腫瘍細胞のことである。
機構モデル:(1)受容体のクラスター化は健常状態に伴うものである。なぜならば、凝集したIBR部分は、成長因子、修飾酵素などのリガンドが、機能受容体として作用するMUC1受容体の隣接する細胞外部分にアクセスするのを遮断するからである。クラスター化は、細胞内テールが細胞内修飾酵素及びシグナリングリガンドにアクセスするのも遮断する。(2)MUC1受容体がIBRを放出する位置で切断されると、受容体のクラスター化を維持する重要な力が失われ、受容体は細胞膜内を自由に移動し、又は修飾酵素、活性化リガンドもしくは成長因子のような分泌リガンド、又は他の細胞表面受容体と相互作用するようになる。これらの相互作用は、細胞増殖のシグナリングカスケードを引き起こす二量体化のような新規の誘導多量体化状態に関与することになろう。
エトモキシル。エトモキシルによる治療を使う本発明の方法が意図されない患者は、既にエトモキシルによる治療を要する疾患と診断されている患者、特にエトモキシルによる治療を必要とする慢性心不全を伴う疾患を有する患者である。そのような疾患は、不適切な筋小胞体機能を伴う不全心肥大などである。
前述のように、異なる薬物は異なる機構に従って作用する。一つの機構による薬物は、MGFRの腫瘍形成促進リガンドへの結合を、薬剤を投与されていない患者の自然の状態に比べて特別に妨害する。別の機構による薬物は、MUC1の全体的な切断を、薬剤を投与されていない患者の自然の状態に比べて特別に削減する。別の機構による薬物は、MUC1受容体の自己凝集を、薬剤を投与されていない患者の自然の状態に比べて特別に維持する。一態様では、薬物の活性度は少なくとも10%である。他の態様では、薬物の活性度は、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%である。
生分解性ポリマーの例は、乳酸及びグリコール酸のポリマー類、ポリ無水物類、ポリ(オルト)エステル類、ポリウレタン類、ポリ(butic acid)、ポリ(吉草酸)、及びポリ(ラクチド−コカプロラクトン)のような合成ポリマー類、並びに、アルギネート及びデキストランやセルロースを含む他の多糖類、コラーゲン、それらの化学誘導体類(置換、化学基、例えばアルキル、アルキレンの付加、ヒドロキシル化、酸化、及び当業者によって日常的に行われる他の修飾)、アルブミン及び他の親水性タンパク質、ゼイン及び他のプロラミン類及び疎水性タンパク質、それらのコポリマー及び混合物などの天然ポリマー類などである。一般的に、これらの材料は酵素加水分解又はインビボにおける水への曝露のいずれかによる表面又はバルク腐食で分解する。
表1:ペプチド配列
実施例で使用されるコロイドの調製/薬物スクリーニング法
本発明のある実施例及び態様において、コロイド粒子表面の自己組織化単層(SAM)を利用する。コロイドはSAMで誘導体化し、国際特許公開番号WO00/43791、2000年7月27日公開、発明の名称“神経変性疾患における異常タンパク質凝集の迅速且つ高感度の検出”(引用により本明細書に援用)に記載されているのと同様の形で薬物スクリーニング用に調製した。
実施例1a.MUC1のPSIBRペプチドの自己凝集の測定
以下の実験は、MUC1受容体の切断部分は、脱落後細胞表面に残って付いている受容体の部分のリガンドになるという、他者の提案した仮説に挑むために設計された。しかしながら、驚くべき結果によれば、細胞表面に近いMUC1受容体の部分は高親和性の相互作用で自己凝集することを示している。図2参照。図2では、A列のカラム1−4及びカラム1の列A−Dのすべてのウェルが数分以内にブルーに変わったが、残りの9個のウェル(列B−Dのカラム2−4)はピンクのままであった。この実験では、MUC1受容体の様々なフラグメントの、相互結合能又は自己結合(自己凝集)能を試験した。結果は、どのフラグメントも受容体の他の部分には結合しないことを示す。しかしながら、少なくとも一部はPSIBRペプチドの配列(表1)によって定義される部分は、高親和性の相互作用で自己凝集する。我々は、この領域を受容体のIBR(鎖間結合領域)と名付けた。
実施例1b:腫瘍状態にあるMUC1切断部位とMUC1鎖間結合との間の関係
本実施例は、MUC1受容体のMGFRとPSIBR間の境界付近のペプチド配列の、自己凝集に参加する能力を調べることによって、腫瘍形成又はがんに関連するMUC1の予想される切断部位を解明しようとするものである。
実施例2:MUC1受容体のMGFR部分の二量体化は、MUC1腫瘍細胞について提案された機構と合致する増強された細胞増殖の引き金を引く
本実施例でMUC1受容体に対する二量体化の影響を示す。本実施例で、MUC1受容体のMGFR領域に対して成長させた2価の抗体に様々な濃度で細胞を曝露すると、MUC1腫瘍細胞について提案された機構と合致する増強された細胞増殖(又はその欠如)がもたらされることを示す。2価の抗体をPSMGFRに対して作製した(すなわち、2個のMGFRに同時に結合する能力を有する単一抗体を製造した)。MUC1腫瘍細胞(T47D)を該抗体に曝露し、細胞増殖を抗体濃度の関数として調べた。成長因子/受容体−抗体応答を象徴する成長/応答曲線が観察された。具体的には、小部分の細胞しか抗体に曝露されないほどの低濃度では細胞増殖は少なかった。1個の抗体が隣接するMGFRを結合できるほど高い抗体濃度では細胞増殖は最大限となった。過剰すぎる抗体濃度では、各抗体は隣接するMGFRを二量体化せず1個のMGFRに結合しただけで、増殖は抑えられた。
実施例3a:MUC1提示細胞によって産生される活性化リガンドは複数のPSMGFRに結合する
本実施例では、MUC1腫瘍細胞の増殖の引き金を引く活性化リガンドは複数のPSMGFRに同時に結合することを示す。固定化したPSMGFRを担持するコロイド粒子を製造し、これらのコロイドの懸濁液を、(1)MUC1腫瘍細胞、又は(2)対照細胞の溶解産物及び上清に曝露した。MUC1腫瘍細胞の溶解産物/上清はコロイドを凝集させた(懸濁液がブルーに変色)。それらに含有されている活性化リガンドが異なるコロイド粒子上のMGFRに結合し、コロイド粒子を凝集させたためである。対照細胞の溶解産物/上清はそうならない。
さらに図6を参照する。カラム1のウェルはHis−PSMGFRを担持するコロイドを含有する。カラム2のウェルは、陰性対照としてGST(グルタチオン−S−トランスフェラーゼ)タンパク質を担持するコロイドを含有する。B列:HTB−133(T47Dとしても知られる)はピンクからブルーの色変化;C列:CRL−1500はピンクからブルーの色変化;A列:CRL−1504はピンクからブルーの色変化であるが、かなり長いインキュベーション期間後;D列:CRL−1902は色変化なし。陰性対照として、溶解産物/上清を無関係のペプチドであるGSTタンパク質を提供しているコロイドにも加えたが、いずれの細胞系についても色変化は観察されなかった。
実施例3b:細胞系におけるMUC1の発現度と、PSMGFRと相互作用するリガンドの存在との関係
本実施例で、MUC1の発現と、細胞表面に直接隣接しているMUC1受容体の部分(MGFR)から誘導されたペプチドに結合するリガンド(一つ又は複数の)の存在との間には直接的な相関があることが示された。
実施例4a:MUC1受容体のMGFR部分に結合するリガンドの特定
MUC1受容体のリガンドを確認しようとして、鎖間結合領域の切断後細胞表面に残って付いているMUC1受容体の部分を表す、合成His−PSMGFRペプチド:
GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAHHHHHH(配列番号2)を、NTA−Niビーズ(カタログ番号1000630;Qiagen GmbH、ドイツ、より入手)に装着し、プロテアーゼ阻害薬PMSF(フェニルメチルスルホニルフルオリド)の存在下(図9)又は不在下(図10)で細胞溶解産物とインキュベートした。T47D細胞からの溶解産物を用いた。その理由は、この乳房腫瘍細胞はMUC1を過剰発現していることが知られていたこと;さらに発明者らが本明細書中でこの細胞系はMUC1リガンドも過剰発現しているという証拠を提示したこと(図8A−D参照)のためである。T47D細胞を培養し、次に1分間音波処理して細胞を溶解した。溶解産物をPSMGFR提示ビーズと混合し、氷上で時々撹拌しながら1時間インキュベートした。陰性対照として、無関係のペプチド、HHHHHHRGEFTGTYITAVTをNTA−Niビーズに付着させ、同一処理した。二組のビーズともpH7.4のリン酸緩衝液で2回洗浄した。結合したタンパク質種を、250mMのイミダゾールも含有するリン酸緩衝液100uLを3回加えて溶離した。どちらのペプチドとも、最初の溶出部分は別個の試料として流せるように取り出しておき、残りの部分は他の2つの溶出液と合わせてTCA(トリクロロ酢酸)−沈殿法(Chen,Lら、Anal.Biochem.Vol 269,179−188ページ;1999)によって濃縮した。溶出液は12%SDSゲルに流した。図9参照。次にゲルを銀染色した(Schevchenko,Aら;Anal.Chem.,Vol.68;850−858ページ;1996)。各レーンに乗せたものは次の通り:(左から右へ)(1)Benchmarkの染色済みタンパク質ラダー(protein ladder)(Gibco);(2)MUC1ペプチドからの最初の溶出液;(3)TCA濃縮試料の1/10;(4)ブランク;(5)TCA濃縮試料の9/10;(6)陰性対照ペプチドからの最初の溶出液;(7)陰性対照ペプチドからのTCA濃縮試料の1/10;(8)0.5ピコモルのBSA(標準として);(9)陰性対照ペプチドからのTCA濃縮試料の9/10;(10)銀染色SDS PAGE標準(BioRad カタログ番号1610314)。図9を参照し、レーン2と6(対照)を比較すると、MUC1 PSMGFRペプチドが明らかに三つのペプチドに結合したことがわかる。すなわち、見掛け分子量17kDの位置の第一の特異的ペプチド;及び見掛け分子量23kDの位置の第二のペプチド(より濃いバンド)である。試料が最も濃縮されているレーン5に第三の特異的バンドが約35kDに見られることに注意する。
本実施例では、MUC1がん細胞によって産生され、これらの細胞における細胞増殖の引き金を引くリガンドは多量体であることを証明する。
これらの実施例では、MUC1腫瘍細胞において特異的に増殖を阻害する薬物を、MUC1腫瘍細胞及び他の細胞の両方において増殖を阻害する薬物と比較した。特異的及び非特異的薬物のどちらも、それらをMUC1腫瘍細胞溶解産物の存在下でPSMGFR提示コロイドに曝露することによって特定した。薬物は、コロイド−コロイド相互作用を防止した薬物として特定された。細胞試験により、これらの薬物は2群に分けられた。MUC1腫瘍細胞に特異的な群と非特異的な群である。非特異的薬物はPSMGFRに結合しないが、活性化リガンドに結合すると考えられ、MUC1提示細胞だけでなく対照細胞の増殖も阻害する。さらに、この群の薬物は、活性化リガンドを取り去って細胞と相互作用させないので、両方の細胞種に対していくらか毒性があった。MUC1腫瘍細胞に特異的な薬物は、ビーズ上のPSMGFRに結合することが見出された。これは、ビーズからのPSMGFRの切断産物のHPLC分析で示された。
実施例5a:MUC1受容体のMGFR部分とその活性化リガンド間の相互作用を遮断する薬剤を特定するためのコロイドベースの比色検出を用いる薬物スクリーニングアッセイ
以下は、抗がん剤を確認するための作用薬物スクリーニングアッセイの一例である。本実施例では、受容体切断後細胞表面に残って付いているMUC1受容体の部分から誘導されたヒスチジンタグ標識ペプチド(His−PSMGFR)を、NTA−ニッケル−SAM被覆金コロイドに連結した。該ペプチド提示コロイドを、MUC1提示細胞、すなわちMUC1受容体の該部分の二量体化又は多量体化を引き起こすリガンドを含有していることが本明細書中で示された細胞の溶解産物/上清とインキュベートした。このリガンドによる受容体のMGFR部分の誘導多量体化は、連結コロイドを一緒にして近くに引き寄せるため、コロイド溶液の色をピンクからブルーに変える。受容体のMGFR部分への活性化リガンドの結合を妨害する薬物は、溶液の色をピンクのまま変えない。
T47D細胞をT25フラスコからトリプシン処理して剥がし、ペレット化し、リン酸緩衝液中に再浮遊させ、超音波処理して溶解し、リガンドを溶液中に放出させた。NTA−SAM被覆コロイドをHis−PSMGFRペプチド:GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAHHHHHHと結合させた。200μlのNTA−SAM被覆コロイドをリン酸緩衝液中100μMのペプチド20μlと15分間インキュベートし、ペレット化して非結合ペプチドを除去し、リン酸緩衝液中に再浮遊させた。陰性対照コロイドは、MUC1ペプチドの代わりにランダム配列のヒスチジンタグ標識ペプチドとインキュベートした。細胞溶解産物(65μl)をDMSO中の5μlの薬物候補と混合し、ELISAプレートのウェル中の30μlMUC1ペプチド結合コロイドに加え、最終薬物濃度を約100μMとした。陽性対照は、薬物候補の代わりにDMSOを含有し、陰性対照は、薬物候補の代わりにDMSOと、MUC1ペプチドの代わりにランダム配列のペプチドと結合したコロイドを含有した。ピンクからブルーへの色変化は、細胞溶解産物中のリガンドがMUC1ペプチドに結合し、該ペプチドを二量体化し、コロイドを互いに十分近接させて色変化を生じさせたことを示している。薬物候補を含有しない陽性対照は、MUC1ペプチドと細胞溶解産物中に存在するリガンド間の相互作用を阻害するものが何もないので、2時間以内にピンクからブルーに変色した。色変化がないのは(ウェルがピンクのまま)、薬物候補がMUC1ペプチドとコグネイトリガンド間の相互作用を、MUC1受容体のMGFR部分に結合することによって、修飾酵素を阻害することによって、又はその活性化リガンドに結合することによって、のいずれかで遮断したことを示している。MUC1ペプチドの代わりにランダム配列のペプチドを提供しているコロイドを含有する陰性対照ウェルは、MUC1ペプチドに対するリガンドがランダム配列のペプチドを二量体化しないので、ピンクのままである。図12に、前述のアッセイに使用したサンプルの薬物スクリーニングプレートを示す。陽性対照ウェル(A1−D1)は2時間以内にピンクからブルーに変色したが、陰性対照ウェル(E1−H1)はピンクのままであった。ウェルE6は、MUC1ペプチドとコグネイトリガンド間の相互作用を阻害した薬物を含有するので、ウェルはピンクのままである。
実施例5b1:特定された薬剤の作用様式を判定するための二次薬物スクリーニング−MUC1とその天然リガンドの相互作用を分断する薬物候補で処理した細胞の増殖
前に、MUC1受容体のMGFR部分に対するリガンドはコロイド上のPSMGFRペプチドの二量体化又は多量体化を起こすことをインビトロで示した。実施例3a参照。また、受容体のMGFR部分の二量体化は増強された細胞増殖を誘導することも示した。実施例2参照。だとすると、受容体のMGFR部分とその活性化リガンドの相互作用を遮断する薬剤はMUC1提示腫瘍細胞の増殖を遮断するであろう。そこで、実施例5aに記載のインビトロ薬物スクリーニングアッセイを用いて確認された薬物を機能アッセイで試験し、MUC1依存性の細胞増殖を阻害するそれらの能力を調べた。
実施例5b2:インビトロの比色薬物スクリーニングで確認された薬物は、MUC1提示細胞に対して選択的及び非選択的の二つに分類される
解説したように、MUC1受容体のMGFR部分とその活性化リガンド間の相互作用を妨害する化合物を確認するインビトロの薬物スクリーニングアッセイ(実施例5aに記載)で確認された化合物は、三つの作用様式で細胞増殖を阻害できる。これらの薬物は、a)成長因子として作用する活性化リガンドの活性を遮断;b)受容体のMGFR部分に直接結合して遮断;又はc)MUC1受容体を修飾する酵素の活性を阻害することができる。(a)によって機能する薬物は様々な細胞種の増殖を阻害する一方、(b)及び(c)に従って機能するものはMUC1提示細胞の増殖を選択的に阻害するであろうと期待される。
実施例5c:PSMGFRペプチドと薬物の共溶出はMGFRへの直接結合を証明する
ここでは、いくつかの薬物が、MUC1依存性の細胞増殖を、MUC1受容体のMGFR部分に結合してMGFR部分とそのコグネイトリガンド間の相互作用を分断することによって阻害したことを示す。いくつかの薬物のPSMGFRペプチドへの直接結合は二つの方法を用いて示された。His−PSMGFRペプチドをNTA−ニッケルアガロースビーズに連結し、次に各薬物候補と別個にインキュベートした。100μlのビーズに1mgのペプチドを飽和になるまで結合させ、非結合ペプチドを洗浄除去し、DMSO中2.7mg/mlの薬物候補25μlと、5mlのリン酸緩衝液中で1時間インキュベートした。非結合薬はリン酸緩衝液で洗浄除去し、ペプチドをPBS、250mMのイミダゾールでビーズから溶離した。薬物候補がペプチドに結合していれば、イミダゾール溶液中にペプチドと共溶出するであろう。次に、ペプチド−薬物複合体をHPLCで分離した。複合体からの溶出ピークを、単独注入した薬物及びPSMGFRペプチド単独からの溶出ピークと比較した。パイロット試験で、MUC1細胞増殖を選択的に阻害する薬物群から無作為に選んだ3種類の薬物を、細胞増殖を非選択的に阻害する群から無作為に選んだ3種類の薬物と比較した。図17に示されている通り、選択群から選んだ左側の薬物はPSMGFRペプチドに結合しているが、非選択群から選んだ右側の薬物は結合していなかった。
予言的実施例5d:MUC1依存性の細胞増殖をMUC1受容体のMGFR部分に結合し遮断することによって阻害する薬物と、MGFR部分を修飾する酵素に作用することによって選択的増殖を阻害する薬物間の区別
この実験は、修飾酵素を阻害することによってMUC1細胞の増殖を選択的に阻害する薬物と、MUC1受容体のMGFR部分に結合し遮断することによって阻害する薬物を見分けるために設計されたものである。以下の実施例8は、MUC1溶解産物中に存在するリガンドは、酵素阻害薬のPSMFを該溶解産物に加えるとPSMGFRペプチドに結合できなかったことを示している。このことは、PSMGFRがまず修飾されてからそのコグネイトリガンドを認識することを示唆している。実施例5aに記載の薬物スクリーニングアッセイを用いると、MUC1提示細胞の増殖を選択的に遮断する薬物と、成長因子として作用するMUC1リガンドを阻害することによって様々な細胞の増殖を遮断する薬物との区別をつけることができない。MUC1に選択的な薬物を確認するには、ヒットした薬物を二次アッセイにかけて、対照細胞と比較したMUC1細胞の細胞増殖率を測定しなければならない。MUC1提示細胞に対して選択的な薬物のうち、MGFRに結合し遮断する薬物と、その修飾酵素を阻害する薬物との区別は、どちらのアッセイでもつけることができない。酵素修飾ペプチドは、非修飾ペプチドより遅い速度でゲルの中を移動するので、ゲル移動性におけるこの差を用いれば、どの薬物が酵素を阻害することによって作用しているかを決定することができる。
実施例6:エトモキシルの細胞増殖に対する阻害効果の調節
本発明でMUC1依存性腫瘍の治療に有用な組成物として確認されたエトモキシルは、MGFR/薬物相互作用の競合的阻害を通じて細胞増殖に及ぼすMGFRの影響を調節するためにMGFRに対して特異的であることが、細胞増殖培地に過剰のPSMGFRを加えることによって示された。
実施例7:MUC1受容体のMGFR部分の酵素修飾の証拠
以下の実験は、受容体切断後細胞表面に残って付いているMUC1受容体の部分(MGFR)が酵素修飾されている可能性を調べるために実施した。合成のHis−PSMGFRペプチド(配列番号2)をNTA−Niビーズに乗せ、T47D細胞の溶解産物とのインキュベーション、又は陰性対照として細胞成長培地とのインキュベーションのいずれかを行った。インキュベーションは、氷上で時々撹拌しながら1時間行った。第二の陰性対照として、無関係のペプチドRGD(配列番号12)をNTA−Niビーズに付着させ、同一処理した。両方の組のビーズをpH7.4のリン酸緩衝液で2回洗浄した。結合したタンパク質種を250mMのイミダゾールを添加して溶離した。各レーンに乗せたものは次の通り:(右から左へ)(10)染色済みタンパク質ラダー(Gibco);(9)ビーズに固定されたPSMGFRペプチド、細胞溶解産物とインキュベートしていない;(8−6)ビーズに固定されたPSMGFRペプチドの溶出液、T47D細胞溶解産物とインキュベートした; (5)ビーズに固定された陰性対照ペプチドの溶出液、T47D細胞溶解産物とインキュベートしていない;(4−2)陰性対照ペプチドの溶出液、溶解産物とインキュベートした。図19を参照する。レーン6−8と9(対照)を比較すると、溶解産物とのインキュベーション後(6−8)、MUC1のPSMGFRペプチドは、細胞成長培地とのインキュベーション後(9)よりも高い分子量に位置しているのが分かる。レーン5と2−4を比べると、細胞溶解産物とのインキュベーション後、対照ペプチドの見掛け分子量に変化はない。これらの結果は、T47D細胞の溶解産物中のリガンドはMUC1受容体のPSMGFRペプチド部分を修飾しているという考えと整合する。
実施例8:MGFRペプチドは酵素修飾されてからその天然リガンドがそれを認識することの証明
MUC1受容体のMGFR部分は酵素修飾されてからそのリガンドと結合するという仮説を試験するために、実施例5aに記載の薬物スクリーニングアッセイを、酵素阻害薬PMSF(フェニルメチルスルホニルフルオリド、Sigma Chemical Co.、米国ミズーリ州セントルイス)の存在下又は不在下で実施した。MUC1を異常発現している乳房腫瘍細胞のT47D細胞を70%の集密度に成長させ、トリプシンで処理してフラスコから剥がし、遠心分離によってペレット化した。溶解産物は、2個のT75フラスコのペレットから次のように調製した。細胞ペレットを300μLのリン酸緩衝液(10mMのリン酸ナトリウム、100mMのNaCl、pH7.4)中に再懸濁させた。溶解産物を二つに分けた。一つの溶解産物分液はそのまま使用した。第二の分液には9μLの100mMストック溶液を加えて最終濃度3mMとした。溶解産物を凍結し4回解凍して、各解凍後15秒間激しく撹拌した。次に、溶解産物を遠心分離によりペレット化し、上清を回収した。溶解産物に6.2mlのリン酸緩衝液を加えて希釈した。次に、実施例5aに記載の薬物スクリーニングアッセイを実施したが、ただし薬物は加えなかった。それより、溶解産物中のリガンドの、多量体化方式によるMGFRへの結合能を試験した。この方式の結合があれば溶液の色はブルーに変化する。図20から分かる通り、PMSFを含有する溶液は色の変化がなく、ピンクのままであった。A1&2のウェルは、1時間以内にピンクからブルーに変化した陽性対照ウェルで、金コロイド上に固定されたHis−PSMGFRペプチドとT47D細胞の溶解産物/上清を含有している。A3&4のウェルは、A1&2のウェルと同じ成分を含有しているが、溶解産物/上清混合物を最初に酵素阻害薬PMSFで処理してあった;PMSFを含有するウェルは溶液の色変化を受けずピンクのままである。B1&2のウェルは陰性対照ウェルで、コロイドに固定されたHis−PSMGFRペプチドを含有するが、溶解産物ではなく緩衝液とインキュベートし、ピンクのままである。C1&2のウェルも陰性対照ウェルで、コロイドに固定されているペプチドが無関係のペプチド(RGD)で、これを溶解産物とインキュベートしたが、これもピンクのままである。
MUC1の切断状態に影響を及ぼす薬物のスクリーニングに関する予言的実施例
MUC1のIBRの放出はがんの進行に相関しうる。以下は、これらの受容体の切断状態に影響を及ぼす薬物候補を特定する全細胞アッセイについての記述である。このスクリーニングは、究極的には細胞から脱落し放出される受容体の自己凝集部分の削減をもたらすいずれかのステップを直接又は間接的に調節する薬物候補の確認もする。前記いずれかのステップとは、酵素切断、受容体の産生、発現、安定性、輸送又は分泌などであるが、これらに限定されない。
Claims (26)
- MUC1の鎖間結合領域に特異的に結合する抗体;及び
該抗体に対して固定されているか又は固定されるように適応されているシグナリング実体を含む、がんの徴候を評価するためのキット。 - 前記シグナリング実体が蛍光部分を含む、請求項1に記載のキット。
- シグナリング実体がコロイド粒子である、請求項1に記載のキット。
- シグナリング実体がコロイド粒子でない、請求項1に記載のキット。
- 前記シグナリング実体が光学的に活性な剤を含む、請求項7に記載のキット。
- 前記シグナリング実体が蛍光部分を含む、請求項7に記載のキット。
- MUC1の鎖間結合領域に特異的に結合する抗体(ここで、シグナリング実体が、該抗体に対して固定されているか又は固定されるように適応されている)と試料とを接触させることによって、患者由来の試料中のMUC1の鎖間結合領域の細胞表面からの切断量を測定し;そして
該測定結果に基づいてがんの徴候又はがんの可能性を評価する、
請求項1に記載のキット。 - 前記試料中の脱落したMUC1の鎖間結合領域の量を測定し、そして
該測定結果に基づいてがんの徴候又はがんの可能性を評価する
ことによって、患者におけるがん、がんのサブタイプ、および/または、再発を診断する、
請求項10に記載のキット。 - がんの徴候又はがんの可能性を、試料中の量を対照中の量に相関させることによって評価する、請求項10に記載のキット。
- 患者の細胞の表面におけるMUC1の鎖間結合領域の量を測定し;そして
該測定結果に基づいてがんの徴候又はがんの可能性を評価する、
請求項10に記載のキット。 - 試料が体液試料である、請求項11に記載のキット。
- 試料が血液である、請求項11に記載のキット。
- 試料が組織試料である、請求項11に記載のキット。
- 試料が患者の細胞から誘導された増殖細胞系である、請求項11に記載のキット。
- がんがMUC1の異常発現を特徴とする、請求項10に記載のキット。
- 鎖間結合領域の量が、MALDI、ウェスタンブロット法、PCR、LCR、rtPCR、サイクリングプローブ技術、ゲル電気泳動、又は抗体利用アッセイ、磁気細胞分取法、蛍光標示式細胞分取法、ビーズ利用アッセイ又はELISAアッセイからなる群から選ばれる方法によって測定される、請求項10に記載のキット。
- 鎖間結合領域の量が凝集アッセイによって測定される、請求項10に記載のキット。
- 鎖間結合領域の量が、コロイド−コロイド又はコロイド−ビーズアッセイのようなコロイドを利用した方法によって測定される、請求項10に記載のキット。
- 試料が、針生検、組織標本、手術中の処置における組織表面、及び腹腔鏡検査のような最小侵襲的な方法における組織表面又は細胞溶液からなる群から選ばれる、請求項10に記載のキット。
- がんが、乳がん、前立腺がん、肺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、膵臓がん、及び脳のがんからなる群から選ばれる、請求項10に記載のキット。
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