JP2017081999A - 診断用腫瘍マーカー、腫瘍形成の阻害のための薬物スクリーニング、並びにがん治療用の組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明では、MUC1の異常発現を伴う細胞増殖に特に焦点を当てて、MUC1細胞増殖に関する検討を行った。
【選択図】図1
Description
・米国仮出願第60/253,361号(2000年11月27日出願)
・米国仮出願第60/255,370号(2000年12月13日出願)
・米国仮出願第60/256,027号(2000年12月15日出願)
・米国仮出願第60/258,157号(2000年12月22日出願)
・米国仮出願第60/259,615号(2001年01月03日出願)
・米国仮出願第60/260,186号(2001年01月05日出願)
・米国仮出願第60/266,169号(2001年02月02日出願)
・米国仮出願第60/289,444号(2001年05月07日出願)
・米国仮出願第60/266,929号(2001年02月06日出願)
・米国仮出願第60/278,093号(2001年03月23日出願)
・米国仮出願第60/294,887号(2001年05月31日出願)
・米国仮出願第60/298,272号(2001年06月14日出願)
本発明の別の方法は、患者の試料中の細胞表面受容体の切断部位を判定し、そして該判定ステップに基づいてがんの徴候又はがんの可能性を評価することを含む。
本発明の別の方法は、MUC1の異常発現を特徴とするがんを有する患者の治療に関し、該患者に腫瘍成長を削減するのに有効な量のL−α−メチル−ドパを投与することを含む。
MUC1の異常発現を特徴とするがんを有する患者を治療するための別の方法は、該患者に腫瘍成長を削減するのに有効な量のブチルインダゾールを投与することを含む。
本発明はまたペプチド種も提供する。本発明の一つのペプチド種は、細胞増殖を促進する成長因子のような活性化リガンドと相互作用する細胞表面受容体の部分であって、該部分はどの細胞からも分離している、に対応する配列の少なくとも一つのフラグメントと親和性タグとを含む。
(2) 表面を有する第2のアーティクルと、該第2のアーティクルの表面に対して固定されているか又は固定されるように適応されているペプチド配列と、をさらに含む、(1)に記載のキット。
(3) ペプチド配列がMGFRである、(1)に記載のキット。
(4) 細胞増殖を促進する成長因子のような活性化リガンドと相互作用する細胞表面受容体の部分を包含するペプチドであって、該部分は、該活性化リガンドと相互作用する十分な細胞表面受容体を包含し、および該部分は、部分間の自然結合を防止するのに必要な程度に鎖間結合領域がないペプチドを用意し;該ペプチドを、該ペプチドと相互作用する活性化リガンドの能力に影響を及ぼす候補薬及び該活性化リガンドに曝露し;そして、該候補薬の、該活性化リガンドと該ペプチドとの相互作用防止能力を測定することを含む方法。
(5) 該候補薬の、該ペプチドと他のタンパク質又はペプチドとの相互作用防止能力を測定することをさらに含む、(4)に記載の方法。
(6) 表面を有する第1のアーティクルと、該表面に対して固定されているか又は固定されるように適応されている複数のペプチドを用意し;該ペプチド及び第1のアーティクルの表面を、候補薬及び少なくとも一つの活性化リガンドに曝露し;そして、該候補薬の、該活性化リガンドと該ペプチドとの相互作用防止能力を測定することを含む、(4)に記載の方法。
(7) 表面を有する第1のアーティクル、表面を有する第2のアーティクル、及び該第1及び第2のアーティクルの表面に対して固定されているか又は固定されるように適応されている複数のペプチドを用意し;該ペプチド並びに第1及び第2のアーティクルの表面を、候補薬及び少なくとも一つの活性化リガンドに曝露し;そして、該第1及び第2のアーティクルの相互に対する固定を測定することを含む、(4)に記載の方法。
(8) ペプチドを候補薬及び少なくとも一つの活性化リガンドに曝露するステップが、該ペプチド及び候補薬を、活性化リガンドを含有する細胞溶解産物及び細胞上清の一つ又は両方に曝露することを含む、(4)に記載の方法。
(9) ペプチド配列がPSMGFRである、(4)に記載の方法。
(10) がんのリスク又は進行を低減するために患者を治療する方法であって、がんのリスクがあることが知られている又はがんと診断された患者に、活性化リガンドと、細胞増殖を促進する活性化リガンドと相互作用する細胞表面受容体の部分との相互作用を阻害する薬剤を投与することを含む方法。
(11) 患者に、細胞増殖を促進する活性化リガンドと相互作用する細胞表面受容体の部分の誘導多量体化を阻害する薬剤を投与することを含む、(10)に記載の方法。
(12) 細胞表面受容体がMUC1である、(10)に記載の方法。
(13) 細胞表面受容体の部分がMGFRである、(10)に記載の方法。
(14) 細胞表面受容体の部分がPSMGFR配列の重要部分を含有している、(10)に記載の方法。
(15) 患者に、細胞増殖を促進する活性化リガンドと相互作用する細胞表面受容体の部分の二量体化を阻害する薬剤を投与することを含む、(10)に記載の方法。
(16) がんが、乳がん、前立腺がん、肺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、及び脳のがんからなる群から選ばれる、(10)に記載の方法。
(17) 活性化リガンドが多量体である、(10)に記載の方法。
(18) 活性化リガンドが約17kDの分子量を有するタンパク質である、(10)に記載の方法。
(19) 活性化リガンドが約23kDの分子量を有するタンパク質である、(10)に記載の方法。
(20) 活性化リガンドが約35kDの分子量を有するタンパク質である、(10)に記載の方法。
(21) 活性化リガンドがタンパク質14−3−3から誘導された配列を含有する、(10)に記載の方法。
(22) 活性化リガンドがカテプシンDから誘導された配列を含有する、(10)に記載の方法。
(23) 活性化リガンドがNM23から誘導された配列を含有する、(10)に記載の方法。
(24) 活性化リガンドがヒトのアネキシンVから誘導された配列を含有する、(10)に記載の方法。
(25) 活性化リガンドがβ−リポトロピンから誘導された配列を含有する、(10)に記載の方法。
(26) 活性化リガンドがプロオピオメラノコルチンの切断産物である、(10)に記載の方法。
(27) 細胞表面受容体の部分が、配列:
(28) 細胞表面受容体の鎖間結合領域の脱落後、細胞表面に残って付いている細胞表面受容体の部分が、ペプチド配列:
(29) 方法で使用するために、薬剤が、ペプチド:
(30) 方法で使用するために、薬剤が、ペプチド配列:
(31) がんのリスク又は進行を低減するために患者を治療する方法であって、がんのリスクがあることが知られている又はがんと診断された患者に、細胞増殖を促進する成長因子のような活性化リガンドと相互作用する細胞表面受容体の部分の予防的クラスター化のための薬剤を投与することを含む方法。
(32) 細胞表面受容体がMUC1である、(31)に記載の方法。
(33) 細胞表面受容体の部分を、複数の部分に結合できる分子と接触させることによって、複数の部分をクラスター化することを含む、(31)に記載の方法。
(34) 部分がMGFRである、(31)に記載の方法。
(35) 部分が相当量のPSMGFR配列を含有する、(31)に記載の方法。
(36) がんが、乳がん、前立腺がん、肺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、及び脳のがんからなる群から選ばれる、(31)に記載の方法。
(37) 細胞表面受容体の部分が、ペプチド配列:
(38) 細胞表面受容体の部分が、ペプチド配列:
(39) 方法で使用するために、薬剤の特異的結合部分が、ペプチド:
(40) 方法で使用するために、薬剤の特異的結合部分が、ペプチド:
(41) 脱落した細胞表面受容体の鎖間結合領域に固定されることが可能な種;及び、該種に対して固定されているか又は固定されるように適応されているシグナリング実体;を含むキット。
(42) 種が、鎖間結合領域に接続している脱落したMUC1受容体の部分に結合している、(41)に記載のキット。
(43) 細胞表面受容体がMUC1である、(41)に記載のキット。
(44) シグナリング実体がコロイド粒子である、(41)に記載のキット。
(45) シグナリング実体がコロイド粒子でない、(41)に記載のキット。
(46) コロイド粒子をさらに含み、シグナリング実体が該コロイド粒子に付着している、(41)に記載のコロイド粒子。
(47) 脱落した細胞表面受容体の鎖間結合領域の少なくとも一部分;及び、該部分に対して固定されているか又は固定されるように適応されているシグナリング実体;を含む組成物。
(48) 細胞表面受容体の鎖間結合領域の脱落後、細胞表面に残って付いている細胞表面受容体の部分に結合可能な種;及び、該種に対して固定されているか又は固定されるように適応されているシグナリング実体;を含むキット。
(49) 細胞表面受容体がMUC1である、(48)に記載のキット。
(50) シグナリング実体がコロイド粒子である、(48)に記載のキット。
(51) シグナリング実体がコロイド粒子でない、(48)に記載のキット。
(52) コロイド粒子をさらに含み、シグナリング実体が該コロイド粒子に付着している、(48)に記載のキット粒子。
(53) 細胞表面受容体の鎖間結合領域の脱落後、細胞表面に残って付いている細胞表面受容体の部分に結合可能な種が約17kDのタンパク質である、(48)に記載のキット。
(54) 細胞表面受容体の鎖間結合領域の脱落後、細胞表面に残って付いている細胞表面受容体の部分に結合可能な種が約23kDのタンパク質である、(49)に記載のキット。
(55) 細胞表面受容体の鎖間結合領域の脱落後、細胞表面に残って付いている細胞表面受容体の部分に結合可能な種が約35kDのタンパク質である、(49)に記載のキット。
(56) 細胞表面受容体の鎖間結合領域の脱落後、細胞表面に残って付いている細胞表面受容体の部分に結合可能な種がタンパク質14−3−3から誘導された配列を含有する、(49)に記載のキット。
(57) 部分が14−3−3を含む、(49)に記載のキット。
(58) 部分がカテプシンDを含む、(49)に記載のキット。
(59) 部分がNM23を含む、(49)に記載のキット。
(60) 部分がヒトのアネキシンVを含む、(49)に記載のキット。
(61) 細胞表面受容体の鎖間結合領域の脱落後、細胞表面に残って付いている細胞表面受容体の部分に結合可能な種がβ−リポトロピンから誘導された少なくとも一つの配列を含有する、(49)に記載のキット。
(62) 細胞表面受容体の鎖間結合領域の脱落後、細胞表面に残って付いている細胞表面受容体の部分に結合可能な種がプロオピオメラノコルチンの切断産物である、(49)に記載のキット。
(63) 鎖間結合領域を包含する細胞表面受容体の部分に結合可能な種;及び、該種に対して固定されているか又は固定されるように適応されているシグナリング実体;を含むキット。
(64) 細胞表面受容体がMUC1である、(63)に記載のキット。
(65) シグナリング実体がコロイド粒子である、(63)に記載のキット。
(66) シグナリング実体がコロイド粒子でない、(63)に記載のキット。
(67) コロイド粒子をさらに含み、シグナリング実体が該コロイド粒子に付着している、(63)に記載のコロイド粒子。
(68) 細胞増殖を促進する成長因子のような活性化リガンドと相互作用する細胞表面受容体の部分に対応する配列の少なくとも一つのフラグメントであって、該部分はどの細胞からも分離しているフラグメント;及び、親和性タグ;を含むペプチド種。
(69) 親和性タグがフラグメントに接続されている、(68)に記載のペプチド種。
(70) 親和性タグが、フラグメント及び親和性タグの両方を包含する連続アミノ酸配列の部分を定義する、(68)に記載のペプチド種。
(71) 親和性タグがポリアミノ酸タグである、(68)に記載の種。
(72) 親和性タグがポリヒスチジンタグである、(68)に記載の種。
(73) 親和性タグがGSTタグである、(68)に記載の種。
(74) 親和性タグがビオチンである、(68)に記載の種。
(75) 親和性タグがチオレドキシンである、(68)に記載の種。
(76) 親和性タグが、アーティクルの表面に対して固定されている種に結合するように選ばれる、(68)に記載の種。
(77) 表面を有するアーティクルと、該表面に対して固定され、親和性タグを捕捉することが可能な種と、をさらに含む、(68)に記載の種。
(78) アーティクルが粒子である、(68)に記載の種。
(79) 親和性タグが、受容体の部分のC−末端に固定されている、(68)に記載の種。
(80) 細胞表面受容体がMUC1である、(68)に記載の種。
(81) 細胞表面受容体部分が、配列:
(82) フラグメントが、PSMGFRの少なくとも一部分を含む、(68)に記載のペプチド種。
(83) フラグメントが、PSMGFRを含む、(68)に記載のペプチド種。
(84) フラグメントが、MUC1依存性腫瘍形成に関連して細胞増殖を促進する成長因子のような活性化リガンドと相互作用するMUC1の部分に対応する配列の少なくとも一つのフラグメントを含む、(68)に記載のペプチド種。
(85) フラグメントが、MUC1依存性腫瘍形成に関連して細胞表面受容体の鎖間結合領域の脱落後、細胞表面に残って付いているMUC1の部分に対応する十分な配列を含む結果、MUC1依存性腫瘍形成に関連して細胞表面受容体の鎖間結合領域の脱落後、細胞表面に残って付いているMUC1の部分と相互作用する生体分子が該フラグメントと相互作用する、(68)に記載のペプチド種。
(86) 粒子;及び、細胞増殖を促進する成長因子のような活性化リガンドと相互作用する細胞表面受容体の部分に対応する配列の少なくとも一つのフラグメントであって、該フラグメントはどの細胞からも分離し、該粒子に固定されているか又は固定されるように適応されているフラグメント;を含むキット。
(87) 細胞表面受容体がMUC1である、(86)に記載のキット。
(88) 表面を有するアーティクル;及び、細胞増殖を促進する成長因子のような活性化リガンドと相互作用する細胞表面受容体の部分に結合する生体分子であって、該生体分子は該アーティクルの表面に固定されているか又は固定されるように適応されている生体分子;を含むキット。
(89) アーティクルが粒子を含む、(88)に記載のキット。
(90) 細胞表面受容体がMUC1である、(88)に記載のキット。
(91) 第2の粒子;及び、細胞表面受容体の鎖間結合領域の脱落後、細胞表面に残って付いている細胞表面受容体の部分であって、該部分はどの細胞からも分離し、該第2の粒子に固定されているか又は固定されるように適応されている部分;をさらに含む、(88)に記載のキット。
(92) 細胞表面受容体の鎖間結合領域の脱落後、細胞表面に残って付いている細胞表面受容体の部分に結合する生体分子が約17kDのタンパク質である、(88)に記載のキット。
(93) 細胞表面受容体の鎖間結合領域の脱落後、細胞表面に残って付いている細胞表面受容体の部分に結合する生体分子が約23kDのタンパク質である、(88)に記載のキット。
(94) 細胞表面受容体の鎖間結合領域の切断後、細胞表面に付着して残った細胞表面受容体の部分に結合する生体分子が約35kDのタンパク質である、(88)に記載のキット。
(95) 細胞表面受容体の鎖間結合領域の切断後、細胞表面に付着して残った細胞表面受容体の部分に結合する生体分子がタンパク質14−3−3から誘導された配列を含有している、(88)に記載のキット。
(96) 細胞表面受容体の鎖間結合領域の切断後、細胞表面に付着して残った細胞表面受容体の部分に結合する生体分子がカテプシンDから誘導された配列を含有している、(88)に記載のキット。
(97) 細胞表面受容体の鎖間結合領域の脱落後、細胞表面に残って付いている細胞表面受容体の部分に結合する生体分子がNM23から誘導された配列を含有している、(88)に記載のキット。
(98) 細胞表面受容体の鎖間結合領域の脱落後、細胞表面に残って付いている細胞表面受容体の部分に結合する生体分子がヒトのアネキシンVから誘導された配列を含有している、(88)に記載のキット。
(99) 細胞表面受容体の鎖間結合領域の脱落後、細胞表面に残って付いている細胞表面受容体の部分に結合する生体分子がβ−リポトロピンから誘導された少なくとも一つの配列を含有している、(88)に記載のキット。
(100) 細胞表面受容体の鎖間結合領域の脱落後、細胞表面に残って付いている細胞表面受容体の部分に結合する生体分子がプロオピオメラノコルチンの切断産物である、(88に)記載のキット。
(101) 細胞表面受容体の鎖間結合領域の脱落後、細胞表面に残って付いている細胞表面受容体の部分に結合する生体分子が、カルシマイシン、フザリン酸、L−α−メチル−ドパ、及びエトモキシルを含む群から選ばれる、(88)に記載のキット。
(102) 細胞表面受容体の鎖間結合領域の脱落後、細胞表面に残って付いている細胞表面受容体の部分に結合する生体分子がカルシマイシンを含む、(88)に記載のキット。
(103) 細胞表面受容体の鎖間結合領域の脱落後、細胞表面に残って付いている細胞表面受容体の部分に結合する生体分子がフザリン酸を含む、(88)に記載のキット。
(104) 細胞表面受容体の鎖間結合領域の脱落後、細胞表面に残って付いている細胞表面受容体の部分に結合する生体分子がL−α−メチル−ドパを含む、(88)に記載のキット。
(105) 細胞表面受容体の鎖間結合領域の脱落後、細胞表面に残って付いている細胞表面受容体の部分に結合する生体分子がエトモキシルを含む、(88)に記載のキット。
(106) 生体分子が、HTB−133、CRL−1504、及びCRL−1500からなる群から選ばれる細胞系から誘導される、(88)に記載の組成物。
(107) 細胞表面受容体の鎖間結合領域の脱落後、細胞表面に残って付いている細胞表面受容体の部分に結合可能なリガンドと、前記結合を遮断可能な薬剤とを、該リガンドと該薬剤との間の相互作用を分断する候補薬に曝露し;そして、該候補薬による相互作用の分断を測定すること;を含む方法。
(108) 細胞表面受容体の鎖間結合領域の脱落後、細胞表面に残って付いている、リガンドと結合可能な細胞表面受容体の部分と、前記結合を遮断可能な薬剤とを、該部分と該薬剤との間の相互作用を分断する候補薬に曝露し;そして、該候補薬による相互作用の分断を測定すること;を含む方法。
(109) 合成薬と、該合成薬の生物学的標的とを、該合成薬と該標的間の相互作用より大きく該生物学的標的と相互作用しうる候補薬に曝露し;そして、該候補薬による相互作用の分断を測定すること;を含む方法。
(110) 合成薬がフザリン酸の誘導体である、(109)に記載の方法。
(111) 合成薬がL−α−メチル−ドパの誘導体である、(109)に記載の方法。
(112) 合成薬がエトモキシルの誘導体である、(109)に記載の方法。
(113) MUC1の異常発現を特徴とするがんを有する患者の治療法であって、該患者に、腫瘍成長の削減に有効な量のフザリン酸を投与することを含む方法。
(114) 患者が、それ以外にカルシマイシンによる治療を要する症状のない、(113)に記載の方法。
(115) 方法が、患者に、天然リガンドと、細胞表面受容体の鎖間結合領域の脱落後、細胞表面に残って付いているMUC1受容体の部分との相互作用を遮断するのに有効な量のフザリン酸を投与することを含む、(113)に記載の方法。
(116) 方法が、患者に、MUC1受容体の鎖間結合領域の脱落を減らすのに有効な量のフザリン酸を投与することを含む、(113)に記載の方法。
(117) 脱落した鎖間結合領域の量が過去の試料で測定された量と比べて減っている、(113)に記載の方法。
(118) 脱落した鎖間結合領域の量が対照試料と比べて減っている、(113)に記載の方法。
(119) MUC1の異常発現を特徴とするがんを有する患者の治療法であって、該患者に、腫瘍成長の削減に有効な量のエトモキシルを投与することを含む方法。
(120) 患者が、それ以外にエトモキシルによる治療を要する症状のない、(119)に記載の方法。
(121) 方法が、患者に、天然リガンドと、細胞表面受容体の鎖間結合領域の脱落後、細胞表面に残って付いているMUC1受容体の部分との相互作用を遮断するのに有効な量のエトモキシルを投与することを含む、(119)に記載の方法。
(122) 方法が、患者に、MUC1受容体の鎖間結合領域の脱落を減らすのに有効な量のエトモキシルを投与することを含む、(119)に記載の方法。
(123) 脱落した鎖間結合領域の量が過去の試料で測定された量と比べて減っている、(119)に記載の方法。
(124) 脱落した鎖間結合領域の量が対照試料と比べて減っている、(119)に記載の方法。
(125) MUC1の異常発現を特徴とするがんを有する患者の治療法であって、該患者に、腫瘍成長の削減に有効な量のL−α−メチル−ドパを投与することを含む方法。
(126) 患者が、それ以外にL−α−メチル−ドパによる治療を要する症状のない、(125)に記載の方法。
(127) 方法が、患者に、天然リガンドと、細胞表面受容体の鎖間結合領域の脱落後、細胞表面に残って付いているMUC1受容体の部分との相互作用を遮断するのに有効な量のL−α−メチル−ドパを投与することを含む、(125)に記載の方法。
(128) 方法が、患者に、MUC1受容体の鎖間結合領域の脱落を減らすのに有効な量のL−α−メチル−ドパを投与することを含む、(125)に記載の方法。
(129) 脱落した鎖間結合領域の量が過去の試料で測定された量と比べて減っている、(125)に記載の方法。
(130) 脱落した鎖間結合領域の量が対照試料と比べて減っている、(125)に記載の方法。
(131) MUC1の異常発現を特徴とするがんを有する患者の治療法であって、該患者に、腫瘍成長の削減に有効な量のカルシマイシンを投与することを含む方法。
(132) 患者が、それ以外にカルシマイシンによる治療を要する症状のない、(131)に記載の方法。
(133) 方法が、患者に、天然リガンドと、細胞表面受容体の鎖間結合領域の脱落後、細胞表面に残って付いているMUC1受容体の部分との相互作用を遮断するのに有効な量のカルシマイシンを投与することを含む、(131)に記載の方法。
(134) 方法が、患者に、MUC1受容体の鎖間結合領域の脱落を減らすのに有効な量のカルシマイシンを投与することを含む、(131)に記載の方法。
(135) 脱落した鎖間結合領域の量が過去の試料で測定された量と比べて減っている、(134)に記載の方法。
(136) 脱落した鎖間結合領域の量が対照試料と比べて減っている、(134)に記載の方法。
(137) MUC1の異常発現を特徴とするがんを有する患者の治療法であって、該患者に、腫瘍成長の削減に有効な量のブチルインダゾールを投与することを含む方法。
(138) 患者が、それ以外にブチルインダゾールによる治療を要する症状のない、(137)に記載の方法。
(139) 方法が、患者に、天然リガンドと、細胞表面受容体の鎖間結合領域の脱落後、細胞表面に残って付いているMUC1受容体の部分との相互作用を遮断するのに有効な量のブチルインダゾールを投与することを含む、(137)に記載の方法。
(140) 方法が、患者に、MUC1受容体の鎖間結合領域の脱落を減らすのに有効な量のブチルインダゾールを投与することを含む、(137)に記載の方法。
(141) 脱落した鎖間結合領域の量が過去の試料で測定された量と比べて減っている、(137)に記載の方法。
(142) 脱落した鎖間結合領域の量が対照試料と比べて減っている、(137)に記載の方法。
(143) MUC1の異常発現を特徴とするがんを有する患者の治療法であって、該患者に、腫瘍成長の削減に有効な量のNS1619を投与することを含む方法。
(144) 患者が、それ以外にNS1619による治療を要する症状のない、(143)に記載の方法。
(145) 方法が、患者に、天然リガンドと、細胞表面受容体の鎖間結合領域の脱落後、細胞表面に残って付いているMUC1受容体の部分との相互作用を遮断するのに有効な量のNS1619を投与することを含む、(143)に記載の方法。
(146) 方法が、患者に、MUC1受容体の鎖間結合領域の脱落を減らすのに有効な量のNS1619を投与することを含む、(143)に記載の方法。
(147) 脱落した鎖間結合領域の量が過去の試料で測定された量と比べて減っている、(143)に記載の方法。
(148) 脱落した鎖間結合領域の量が対照試料と比べて減っている、(143)に記載の方法。
(149) カルシマイシン、ブチルインダゾン、NS1619、フザリン酸、L−α−メチル−ドパ、及びエトモキシルの中から選ばれる組成物と、細胞表面受容体の鎖間結合領域の脱落後、細胞表面に残って付いている細胞表面受容体の部分に結合する生体分子とを、該組成物と該生体分子との間の相互作用を分断しうる候補薬に曝露し;そして、該候補薬による相互作用の妨害を測定すること;を含む方法。
(150) がんを有する又はがんを発症するリスクのある患者の治療法であって、該患者に、細胞表面受容体の切断を減らす薬剤を投与することを含む方法。
(151) がんを有する又はがんを発症するリスクのある患者の治療法であって、該患者に、細胞表面受容体の鎖間結合領域の細胞表面からの切断を減らす薬剤を投与することを含む方法。
(152) 細胞表面受容体がMUC1である、(150)に記載の方法。
(153) 鎖間結合領域が、配列:
(154) 鎖間結合領域が、ヒトMUC1受容体のアミノ酸507〜549(スパイサーらの配列参照−ジェンバンクアクセッション番号P15941、PID G547937のアミノ酸1067〜1100に対応)の領域内の約12〜18個のアミノ酸の連続アミノ酸配列を含む、(150)に記載の方法。
(155) 鎖間結合領域が、ヒトMUC1受容体のアミノ酸525〜549(スパイサーらの配列参照−ジェンバンクアクセッション番号P15941、PID G547937のアミノ酸1085〜1109に対応)の領域内の約12〜18個のアミノ酸の連続アミノ酸配列を含む、(150)に記載の方法。
(156) がんが、乳がん、前立腺がん、肺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、及び脳のがんからなる群から選ばれる、(150)に記載の方法。
(157) がんがMUC1受容体の異常発現を特徴とする、(150)に記載の方法。
(158) 細胞表面受容体の鎖間結合領域の細胞表面からの切断量を測定し;そして、該測定ステップに基づいてがんの徴候又はがんの可能性を評価すること;を含む方法。
(159) 細胞表面受容体がMUC1である、(158)に記載の方法。
(160) 患者の試料中の脱落した細胞表面受容体の鎖間結合領域の量を測定し、そして、該測定ステップに基づいてがんの徴候又はがんの可能性を評価することによって患者におけるがんを診断することを含む、(158)に記載の方法。
(161) 評価ステップが、がんの徴候又はがんの可能性として、試料中の量を対照中の量に相関させることを含む、(158)に記載の方法。
(162) 患者の細胞の表面における細胞表面受容体の鎖間結合領域の量を測定し;そして、該測定ステップに基づいてがんの徴候又はがんの可能性を評価すること;を含む、(158)に記載の方法。
(163) 鎖間結合領域が、配列:
(164) 鎖間結合領域が、ヒトMUC1受容体のアミノ酸507〜549(スパイサーらの配列参照−ジェンバンクアクセッション番号P15941、PID G547937のアミノ酸1067〜1100に対応)の領域内の約12〜18個のアミノ酸の連続アミノ酸配列を含む、(158)に記載の方法。
(165) 鎖間結合領域が、ヒトMUC1受容体のアミノ酸525〜549(スパイサーらの配列参照−ジェンバンクアクセッション番号P15941、PID G547937のアミノ酸1085〜1109に対応)の領域内の約12〜18個のアミノ酸の連続アミノ酸配列を含む、(158)に記載の方法。
(166) 試料が体液試料である、(160)に記載の方法。
(167) 試料が血液である、(160)に記載の方法。
(168) 試料が組織試料である、(160)に記載の方法。
(169) 試料が患者の細胞から誘導された増殖細胞系である、(160)に記載の方法。
(170) がんがMUC1の異常発現を特徴とする、(158)に記載の方法。
(171) 鎖間結合領域の量が、MALDI、ウェスタンブロット法、PCR、LCR、rtPCR、サイクリングプローブ技術、ゲル電気泳動、又は抗体利用アッセイ、磁気細胞分取法、蛍光標示式細胞分取法、ビーズ利用アッセイ又はELISAアッセイからなる群から選ばれる方法によって測定される、(158)に記載の方法。
(172) 鎖間結合領域の量が凝集アッセイによって測定される、(158)に記載の方法。
(173) 鎖間結合領域の量が、コロイド−コロイド又はコロイド−ビーズアッセイのようなコロイドを利用した方法によって測定される、(158)に記載の方法。
(174) 試料が、針生検、組織標本、手術中の処置における組織表面、及び腹腔鏡検査のような最小侵襲的な方法における組織表面又は細胞溶液からなる群から選ばれる、(158)に記載の方法。
(175) 患者の試料中の細胞表面受容体の切断部位を判定し;そして、該判定ステップに基づいてがんの徴候又はがんの可能性を評価すること;を含む方法。
(176) 細胞表面受容体がMUC1である、(175)に記載の方法。
(177) 試料が、針生検、組織標本、手術中の処置における組織表面、及び腹腔鏡検査のような最小侵襲的な方法における組織表面又は細胞溶液からなる群から選ばれる、(175)に記載の方法。
(178) 試料が体液試料である、(175)に記載の方法。
(179) 試料が血液である、(175)に記載の方法。
(180) 試料が組織試料である、(175)に記載の方法。
(181) がんが、乳がん、前立腺がん、肺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、及び脳のがんからなる群から選ばれる、(175)に記載の方法。
(182) がんがMUC1の異常発現を特徴とする、(175)に記載の方法。
(183) 切断部位が、MALDI、ウェスタンブロット法、PCR、LCR、rtPCR、サイクリングプローブ技術、ゲル電気泳動、又は抗体利用アッセイ、磁気細胞分取法、蛍光標示式細胞分取法、ビーズ利用アッセイ又はELISAアッセイからなる群から選ばれる方法によって判定される、(175)に記載の方法。
(184) 鎖間結合領域の量が、コロイド−コロイド又はコロイド−ビーズアッセイのようなコロイドを利用した方法によって測定される、(175)に記載の方法。
(185) 細胞表面の切断部位を判定する方法であって、細胞を、一つの可能性ある細胞表面受容体の切断部位に特異的に結合する薬剤と、別の可能性ある細胞表面受容体の切断部位に特異的に結合する別の薬剤とに接触させ;そして、二つの薬剤の細胞表面への結合比を比較すること;を含む方法。
(186) 細胞表面受容体がMUC1である、(185)に記載の方法。
(187) がん又はがんの可能性を示す生理学的状態を診断する方法であって、MUC1の異なる切断状態とは区別可能なMUC1の特異的切断状態を判定することを含む方法。
(188) 患者の試料の細胞表面からの細胞表面受容体の鎖間結合領域の第1の切断量を測定し;患者の試料の細胞表面からの細胞表面受容体の鎖間結合領域の第2の切断量を測定し;前記第1の量を前記第2の量と比較すること;を含む方法。
(189) がんの進行及び/又はがんの治療の効果の指標として、第1の量を第2の量と比較することを含む、(188)に記載の方法。
(190) がんの予防用薬剤の投与の指標として、第1の量を第2の量と比較することを含む、(188)に記載の方法。
(191) 患者ががんの治療を受けており、方法が、治療の効果の指標として第1の量を第2の量と比較することを含む、(188)に記載の方法。
(192) 細胞表面受容体がMUC1である、(188)に記載の方法。
(193) 鎖間結合領域が、配列:
(194) 鎖間結合領域が、ヒトMUC1受容体のアミノ酸507〜549(スパイサーらの配列参照−ジェンバンクアクセッション番号P15941、PID G547937のアミノ酸1067〜1100に対応)の領域内の約12〜18個のアミノ酸の連続アミノ酸配列を含む、(192)に記載の方法。
(195) 鎖間結合領域が、ヒトMUC1受容体のアミノ酸525〜549(スパイサーらの配列参照−ジェンバンクアクセッション番号P15941、PID G547937のアミノ酸1085〜1109に対応)の領域内の約12〜18個のアミノ酸の連続アミノ酸配列を含む、(188)に記載の方法。
(196) 試料が体液試料である、(188)に記載の方法。
(197) 試料が血液である、(188)に記載の方法。
(198) 試料が組織試料である、(188)に記載の方法。
(199) がんが、乳がん、前立腺がん、肺がん、卵巣がん、結腸直腸がん、及び脳のがんからなる群から選ばれる、(188)に記載の方法。
(200) 試料が患者の細胞から誘導された増殖細胞系である、(188)に記載の方法。
(201) 鎖間結合領域の量が、MALDI、ウェスタンブロット法、PCR、LCR、rtPCR、サイクリングプローブ技術、ゲル電気泳動、又は抗体利用アッセイ、磁気細胞分取法、蛍光標示式細胞分取法、ビーズ利用アッセイ又はELISAアッセイからなる群から選ばれる方法によって測定される、(188)に記載の方法。
(202) 鎖間結合領域の量が凝集アッセイによって測定される、(188)に記載の方法。
(203) 鎖間結合領域の量が、コロイド−コロイド又はコロイド−ビーズアッセイのようなコロイドを利用した方法によって測定される、(188)に記載の方法。
(204) 試料が、針生検、組織標本、手術中の処置における組織表面、及び腹腔鏡検査のような最小侵襲的な方法における組織表面又は細胞溶液からなる群から選ばれる、(188)に記載の方法。
(205) 鎖間結合領域の量が、コロイド−コロイド又はコロイド−ビーズアッセイのようなコロイドを利用した方法によって測定される、(188)に記載の方法。
(206) 試料が、針生検、組織標本、手術中の処置における組織表面、及び腹腔鏡検査のような最小侵襲的な方法における組織表面又は細胞溶液からなる群から選ばれる、(188)に記載の方法。
(207) 患者の試料中の細胞の表面における細胞表面受容体の鎖間結合領域の第1の量を測定し;患者の試料中の細胞の表面における細胞表面受容体の鎖間結合領域の第2の量を測定し;前記第1の量を前記第2の量と比較すること;を含む、(188)に記載の方法。
(208) 患者の試料中の脱落した細胞表面受容体の鎖間結合領域の第1の量を測定し;患者の試料中の脱落した細胞表面受容体の鎖間結合領域の第2の量を測定し;前記第1の量を前記第2の量と比較すること;を含む、(188)に記載の方法。
(定義)
「MUC1成長因子受容体(MGFR)」という用語は、細胞増殖を促進する成長因子のような活性化リガンドと相互作用するMUC1受容体の部分を意味する機能的定義である。MUC1のMGFR領域は、細胞表面に最も近い部分で、PSMGFRの大部分又はすべてによって規定される。MGFRは、非修飾ペプチドと、例えばリン酸化、グリコシル化などのような酵素修飾を受けたペプチドの両方を含む。本発明の結果は、腫瘍形成に関わる部位で細胞からのIBR放出をもたらすMUC1の切断が起こると、この部分がリガンドにアクセス可能になるという機構と合致する。
「鎖間結合領域」(IBR)という用語は、他のMUC1分子の同一領域に強固に結合するMUC1受容体の部分を意味する機能的定義であり、その結果、MUC1は各受容体のIBRを介して他のMUC1受容体と凝集(すなわち自己凝集)する能力を備えることになる。この自己凝集が、健常細胞で観察されるMUC1受容体のクラスター化に寄与しているのであろう。
“反復”という用語は、当該技術分野におけるその通常の意味を持つ。
“MUC1成長因子受容体の延長配列”(ESMGFR)という用語は、His−PSMGFRのすべて+PSIBRの近位末端の9個のアミノ酸を規定する、以下に定義した(表1:配列番号3参照)ペプチド配列のことである。
“分離”という用語は、細胞からの物理的分離を意味する。すなわち、細胞に対して固定されていたMUC1の部分が該細胞に対してもはや固定されていない状態をいう。例えば、MUC1の部分の切断の場合、切断された部分が細胞から離れて自由に移動し、その後体液中に検出されたり、切断された細胞から離れた場所、例えば別の細胞、リンパ節などに固定されれば、“分離した”ことになる。
“MUC1提示細胞”とは、MUC1及び/又はMGFRを表面に発現している非がん性及びがん性細胞のことである。“MUC1腫瘍細胞”又は“MUC1がん細胞”又は“がん性MUC1細胞”とは、MUC1及び/又はMGFRをその表面に異常発現しているがん性腫瘍細胞のことである。
シグナリング実体の前駆体は、本明細書中で使用している“シグナリング実体”とは区別
可能であるが、その定義内に含める。
・国際特許出願番号PCT/US00/01997、出願日2000年1月25日、発明の名称“神経変性疾患における異常タンパク質凝集の迅速且つ高感度の検出”、公開番号WO00/43791
・国際特許出願番号PCT/US00/01504、出願日2000年1月21日、発明の名称“コロイド及び非コロイド構造を用いるアッセイ”、国際特許公開番号WO00/34783として2000年7月27日に公開
・米国特許出願番号09/631,818、出願日2000年8月3日、発明の名称“タンパク質凝集の迅速且つ高感度の検出”
・Bamdadらによる米国仮出願、出願番号60/248,865、出願日2000年11月15日、発明の名称“エンドスタチン様血管形成阻害”
・米国特許出願、同一名称の出願、出願日2001年11月15日
(機構モデル)
(1) 受容体のクラスター化は健常状態に伴うものである。なぜならば、凝集したIBR部分は、成長因子、修飾酵素などのリガンドが、機能受容体として作用するMUC1受容体の隣接する細胞外部分にアクセスするのを遮断するからである。クラスター化は、細胞内テールが細胞内修飾酵素及びシグナリングリガンドにアクセスするのも遮断する。
(2) MUC1受容体がIBRを放出する位置で切断されると、受容体のクラスター化を維持する重要な力が失われ、受容体は細胞膜内を自由に移動し、又は修飾酵素、活性化リガンドもしくは成長因子のような分泌リガンド、又は他の細胞表面受容体と相互作用するようになる。これらの相互作用は、細胞増殖のシグナリングカスケードを引き起こす二量体化のような新規の誘導多量体化状態に関与することになろう。
エトモキシル。エトモキシルによる治療を使う本発明の方法が意図されない患者は、既にエトモキシルによる治療を要する疾患と診断されている患者、特にエトモキシルによる治療を必要とする慢性心不全を伴う疾患を有する患者である。そのような疾患は、不適切な筋小胞体機能を伴う不全心肥大などである。
前述のように、異なる薬物は異なる機構に従って作用する。一つの機構による薬物は、MGFRの腫瘍形成促進リガンドへの結合を、薬剤を投与されていない患者の自然の状態に比べて特別に妨害する。別の機構による薬物は、MUC1の全体的な切断を、薬剤を投与されていない患者の自然の状態に比べて特別に削減する。別の機構による薬物は、MUC1受容体の自己凝集を、薬剤を投与されていない患者の自然の状態に比べて特別に維持する。一態様では、薬物の活性度は少なくとも10%である。他の態様では、薬物の活性度は、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%である。
生分解性ポリマーの例は、乳酸及びグリコール酸のポリマー類、ポリ無水物類、ポリ(オルト)エステル類、ポリウレタン類、ポリ(butic acid)、ポリ(吉草酸)、及びポリ(ラクチド−コカプロラクトン)のような合成ポリマー類、並びに、アルギネート及びデキストランやセルロースを含む他の多糖類、コラーゲン、それらの化学誘導体類(置換、化学基、例えばアルキル、アルキレンの付加、ヒドロキシル化、酸化、及び当業者によって日常的に行われる他の修飾)、アルブミン及び他の親水性タンパク質、ゼイン及び他のプロラミン類及び疎水性タンパク質、それらのコポリマー及び混合物などの天然ポリマー類などである。一般的に、これらの材料は酵素加水分解又はインビボにおける水への曝露のいずれかによる表面又はバルク腐食で分解する。
追加の抗新生物薬は、Goodman及びGilmanの“The Pharmacological Basis of Therapeutics”、第8版、1990年、McGraw−Hill,Inc.(Health Professions Division)の第52章、Antineoplastic Agents(Paul Calabresi及びBruce A.Chabner)、及びその導入部の1202〜1263頁に開示されている。
本発明のある実施例及び態様において、コロイド粒子表面の自己組織化単層(SAM)を利用する。コロイドをSAMで誘導体化し、国際特許公開番号WO00/43791、2000年7月27日公開、発明の名称“神経変性疾患における異常タンパク質凝集の迅速且つ高感度の検出”(引用により本明細書に援用)に記載されているのと同様の形で薬物スクリーニング用に調製した。
コロイド凝集は、初め懸濁液中に分散しているコロイド粒子の色変化をモニターすることによって高感度に検出できる。凝集の結果、色はブルーに変化する。補助的シグナリング実体は必要ない。薬物スクリーニングでは、凝集(又はその欠如)は候補薬の存在下で観察される。
以下の実験は、MUC1受容体の切断部分は、脱落後細胞表面に残って付いている受容体の部分のリガンドになるという、他者の提案した仮説に挑むために設計された。しかしながら、驚くべき結果によれば、細胞表面に近いMUC1受容体の部分は高親和性の相互作用で自己凝集することを示している。図2参照。図2では、A列のカラム1−4及びカラム1の列A−Dのすべてのウェルが数分以内にブルーに変わったが、残りの9個のウェル(列B−Dのカラム2−4)はピンクのままであった。この実験では、MUC1受容体の様々なフラグメントの、相互結合能又は自己結合(自己凝集)能を試験した。結果は、どのフラグメントも受容体の他の部分には結合しないことを示す。しかしながら、少なくとも一部はPSIBRペプチドの配列(表1)によって定義される部分は、高親和性の相互作用で自己凝集する。我々は、この領域を受容体のIBR(鎖間結合領域)と名付けた。
本実施例は、MUC1受容体のMGFRとPSIBR間の境界付近のペプチド配列の、自己凝集に参加する能力を調べることによって、腫瘍形成又はがんに関連するMUC1の予想される切断部位を解明しようとするものである。
ヒスチジンタグ標識ペプチド(ESMGFR)であってその配列はHis−PSMGFRペプチドの全アミノ酸に加えて、PSMGFRに隣接するPSIBR領域から9個のアミノ酸をペプチドのN末端に追加したものを包含する。N末端−VQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFHHHHHH−C末端。
(下記の実施例2) 細胞をMGFRに対して作製された2価の抗体に曝露すると、成長因子/受容体−抗体応答を象徴する成長/応答曲線で特徴づけられる細胞増殖を誘導すること;
(下記の実施例3a−b) MUC1提示細胞によって産生される活性化リガンドは複数のPSMGFRに結合し、各細胞種によって産生される活性化リガンドの量はその細胞種によって産生されるMUC1受容体の量に比例していること;
(下記の実施例4b) MUC1腫瘍細胞は多量体の種を産生すること;及び
(下記の実施例5b2) MUC1腫瘍細胞に特異的であることが見出された薬物(MUC1腫瘍細胞における増殖は阻害するが他の細胞は阻害しない薬物)は細胞のMGFRに結合することが示されるが、特異的でない薬物(MUC1腫瘍細胞及び他の細胞を阻害する薬物)は多量体性のリガンドに結合することによってそれを細胞との相互作用から除外するという点で毒性があること。
本実施例でMUC1受容体に対する二量体化の影響を示す。本実施例で、MUC1受容体のMGFR領域に対して成長させた2価の抗体に様々な濃度で細胞を曝露すると、MUC1腫瘍細胞について提案された機構と合致する増強された細胞増殖(又はその欠如)がもたらされることを示す。2価の抗体をPSMGFRに対して作製した(すなわち、2個のMGFRに同時に結合する能力を有する単一抗体を製造した)。MUC1腫瘍細胞(T47D)を該抗体に曝露し、細胞増殖を抗体濃度の関数として調べた。成長因子/受容体−抗体応答を象徴する成長/応答曲線が観察された。具体的には、小部分の細胞しか抗体に曝露されないほどの低濃度では細胞増殖は少なかった。1個の抗体が隣接するMGFRを結合できるほど高い抗体濃度では細胞増殖は最大限となった。過剰すぎる抗体濃度では、各抗体は隣接するMGFRを二量体化せず1個のMGFRに結合しただけで、増殖は抑えられた。
MUC1を過剰発現しているヒト乳がん細胞系のT47D(HTB−133)細胞を培養して30%の集密度(コンフルエンシー)にした。MUC1受容体のPSMGFR部分に対して作製した抗体、すなわちMGFRに対する抗体(Zymed、米国カリフォルニア州サンフランシスコ)を、マルチウェル細胞培養プレート中で細胞に様々な濃度で加えた。陰性対照として、第二組のT47D細胞を無関係の抗体(抗ストレプトアビジン)で処理した。抗体を加える前に細胞をカウントした(ゼロ時)。すべての実験は3組にして実施した。細胞は、通常条件下にてCO2インキュベータ中で成長させた。細胞を24時間時及び再度48時間時に血球計算器を用いてカウントした(各ウェルあたり3回カウント)。結果は図4参照。すなわち、対照抗体で処理した同じ細胞の増殖と比べて、濃度依存性の様式で、抗体添加が増強された細胞増殖を引き起こしていた。図4は、24及び48時間時に測定された細胞増殖を抗PSMGFR濃度の関数としてプロットしたグラフである。最適の抗体濃度、おそらく1個の抗体がMUC1受容体の2個のMGFR部分に2価的に結合する、すなわち受容体を二量体化する場合に細胞増殖は最大になる。
本実施例では、MUC1腫瘍細胞の増殖の引き金を引く活性化リガンドは複数のPSMGFRに同時に結合することを示す。固定化したPSMGFRを担持するコロイド粒子を製造し、これらのコロイドの懸濁液を、(1)MUC1腫瘍細胞、又は(2)対照細胞の溶解産物及び上清に曝露した。MUC1腫瘍細胞の溶解産物/上清はコロイドを凝集させた(懸濁液がブルーに変色)。それらに含有されている活性化リガンドが異なるコロイド粒子上のMGFRに結合し、コロイド粒子を凝集させたためである。対照細胞の溶解産物/上清はそうならない。
表1に記載のHis−PSMGFRペプチドの100μM溶液20μlを、ヒスチジンタグ標識ペプチドを捉えるためにNTA−ニッケル部分を含むSAMで誘導体化したコロイド100μlに加えた。4種類の異なる腫瘍関連細胞系(HTB−133(T47Dとも呼ばれる)、CRL−1500、CRL−1504及びCRL−1902;ATCC,American Type Culture Collection、バージニア州マナッサス)からの溶解産物及び上清を、ペプチド提示コロイドのアリコートに加えた。96穴滴板の各ウェルに、30uLの各溶解産物/上清を、40uLのPBS、30ulのHis−PSMGFR担持コロイド又は陰性対照としてGST担持コロイドに加えた。MUC1受容体を過剰発現している二つの細胞系ではピンクからブルーへの色変化がすぐに生じた。MUC1を発現しているCRL−1504細胞にも色変化が観察されたが、かなり長いインキュベーション期間後のことであった。MUC1受容体を発現することが知られていない細胞系CRL−1902では色変化は生じなかった。陰性対照として、溶解産物を無関係のペプチドであるGSTタンパク質を提供しているコロイドにも加えた。追加の陰性対照として(データは示さず)、異なる細胞系の成長培地をコロイド調製物に加えた。陰性対照では色変化は観察されなかった。
さらに図6を参照する。カラム1のウェルはHis−PSMGFRを担持するコロイドを含有する。カラム2のウェルは、陰性対照としてGST(グルタチオン−S−トランスフェラーゼ)タンパク質を担持するコロイドを含有する。B列:HTB−133(T47Dとしても知られる)はピンクからブルーの色変化;C列:CRL−1500はピンクからブルーの色変化;A列:CRL−1504はピンクからブルーの色変化であるが、かなり長いインキュベーション期間後;D列:CRL−1902は色変化なし。陰性対照として、溶解産物/上清を無関係のペプチドであるGSTタンパク質を提供しているコロイドにも加えたが、いずれの細胞系についても色変化は観察されなかった。
これらの結果から、HTB−133(T47D)及びCRL−1500の細胞系は、MUC1受容体に対するリガンドを高濃度に分泌し、該リガンドは受容体を二量体化又は多量体化するように作用していることを示す。
本実施例で、MUC1の発現と、細胞表面に直接隣接しているMUC1受容体の部分(MGFR)から誘導されたペプチドに結合するリガンド(一つ又は複数の)の存在との間には直接的な相関があることが示された。
カラム1〜3:(コロイド上のNTA濃度)20μM;カラム4〜6:40μM;カラム7〜9:60μM;カラム10〜12:80μM、いずれも付着溶液中の総チオール濃度は600μM。図8A:時間=0;図8B:時間=15分;図8C:時間=1時間;図8D:時間=3時間。
概して、これらの結果は、リガンド産生とMUC1受容体の異常発現の両方が関与するフィードバックループに関する機構を示している。
MUC1受容体のリガンドを確認しようとして、鎖間結合領域の切断後細胞表面に残って付いているMUC1受容体の部分を表す、合成His−PSMGFRペプチド:GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAHHHHHH(配列番号2)を、NTA−Niビーズ(カタログ番号1000630;Qiagen GmbH、ドイツ、より入手)に装着し、プロテアーゼ阻害薬PMSF(フェニルメチルスルホニルフルオリド)の存在下(図9)又は不在下(図10)で細胞溶解産物とインキュベートした。T47D細胞からの溶解産物を用いた。その理由は、この乳房腫瘍細胞はMUC1を過剰発現していることが知られていたこと;さらに発明者らが本明細書中でこの細胞系はMUC1リガンドも過剰発現しているという証拠を提示したこと(図8A〜D参照)のためである。T47D細胞を培養し、次に1分間音波処理して細胞を溶解した。溶解産物をPSMGFR提示ビーズと混合し、氷上で時々撹拌しながら1時間インキュベートした。陰性対照として、無関係のペプチド、HHHHHHRGEFTGTYITAVTをNTA−Niビーズに付着させ、同一処理した。二組のビーズともpH7.4のリン酸緩衝液で2回洗浄した。結合したタンパク質種を、250mMのイミダゾールも含有するリン酸緩衝液100uLを3回加えて溶離した。どちらのペプチドとも、最初の溶出部分は別個の試料として流せるように取り出しておき、残りの部分は他の2つの溶出液と合わせてTCA(トリクロロ酢酸)−沈殿法(Chen,Lら、Anal.Biochem.Vol 269,179−188ページ;1999)によって濃縮した。溶出液は12%SDSゲルに流した。図9参照。次にゲルを銀染色した(Schevchenko,Aら;Anal.Chem.,Vol.68;850−858ページ;1996)。各レーンに乗せたものは次の通り:(左から右へ)
(1)Benchmarkの染色済みタンパク質ラダー(protein ladder)(Gibco);
(2)MUC1ペプチドからの最初の溶出液;
(3)TCA濃縮試料の1/10;
(4)ブランク;
(5)TCA濃縮試料の9/10;
(6)陰性対照ペプチドからの最初の溶出液;
(7)陰性対照ペプチドからのTCA濃縮試料の1/10;
(8)0.5ピコモルのBSA(標準として);
(9)陰性対照ペプチドからのTCA濃縮試料の9/10;
(10)銀染色SDS PAGE標準(BioRad カタログ番号1610314)。
図9を参照し、レーン2と6(対照)を比較すると、MUC1 PSMGFRペプチドが明らかに三つのペプチドに結合したことがわかる。すなわち、見掛け分子量17kDの位置の第一の特異的ペプチド;及び見掛け分子量23kDの位置の第二のペプチド(より濃いバンド)である。試料が最も濃縮されているレーン5に第三の特異的バンドが約35kDに見られることに注意する。
本実施例では、MUC1がん細胞によって産生され、これらの細胞における細胞増殖の引き金を引くリガンドは多量体であることを証明する。
17kD、23kD、及び35kDのタンパク質バンドを上記実施例4aに記載したゲルから切り取り、ペプチド分析に供した。これらのゲルバンドは、MUC1受容体のMGFR領域に対するリガンドを含有していると考えられた。17kD及び23kDの種は、プロテアーゼ阻害薬PMSFの存在下でMGFRペプチドに結合したが、35kDの種はPMSFを細胞溶解産物の混合物に添加しなかった場合に結合したことを思い起こしてほしい。
本発明の方法に合致させた治療戦略は、一つのリガンドとMUC1受容体のMGFR部分との相互作用を妨害する化合物を特定する、又はリガンドに結合してその作用を遮断する化合物を特定する、のいずれかになる。
これらの実施例では、MUC1腫瘍細胞において特異的に増殖を阻害する薬物を、MUC1腫瘍細胞及び他の細胞の両方において増殖を阻害する薬物と比較した。特異的及び非特異的薬物のどちらも、それらをMUC1腫瘍細胞溶解産物の存在下でPSMGFR提示コロイドに曝露することによって特定した。薬物は、コロイド−コロイド相互作用を防止した薬物として特定された。細胞試験により、これらの薬物は2群に分けられた。MUC1腫瘍細胞に特異的な群と非特異的な群である。非特異的薬物はPSMGFRに結合しないが、活性化リガンドに結合すると考えられ、MUC1提示細胞だけでなく対照細胞の増殖も阻害する。さらに、この群の薬物は、活性化リガンドを取り去って細胞と相互作用させないので、両方の細胞種に対していくらか毒性があった。MUC1腫瘍細胞に特異的な薬物は、ビーズ上のPSMGFRに結合することが見出された。これは、ビーズからのPSMGFRの切断産物のHPLC分析で示された。
以下は、抗がん剤を確認するための作用薬物スクリーニングアッセイの一例である。本実施例では、受容体切断後細胞表面に残って付いているMUC1受容体の部分から誘導されたヒスチジンタグ標識ペプチド(His−PSMGFR)を、NTA−ニッケル−SAM被覆金コロイドに連結した。該ペプチド提示コロイドを、MUC1提示細胞、すなわちMUC1受容体の該部分の二量体化又は多量体化を引き起こすリガンドを含有していることが本明細書中で示された細胞の溶解産物/上清とインキュベートした。このリガンドによる受容体のMGFR部分の誘導多量体化は、連結コロイドを一緒にして近くに引き寄せるため、コロイド溶液の色をピンクからブルーに変える。受容体のMGFR部分への活性化リガンドの結合を妨害する薬物は、溶液の色をピンクのまま変えない。
T47D細胞をT25フラスコからトリプシン処理して剥がし、ペレット化し、リン酸緩衝液中に再浮遊させ、超音波処理して溶解し、リガンドを溶液中に放出させた。NTA−SAM被覆コロイドをHis−PSMGFRペプチド:GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAHHHHHHと結合させた。200μlのNTA−SAM被覆コロイドをリン酸緩衝液中100μMのペプチド20μlと15分間インキュベートし、ペレット化して非結合ペプチドを除去し、リン酸緩衝液中に再浮遊させた。陰性対照コロイドは、MUC1ペプチドの代わりにランダム配列のヒスチジンタグ標識ペプチドとインキュベートした。細胞溶解産物(65μl)をDMSO中の5μlの薬物候補と混合し、ELISAプレートのウェル中の30μlMUC1ペプチド結合コロイドに加え、最終薬物濃度を約100μMとした。陽性対照は、薬物候補の代わりにDMSOを含有し、陰性対照は、薬物候補の代わりにDMSOと、MUC1ペプチドの代わりにランダム配列のペプチドと結合したコロイドを含有した。ピンクからブルーへの色変化は、細胞溶解産物中のリガンドがMUC1ペプチドに結合し、該ペプチドを二量体化し、コロイドを互いに十分近接させて色変化を生じさせたことを示している。薬物候補を含有しない陽性対照は、MUC1ペプチドと細胞溶解産物中に存在するリガンド間の相互作用を阻害するものが何もないので、2時間以内にピンクからブルーに変色した。色変化がないのは(ウェルがピンクのまま)、薬物候補がMUC1ペプチドとコグネイトリガンド間の相互作用を、MUC1受容体のMGFR部分に結合することによって、修飾酵素を阻害することによって、又はその活性化リガンドに結合することによって、のいずれかで遮断したことを示している。MUC1ペプチドの代わりにランダム配列のペプチドを提供しているコロイドを含有する陰性対照ウェルは、MUC1ペプチドに対するリガンドがランダム配列のペプチドを二量体化しないので、ピンクのままである。図12に、前述のアッセイに使用したサンプルの薬物スクリーニングプレートを示す。陽性対照ウェル(A1〜D1)は2時間以内にピンクからブルーに変色したが、陰性対照ウェル(E1〜H1)はピンクのままであった。ウェルE6は、MUC1ペプチドとコグネイトリガンド間の相互作用を阻害した薬物を含有するので、ウェルはピンクのままである。
前に、MUC1受容体のMGFR部分に対するリガンドはコロイド上のPSMGFRペプチドの二量体化又は多量体化を起こすことをインビトロで示した。実施例3a参照。また、受容体のMGFR部分の二量体化は増強された細胞増殖を誘導することも示した。実施例2参照。だとすると、受容体のMGFR部分とその活性化リガンドの相互作用を遮断する薬剤はMUC1提示腫瘍細胞の増殖を遮断するであろう。そこで、実施例5aに記載のインビトロ薬物スクリーニングアッセイを用いて確認された薬物を機能アッセイで試験し、MUC1依存性の細胞増殖を阻害するそれらの能力を調べた。
解説したように、MUC1受容体のMGFR部分とその活性化リガンド間の相互作用を妨害する化合物を確認するインビトロの薬物スクリーニングアッセイ(実施例5aに記載)で確認された化合物は、三つの作用様式で細胞増殖を阻害できる。これらの薬物は、(a)成長因子として作用する活性化リガンドの活性を遮断;(b)受容体のMGFR部分に直接結合して遮断;又は(c)MUC1受容体を修飾する酵素の活性を阻害することができる。(a)によって機能する薬物は様々な細胞種の増殖を阻害する一方、(b)及び(c)に従って機能するものはMUC1提示細胞の増殖を選択的に阻害するであろうと期待される。
ここでは、いくつかの薬物が、MUC1依存性の細胞増殖を、MUC1受容体のMGFR部分に結合してMGFR部分とそのコグネイトリガンド間の相互作用を分断することによって阻害したことを示す。いくつかの薬物のPSMGFRペプチドへの直接結合は二つの方法を用いて示された。His−PSMGFRペプチドをNTA−ニッケルアガロースビーズに連結し、次に各薬物候補と別個にインキュベートした。100μlのビーズに1mgのペプチドを飽和になるまで結合させ、非結合ペプチドを洗浄除去し、DMSO中2.7mg/mlの薬物候補25μlと、5mlのリン酸緩衝液中で1時間インキュベートした。非結合薬はリン酸緩衝液で洗浄除去し、ペプチドをPBS、250mMのイミダゾールでビーズから溶離した。薬物候補がペプチドに結合していれば、イミダゾール溶液中にペプチドと共溶出するであろう。次に、ペプチド−薬物複合体をHPLCで分離した。複合体からの溶出ピークを、単独注入した薬物及びPSMGFRペプチド単独からの溶出ピークと比較した。パイロット試験で、MUC1細胞増殖を選択的に阻害する薬物群から無作為に選んだ3種類の薬物を、細胞増殖を非選択的に阻害する群から無作為に選んだ3種類の薬物と比較した。図17に示されている通り、選択群から選んだ左側の薬物はPSMGFRペプチドに結合しているが、非選択群から選んだ右側の薬物は結合していなかった。
この実験は、修飾酵素を阻害することによってMUC1細胞の増殖を選択的に阻害する薬物と、MUC1受容体のMGFR部分に結合し遮断することによって阻害する薬物を見分けるために設計されたものである。以下の実施例8は、MUC1溶解産物中に存在するリガンドは、酵素阻害薬のPSMFを該溶解産物に加えるとPSMGFRペプチドに結合できなかったことを示している。このことは、PSMGFRがまず修飾されてからそのコグネイトリガンドを認識することを示唆している。実施例5aに記載の薬物スクリーニングアッセイを用いると、MUC1提示細胞の増殖を選択的に遮断する薬物と、成長因子として作用するMUC1リガンドを阻害することによって様々な細胞の増殖を遮断する薬物との区別をつけることができない。MUC1に選択的な薬物を確認するには、ヒットした薬物を二次アッセイにかけて、対照細胞と比較したMUC1細胞の細胞増殖率を測定しなければならない。MUC1提示細胞に対して選択的な薬物のうち、MGFRに結合し遮断する薬物と、その修飾酵素を阻害する薬物との区別は、どちらのアッセイでもつけることができない。酵素修飾ペプチドは、非修飾ペプチドより遅い速度でゲルの中を移動するので、ゲル移動性におけるこの差を用いれば、どの薬物が酵素を阻害することによって作用しているかを決定することができる。
本発明でMUC1依存性腫瘍の治療に有用な組成物として確認されたエトモキシルは、MGFR/薬物相互作用の競合的阻害を通じて細胞増殖に及ぼすMGFRの影響を調節するためにMGFRに対して特異的であることが、細胞増殖培地に過剰のPSMGFRを加えることによって示された。
以下の実験は、受容体切断後細胞表面に残って付いているMUC1受容体の部分(MGFR)が酵素修飾されている可能性を調べるために実施した。合成のHis−PSMGFRペプチド(配列番号2)をNTA−Niビーズに乗せ、T47D細胞の溶解産物とのインキュベーション、又は陰性対照として細胞成長培地とのインキュベーションのいずれかを行った。インキュベーションは、氷上で時々撹拌しながら1時間行った。第二の陰性対照として、無関係のペプチドRGD(配列番号12)をNTA−Niビーズに付着させ、同一処理した。両方の組のビーズをpH7.4のリン酸緩衝液で2回洗浄した。結合したタンパク質種を250mMのイミダゾールを添加して溶離した。各レーンに乗せたものは次の通りである:(右から左へ)
(10) 染色済みタンパク質ラダー(Gibco);
(9) ビーズに固定されたPSMGFRペプチド、細胞溶解産物とインキュベートしていない;
(8〜6) ビーズに固定されたPSMGFRペプチドの溶出液、T47D細胞溶解産物とインキュベートした;
(5) ビーズに固定された陰性対照ペプチドの溶出液、T47D細胞溶解産物とインキュベートしていない;
(4〜2) 陰性対照ペプチドの溶出液、溶解産物とインキュベートした。
これらの結果は、リガンドは、2個の隣接するMUC1受容体のMGFR部分に共有結合する酵素で、受容体の二量体化を起こし、細胞増殖のシグナリングカスケードを開始するという考えとも整合する。この機構に従って、本発明の薬物は、この酵素の作用を阻害することによって細胞増殖を妨げている。
MUC1受容体のMGFR部分は酵素修飾されてからそのリガンドと結合するという仮説を試験するために、実施例5aに記載の薬物スクリーニングアッセイを、酵素阻害薬PMSF(フェニルメチルスルホニルフルオリド、Sigma Chemical Co.、米国ミズーリ州セントルイス)の存在下又は不在下で実施した。MUC1を異常発現している乳房腫瘍細胞のT47D細胞を70%の集密度に成長させ、トリプシンで処理してフラスコから剥がし、遠心分離によってペレット化した。溶解産物は、2個のT75フラスコのペレットから次のように調製した。細胞ペレットを300μLのリン酸緩衝液(10mMのリン酸ナトリウム、100mMのNaCl、pH7.4)中に再懸濁させた。溶解産物を二つに分けた。一つの溶解産物分液はそのまま使用した。第二の分液には9μLの100mMストック溶液を加えて最終濃度3mMとした。溶解産物を凍結し4回解凍して、各解凍後15秒間激しく撹拌した。次に、溶解産物を遠心分離によりペレット化し、上清を回収した。溶解産物に6.2mlのリン酸緩衝液を加えて希釈した。次に、実施例5aに記載の薬物スクリーニングアッセイを実施したが、ただし薬物は加えなかった。それより、溶解産物中のリガンドの、多量体化方式によるMGFRへの結合能を試験した。この方式の結合があれば溶液の色はブルーに変化する。図20から分かる通り、PMSFを含有する溶液は色の変化がなく、ピンクのままであった。A1&2のウェルは、1時間以内にピンクからブルーに変化した陽性対照ウェルで、金コロイド上に固定されたHis−PSMGFRペプチドとT47D細胞の溶解産物/上清を含有している。A3&4のウェルは、A1&2のウェルと同じ成分を含有しているが、溶解産物/上清混合物を最初に酵素阻害薬PMSFで処理してあった;PMSFを含有するウェルは溶液の色変化を受けずピンクのままである。B1&2のウェルは陰性対照ウェルで、コロイドに固定されたHis−PSMGFRペプチドを含有するが、溶解産物ではなく緩衝液とインキュベートし、ピンクのままである。C1&2のウェルも陰性対照ウェルで、コロイドに固定されているペプチドが無関係のペプチド(RGD)で、これを溶解産物とインキュベートしたが、これもピンクのままである。
MUC1のIBRの放出はがんの進行に相関しうる。以下は、これらの受容体の切断状態に影響を及ぼす薬物候補を特定する全細胞アッセイについての記述である。このスクリーニングは、究極的には細胞から脱落し放出される受容体の自己凝集部分の削減をもたらすいずれかのステップを直接又は間接的に調節する薬物候補の確認もする。前記いずれかのステップとは、酵素切断、受容体の産生、発現、安定性、輸送又は分泌などであるが、これらに限定されない。
表1を参照する。受容体はいくつかの異なる部位で切断され、選択可能な始まりと終わりを有するペプチドフラグメントを生じることができる。表1のこれらのフラグメントの場合、上流であれ下流であれ、8〜10個の連続アミノ酸のどのストレッチも、本明細書中で引用した結合実体である特定のフラグメントを識別するのに十分であり得る。
当業者であれば、本明細書中にあげたすべてのパラメータは例示的意味合いのものであり、実際のパラメータは、本発明の方法及び装置が使用される特定の用途によることは容易に理解されるであろう。従って、前述の態様は例のためだけに提供されており、添付のクレーム及びその等価物の範囲内で、本発明は具体的に記載した以外のやり方で実施できるのは当然のことである。具体的には、当業者であれば、ほんの日常的な実験を使って、本明細書中に記載した本発明の特定の態様に対する多くの等価物を認識又は確認できるであろう。そうした等価物も以下のクレームによって本発明の範囲に含まれることは言うまでもない。
患者に、特定の状態の予防又は治療のために化合物を投与するいくつかの方法を本明細書中に開示している。本発明のそのような各側面において、本発明は、そのような特定の状態の治療又は予防に使用する化合物、並びに該化合物をそのような特定の状態の治療又は予防のための医薬品製造に使用することも特に含む。
クレーム中、アミノ酸の配列番号は、Andrew SpicerらによるJ.Biol.Chem Vol 266 No.23,1991,15099−15109に掲載の通りである。
Claims (4)
- MUC1の異常発現を特徴とするがんについて、そのリスクまたは進行を低減するために患者の治療に用いられる薬剤であって、
この薬剤は、配列番号7または配列番号10の1110から1154のペプチド配列に結合可能な2価の抗体であり、
治療において、がんのリスクがあることが知られている患者またはがんと診断された患者に投与される、上記薬剤。 - MUC1の異常発現を特徴とするがんについて、そのリスクまたは進行を低減するために患者の治療に用いられる薬剤であって、
この薬剤は、MUC1の成長因子受容体領域(MGFR領域)に結合可能な抗体であり、
治療において、がんのリスクがあることが知られている患者またはがんと診断された患者に投与される、上記薬剤。 - MUC1の異常発現を特徴とするがんが、乳がん、前立腺がん、肺がん、卵巣がん、結腸直腸がんまたは脳のがんである、請求項1または2の薬剤。
- 1つの抗体が1つのMGFRのみに結合するような量で前記抗体が用いられる、請求項1〜3のいずれかに記載の薬剤。
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