JP4563451B2

JP4563451B2 - Ｂ型肝炎ウイルスのｓ−表面抗原に対するするヒト化抗体

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Publication number: JP4563451B2
Application number: JP2007508271A
Authority: JP
Inventors: カン・フイイル; リー・ビュンキュ; パク・セチョル; ソン・モヨン; ヨ・テヒョン; リー・ジェスン; キム・チャンソク; パク・サンコ; ナ・カンイン
Original assignee: Yuhan Corp
Current assignee: Yuhan Corp
Priority date: 2004-04-14
Filing date: 2005-04-11
Publication date: 2010-10-13
Anticipated expiration: 2025-04-11
Also published as: JP2008501312A; US7435414B2; WO2005100400A1; US20060014937A1; KR20050100414A; CN1980956B; CN1980956A; KR100789645B1

Description

本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨｅｐａｔｉｔｉｓＢＶｉｒｕｓ、以下“ＨＢＶ”という）のＳ−表面抗原に対するヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄａｎｔｉｂｏｄｙ）、その製造方法及びそれを含むＨＢＶ関連疾患治療用薬学組成物に関する。

Ｂ型肝炎ウイルスはデーン粒子（Ｄａｎｅｐａｒｔｉｃｌｅ）として知られている約４２ｎｍの球形粒子であって、外側のエンべロープ（ｏｕｔｅｒｅｎｖｅｌｏｐｅ）およびヌクレオカプシドよりなる。ヌクレオカプシド（ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ）を取り囲んでいる外側のエンべロープは多量のＢ型肝炎表面抗原（ＨｅｐａｔｉｔｉｓＢｓｕｒｆａｃｅａｎｔｉｇｅｎｓ）を含んでおり、約１８０個のＢ型肝炎コア蛋白質（ＨｅｐａｔｉｔｉｓＢｃｏｒｅｐｒｏｔｅｉｎｓ）を含むヌクレオカプシド（ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ）はＨＢＶ構造遺伝子、ポリメラーゼ等をコードする数種の遺伝子を含む。
（Ｓｕｍｍｅｒｓｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、７２、４５７９、１９７５；ＰｉｅｒｒｅＴｉｏｌｌａｉｓｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１３、４０６−４１１、１９８１）。

ＨＢＶ表面抗原の遺伝子コード領域は３個のインフレ−ム（in−frame）開始部位を含んでおり、これらは全てＳ−ドメイン（Ｓ−ｄｏｍａｉｎ）末端の終了コドンを共有している。従って、ＨＢＶ表面抗原は３つの群に分けられる：（ｉ）Ｓ−ドメインのみを含む小さいＨＢＶ表面抗原（ＳｍａｌｌＨｅｐａｔｉｔｉｓＢＶｉｒｕｓＳｕｒｆａｃｅＡｎｔｉｇｅｎ、以下「Ｓ−表面抗原」という）、（ｉｉ）Ｓ−ドメイン及び５５個のアミノ酸よりなるＰｒｅ−Ｓ２を含むミドルＨＢＶ表面抗原（ＭｉｄｄｌｅＨｅｐａｔｉｔｉｓＢＶｉｒｕｓＳｕｒｆａｃｅＡｎｔｉｇｅｎ、以下「Ｍ−表面抗原」という）、（ｉｉｉ）Ｓ−ドメイン、Ｐｒｅ−Ｓ２及びｐｒｅ−Ｓ１を含む大ＨＢＶ表面抗原（ＬａｒｇｅＨｅｐａｔｉｔｉｓＢＶｉｒｕｓＳｕｒｆａｃｅＡｎｔｉｇｅｎ、以下「Ｌ−表面抗原」という）。Ｓ−表面抗原は発現される全体表面抗原の約８０％以上を占める。

現在慢性肝炎治療剤としては、インターフェロンアルファ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎａ）とラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎ）が広く用いられているが（Ｃ．Ｌ．Ｌａｉ、Ｐ．Ｃ．Ｗｕ、Ｈ．Ｋ．Ｍ．Ｊ、３、２８９−９６、１９９７）、インターフェロンアルファは生体内ウイルスに対する免疫反応にもかかわらず毒性が強い。一方、核酸誘導体として作用するラミブジンは、ＤＮＡポリメラーゼを阻害することにより抗ウイルス活性を示す。経口投与用ラミブジンは治療效果が高いが、長期服用の場合、ラミブジンに対する耐性を有する突然変異体が出現する可能性が高い（ＤａｒｙｌＴ．−Ｙ．Ｌａｕｅｔａｌ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ３２、８２８−３４、２０００）。更に、ヒト血漿から分離した抗ＨＢＶポリクローン抗体は肝移植及び垂直伝染からのＨＢＶ感染を防止するために用いられている。しかしながら、この抗体も、それが抗原に対する特異性が低くかつ人の血液から分離しなければならない等の問題を有している。

前記問題点を解決するためにＨＢＶ表面抗原に対するマウスモノクローン抗体を用いる方法が開発されたが、マウスモノクローン抗体を長期間使用すると、マウス抗体に対するヒト抗体が形成される免疫反応が発生するという問題がある（ＤｉｍａｇｇｉｏＪ．Ｊ．、ＳｃｈｅｉｎｂｅｒｇＤ.Ａ.ｅｔａｌ.、ＣａｎｃｅｒＣｈｅｍｏｔｈｅｒ.Ｂｉｏｌ.ＲｅｓｐｏｎｓｅＭｏｄｉｆ.１１、１７７−２０３、１９９０）。

マウスモノクローナル抗体の望ましくない性質を克服するため、抗原と結合する部位を除いたフレームワークをヒト抗体に置換することによりヒト化抗体が開発された。そのようなヒト化抗体を製造するのに現在用いられている方法は、マウス抗体と最も近い配列類似性を示すヒト抗体をコードする遺伝子を選定し、マウス抗体の相補性決定領域ＣＤＲ部位のみをヒト抗体でＣＤＲグラフティング法により置換する工程を含む。ヒト化抗体はインビボ免疫反応を軽減させるという長所がある（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎｅｔａｌ.、Ｎａｔｕｒｅ、３３２、３２３、１９８８；Ｎａｋａｔａｎｉｅｔａｌ．、ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７、４３５、１９９４）。しかし、マウス抗体の抗原と結合するＣＤＲ部位のみをヒト抗体に移植した場合、高い選択性と反応性を喪失する場合が頻繁に発生する（ＣａｒｔｅｒＰｅｔａｌ．、Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ、８９；４２８５−４２８９、１９９２）。
そこで本発明者は従来のヒト化抗体のそのような問題を克服するために努力し、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ−表面抗原に対するマウスモノクローン抗体の抗体特異性はそのまま維持し、かつマウスモノクローン抗体の可変地域をヒト抗体遺伝子で置換してマウスモノクローン抗体に対する免疫反応を最小化したＢ型肝炎ウイルスのＳ−表面抗原に対するヒト化抗体を開発した。

従って、本発明の目的はＢ型肝炎ウイルスのＳ−表面抗原に対するヒト化抗体及びその製造方法を提供することである。
本発明の他の目的は、前記ヒト化抗体を有效成分として含むＢ型肝炎ウイルスに関連する疾患の治療用薬学組成物を提供することである。

本発明の一態様によれば、
ａ）相補性決定部位（ＣＤＲ）に配列番号３８〜４０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
ｂ）相補性決定部位に配列番号４１〜４３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
c）ヒト抗体の重鎖不変領域と同一の重鎖不変領域；及び
d）ヒト抗体の軽鎖不変領域と同一の軽鎖不変領域
を含むＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のＳ−表面抗原に対するヒト化抗体を提供する。

本発明のヒト化抗体は、マウスモノクローン抗体と類似する抗原結合能力を示し、かつ免疫誘発能力が顕著に低いヒト化抗体であって、慢性Ｂ型肝炎患者の治療、肝移植患者の感染予防及びＢ型肝炎ウイルスに感染された産婦から胎児への垂直感染予防等に有用である。

本発明は重鎖可変領域または軽鎖可変領域におけるその相補性決定部位がマウスモノクローン抗体に由来し、抗体分子の骨格領域がヒト抗体に由来するヒト化抗体を開示する。ヒト化抗体は、抗原結合親和度（Ｋａ）が７ｘ１０^７Ｍ^-１〜１ｘ１０^８Ｍ^-１であることが好ましい。
本発明のヒト化抗体はマウスモノクローナル抗体Ａ９−１１−５（寄託番号ＫＴＣＣ１８０２０ＰおよびＫＴＣＣ１８０２１Ｐ）から、ＣＤＲグラフティング法により製造でき、マウスモノクローナル抗体Ａ９−１１−５の重鎖可変領域は配列番号３８〜４０の３つのＣＤＲ領域を含み、軽鎖可変領域は配列番号４１〜４３の３つのＣＤＲ領域を含む。

まず、前記マウスモノクローン抗体Ａ９−１１−５の軽鎖及び重鎖可変領域のアミノ酸配列をジーンバンクデータベース（Ｇｅｎｅｂａｎｋｄａｔａｂａｓｅ）におけるヒト配列と比較し、マウス抗体Ａ９−１１−５重鎖と最大の配列類似性を有するカバット（Ｋａｂａｔ）により定義されたヒト重鎖可変領域サブグループ２（Ｈｈ２）、およびマウスモノクローン抗体Ａ９−１１−５軽鎖と最大の類似性を有するジーンバンクＩｇブラストのヒトＩｇラムダ生殖系Ｖ遺伝子（ＩｇｌａｍｄａｇｅｒｍｌｉＶｇｅｎｅｓ of ＧｅｎｅｂａｎｋＩｇｂｌａｓｔの）のヒト軽鎖可変領域サブグループ７（ｈＶ７）またはＶ３を選択する。（ＫａｗａｓａｋｉＫ．ｅｔａｌ、１９９７）。

ヒト化抗体重鎖および軽鎖をコードする遺伝子はこのように選定されたヒト遺伝子を鋳型として用いることにより増幅できる。この方法では、ヒト化抗体の重鎖及び軽鎖をコードするヌクレオチド配列のそれぞれを、よく知られた遺伝子研究および抗体構造分析の情報を基にして修飾し得る。マウスモノクローナル抗体のあるヌクレオチド配列が抗原結合親和性に影響を及ぼすか、抗体構造に重要であるなら、それらは配列で置換することなく保存される。（ＫａｂａｔＥ．Ａ．ｅｔａｌ．、Ｄ．Ｈ．Ｈ．Ｓ．、９１−３２４２、１９９１；ＣｈｏｔｈｉａＣ．ｅｔａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３４２、８７７−８８３、１９８９；ＧａｒｙＭ．Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ．ｅｔａｌ．、ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７、８０５−８１４、１９９４；ＬｉｎｄａＨａｒｒｉｓ、ａｎｄＢａｊｏｒａｔｈ、Ｊ．ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ、４、３０６−３１０、１９９５）。

ヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子は、ＨＢＶＳ−表面抗原を特異的に認識するマウスモノクローン抗体Ａ９−１１−５の重鎖可変領域をコードする遺伝子の抗原結合部位を除いたフレームワークをヒト抗体の重鎖サブグループ２（Ｈｈ２）で置換することによって製造される。ヒト化抗体の重鎖可変領域をコードするそのような遺伝子は、マウスモノクローン抗体Ａ９−１１−５の重鎖をコードする遺伝子を鋳型として用いて、マウスモノクローナル抗体をヒト化させるプライマーを選定し、対応するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）を行った後、増幅されたＰＣＲ産物を制限酵素及びＤＮＡリガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）を用いて連結する工程によって製造することができる。このように製造したヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子をＨＦＷ１４１（配列番号３２）と名付け、これは配列番号３５のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする（図１参照）。

ヒト化重鎖可変領域をコードする遺伝子を含む、ヒト化抗体の重鎖全体をコードする遺伝子を製造するために、遺伝子ＨＦＷ１４１をＰＣＲベクターに挿入して、ｐＣＲ−ＨＦＷ１４１を製造する。この時、ヒト化抗体の重鎖リーダー配列の前方にコザック配列（Ｋｏｚａｋ、Ｍ．Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５、８１２５−８１４８、１９８７）を挿入し、重鎖リーダー配列のいくつかのコドンを動物細胞において使用頻度の高い他のコドンで置換する。そのことはヒト化抗体の重鎖可変領域の発現効率を増加させる（配列番号１）。ヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子断片は発現ベクターｐＣＲ−ＨＦＷ１４１から単離し、ヒト抗体の重鎖不変領域をコードする遺伝子をコードする遺伝子を含む発現ベクターＨＡＢ−ＨＣ（寄託番号:ＫＣＴＣ１０２２９ＢＰ、大韓民国特許公開番号第２００４−１２２６６号）に挿入し、ヒト化抗体の重鎖の発現ベクターを得る。このように製造された発現ベクターをｐＨＡＢ−ＨＦＷ１４１ＨＦ（寄託番号:ＫＣＴＣ１０５３３ＢＰ）と名付けた。ヒト化抗体の重鎖全体をコードする遺伝子は重鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＨＦＷ１４１ＨＦから分離することができ、ＨＦＷ１４１ＨＦと名付けた。

前記ヒト化重鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＨＦＷ１４１ＨＦで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉＴＯＰ１０Ｆ'形質転換体を２００３年１０月２９日付でKorean Collection for Type Cultures（ＫＣＴＣ）（住所：Korea Research Insitute of Bioscience and Biotechnology, (KRIBB),#52, Oun-dong, Yusong-ku, Taejon,305-333,韓国）に、寄託番号:ＫＣＴＣ１０５３３ＢＰで、ブタペスト条約に従って寄託した。

ヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子は、ＨＢＶＳ−表面抗原を特異的に認識するマウスモノクローン抗体Ａ９−１１−５の軽鎖可変領域をコードする遺伝子の抗原結合部位を除いたフレームワーク領域をヒト抗体の軽鎖サブグループ７（ｈＶ７）または軽鎖ラムダ生殖細胞系Ｖ３で置換することによって製造し得る。ヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードするそのような遺伝子はマウスモノクローン抗体Ａ９−１１−５の軽鎖をコードする遺伝子を鋳型として用いてマウスモノクローナル抗体をヒト化するプライマーを設計し、対応するプライマーを用いてＰＣＲを行った後、制限酵素及びＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｓｅ）を用いて各ＰＣＲ産物を互いに連結する工程により製造しうる。このように製造したヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子をそれぞれＬＦＷ２２−３１（配列番号３３）及びＬＦＷ２２−３１２（配列番号３４）と名付けた。それらは配列番号３６及び配列番号３７のヌクレオチド配列を有するポリペプチドをそれぞれコ−ドする（図２参照）。

ヒト化軽鎖可変領域をコードする遺伝子を含むヒト化抗体の軽鎖全体をコードする遺伝子を製造するために遺伝子ＬＦＷ２２−３１またはＬＦＷ２２−３１２をＰＣＲベクターに挿入してｐＣＲ−ＬＦＷ２２−３１またはｐＣＲ−ＬＦＷ２２−３１２を製造する。この時、ヒト化抗体の軽鎖リーダー配列の前方にコザック配列（Ｋｏｚａｋ、Ｍ．Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５、８１２５−８１４８、１９８７）を挿入し、軽鎖リーダー配列遺伝子のいくつかのコドンを動物細胞で高い頻度で使用される他のコドンで置換することがヒト化抗体の軽鎖可変領域の高発現のために好ましい（配列番号１３）。ヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子断片は発現ベクターｐＣＲ−ＬＦＷ２２−３１またはｐＣＲ−ＬＦＷ２２−３１２から分離し、ヒト抗体の軽鎖定常領域をコードする遺伝子を含む発現ベクターｐＨＡＢ−ＬＣ（寄託番号:ＫＣＴＣ１０２３１ＢＰ、大韓民国特許公開番号第２００４−１２２６７号）に挿入し、ヒト化抗体軽鎖の発現ベクターを得る。このように構築した発現ベクターをそれぞれｐＨＡＢ−ＬＦＷ２２−３１ＬＦ（寄託番号:ＫＣＴＣ１０５３２ＢＰ）及びｐＨＡＢ−ＬＦＷ２２−３１２ＬＦ（寄託番号:ＫＣＴＣ１０５５３ＢＰ）と名付けた。ヒト化抗体の軽鎖全体をコードする遺伝子は軽鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＬＦＷ２２−３１ＬＦ及びｐＨＡＢ−ＬＦＷ２２−３１２ＬＦからを分離することができ、それぞれＬＦＷ２２−３１ＬＦ及びＬＦＷ２２−３１２ＬＦと名付けた。

ヒト化軽鎖発現ベクターｐＨＡＢＬＦＷ２２−３１ＬＦおよびｐＨＡＢＬＦＷ２２−３１２ＬＦのそれぞれで形質転換したＥ．ｃｏｌｉＴＯＰ１０Ｆ’は２００３年１０月２９日付及び２００３年１１月２５日付でKorean Collection for Type Cultures（ＫＣＴＣ）（住所：Korea Research Insitute of Bioscience and Biotechnology, (KRIBB),#52, Oun-dong, Yusong-ku, Taejon,305-333,韓国）にブタペスト条約に従って寄託番号ＫＣＴＣ１０５３２ＢＰ及びＫＣＴＣ１０５５３ＢＰで寄託した

ジーンポーター（ＧｅｎｅＰＯＴＥＲ）のような適切な形質転換溶液を用いてヒト化重鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＨＦＷ１４１ＨＦ及びヒト化軽鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＬＦＷ２２−３１ＬＦでＣＨＯ細胞を形質転換し、ＨＢＶＳ−表面抗原を特異的に認識するヒト化抗体を生産する形質転換体を製造することができ、形質転換体をＣＨＯ−ＹＨＢ１１１０−１３と名付けた。更に、他の形質転換体をヒト化重鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＨＦＷ１４１ＨＦ及びヒト化軽鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＬＦＷ２２−３１２ＬＦを用いて前記と同様な方法で形質転換体を製造することができ、これをＣＨＯ−ＹＨＢ１１１０−１５と名付けた。

形質転換体細胞系から本発明のヒト化抗体を精製するために、形質転換体ＣＨＯ−ＹＨＢ１１１０−１３またはＣＨＯ−ＹＨＢ１１１０−１５を適当な培地で培養し培養上清を、プロテインＡ（ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ、ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）またはヤギ抗−ヒト免疫グロブリンＧ（ｇｏａｔａｎｔｉ−ｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧ、Ｚｙｍｅｄ社）を用いるカラムクロマトグラフィ−に付す。このように精製したヒト化抗体をそれぞれＹＨＢ１１１０−１３及びＹＨＢ１１１０−１５と名付けた。

ＨＢＶＳ−表面抗原を特異的に認識するヒト化抗体ＹＨＢ１１１０−１３及びＹＨＢ１１１０−１５は、６×１０^７〜５×１０^８Ｍ^-１の抗原結合親和度を示し、これは本発明のヒト化抗体が以前に報告されたマウスモノクローン抗体と類似する抗原結合能力を維持するが、免疫誘発能力は顕著に減少し、Ｂ型肝炎ウイルスに関連する疾患の治療に副作用なしに效果的に用いられる。

このような目的で、本発明のヒト化抗体を薬学的組成物において有效成分として用い、ＨＢＶに関連する病気を治療できる。薬学的組成物は即時の、または延長された放出のため経口あるいは非経口用量形として製剤化できる。その組成物は希釈剤、充填剤、崩壊制、甘味制、潤滑剤、芳香剤等の薬学製品に通常用いられる非活性成分を含み得る。薬学組成物はボーラス注入または持続ドリップによる静脈投与のため、または移植カプセルからの放出のため好ましくは製剤化される。静脈投与の典型的な製剤は希釈剤として食塩水を用いる。
治療用投与のための抗体の製剤は当業者に知られていると考えられる。

患者のための用量は、用いられる具体的な抗体、体重、患者の年齢、性別、健康状態、食餌、投与期間および組成物の製剤、投与経路、処置すべき病気等によって変化する。典型的な用量は０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜１，０００ｍｇ／ｋｇ／日である。より典型的には用量は０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日である。
本発明の組成物は、患者に対する本発明の抗体の投与のために、治療剤として抗体が投与できる臨床的適応症、用量およびスケジュール、および／または禁忌を記載した印刷物を含むことができる。

以下、本発明を実施例によりより詳しく説明する。但し、下記の実施例は、本発明を例示するためであり、本発明を限定するものではない。
実施例１
ヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子の構築
ＨＢＶＳ−表面抗原に対するマウス抗体Ａ９−１１−５（寄託番号:ＫＣＴＣ１８０２０Ｐ及びＫＣＴＣ１８０２１Ｐ）の重鎖可変領域をコードする遺伝子を鋳型として、プライマー対配列番号１と配列番号１２を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって、リーダー配列が含まれたヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子Ａを増幅した。増幅されたＰＣＲ産物はアガローズゲル電気泳動及びキアゲル抽出キット（ＱＩＡｇｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ社、米国）を用いて回収した。

次に、精製された遺伝子Ａを、鋳型として配列番号１と配列番号３のプライマー対または配列番号２と配列番号１２のプライマー対を用いてＰＣＲに付した。それぞれの増幅されたＰＣＲ産物を制限酵素ＳｔｕＩ（ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）を用いて３７℃で２時間反応させて切断した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＤＮＡｌｉｇａｓｅ、ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）を用いて常温で１時間反応させて重鎖可変領域をコードする遺伝子Ｂを製造した。

次に前記重鎖可変領域をコードする遺伝子Ｂを鋳型として配列番号４と配列番号１２のプライマー対または配列番号１と配列番号５のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。増幅されたＰＣＲ産物のそれぞれを制限酵素ＰｓｔＩ（ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）を用いて３７℃で２時間反応させて切断した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＤＮＡｌｉｇａｓｅ、ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）を用いて常温で1時間反応させて重鎖可変領域をコードする遺伝子Ｃを製造した。

前記と同様な方法で、遺伝子Ｃを鋳型として、配列番号６と配列番号１２、または配列番号１と配列番号７のプライマー対を用いてＰＣＲ増幅した後、制限酵素ＳａｌＩ（ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）で切断して重鎖可変領域をコードする遺伝子Ｄを得た。前記重鎖可変領域をコードする遺伝子Ｄを配列番号８と配列番号１２のプライマー対、または配列番号１と配列番号９のプライマー対を用いてＰＣＲ増幅した後、制限酵素ＤｒａＩ（ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）で切断して重鎖可変領域をコードする遺伝子Ｅを得た。前記重鎖可変遺伝子Ｅを配列番号１０と配列番号１２、または配列番号１と配列番号１１のプライマー対を用いてＰＣＲ増幅した後、制限酵素ＸｂａＩ（ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）を用いて切断した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＤＮＡｌｉｇａｓｅ、ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）を用いて常温で１時間反応させて重鎖可変領域をコードする遺伝子Ａ９Ｖ７ＦＷ４２ＨＶを製造した。

また、前記と同様な方法で、重鎖可変領域をコードする遺伝子Ａ９Ｖ７ＦＷ４２ＨＶを再び鋳型として、配列番号２３と配列番号２５、または配列番号１と配列番号２４のプライマー対を用いてＰＣＲ増幅を行なった。それぞれの増幅されたＰＣＲ産物を１：１モル比で混合した後、配列番号１と配列番号２５を用いて９５℃で２分、５８℃で２分、７２℃で２分の条件で３０回繰り返して重畳ＰＣＲ増幅を行い、最終的にヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子を製造し、これをＨＦＷ１４１と名付けた。

それぞれのＰＣＲ反応に用いられた塩基及びＰＣＲ条件は下記の表１に記述した。
それぞれのＰＣＲ反応は９５℃で５分間前処理した後、下記の表１の各条件により３０回繰り返して行った後、７２℃で１０分間最終延長を行った。

実施例２
ヒト化抗体の重鎖全体遺伝子の構築及びその発現ベクターの製造
ヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子の高発現のためにヒト化抗体の重鎖リーダー配列の前方にコザック配列（Ｋｏｚａｋ、Ｍ．Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５、８１２５−８１４８、１９８７）を挿入し、重鎖リーダー配列４番目のアミノ酸であるロイシン（Ｌｅｕｃｉｎ）の塩基コドンを既存のＴＴＡから、動物細胞において使用頻度の高いコドンであるＣＴＧで置換して発現效率が高いプライマーを製作した。前記のように置換されたヒト化抗体の重鎖リーダー配列を下記の表２に記述した。

実施例１で製造したヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子ＨＦＷ１４１をＰＣＲベクターに挿入し、これをｐＣＲ−ＨＦＷ１４１と名付けた。
また、ヒト化抗体の重鎖全体遺伝子を製造するために、ヒト抗体の重鎖不変領域をコードする遺伝子が挿入されたｐＨＡＢ−ＨＣ（ＫＣＴＣ１０２２９ＢＰ、大韓民国特許公開番号第２００４−１２２６６号）発現ベクターを用いた。

まず、ヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子ＨＦＷ１４１を発現ベクターｐＨＡＢ−ＨＣに挿入するため、前記で製造したｐＣＲ−ＨＦＷ１４１を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｐａＩ（ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）を用いて３７℃で２時間反応させて切断した後、１．５％アガロースゲル電気泳動とエチジウムブロマイド（ｅｔｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ、ＥｔＢｒ）染色を通じて約４５０ｂｐの遺伝子断片を確認した。

同様に発現ベクターｐＨＡＢ−ＨＣを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｐａＩで切断して約６．５Ｋｂの切断された発現ベクターを確認した。その後、それぞれの遺伝子断片をキアゲル抽出キット（ＱＩＡｇｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ社、米国）を用いて回収した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＤＮＡｌｉｇａｓｅ、ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）を用いて１６℃で一晩反応させた後、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ'を形質転換させて形質転換体を得た。得られた形質転換体を１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリンが含有されたＬＢ培地で一晩培養しプラスミドを回収した後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｐａＩで切断して、約１．４Ｋｂのヒト化抗体の重鎖全体遺伝子を電気泳動を通じて分離した。
前記のような方法によって製造したヒト化抗体の重鎖全体をＨＦＷ１４１ＨＦと名付けた。また、前記ヒト化抗体の重鎖全体遺伝子ＨＦＷ１４１ＨＦが挿入されたヒト化抗体の重鎖発現ベクターをｐＨＡＢ−ＨＦＷ１４１ＨＦと名付け（図３参照）、これを用いてＥ．ｃｏｌｉＴＯＰ１０Ｆ'を形質転換させた細胞株を２００３年１０月２９日付でKorean Collection for Type Cultures（ＫＣＴＣ）遺伝子バンクに寄託した（寄託番号:ＫＣＴＣ１０５３３ＢＰ）。

実施例３
ヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子の構築
ＨＢＶＳ−表面抗原を認識するマウスモノクローン抗体Ａ９−１１−５の軽鎖可変領域をコードする遺伝子を鋳型として、配列番号１３と配列番号２２のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより、リーダー配列が含まれた軽鎖可変領域をコードする遺伝子Ａ’を増幅した。これをアガローズゲル電気泳動及びエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）染色を通じて確認し、キアゲル抽出キット（ＱＩＡｇｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ）を用いて回収した。

次に精製された遺伝子Ａ’を鋳型として、配列番号１４と配列番号２２のプライマー対、または配列番号１３と配列番号１５のプライマー対を用いてＰＣＲ増幅した。増幅された遺伝子を制限酵素ＫｐｎＩ（ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）を用いて３７℃で２時間反応させて切断した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＤＮＡｌｉｇａｓｅ、ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）を用いて常温で１時間反応させて軽鎖可変領域をコードする遺伝子Ｂ’を製造した。
一方、前記軽鎖可変領域をコードする遺伝子Ｂを鋳型として配列番号１６と配列番号２２のプライマー対、または配列番号１３と配列番号１７のプライマー対を用いてＰＣＲ増幅した。増幅された遺伝子を制限酵素ＭｓｃＩ（ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）を用いて３７℃で２時間反応させて切断した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＤＮＡｌｉｇａｓｅ、ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）を用いて常温で１時間反応させて連結して軽鎖可変領域をコードする遺伝子Ｃ’を製造した。

前記と同様な方法で、軽鎖可変領域をコードする遺伝子Ｃ’を配列番号１８と配列番号２２のプライマー対、または配列番号１３と配列番号１９のプライマー対を用いて増幅した後、制限酵素ＡｐａＬＩ（ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）を用いて切断し軽鎖可変領域をコードする遺伝子Ｄ’を得、これを鋳型として配列番号２０と配列番号２２のプライマー対または配列番号１３と配列番号２１のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、制限酵素ＳｍａＩ（ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）を用いて切断した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＤＮＡＬｉｇａｓｅ、ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）を用いて常温で１時間反応させて軽鎖可変領域をコードする遺伝子Ａ９Ｖ７ＬＶを製造した。

また、軽鎖可変領域をコードする遺伝子Ａ９Ｖ７ＬＶを鋳型として配列番号２６と配列番号２２のプライマー対、または配列番号１３と配列番号２７のプライマー対を用いて下記の表３の条件でＰＣＲを行った。それぞれ増幅されたＰＣＲ産物を１：１モル比で混合した後、配列番号１３と配列番号２２を用いて、９５℃で２分、５８℃で２分、７２℃で２分の条件で３０回繰り返して重畳ＰＣＲ増幅を行って、最終的にヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子を製造し、それをＬＦＷ２２と名付けた。

また、前記と同様な方法で、製造されたＬＦＷ２２を再び鋳型として配列番号２８と配列番号２２のプライマー対、または配列番号１３と配列番号２９のプライマー対を用いて表３の条件でＰＣＲ増幅を行った。それぞれ増幅されたＰＣＲ産物を１：１モル比で混合した後、配列番号１３と配列番号２２を用いて、９５℃で２分、５８℃で２分、７２℃で２分の条件で３０回繰り返して重畳ＰＣＲ増幅を行い、最終的にヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子を製造し、それをＬＦＷ２２−３１と名付けた。

また、前記と同様な方法で、製造されたＬＦＷ２２−３１を再び鋳型として配列番号３０と配列番号２２のプライマー対、または配列番号１３と配列番号３１のプライマー対を用いて表３の条件でＰＣＲ増幅を行った。それぞれ増幅されたＰＣＲ産物を１：１モル比で混合した後、配列番号１３と配列番号２２を用いて、９５℃で２分、５８℃で２分、７２℃で２分の条件で３０回繰り返して重畳ＰＣＲ増幅を行い、最終的にヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子を製造し、それをＬＦＷ２２−３１２と名付けた。
前記のＰＣＲ反応で用いられた塩基及びＰＣＲ条件を下記の表３に記述した。
それぞれのＰＣＲ反応は９５℃で５分間前処理した後、下記の表３の各条件によって３０回繰り返して行った後、７２℃で１０分間最終延長を行った。

実施例４
ヒト化抗体の軽鎖全体遺伝子の構築及びその発現ベクターの製造
ヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子の高発現のために、ヒト化抗体の軽鎖リーダー配列の前方にコザック配列（Ｋｏｚａｋ、Ｍ．Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５、８１２５−８１４８、１９８７）を挿入し、軽鎖リーダー配列遺伝子のうち８番目のアミノ酸を既存のフェニルアラニン（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）から動物細胞において発現效率の高いロイシンで置換し、６番目のロイシンを暗号化するＣＴＴをＣＴＧに、７番目のイソロイシンを暗号化するＡＴＡをＡＴＣで置換して軽鎖の発現效率の高いプライマーを製作した。前記のように置換されたヒト化抗体の軽鎖リーダー配列を下記の表４に記述した。

実施例３で製造したヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子ＬＦＷ２２−３１をＰＣＲベクターに挿入し、これをｐＣＲ−ＬＦＷ２２−３１と名付けた。

また、ヒト化抗体の軽鎖全体遺伝子を製造するために、ヒト抗体の軽鎖不変領域をコードする遺伝子が挿入されたｐＨＡＢ−ＬＣ（ＫＣＴＣ１０２３１ＢＰ、大韓民国特許公開番号第２００４−１２２６７号）発現ベクターを用いた。

まず、ヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子ＬＦＷ２２−３１を発現ベクターｐＨＡＢ−ＬＣに挿入するために、前記で製造したｐＣＲ−ＬＦＷ２２−３１を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｖｒＩＩを用いて３７℃で２時間反応させ切断した後、１．５％アガロースゲル電気泳動とエチジウムブロマイド染色を行って約４００ｂｐの遺伝子断片を確認した。

同様に発現ベクターｐＨＡＢ−ＬＣを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｖｒＩＩで切断し、約５．６Ｋｂの切断された発現ベクターを確認した。その後、それぞれの遺伝子断片をキアゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社．米国）を用いて回収した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ＤＮＡＬｉｇａｓｅ、ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）を用いて１６℃で一晩反応させた後、Ｅ．ｃｏｌｉＴＯＰ１０Ｆ'を形質転換させて形質転換体を得た。得られた形質転換体を１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリンが含有されたＬＢ培地で一晩培養し、プラスミドを回収した後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ（ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）で切断して、約０．７Ｋｂのヒト化抗体の軽鎖全体遺伝子を、電気泳動を通じて確認した。

前記のような方法によって製造したヒト化抗体の軽鎖全体をコードする遺伝子をＬＦＷ２２−３１ＬＦと名付けた。また、前記遺伝子ＬＦＷ２２−３１ＬＦが挿入されたヒト化抗体の軽鎖発現ベクターをｐＨＡＢＬＦＷ２２−３１ＬＦと名付け（図４参照）、これを用いてＥ．ｃｏｌｉＴＯＰ１０Ｆ'を形質転換させた細胞株を２００３年１０月２９日付でKorean Collection for Type Cultures（ＫＣＴＣ）に寄託した（寄託番号:ＫＣＴＣ１０５３２ＢＰ）。

同様に、実施例３で製造したヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子ＬＦＷ２２−３１２に対しても前記と同様な方法によって、ヒト抗体の軽鎖不変領域をコードする遺伝子が連結されたヒト化抗体の軽鎖全体をコードする遺伝子を製造し、これをＬＦＷ２２−３１２ＬＦと名付けた。また、前記遺伝子ＬＦＷ２２−３１２ＬＦが挿入されたヒト化抗体の軽鎖発現ベクターをｐＨＡＢＬＦＷ２２−３１２ＬＦと名付け（図４参照）、これを用いてＥ．ｃｏｌｉＴＯＰ１０Ｆ'を形質転換させた細胞株を２００３年１１月２５日付でKorean Collection for Type Cultures（ＫＣＴＣ）に寄託した（寄託番号:ＫＣＴＣ１０５５３ＢＰ）。

実施例５
ヒト化抗体のＣＨＯ細胞への形質転換
動物細胞でのヒト化抗体の活性を測定するために、前記実施例２及び実施例４でそれぞれ製造した重鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＨＦＷ１４１ＨＦ及び軽鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＬＦＷ２２−３１ＬＦを用いて、ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−９０９６、米国）を形質転換させた。

まず、ＣＨＯ細胞を培養するために、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＪＲＨ社、米国）に１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム（ＳｏｄｉｕｍＢｉｃａｒｂｏｎａｔｅ、Ｓｉｇｍａ社、米国）、１０％子牛血清（ｈｅａｔｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄＦＢＳ、ＧｉｂｏＢＲＬ、米国）を添加した培養培地を利用した。５％二酸化炭素が供給された３７℃培養器（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄＣＯ_２ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で２日〜３日間前記細胞を培養した後、常温（２５℃）で１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞を回収した。次に回収したＣＨＯ細胞を０．４％トリパンブルー（ｔｒｙｐａｎｂｌｕｅ、ＧｉｂｏＢＲＬ、米国）溶液で染色し、ヘマトサイトメーター（ｈｅｍａｔｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を用いて細胞の数を測定し、約６ｘ１０^６個の細胞をＴ−２２５フラスコ（または、Ｔ−７５フラスコ）に移して再び継代培養した。

前記継代培養したＣＨＯ細胞をフラスコ表面の約６０−９０％を占めるまで充分に増殖させた後、形質転換する遺伝子１０ｕｇと形質転換溶液であるジンポーター（ＧｅｎｅＰｏｔｅｒ）溶液４０μｌをＤＭＥＭ／Ｆ１２（ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍ、無血清）培地５ｍｌに混ぜて混合した。前記混合液を常温で１０乃至４５分間放置した後、培養液を除去した細胞とともに３７℃の培養基（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄＣＯ_２ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で約３乃至５時間培養して、形質転換体を得、これをＣＨＯ−ＹＨＢ１１１０−１３と名付けた。

同様に、前記実施例２及び実施例４でそれぞれ製造した重鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＨＦＷ１４１ＨＦ及び軽鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＬＦＷ２２−３１２ＬＦを前記と同様な方法によって、ＣＨＯ細胞を形質転換させて形質転換体を得、これをＣＨＯ−ＹＨＢ１１１０−１５と名付けた。

実施例６
ヒト化抗体の精製
前記実施例５で得た形質転換体ＣＨＯ−ＹＨＢ１１１０−１３を培養してヒト化抗体遺伝子を発現させた。具体的に、細胞培養はＴ−７５フラスコに２ｘ１０^６個の細胞を接種し、１０％子牛血清が含有されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で培養した。前記の細胞培養液を回収して遠心分離した後、濾過して抗体が含まれた培養液のみを精製した。

また、培養液から抗体のみを精製するために、蛋白質−Ａ（ｐｒｏｔｅｉｎＡ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）とヤギ抗ヒト免疫グロブリンＧ（ｇｏａｔ−ａｎｔｉｈｕｍａｎＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧ、Ｚｙｍａｄ社）が結合されているセファロ−ス４Ｂ（ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ）を用いた。抗体を蛋白質−Ａと結合させるために抗体が発現された前記の細胞培養液を蛋白質−Ａが結合されたカラム（ｃｏｌｕｍｎ）に通過させた後、ｐＨ２．５のグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）緩衝液をカラムに導入しヒト化抗体を溶出した。その後、１ＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）緩衝液を前記抗体回収液の１／１０体積で添加して溶出液を中和した。中和した溶出液をヤギ抗ヒト免疫グロブリンＧが結合されているセファロ−ス４Ｂ前記に適用し、ヒト化抗体蛋白質を特異的に捕獲した。

ヒト化抗体は、前記蛋白質−Ａカラムクロマトグラフィ−を用いる同様な方法を用いてヒト化抗体をさらに精製し、ＹＨＢ１１１０−１３と名付けた。

同様に、前記と同様な方法によって実施例５で得た形質転換体ＣＨＯ−ＹＨＢ１１１０−１５を培養し、培養上清から抗体を精製することによりヒト化抗体ＹＨＢ１１１０−１５を得た。

精製されたヒト化抗体のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った結果、５０キロダルトン（ＫＤａ）および２５キロダルトン（ＫＤａ）バンドが観察され、それらは、それぞれヒト化抗体の重鎖および軽鎖として同定された（図５参照）。

実施例７
ヒト化抗体のＨＢＶＳ−表面抗原に対する抗原結合親和力測定
実施例６で精製したヒト化抗体をサンドイッチＥＬＩＳＡ（ｓａｎｄｗｉｃｈＥＬＩＳＡ）方法を用いて定量し、Ｓ−表面抗原（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＥｎｚｙｍｅ社、米国）エイデ−アル型（ａｄｒｔｙｐｅ）を用いて、その抗原結合活性を分析した。抗体を定量するために、マイクロプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ社、米国）の各ウェルにヤギ抗ヒト免疫グロブリンＧ．Ａ．Ｍ（ｇｏａｔ−ａｎｔｉｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＧ．Ａ．Ｍ、Ｚｙｍｅｄ社、米国）を１００ｎｇずつ入れて４℃で一晩反応させコーティングした。この時、マウスモノクローン抗体（Ａ９−１１−５）を対照として用いた。

次に、ＨＢＶＳ−表面抗原に対する抗体の親和力を測定するために様々な濃度（１０^-１１乃至１０^-６Ｍ）の抗原溶液（各１００μｌ）に５ｎｇのマウスモノクローン抗体（Ａ９−１１−５）、ヒト化抗体ＹＨＢ１１１０−１３及びＹＨＢ１１１０−１５をそれぞれ混ぜた後、３７℃で１時間反応させ、０.５ｕｇの抗原がコーティングされているプレートの各ウェルに添加して３７℃で約２時間放置した。次に、各ウェルに西洋わさび過酸化分解酵素（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合されたヤギ抗−ヒトポリクローン抗体（ｇｏａｔａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ、ＢｉｏＲａｄ社、米国）を１，０００倍希薄して１００μｌずつ加えて３７℃で１時間反応させた後、西洋わさび過酸化分解酵素基質キット（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｓｕｂｓｔｒａｔｅｋｉｔ、ＢｉｏＲａｄ社、米国）で発色させて吸光度を測定した。

前記で測定した吸光度から、抗原に結合した抗体と結合していない抗体の濃度を換算して抗体の抗原に対する親和度を測定し（Ｆｒｉｇｕｅｔ、ｅｔａｌ．１９８５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．７７、３０５−３１９）、その結果を表５に示した。

上記の表５に記述されたように、本実施例のヒト化抗体ＹＨＢ１１１０−１３の抗原結合親和度はマウスモノクローン抗体（Ａ９−１１−５）の抗原結合親和度とほぼ同等な水準であることを確認した（図６参照）。

ＨＢＶＳ−表面抗原に対するマウスモノクローン抗体の重鎖（Ａ９−１１−５）、ヒト化抗体の重鎖（ＨＦＷ１４１）及びヒト抗体の重鎖サブグループ２番（Ｈｈ２）のアミノ酸配列を比較して示した図である。ＨＢＶＳ−表面抗原に対するマウスモノクローン抗体の軽鎖（Ａ９−１１−５）、ヒト化抗体の軽鎖（ＬＦＷ２２−３１及びＬＦＷ２２−３１２）及びヒト抗体の軽鎖サブグループ７番（ｈＶ７）のアミノ酸配列を比較して示した図である。ヒト化抗体重鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＨＦＷ１４１ＨＦを製造する過程を図式化した図である。ヒト化抗体軽鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＬＦＷ２２−３１ＬＦ及びｐＨＡＢ−ＬＦＷ２２−３１２ＬＦを製造する過程の図式化した図である。動物細胞で生産及び精製された本発明によるヒト化抗体のＳＤＳポリアクリルアマイドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ｐｏｌｙａｃｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）結果を示す。レーン１はマウス抗体；レーン２はＹＨＢ−１１１０−１３；レーン３はＹＨＢ−１１１０−１５を示す。本発明によるヒト化抗体ＹＨ１１１０−１３及びＹＨＢ１１１０−１５のＨＢＶＳ−表面抗原に対する抗原結合親和度を示したグラフである。

Claims

ａ）配列番号３５のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
ｂ）配列番号３６または３７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
ｃ）ヒト抗体の重鎖不変領域と同一の重鎖不変領域；及び
ｄ）ヒト抗体の軽鎖不変領域と同一の軽鎖不変領域；
を含むＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のＳ−表面抗原に対するヒト化抗体。
ヒト化抗体の抗原結合親和度（Ｋａ）が６×１０^７〜５×１０^８Ｍ^-１であることを特徴とする請求項１に記載のヒト化抗体。
重鎖可変領域が配列番号３２の塩基配列を含むポリヌクレオチドによってコードされることを特徴とする請求項１に記載のヒト化抗体。
軽鎖可変領域が配列番号３３または配列番号３４の塩基配列を有するポリヌクレオチドによってコードされていることを特徴とする請求項１に記載のヒト化抗体。
配列番号３５の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ−表面抗原に特異的なヒト化抗体の重鎖可変領域の発現ベクター。
発現ベクターが、寄託番号：ＫＣＴＣ１０５３３ＢＰで寄託してある大膓菌細胞株に含まれるものであることを特徴とする請求項５に記載の重鎖発現ベクター。
配列番号３６または配列番号３７の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とするＢ型肝炎ウイルスのＳ−表面抗原に特異的なヒト化抗体の軽鎖可変領域の発現ベクター。
発現ベクターが、寄託番号：ＫＣＴＣ１０５３２ＢＰまたはＫＣＴＣ１０５５３ＢＰで寄託してある大膓菌細胞株に含まれるものであることを特徴とする請求項７に記載の軽鎖発現ベクター。
請求項５または請求項７の発現ベクターで形質転換された大膓菌細胞。
大膓菌細胞がＴＯＰ１０Ｆ’／ｐＨＡＢ−ＨＦＷ１４１ＨＦ（寄託番号:ＫＣＴＣ１０５３３ＢＰ）、ＴＯＰ１０Ｆ’／ｐＨＡＢ−ＬＦＷ２２−３１ＬＦ（寄託番号:ＫＣＴＣ１０５３２ＢＰ）、またはＴＯＰ１０Ｆ’／ｐＨＡＢ−ＬＦＷ２２−３１２ＬＦ（寄託番号:ＫＣＴＣ１０５５３ＢＰ）であることを特徴とする請求項９に記載の大膓菌細胞株。
請求項１乃至請求項４のいずれかに記載のヒト化抗体のいずれかを含むことを特徴とするＢ型肝炎ウイルスに関連する疾患の治療用組成物。