KR100308758B1 - Ｂ형 간염 바이러스의 표면항원 프리-ｓ2에 대한 인간화 항체 및그의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 B형 간염 바이러스 (hepatitis B virus)의 표면항원 프리-S2에 대한 인간화 항체 (humanized antibody)에 관한 것으로서, 구체적으로 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 생쥐 단일클론항체의 가변영역과 가장 유사한 사람 유전자를 이용하여 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 기존 인간화 항체 (대한민국 특허 제102173호)의 생쥐 유래의 아미노산 잔기를 감소시킴으로 인체 면역반응을 현저히 감소시킬 수 있는 HBV 프리-S2 에 대한 인간화 항체의 중쇄 (heavy chain) 유전자 및 경쇄 (light chain) 유전자, 이를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환시킨 형질전환체 그리고 상기 형질전환체를 배양하여 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 인간화 항체를 제조하는 방법으로 구성되며, 상기 과정으로 얻은 본 발명의 인간화 항체는 기존의 인간화 항체와 유사한 항원 결합능을 유지하면서 기존의 인간화 항체보다 면역유발능을 현저히 감소시킴으로 HBV 감염의 예방과 B형 만성 간염의 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

Ｂ형 간염 바이러스의 표면항원 프리-Ｓ2 에 대한 인간화 항체 및 그의 제조방법{Humanized antibody specific for HBV surface antigen pre S2 and the process for preparation thereof}
본 발명은 B형 간염 바이러스 (hepatitis B virus, 이하 ' HBV '로 약칭함)의 표면항원 프리-S2에 대한 인간화 항체 (humanized antibody)에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 본 발명은 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 생쥐 단일클론항체의 가변영역과 가장 유사한 사람 유전자를 이용하여 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 기존 인간화 항체 가변영역의 생쥐 유래의 아미노산 잔기의 일부를 사람 항체의 것으로 치환시킴으로 인체 면역반응을 현저히 감소시킬 수 있는 인간화 항체의 중쇄 (heavy chain) 유전자 및 경쇄 (light chain) 유전자, 이를 포함하는 발현 벡터, 그 형질전환체, 이들을 이용한 인간화 항체의 제조방법에 관한 것이다.
HBV 는 인체에 침입하여 만성 및 급성 간염을 일으키고 악화될 경우 간경화와 간암의 원인이 되는 병원체로서, 전세계적으로 환자가 3억명에 이르는 것으로 추산되고 있다 (Tiollais and Buenda,Sci. Am.,264, 48, 1991). HBV 피막은 3개의 단백질로 구성되는데, 구체적으로 S 항원을 포함하는 주 (major) 단백질, S 항원과 프리-S2 항원을 포함하는 중 (middle) 단백질 및 S 항원, 프리-S2 항원과 프리-S1 항원을 포함하는 대 (large) 단백질로 구성된다 (Neurath, A. R. and Kent, S. B. H.,Adv. Virus Res., 34, 65-142, 1988). 이 모든 표면항원 단백질들은 HBV 를 중화시키고 무력화하는 항체를 유도하는데, 그 중 프리-S2 항원은 55개의아미노산으로 구성되어 있으며 HBV에 대한 중화 항체가 생기도록 유도하는 작용을 한다 (Neurath, et al.,Vaccine,4, 35, 1986).
HBV 에 감염된 경우, 예를 들어 HBV 양성인 모친으로부터 태어나는 신생아나 HBV 에 노출된 의료기관 종사자들 또는 HBV 관련 간질환으로 인한 간이식 수술환자 등은 HBV 감염을 방지하기 위하여 현재까지는 HB 면역글로불린 (이하 ' HBIG '로 약칭함)을 사용하였다 (Beasley,et al.,Lancet,2, 1099, 1983; Todo,et al.,Hepatol.,13, 619, 1991). 그러나 현재 사용되고 있는 HBIG 는 혈장으로부터 추출되기 때문에, 항원에 대한 특이성 (specificity)이 낮고, 제조 과정 중 오염원에 노출될 우려가 있으며, 사람의 혈액이 계속적으로 공급되어야 하는 문제점이 있다.
상기 문제점을 해결하기 위하여 생쥐의 HBV 표면항원에 대한 단일클론항체를 사용하는 방법이 개발되었다. 생쥐 단일클론항체는 일반적으로 항원에 대한 친화도가 높고 대량 생산이 가능하지만, 사람에게 주사할 경우 체내에서 면역 반응을 유발시키는 단점이 있었다 (Shawler,et al.,J. Immunol., 135, 1530, 1985).
따라서 최근에 생쥐 유래의 단일클론항체로서 높은 친화도와 특이성을 유지하면서 인체 내에서의 면역유발능을 최대한 줄일 수 있는 방법으로 생쥐의 항원결합 부위만을 사람 항체에 이식시킨 ' 인간화 항체 '가 개발되었다. 이와 같은 인간화 항체는 유전공학적으로 대량 생산이 가능하고 유전자의 대부분을 인간화하여 인체 내에서의 면역반응을 대폭 줄일 수 있게 되었다는 장점이 있으나, 여전히 인체 내에서의 면역반응을 일으키는 부작용을 감소시켜야 하는 과제는 남아있다(Riechmann,et al.,Nature,332, 323, 1988; Nakatani,et al.,Protein Engineering,7, 435, 1994).
이에 본 발명자들은 기존의 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 인간화 항체보다 인체 면역유발능이 더욱 개선된 인간화 항체를 제조하기 위하여, HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 기존 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자로부터 더욱 인간화된 항체 경쇄 및 중쇄 유전자를 제조하고 이들을 발현 벡터에 클로닝하여 숙주세포에 형질전환시키고 이를 배양하여 얻은 인간화 항체가 기존의 인간화 항체보다 더 인간화되면서 기존의 인간화 항체와 유사한 항원결합능을 유지하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 생쥐 유래의 아미노산 잔기가 인간화되어 인체 면역유발능이 현저히 감소된 새로운 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 인간화 항체를 제공함에 그 목적이 있다.
도 1은 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 생쥐 단일클론항체 및 인간화 항체의 중쇄 아미노산 서열 및 염기 서열을 비교하여 나타낸 것이고,
도 2는 HBV 표면항원 프리-S2에 대한 기존 인간화 항체 ZP39의 중쇄 유전자를 포함하는 기존 발현 벡터 pRc/CMV-HC-S2(zp)를 주형으로 재조합 PCR 을 수행하여 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 인간화 항체 HS2(Ⅱ)의 중쇄유전자를 제작하는 과정을 개략적으로 나타낸 것이고,
도 3은 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 생쥐 단일클론항체 및 인간화 항체의 경쇄 아미노산 서열 및 염기 서열을 비교하여 나타낸 것이고,
도 4는 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 기존 인간화 항체 ZP39의 경쇄 유전자를 포함하는 기존 발현 벡터 pKC-dhfr-S2(z) 를 주형으로 재조합 PCR 을 수행하여 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 인간화 항체 HS2(Ⅱ)의 경쇄를 제작하는 과정을 개략적으로 나타낸 것이고,
도 5는 본 발명의 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 인간화 항체의 중쇄를 생산하는 발현 벡터 pCMV-HS2(Ⅱ)HC 를 나타낸 것이고,
도 6은 본 발명의 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 인간화 항체의 경쇄를 생산하는 발현 벡터 pKC-dhfr-HS2(Ⅱ)를 나타낸 것이고,
도 7은 본 발명의 인간화 항체 HS2(Ⅱ)의 항원 결합친화도를 기존 인간화 항체 ZP39 와 비교하여 나타낸 것이다.
◆ : ZP39 ▲ : HS2(Ⅱ)
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 기존의 인간화 항체보다 생쥐 유래의 아미노산 잔기들을 더욱 감소시킨 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 그리고 그들의 아미노산 서열을 제공한다.
또한, 본 발명은 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 기존의 인간화 항체보다 생쥐 유래의 아미노산 잔기들을 더욱 감소시킨 인간화 항체의 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 HBV의 표면항원 프리-S2 에 대한 인간화 항체의 경쇄 또는 중쇄 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환시킨 형질전환체 및 이를 배양하여 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 인간화 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 과정으로 제조한 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 인간화 항체는 HBV 감염의 예방 및 B형 만성 간염의 치료에 사용하는 용도를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 생쥐 단일클론항체의 가변영역과 유사한 아미노산 서열을 가지는 사람 유전자를 이용하여 가변영역의 기존 HBV 프리-S2에 대한 인간화 항체 아미노산 잔기를 더욱 인간화시킨 중쇄 및 경쇄로 이루어진 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 인간화 항체를 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 인간화 항체는 서열 13 의 아미노산 서열을 가지는 인간화 중쇄 가변영역 및 서열 14 의 아미노산 서열을 가지는 인간화 경쇄 가변영역을 포함한다.
본 발명의 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 인간화 항체를 제조하기 위하여, 우선 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 기존 인간화 항체 (대한민국 특허 제102173호)의 중쇄 및 경쇄 가변영역으로 부터 생쥐 유래의 아미노산 잔기의 일부를 사람 항체의 것으로 치환시킨 인간화 항체의 중쇄 및 경쇄 유전자를 제조한다.
우선 인간화 항체의 중쇄 유전자를 제조하기 위하여, 기존 인간화 항체의 중쇄 유전자를 포함하는 발현 벡터 pRc/CMV-HC-S2(zp) (대한민국 특허등록 제 102173호)를 주형으로 하고 서열 1 ∼ 서열 6 의 시발체를 사용하여 재조합 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 반복 수행한다. 구체적으로, 서열 1 과 서열 2, 서열 3 과 서열 4 의 시발체로 DNA 단편을 얻고 이를 서열 1 과 서열 4 의 시발체로 재조합 PCR 하여 연결한 다음 상기 합성된 단편을 서열 5 와 서열 6 의 시발체로 합성한 DNA 단편과 연결하여 서열 1 과 서열 6 의 시발체를 사용한 PCR 을 수행함으로 인간화 중쇄 유전자를 얻어 플라스미드 벡터에 클로닝하였다. 상기 과정으로 얻은 플라스미드 벡터는 pHHC-HS2(Ⅱ)로 명명하였다 (도 2참조).
본 발명의 인간화 중쇄의 가변영역은 기존의 인간화 항체의 중쇄에서 생쥐 유래의 가변영역 아미노산 잔기 3 개를 사람 항체 중쇄 DP38의 것으로 치환한 것으로 서열 13 의 아미노산 서열로 이루어진 가변영역을 포함한다 (도 1참조).도 1에서 아미노산 서열의 일부에 밑줄을 그은 부분은 앞에서 차례로 CDR1, CDR2, CDR3를 나타낸 것이다.
상기 아미노산 치환은 항원결합 친화도에 별 영향을 주지 않을 것으로 예상되는 2개의 생쥐 유래의 몇몇 프레임 워크 영역 (framework region, FR)1 아미노산 잔기와 CDR (complementarity determining region) 2의 1개 아미노산 잔기를 사람 항체의 것을 그대로 사용한 것으로 FR1 영역의 3번 아미노산 잔기 라이신 (lysine,Lys)을 글루타민 (glutamin, Gln)으로 5번 아미노산 잔기 글루탐산 (glutamic acid, Glu)을 발린 (valine, Val)으로 CDR2 영역의 61번 아미노산 잔기 글루탐산을 알라닌 (alanine, Ala)으로 치환시킨 것이다.
또한 인간화 항체의 경쇄 유전자를 제조하기 위하여, 기존 인간화 항체의 경쇄 유전자를 포함하는 발현 벡터 pKC-dhfr-S2(z) (대한민국 특허등록 제 102173호)를 주형으로 하고 서열 7 ∼ 서열 12 의 시발체를 사용하여 재조합 PCR 을 반복 수행한다. 구체적으로, 서열 7 과 서열 8, 서열 9 와 서열 10 의 시발체로 DNA 단편을 얻고 이를 서열 7 과 서열 10 의 시발체로 재조합 PCR 하여 연결한 다음 상기 합성된 단편을 서열 11 과 서열 12 의 시발체로 합성한 DNA 단편과 연결하여 서열 7 와 서열 12 의 시발체를 사용한 재조합 PCR 을 수행함으로 인간화 경쇄 유전자 를 얻어 플라스미드 벡터에 클로닝하였다. 상기 과정으로 얻은 플라스미드 벡터는 pHKC-HS2(II)로 명명하였다 (도 4참조).
본 발명의 인간화 경쇄의 가변영역은 기존의 인간화 항체의 경쇄에서 생쥐 항체 유래의 가변영역 아미노산 잔기 4개를 사람 항체 경쇄 DPK24 의 것으로 치환한 것이다. CDR1 영역의 27b번 아미노산 잔기 루이신(leucine, Leu)을 발린으로 29번 아미노산 잔기 글루타민을 아스파라진 (asparagine, Asn)으로 치환시키고 또한 CDRs 구조에 영향을 미치지 않을 것으로 생각되는 경쇄 가변영역의 FR1 4번 아미노산 잔기 루이신을 메티오닌 (methionine, Met)으로 5번 글루탐산을 트레오닌 (threonine, Thr)으로 치환시켜 줌으로써 항원친화도가 높은 인간화항체를 제조하였으며, 이는 서열 14의 아미노산 서열로 이루어진 가변영역을 포함한다 (도 3참조).도 3에서 아미노산 서열의 일부에 밑줄을 그은 부분은 앞에서 차례로 CDR1, CDR2, CDR3 를 나타낸 것이다.
본 발명은 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환시킨 형질전환체를 배양하여 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 인간화 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 인간화 중쇄 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터 pHHC-HS2(Ⅱ)로부터 인간화 중쇄 유전자를 분리하여 발현 벡터 pRc/CMV (Invitrogen사 제품)에 삽입함으로 본 발명의 인간화 중쇄를 생산하는 발현 벡터 pCMV-HS2(Ⅱ)HC 를 제작한다 (도 5참조).
또한, 인간화 경쇄 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터 pHKC-HS2(Ⅱ)로부터 인간화 경쇄 유전자를 분리하여 발현 벡터 pCMV-dhfr (KCTC 8671P)에 삽입함으로 본 발명의 인간화 경쇄를 생산하는 발현 벡터 pKC-dhfr-HS2(Ⅱ)를 제작한다 (도 6참조).
본 발명은 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 인간화 항체를 제조하기 위하여, 상기 인간화 중쇄 유전자를 포함하는 발현 벡터 pCMV-HS2(Ⅱ)HC 및 인간화 경쇄 유전자를 포함하는 발현 벡터 pKC-dhfr-HS2(Ⅱ)를 함께 숙주세포에 형질전환시켜 형질전환체를 얻은 다음 이를 배양함으로 인간화 항체를 생산한다.
상기와 같은 과정으로 얻은 인간화 항체의 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 결합능과 항원 결합 친화도를 조사한 결과, 본 발명의 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 인간화 항체는 기존의 인간화 항체와 유사한 항원결합능을 유지하면서도 기존의 인간화 항체보다 현저히 감소된 면역유발능을 나타내었다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 인간화 중쇄 유전자의 제조
본 발명의 인간화 항체의 중쇄 유전자를 제조하기 위하여, 기존 인간화 항체(대한민국 특허등록 제102173호)의 중쇄 유전자를 포함하는 발현 벡터 pRc/CMV-HC-S2(zp) (대한민국 특허등록 제102173호)를 주형으로 재조합 PCR 을 수행하였다 (도 2참조). 개선된 두 번째 인간화 항체에서는, 첫 번째 인간화 항체에서 생쥐의 프레임워크 아미노산 잔기 중 항원결합 친화도에 미미한 영향을 줄 것으로 예상되는 3번 및 5번 아미노산 잔기와 항원과의 결합에 참여하지 않을 것으로 여겨지는 CDR2의 61번 아미노산 잔기에 대해서는 사람 항체 DP38 의 것을 그대로 사용하였다. 상기와 같이 아미노산 서열의 변화를 유도한 재조합 PCR 에 이용되는 시발체는 서열 1 ∼ 서열 6 에 기술하였다.
PCR 반응은 94 ℃에서 1분, 55 ℃에서 1분, 72 ℃에서 1분으로 Taq DNA 중합효소 (polymerase)를 사용하여 30회 반복 수행하였다. 먼저, 서열 1과 서열 2, 서열 3과 서열 4, 서열 5와 서열 6 의 시발체를 사용하여 얻어진 DNA 단편들중 서열 1과 서열 2, 서열 3과 서열 4의 시발체를 사용하여 얻어진 DNA 단편들 140bp와 196bp를 어닐닝하고 다시 서열 1과 서열 4의 시발체로 재조합 PCR 하여 연결한 다음 상기 합성된 단편 (320bp)을 서열 5와 서열 6의 시발체를 사용하여 합성된 DNA 단편 (1165bp)과 서열 1과 서열 8의 시발체를 사용하여 연결하였다. 최종적으로 합성된 인간화 항체의 중쇄 유전자 (약 1428bp)를 제한효소EcoRI와SalI로 양끝을 잘라 플라스미드 벡터 pBluescript SK(＋)에 클로닝함으로 얻은 플라스미드 벡터를 pHHC-HS2(Ⅱ)로 명명하였다. 상기에서 얻은 인간화 항체의 중쇄 유전자 염기 서열은 DNA 시퀀싱 (sequencing)으로 확인하였다.
실시예 2. 인간화 경쇄 유전자의 제조
본 발명의 인간화 항체의 경쇄 유전자를 제조하기 위하여, 기존 인간화 항체의 경쇄 유전자를 포함하는 발현 벡터 pKC-dhfr-S2(z) (대한민국 특허등록 제 102173호)를 주형으로 재조합 PCR 을 수행하였다 (도 4참조). 두 번째 인간화 항체에서는 첫 번째 인간화 항체에서 생쥐의 프레임워크 아미노산 잔기 중 항원결합 친화도에 미미한 영향을 줄 것으로 예상되는 4번 및 5번 잔기와 항원과의 결합에 참여하지 않을 것으로 여겨지는 CDR1의 27b, 29번 아미노산 잔기에 대해서는 사람의 것을 그대로 사용하였다. 상기와 같은 아미노산 서열의 변화를 유도한 재조합 PCR 에 이용되는 시발체는 서열 7 ∼ 서열 12 에 기술하였다.
PCR 반응은 94 ℃에서 1분, 55 ℃에서 1분, 72 ℃에서 1분으로 30회 반복 수행하였다. 먼저 서열 7과 서열 8, 서열 9와 서열 10, 서열 11과 서열 12의 시발체를 사용하여 얻어진 DNA 단편들중 서열 7과 서열 8, 서열 9와 서열 10의 시발체를 사용하여 얻어진 DNA 단편들 84bp와 100bp를 어닐닝하고 다시 서열 7과 서열 10의 시발체로 재조합 PCR 하여 연결한 다음 상기 합성된 단편 (166bp)을 다시 서열 11과 서열 12의 시발체로 합성한 DNA단편 (697bp)과 어닐닝하고 서열 7과 서열 12 의 시발체로 연결하여 최종적으로 인간화 항체의 경쇄 유전자 (879bp)를 합성하였다. 합성된 인간화 항체의 경쇄 유전자를 제한효소HindⅢ와SalI로 양끝을 잘라 플라스미드 벡터 pBluescript SK(＋)에 클로닝함으로 얻은 플라스미드 벡터를 pHKC-HS2(II)로 명명하였다. 상기에서 얻은 인간화 항체의 경쇄 유전자의 염기 서열은 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.
실시예 3. 인간화 중쇄를 생산하는 발현 벡터의 제조
플라스미드 벡터 pHHC-HS2(II)를 제한효소EcoRI와SalI으로 잘라서 인간화 중쇄 유전자를 분리하였다. 또한, 발현 벡터 pRc/CMV (Invitrogen사 제품)를 제한효소EcoRI와SalI으로 잘라서 벡터를 분리한 다음 이에 상기에서 얻은 인간화 중쇄 유전자를 연결하여 인간화 중쇄를 생산하는 발현 벡터 pCMV-HS2(Ⅱ)HC 를 제작하였다 (도 5참조).
상기 발현 벡터 pCMV-HS2(Ⅱ)HC 는 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소유전자은행에 1998년 11월 4일자로 기탁하였다 (수탁번호: KCTC 0538 BP).
실시예 4. 인간화 경쇄를 생산하는 발현 벡터의 제조
플라스미드 벡터 pHKC-HS2(II)를 제한효소HindⅢ와SalI 로 잘라 인간화 경쇄 유전자를 분리하고 이를 발현 벡터 pCMV-dhfr (KCTC 8671P)의 제한효소HindⅢ와SalI 위치에 삽입하여 인간화 경쇄를 생산하는 발현 벡터 pKC-dhfr-HS2(Ⅱ)를 제작하였다 (도 6참조).
상기 발현 벡터 pKC-dhfr-HS2(Ⅱ)는 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1998년 11월 4일자에 기탁하였다 (수탁번호 : KCTC 0539 BP).
실시예 5. COS7 세포에서 인간화 항체의 발현
송아지 혈청이 10 % 첨가된 DMEM 배양 배지 (GIBCO사 제품)에서 37℃, 5 % 탄산가스를 유지하면서 COS7 세포를 계대 배양하였다. 상기 세포를 100 mm 접시에 1×106개 접종하고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 한편, 상기 실시예 3과 실시예 4 에서 얻은 발현 벡터 pCMV-HS2(Ⅱ)HC 및 pKC-dhfr-HS2(Ⅱ)을 각각 5 ㎍씩 OPTI MEM I 800 ㎕ 로 희석하고 50 ㎕ 리포펙타민 (Lipofectamine, GIBCO사 제품)도 OPTI MEM I 800 ㎕ 로 희석한 다음 상기 혼합물들을 15 ㎖ 튜브에 혼합하여 15분 이상 실온에서 방치하였다. 혼합물을 방치하는 사이에 전날 접종해 둔 COS7 세포를 OPTI MEM I (GIBCO사 제품)로 2회 세척하였다. 상기 DNA 와 리포펙타민 혼합물에 6.4 ㎖의 OPTI MEM I를 첨가하여 혼합하고 상기에서 세척한 COS7 세포 위에 균일하게 부어 주었다. 이를 탄산가스 항온기에서 72시간 동안 배양하고 배양액의상층액을 모아 초원심 여과장치 (Ultrafiltration Kit)로 농축한 다음 샌드위치 엘리자 (Sandwich ELISA) 방법을 이용하여 항체의 농도를 측정하였다. 이 때, 항-인간 항체 (anti-human IgG)의 전체를 포획 항체 (capture antibody)로 사용하고 농축한 배양액 또는 표준 용액 (standard protein)을 일정농도로 첨가하여 37℃, 1시간동안 반응시킨 후 항-인간 항체 (Fc-specific)에 양고추냉이 과산화수소 (horseradish peroxidase) 효소가 결합 (conjugation)된 항체를 결합시켜 492nm에서 흡광도를 측정하였다.
실시예 6. 인간화 항체의 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 결합능 조사
HBV 표면항원 프리-S2(정제된 GST-preS2 융합단백질)를 마이크로플레이트의 각 웰에 1μg씩 코팅하고, 정량된 항체의 농도에 기초하여 항체 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 7.5, 10, 20, 50ng씩을 첨가하고 항-인간 항체 (Fc-specific)에 양고추냉이 과산화수소 (horseradish peroxidase) 효소가 결합 (conjugation)된 항체를 2차 항체로 결합시키는 간접 엘리자를 수행하여 492 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 대조군으로는 기존의 인간화 항체 ZP39 (대한민국특허등록 제102173호)를 정제하여 사용하였으며, 그 결과는표 1에 나타내었다.
ZP39 항체와 본 발명의 HS2(Ⅱ) 항체의 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 결합능 (흡광도, 492nm)
첨가량 (ng) 0 0.25 0.5 1 2 3 4 5 7.5 10 20 40
ZP39 0.07 0.26 0.47 0.73 0.96 1.19 1.28 1.38 1.63 1.78 2.10 2.16
HS2(Ⅱ) 0.06 0.28 0.36 0.57 0.82 0.99 1.24 1.32 1.58 1.60 2.00 2.12
실시예 7. 인간화 항체의 항원 결합 친화도의 조사
인간화 항체의 HBV 항원에 대한 친화도를 조사하기 위하여, 경쟁적 엘리자 방법 (competitive ELISA; Ryu,et al.,J. Med. Virol.,52, 226, 1997)을 이용하여 항원 결합 친화도를 측정하였다. 먼저, 1×10-6∼ 1×10-12M 농도의 HBV 프리-S2항원(정제된 GST-pre S2 융합단백질)에 대하여 각각 HS2(II)항체와 대조군인 ZP39 항체 5 ng씩을 37 ℃에서 2시간 동안 반응시킨 다음 반응 혼합물을 96웰에 코팅되어 있는 항원과 결합시켰다. 상기 과정으로부터 HBV 프리-S2 항원과 결합한 항체의 양을 간접 엘리자에 의하여 최종적으로 측정하고 그 결과를도 7에 나타내었다. ZP39 항체와 본 발명의 HS2(Ⅱ) 항체의 항원 결합 친화도를 비교해 본 결과, ZP39 항체는 약 1.4 × 108M-1, HS2(Ⅱ) 항체는 4 × 108M-1로, HS2(Ⅱ)항체가 ZP39 항체보다 그 항원 결합 친화도가 약간 우수함을 확인하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 인간화 항체는 기존의 인간화 항체와 유사한 항원결합능을 나타내는 반면, 기존의 인간화 항체보다 아미노산 잔기가 더 인간화되어 인체 내에서 면역유발능을 현저히 감소시킬 수 있어 B형 간염 바이러스의 감염을 예방하고 만성 간염의 치료 등에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (9)

  1. 서열 13 의 아미노산 서열을 가지는 가변영역을 포함하는 인간화 중쇄로 된 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 인간화 항체.
  2. 서열 14 의 아미노산 서열을 가지는 가변영역을 포함하는 인간화 경쇄로 된 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 인간화 항체.
  3. 서열 13 의 아미노산 서열의 가변영역을 포함하는 인간화 중쇄를 암호하는 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 인간화 중쇄 유전자.
  4. 서열 14 의 아미노산 서열의 가변영역을 포함하는 인간화 경쇄를 암호하는 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 인간화 경쇄 유전자.
  5. 제 3항의 유전자를 포함하는 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 인간화 항체의 중쇄를 생산하는 발현 벡터 pCMV-HS2(Ⅱ)-HC (수탁번호 : KCTC 0538 BP).
  6. 제 4항의 유전자를 포함하는 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 인간화 항체의 경쇄를 생산하는 발현 벡터 pKC-dhfr-HS2(Ⅱ) (수탁번호 : KCTC 0539 BP).
  7. 제 5항의 발현 벡터 pCMV-HS2(Ⅱ)-HC 와 제 6항의 발현 벡터 pKC-dhfr-HS2(Ⅱ)를 이용하여 포유동물세포를 형질전환시킴으로 얻은 형질전환체
  8. 제 7항의 형질전환체를 배양하고 이로부터 HBV 표면항원 프리-S2에 대한 인간화 항체를 얻는 HBV 표면항원 프리-S2 에 대한 인간화 항체의 제조방법.
  9. 제 1항 또는 제 2항의 HBV 표면항원 프리-S2에 대한 인간화 항체를 유효성분으로 하는 B형 간염의 예방 및 치료제.
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