KR100971497B1 - 인간 종양괴사인자-알파에 특이적으로 결합하는 인간화항체 - Google Patents

인간 종양괴사인자-알파에 특이적으로 결합하는 인간화항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 종양괴사인자 알파 (human tumor necrosis factor-α; hTNF-α)에 특이적으로 결합하는 인간화 항체(humanized antibody) 및 이를 함유하는 hTNF-α 관련 질환의 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 인간화 항체는 마우스 단일클론 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변영역의 상보성 결정 부위 (CDR, complementarity determining region)를 제외한 나머지 골격 (FW, framework) 영역을 인간 항체의 중쇄 또는 경쇄로 치환함으로써 제조되며, 본래 마우스 단일클론 항체의 hTNF-α에 대한 반응성은 유지하면서도 면역반응 유발 가능성이 최소화되므로, 류마티스 관절염, 크론병, 건선성 관절염 및 강직성 척수염과 같은 hTNF-α 관련 질환의 치료에 효율적으로 사용될 수 있다.
인간화 항체, 인간 종양괴사인자 알파, 류마티스 관절염

Description

인간 종양괴사인자-알파에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 {HUMANIZED ANTIBODY SPECIFIC FOR HUMAN TUMOR NECROSIS FACTOR-α}
도 1은 인간 종양괴사인자 알파 (hTNF-α) 항원에 특이적으로 결합하는 마우스 단일 클론 항체의 중쇄 (TSK114H) 가변영역 (서열번호 47), 인간 항체의 중쇄 서브그룹 1번 (Hh1) 가변영역 (서열번호 48), 및 본 발명에 따른 인간화 항체의 중쇄 가변영역 (TNHV2, TNHV2k 및 TNHV1k; 서열번호 36 내지 38)의 아미노산 서열을 비교하여 나타낸 것이고,
도 2는 hTNF-α 항원에 특이적으로 결합하는 마우스 단일 클론 항체의 경쇄 (TSK114L) 가변영역 (서열번호 49), 인간 항체의 경쇄 서브그룹 1 (Hk1)의 가변영역 (서열번호 50), 및 본 발명에 따른 인간화 항체의 경쇄 가변영역(TNLV2 및 TNLV2d; 서열번호 39 및 40)의 아미노산 서열을 비교하여 나타낸 것이고,
도 3은 본 발명에 따른 인간화 항체의 중쇄 발현벡터 pHAB-TNHV2 HF의 제조 과정을 도식화한 것이고,
도 4는 본 발명에 따른 인간화 항체의 중쇄 발현벡터 pHAB-TNHV2k HF의 제조 과정을 도식화한 것이고,
도 5는 본 발명에 따른 인간화 항체의 중쇄 발현 벡터 pHAB-TNHV1k HF의 제 조 과정을 도식화한 것이고,
도 6은 본 발명에 따른 인간화 항체의 경쇄 발현벡터 pHAB-TNLV2 LF의 제조 과정을 도식화한 것이고,
도 7은 본 발명에 따른 인간화 항체의 경쇄 발현 벡터 pHAB-TNLV2d LF의 제조 과정을 도식화한 것이고,
도 8은 동물세포에서 생산 및 정제된 본 발명에 따른 인간화 항체의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 사진이고,
도 9는 마우스 단일클론 항체와 본 발명에 따른 인간화 항체의 hTNF-α 항원에 대한 항원 결합 친화도를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 인간 종양괴사인자 알파 (human tumor necrosis factor-α, hTNF-α)에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
hTNF-α는 약 17 kDa 단백질 서브유닛 3개로 구성된 삼량체 (Trimer)의 구조를 가지며 (Eck M. J. et al., JBC, 267; 2119-2122, 1992; Smith R. A. et al., JBC, 262; 6951-6954, 1987), 염증성 대식세포와 단핵구 등으로부터 분비되는 염증성 사이토카인 (cytokine)으로서 급성염증 또는 세포의 괴사와 세포자멸 등의 세포 반응에 있어 신호 전달자로 작용한다 (Beyaert R. et al., FEBS Lett, 340; 9-16, 1994). hTNF-α는 염증성 작용을 야기하여 조직손상, 예를 들면 연골 및 뼈의 분해 (Saklatvala J., Nature, 322; 547-549, 1986), 접착분자 유도, 혈관 내피 세포 상에서 프로응집 활성 유도 (Pober J. S. et al., J. Immunol., 136; 1680-1687, 1986), 호중구 및 림프구의 접착증가 (Pober J. S. et al., J. Immunol., 138; 3319-3324, 1987) 등을 초래한다. 또한, hTNF-α는 감염과 종양에 대한 방어기전에도 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다 (Fiers W., FEBS Lett, 285; 199-212, 1991).
hTNF-α가 관여하는 질환으로는 염증성 질환, 자가면역질환, 박테리아 등의 감염, 암 및 퇴행성 질환 등이 있다. hTNF-α는 특히 류마티스 관절염, 크론병, 건선성 관절염 및 강직성 척수염 등에서 특정 생리학적 치료의 유용한 표적이 되고 있다.
한편, hTNF-α 억제제를 이용한 류마티스성 관절염 치료의 가능성이 1990년을 전후하여 시사된 바 있다. 초기 류마티스성 관절로부터 얻어진 활액세포로부터 hTNF-α의 과발현이 관찰되었고 (Buchan G. et al., Clin Exp Immunol, 73; 449-455, 1988), 위 조건의 세포에 항 hTNF-α 단일 클론 항체를 처리한 결과 류마티스성 관절염의 병변과 관련된 사이토카인의 감소가 관찰되었다 (Butler D. M. et al., Eur Cytokine Netw, 6; 225-230, 1995). 콜라겐으로 유도된 마우스의 관절염 질환 모델에서도 항 hTNF-α 항체 또는 수용성 hTNF-α 수용체가 관절의 염증과 손상을 억제하는 결과가 보고되었다 (Piguet P. F. et al., Immunology, 77; 510-514, 1992; Wooley P. H. et al., J Immunol, 151; 6602-6607, 1993; Williams R. O. et al., Immunology, 84; 433-439, 1995). 또한, hTNF-α가 과발현되도록 형질전환된 마우스에서도 염증을 동반한 관절염이 유도되는 결과가 보고되었다 (Keffer J. et al., EMBO J, 10; 4025-4031, 1991).
이러한 결과들을 고찰하여 볼 때, hTNF-α는 관절염에 있어서 염증성 사이토카인을 조절하는 직접적인 상위 조절자로서 혹은 간접적인 조절자로서 중요한 역할을 담당한다는 것을 알 수 있다. 따라서 류마티스성 관절염의 치료 등을 위해 hTNF-α에 대한 높은 선택성과 반응성을 갖는 항체의 개발이 요구된다.
특정 항원에 대한 선택성 및 반응성이 높은 항체는 마우스의 면역을 통하여 얻는 것이 일반적이다 (Kohler G. & Milstein C., Nature, 256; 495-497, 1975). 마우스 유래의 단일 클론 항체는 제조하기가 쉽고, 항원에 대한 반응성이 높은 항체를 선별하기는 용이하나 치료제로 장기간 사용하면 마우스 항체에 대한 면역반응으로 항 마우스 항체가 형성되는 문제가 발생한다 (Dimaggio J.J. et al., Cancer Chemother Biol Response Modif, 11; 177-203, 1990).
따라서 상기의 문제점을 해결하기 위하여 항체의 항원 결합 부위를 제외한 나머지 부분을 인간 항체로 치환한 인간화 항체가 개발되었다. 현재 마우스 항체로부터 인간화 항체를 제조하는 방법으로 마우스 항체의 상보성 결정 부위 (CDR, complementarity determining region) 만을 인간 항체에 이식하는 CDR 이식 (grafting) 방법이 이용되고 있다. 이와 같은 인간화 항체는 유전자의 대부분을 인간화하였으므로 인체 내에서의 면역반응을 줄일 수 있는 장점이 있다 (Riechmann L. et al., Nature, 332; 323-327, 1988; Nakatani T. et al., Protein Engineering, 7; 435-443, 1994). 그러나, 마우스 항체의 항원과 결합하는 CDR 부위만을 인간 항체에 이식하였을 경우 마우스 항체 본래의 높은 선택성과 반응성을 상실하는 경우가 많다 (Carter P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89; 4285-4289, 1992).
이에, 본 발명자들은 기존 인간화 항체의 문제점을 해결하기 위해 노력한 결과, hTNF-α에 특이적으로 결합하는 마우스 단일 클론 항체의 항원 결합능은 그대로 유지하면서 면역반응이 최소화된, hTNF-α에 특이적으로 결합하는 인간화 항체를 개발하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 hTNF-α에 특이적으로 결합하는 인간화 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인간화 항체의 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 DNA 및 이를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 인간화 항체를 유효 성분으로 포함하는 hTNF-α 관련 질환의 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는
a) 상보성 결정 부위에 각각 하기 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역;
HYGMN WINTNTGEPRYDEEFKG YDSRGFDC
(서열번호 41 내지 43)
b) 상보성 결정 부위에 각각 하기 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역;
TASSSISYNYFH SSSNLAS HQYERSPWT
(서열번호 44 내지 46)
c) 인간 항체의 중쇄 불변영역과 동일한 중쇄 불변영역; 및
d) 인간 항체의 경쇄 불변영역과 동일한 경쇄 불변영역
을 갖는 인간 종양괴사인자 알파 (hTNF-α)에 특이적인 인간화 항체를 제공한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 인간화 항체에서, 중쇄 및 경쇄 가변영역의 CDR은 hTNF-α에 특이적으로 결합하는 마우스 단일클론 항체로부터 유래되고, 중쇄 및 경쇄 가변영역에서 CDR을 제외한 골격 영역과 중쇄 및 경쇄의 불변영역은 인간 항체로부터 유래된다. 본 발명의 인간화 항체는 항원 결합 친화도 (Kd)가 1 × 10-9 M 내지 1 × 10-13 M 인 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 인간화 항체는 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance; SPR) 방법에 의해 결정된 해리상수(Koff)가 1 × 10-6 s-1 내지 1 × 10-9 s- 1 인 것이 바람직하다.
본 발명의 인간화 항체는 중쇄 가변영역에 서열번호 41 내지 43의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하고, 경쇄 가변영역에 서열번호 44 내지 46의 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는, hTNF-α에 특이적으로 결합하는 마우스 단일클론 항체 TSK114 (기탁번호: KCTC 10514BP 및 10515BP)로부터 CDR 이식 방법에 의해 제조할 수 있다. 우선, 상기 마우스 단일클론 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자와 가장 유사한 염기 서열을 유전자은행 데이터 베이스(GenBank database)로부터 검색함으로써, 중쇄의 경우 캐뱃(Kabat)의 정의에 의한 인간 중쇄 가변영역 서브그룹 1번 (Hh1)이 마우스 단일클론 항체의 가변영역 유전자와 가장 유사하고, 경쇄의 경우 인간 경쇄 카파 가변영역 서브그룹 1번(Hk1)이 마우스 단일클론 항체의 가변영역 유전자와 가장 유사한 인간 유전자임을 확인할 수 있다 (Harris L. & Bajorath J., Protein Science, 4; 306-310, 1995).
상기에서 선정된 인간 유전자를 근거로 하여 인간화 항체의 중쇄 및 경쇄 유전자를 제조한다. 인간화 항체의 중쇄 및 경쇄 유전자의 제조 과정에서는 공지된 유전자 분석 자료 및 항체 구조분석 자료를 토대로 하여 염기 서열을 적절히 변형할 수 있으며, 항원과의 결합에 영향을 미치거나 항체 구조에 중요한 아미노산을 코딩하는 서열은 마우스 단일클론 항체 유전자 본래의 서열을 이용하는 것이 바람직하다 (Kabat E. A. et al., D.H.H.S. Publication number (NIH) 91-3242, 1991; Chothia C. et al., Nature, 342; 877-883, 1989; Studnicka G. M. et al., Protein Engineering, 7; 805-814, 1994; Harris L. & Bajorath J., Protein Science, 4; 306-310, 1995).
인간화 항체의 중쇄 가변영역 유전자는 hTNF-α에 특이적으로 결합하는 마우스 단일 클론 항체 TSK114의 중쇄 가변영역 유전자 중에서 항원과 결합하는 부분을 제외한 나머지를 인간 항체의 중쇄 서브그룹 1 (Hh1)로 치환함으로써 제조된다. 즉, 인간화 항체의 중쇄 가변영역 유전자는 마우스 단일클론 항체 TSK114의 중쇄 유전자를 주형으로 하여 인간화시킬 염기들을 선정하고, 각각에 해당하는 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction, PCR)을 수행한 후, 각 PCR 산물을 제한효소 및 DNA 리가아제 (ligase)를 이용하여 연결함으로써 제조될 수 있으며, 이렇게 제조된 인간화 항체의 중쇄 가변영역 유전자를 각각 TNHV2 (서열번호 31), TNHV2k (서열번호 32) 및 TNHV1k (서열번호 33)라고 명명한다. 중쇄 가변영역 유전자 TNHV2, TNHV2k 및 TNHV1k는 각각 서열번호 36, 37 및 38의 아미노산 서열을 코딩한다 (도 1 참조).
상기에서 제조된 인간화 항체의 중쇄 가변영역 유전자를 포함하는 인간화 항체의 중쇄 전체 유전자를 제조하기 위하여, 먼저 상기 인간화 항체의 중쇄 가변영역 유전자 TNHV2, TNHV2k 또는 TNHV1k를 적절한 벡터, 예를 들어 TOPO 벡터 (TOPO TA cloning kit, Invitrogen사, 미국)에 삽입시켜 벡터 pCR-TNHV2 Hv, pCR-TNHV2k Hv 및 pCR-TNHV1k Hv를 제조한다. pCR-TNHV2 Hv, pCR-TNHV2k Hv 또는 pCR-TNHV1k Hv로부터 인간화 항체의 중쇄 가변영역 유전자를 분리하고, 분리된 인간화 항체의 중쇄 가변영역 유전자를 인간 항체의 중쇄 불변영역 유전자가 삽입된 pHAB-HC (KCTC 10229BP, 대한민국 특허공개 제2004-12266호) 발현벡터에 삽입시켜 인간화 항체의 중쇄 발현벡터를 제조할 수 있으며, 이렇게 제조된 인간화 항체의 중쇄 발현벡터를 각각 pHAB-TNHV2 HF (기탁번호: KCTC 10691BP, 기탁일: 2004년 9월 1일), pHAB-TNHV2k HF (기탁번호: KCTC 10692BP, 기탁일: 2004년 9월 1일) 및 pHAB-TNHV1k HF (기탁번호: KCTC 10818BP, 기탁일: 2005년 6월 13일)라고 명명한다. 상기 중쇄 발현벡터 pHAB-TNHV2 HF, pHAB-TNHV2k HF 및 pHAB-TNHV1k HF로부터 인간화 항체의 중쇄 전체 유전자를 분리할 수 있으며, 분리된 인간화 항체의 중쇄 전체 유전자를 각각 TNHV2 HF, TNHV2k HF 및 TNHV1k HF라고 명명한다.
한편, 인간화 항체의 경쇄 가변영역 유전자는 hTNF-α에 특이적으로 결합하는 마우스 단일 클론 항체 TSK114의 경쇄 가변영역 유전자 중에서 항원과 결합하는 부분을 제외한 나머지를 인간 항체의 경쇄 서브그룹 1 (Hk1)로 치환함으로써 제조된다. 즉, 인간화 항체의 경쇄 가변영역 유전자는 마우스 단일클론 항체 TSK114의 경쇄 유전자를 주형으로 하여 인간화시킬 염기들을 선정하고, 각각에 해당하는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 후, PCR 산물을 제한효소 및 DNA 리가아제를 이용하여 연결함으로써 제조될 수 있으며, 이렇게 제조된 인간화 항체의 경쇄 가변영역 유전자를 TNLV2 (서열번호 34) 및 TNLV2d (서열번호 35)라고 명명한다. 경쇄 가변영역 유전자 TNLV2와 TNLV2d는 각각 서열번호 39 및 40의 아미노산 서열을 코딩한다 (도 2 참조).
상기에서 제조된 인간화 항체의 경쇄 가변영역 유전자 TNLV2 또는 TNLV2d를 포함하는 인간화 항체의 경쇄 전체 유전자를 제조하기 위하여, 상기 인간화 항체의 경쇄 가변영역 유전자 TNLV2와 TNLV2d를 적절한 벡터, 예를 들어 TOPO 벡터에 삽입시켜 pCR-TNLV2 Lv와 pCR-TNLV2d Lv를 제조한다. pCR-TNLV2 Lv와 pCR-TNLV2d Lv로부터 각각 경쇄 가변영역 유전자를 분리하고, 분리된 경쇄 가변영역 유전자를 인간 항체의 경쇄 불변영역 유전자가 삽입된 pHAB-KC (KCTC 10230BP, 대한민국 특허공개 제2004-12268호) 발현벡터에 삽입시켜 인간화 항체의 경쇄 발현벡터를 제조할 수 있으며, 이렇게 제조된 인간화 항체의 경쇄 발현벡터를 pHAB-TNLV2 LF (기탁번호: KCTC 10690 BP, 기탁일: 2004년 9월 1일) 및 pHAB-TNLV2d LF (기탁번호: KCTC 10817BP, 기탁일: 2005년 6월 13일)라고 명명한다. 상기 경쇄 발현벡터 pHAB-TNLV2 LF와 pHAB-TNLV2d LF로부터 인간화 항체의 경쇄 전체 유전자를 분리할 수 있으며, 분리된 인간화 항체의 경쇄 전체 유전자를 각각 TNLV2 LF 및 TNLV2d LF라고 명명한다.
진포터 (Gene POTER, GTS 사, 미국)와 같은 적절한 형질전환 용액을 사용하여 상기에서 제조된 인간화 항체의 중쇄 발현벡터 pHAB-TNHV2 HF 및 인간화 항체의 경쇄 발현벡터 pHAB-TNLV2 LF로 CHO 세포를 형질전환시켜 hTNF-α에 특이적인 인간화 항체를 생산하는 형질전환체를 제조할 수 있으며, 이를 CHO-YHB1406이라고 명명한다. 또한, 인간화 항체의 중쇄 발현벡터 pHAB-TNHV2k HF, 및 인간화 항체의 경쇄 발현벡터 pHAB-TNLV2 LF 또는 pHAB-TNLV2d LF를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 형질전환체를 제조할 수 있으며, 이를 CHO-YHB1411 및 CHO-YHB1411-2로 각각 명명한다. 마지막으로, 인간화 항체의 중쇄 발현벡터 pHAB-TNHV1k HF 및 인간화 항체의 경쇄 발현벡터 pHAB-TNLV2d LF를 이용하여 상기와 동일한 방법으로 형질전환체를 제조할 수 있으며, 이를 CHO-YHB1406-2라고 명명한다.
상기에서 얻은 형질전환체 CHO-YHB1406, CHO-YHB1411, CHO-YHB1411-2 또는 CHO-YHB1406-2를 배양하여 얻어진 배양액을 단백질-A (protein-A, 아머샴 바이오사이언스, 스웨덴)와 산양 항 인간 면역글로불린 G (goat anti-human immunoglobulin G, 자이매드사)로 정제함으로써 본 발명의 인간화 항체를 분리할 수 있으며, 이와 같이 분리된 인간화 항체를 각각 YHB1406, YHB1411, YHB1411-2, 및 YHB1406-2라고 명명한다.
본 발명의 인간화 항체의 항원 결합 친화도는, 예를 들어 경쟁적 효소면역측정법(competitive ELISA), 고체상 효소면역측정법(solid phase ELISA) 또는 표면 플라즈몬 공명법(surface plasma resonance)에 의해 측정할 수 있다. 그 결과, 본 발명의 인간화 항체 YHB1406, YHB1411, YHB1411-2 및 YHB1406-2는 1 × 10-9 M 내지 1 × 10-13 M의 항원 결합 친화도(Kd)를 나타내어 기존의 마우스 단일클론 항체와 유사한 항원 결합능력을 유지하는 한편, 면역반응 유발 가능성은 현저히 감소되므로 hTNF-α 관련 질환의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 인간화 항체는 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance; SPR) 방법에 의해 결정된 해리상수(Koff)가 1 × 10-6 s-1 내지 1 × 10-9 s- 1 로서 항원과 항체의 해리도가 매우 낮다.
이러한 목적으로, 본 발명의 인간화 항체를 유효성분으로서 류마티스 관절 염, 크론병, 건선성 관절염, 건선, 패혈증, 천식, 베게너 육아종증, 염증 및 강직성 척수염 등과 같은 hTNF-α 관련 질환의 치료용 약학 조성물을 제조할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제, 담체, 희석제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 단백질 의약품의 투여에 유용한 제제 형태, 예를 들어 주사제와 같은 단위 투여형 또는 수회 투여형 제제로 제형화될 수 있다. 이러한 약학 조성물은 목적하는 바에 따라 다양한 투여 경로를 통해 투여할 수 있고, 하루에 0.01 ㎎/kg 내지 1,000 ㎎/kg, 더욱 바람직하게는 0.1 ㎎/kg 내지 10 ㎎/kg의 양으로 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여 용량 수준은 사용될 특정 항체, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여 기간, 투여 방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
실시예 1: 인간화 항체의 중쇄 가변영역 유전자의 제조
hTNF-α에 특이적으로 결합하는 마우스 단일클론 항체 TSK114 (기탁번호: KCTC 10514BP 및 KCTC 10515BP)의 중쇄 가변영역 유전자를 주형으로 하고, 서열번호 1과 서열번호 14의 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 수행함으로써 리더서열이 포함된 인간화 항체의 중쇄 가변영역 유전자 A를 증폭하였다. PCR 로 증폭된 유전자 조각을 아가로즈 젤 전기영동 및 퀴아젤 추출키트 (QIAgel extraction kit, Qiagen사, 미국)를 이용하여 회수하였다.
다음으로 분리 정제된 중쇄 가변영역 유전자 A를 주형으로 하고 서열번호 1과 서열번호 7의 프라이머 쌍 및 서열번호 6과 서열번호 14의 프라이머 쌍을 이용하여 DNA 단편을 증폭한 후, 증폭된 DNA 단편들 및 서열번호 1과 서열번호 14의 프라이머 쌍을 사용하여 중첩 (overlapping) PCR을 실시하였다. 증폭된 DNA 단편을 TOPO 벡터 (TOPO TA cloning kit, Invitrogen사, 미국)와 함께 상온에서 45분 동안 반응시킨 후, 얻어진 벡터로 대장균 TOP10F'(Invitrogen사, 미국)를 형질전환시켜 형질전환체를 얻었다. 얻어진 형질전환체를 100 ㎍/㎖의 암피실린이 함유된 LB 배지에서 하룻밤 배양한 뒤 플라스미드를 회수한 다음, 제한효소 EcoRI (바이오랩사, 미국)으로 절단하여 약 450 bp의 인간화 항체의 중쇄 가변영역 유전자 B를 제조하였다.
상기 중쇄 가변영역 유전자 B를 주형으로 하고 서열번호 1과 서열번호 9의 프라이머 쌍 및 서열번호 8과 서열번호 14의 프라이머 쌍을 이용하여 DNA 단편들을 증폭한 후, 증폭된 DNA 단편들 및 서열번호 1과 서열번호 14의 프라이머 쌍을 사용하여 중첩 PCR을 실시하였다. 상기에서와 같이, 증폭된 DNA 단편을 TOPO 벡터에 클로닝하고 제한효소 EcoRI으로 절단하여 약 450 bp의 인간화 항체 중쇄 가변영역 유전자 C를 제조하였다.
상기와 동일한 방법으로, 중쇄 가변영역 유전자 C를 주형으로 하고 서열번호 1과 서열번호 11의 프라이머 쌍 및 서열번호 10과 서열번호 14의 프라이머 쌍을 이 용하여 PCR을 수행한 다음, 증폭된 DNA 단편들 및 서열번호 1과 서열번호 14의 프라이머 쌍을 사용하여 중첩 PCR을 실시한 뒤, TOPO 벡터에 클로닝하여 인간화 항체의 중쇄 가변영역 유전자 D를 얻었고, 이를 주형으로 하고 서열번호 4와 서열번호 14의 프라이머 쌍 및 서열번호 1과 서열번호 5의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행한 후, 증폭된 DNA 단편들 및 서열번호 1과 서열번호 14의 프라이머 쌍을 사용하여 중첩 PCR을 실시한 뒤, TOPO 벡터에 클로닝하여 인간화 항체의 중쇄 가변영역 유전자 E를 얻었다.
또한, 중쇄 가변영역 유전자 E를 주형으로 하고 서열번호 1과 서열번호 3의 프라이머 쌍 및 서열번호 2와 서열번호 14의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하고, 증폭된 DNA 단편들 및 서열번호 1과 서열번호 14의 프라이머 쌍을 사용하여 중첩 PCR을 실시한 뒤, TOPO 벡터에 클로닝하여 약 450 bp의 인간화 항체의 중쇄 가변영역 유전자 TNHV2 (서열번호 31)를 확보하였고, TNHV2 유전자가 삽입된 TOPO 벡터를 pCR-TNHV2 Hv 라고 명명하였다.
또한, 상기와 동일한 방법으로, 제조된 TNHV2를 주형으로 사용하고 서열번호 1과 서열번호 13의 프라이머 쌍 및 서열번호 12와 서열번호 14의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하고, 증폭된 DNA 단편들 및 서열번호 1과 서열번호 14의 프라이머 쌍을 사용하여 중첩 PCR을 실시한 뒤, TOPO 벡터에 클로닝하여 또 다른 인간화 항체의 중쇄 가변영역 유전자를 제조하였으며, 이를 TNHV2k (서열번호 32)라고 명명하였고, TNHV2k 유전자가 삽입된 TOPO 벡터를 pCR-TNHV2k Hv라고 명명하였다.
또한, 상기와 동일한 방법으로, 제조된 TNHV2k를 주형으로 사용하고 서열 번 호 1과 서열번호 15의 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하고 TOPO 벡터에 클로닝하여 또 다른 인간화 항체의 중쇄 가변 영역 유전자를 제조하였으며, 이를 TNHV1k (서열번호 33)라고 명명하였고, TNHV1k 유전자가 삽입된 TOPO 벡터를 pCR-TNHV1k Hv라고 명명하였다.
상기 PCR 반응에서 사용된 프라이머 및 PCR 조건을 하기 표 1에 기술하였다. 각각의 PCR 반응은 95℃에서 7분 동안 전처리한 후, 하기 표 1의 각 조건에 따라 30회 반복 수행한 다음, 72℃에서 10분 동안 반응을 종결시켰다.
Figure 112005077752726-pat00001
실시예 2: 인간화 항체의 중쇄 전체 유전자 및 발현벡터의 제조
실시예 1에서 제조된 pCR-TNHV2 Hv 벡터의 중쇄 가변영역 유전자를 이용하여 인간화 항체의 중쇄 전체 유전자를 제조하기 위하여, 인간 항체의 중쇄 불변영역 유전자가 삽입된 pHAB-HC (KCTC 10229BP, 대한민국 특허공개 제2004-0012266호) 벡터를 사용하였다.
먼저, 인간화 항체의 중쇄 가변영역 유전자 TNHV2를 벡터 pHAB-HC에 삽입하기 위하여, 실시예 1에서 제조된 벡터 pCR-TNHV2 Hv를 제한효소 HindIII/ApaI (바이오렙사, 미국)과 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 절단한 다음 1.5 % 아가로스 젤 전기영동과 에티디움 브로마이드 (etidium bromide, EtBr) 염색을 통하여 약 450 bp의 유전자 조각을 확인하였다.
마찬가지로, 벡터 pHAB-HC를 제한효소 HindIII/ApaI로 절단하여 약 6.5 Kb의 절단된 벡터를 확인하였다. 그 후, 각각의 유전자 조각을 퀴아젤 추출키트 (QIAgel extraction kit, Qiagen사, 미국)를 이용하여 회수한 다음, T4 DNA 연결효소 (DNA ligase, 바이오랩사, 미국)를 이용하여 16℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 후, 대장균 TOP10F'를 형질전환시켜 형질전환체를 얻었다. 얻어진 형질전환체를 100 ㎍/㎖의 암피실린이 함유된 LB 배지에서 하룻밤 배양한 뒤 플라스미드를 회수한 다음, 제한효소 HindIII/NotI (바이오랩사, 미국)으로 절단하여 인간화 항체의 중쇄 가변영역 유전자 TNHV2와 인간 항체의 중쇄 불변영역 유전자가 연결된 약 1.4 Kb의 인간화 항체의 중쇄 전체 유전자를 전기영동을 통하여 확인하였다.
상기와 같은 방법에 따라 제조된 인간화 항체의 중쇄 전체 유전자를 TNHV2 HF라고 명명하였다. 또한, 상기 인간화 항체의 중쇄 전체 유전자 TNHV2 HF가 삽입된 인간화 항체의 중쇄 발현벡터를 pHAB-TNHV2 HF라고 명명하였으며 (도 3), 이를 이용하여 대장균 TOP10F'를 형질전환시킨 세포주를 2004년 9월 1일자로 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC)에 기탁하였다 (기탁번호: KCTC 10691BP).
마찬가지로, 실시예 1에서 제조된 인간화 항체의 중쇄 가변영역 유전자 TNHV2k와 TNHV1k에 대하여도 상기와 동일한 방법에 따라 인간 항체의 중쇄 불변영역 유전자가 연결된 인간화 항체의 중쇄 전체 유전자를 제조하였으며, 이를 각각 TNHV2k HF 및 TNHV1k HF로 명명하였다. 또한, 상기 유전자 TNHV2k HF 또는 TNHV1k HF가 삽입된 인간화 항체의 중쇄 발현벡터를 pHAB-TNHV2k HF 및 pHAB-TNHV1k HF로 명명하였으며 (도 4 및 도 5), 이를 이용하여 대장균 TOP10F'를 형질전환시킨 세포주를 2004년 9월 1일자와 2005년 6월 13일자로 각각 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC)에 기탁하였다 (기탁번호: KCTC 10692BP 및 KCTC 10818BP).
실시예 3: 인간화 항체의 경쇄 가변영역 유전자의 제조
hTNF-α에 특이적으로 결합하는 마우스 단일클론 항체 TSK114(기탁번호: KCTC 10514BP 및 KCTC 10515BP)의 경쇄 가변영역 유전자를 주형으로 하고 서열번호 16과 서열번호 30의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행함으로써 리더서열이 포함된 인간화 항체의 경쇄 가변영역 유전자 A를 얻었다. 이를 아가로즈 젤 전기영동 및 에티디움 브로마이드(EtBr) 염색을 통하여 확인하였고, 퀴아젤 추출키트 (QIAgel extraction kit)를 이용하여 회수하였다.
다음으로 분리 정제된 경쇄 가변영역 유전자 A를 주형으로 하고 서열번호 16과 서열번호 25의 프라이머 쌍 및 서열번호 24와 서열번호 30의 프라이머 쌍을 이용하여 DNA 단편을 증폭한 후 증폭된 DNA 단편들 및 서열번호 16과 서열번호 30의 프라이머 쌍을 사용하여 중첩 PCR을 실시하였다. 증폭된 DNA 단편을 TOPO 벡터와 함께 상온에서 45분 동안 반응시킨 후, 얻어진 벡터로 대장균 TOP10F'를 형질전환시켜 형질전환체를 얻었다. 얻어진 형질전환체를 100 ㎍/㎖의 암피실린이 함유된 LB 배지에서 하룻밤 배양한 뒤 플라스미드를 회수한 다음, 제한효소 EcoRI로 절단하여 약 400 bp의 인간화 항체의 경쇄 가변영역 유전자 B를 제조하였다.
상기 경쇄 가변영역 유전자 B를 주형으로 하고 서열번호 26과 서열번호 30의 프라이머 쌍 및 서열번호 16과 서열번호 27의 프라이머 쌍을 이용하여 증폭한 후, 증폭된 DNA 단편들 및 서열번호 16과 서열번호 30의 프라이머 쌍을 사용하여 중첩 PCR을 실시하였다. 상기와 같이 증폭된 DNA 단편을 TOPO 벡터로 클로닝하고, 제한효소 EcoRI로 절단하여 약 400 bp의 인간화 항체의 경쇄 가변영역 유전자 C를 제조하였다.
상기와 동일한 방법으로, 경쇄 가변영역 유전자 C를 주형으로 하고, 서열번호 16와 서열번호 23의 프라이머 쌍 및 서열번호 22와 서열번호 30의 프라이머 쌍을 이용한 PCR로 증폭한 후, 증폭된 DNA 단편들 및 서열번호 16과 서열번호 30의 프라이머 쌍을 사용하여 중첩 PCR을 실시한 뒤, TOPO 벡터로 클로닝하여 인간화 항체의 경쇄 가변영역 유전자 D를 제조하였다.
인간화 항체의 경쇄 가변영역 유전자 E는 경쇄 가변영역 유전자 D를 주형으로 하고, 서열번호 18과 서열번호 30의 프라이머 쌍 및 서열번호 16과 서열번호 19의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 증폭한 후, 증폭된 DNA 단편들 및 서열번호 16과 서열번호 30의 프라이머 쌍을 사용하여 중첩 PCR을 실시한 뒤, TOPO 벡터로 클로닝하여 제조하였다.
인간화 항체의 경쇄 가변영역 유전자 F는 경쇄 가변영역 유전자 E를 주형으로 하고, 서열번호 20과 서열번호 30의 프라이머 쌍 및 서열번호 16과 서열번호 21의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 증폭한 후, 증폭된 DNA 단편들 및 서열번호 16과 서열번호 30의 프라이머 쌍을 사용하여 중첩 PCR을 실시한 뒤, TOPO 벡터로 클로닝하여 제조하였다.
또한, 상기 경쇄 가변영역 유전자 F를 주형으로 하고, 서열번호 28과 서열번호 30의 프라이머 쌍 및 서열번호 16과 서열번호 29의 프라이머 쌍을 이용하여 증폭한 후, 증폭된 DNA 단편들 및 서열번호 16과 서열번호 30의 프라이머 쌍을 사용하여 중첩 PCR을 실시하여 인간화 항체의 경쇄 가변영역 유전자를 얻어 TNLV2 (서열번호 34)로 명명하였고, TNLV2 유전자가 삽입된 TOPO 벡터를 pCR-TNLV2 Lv라고 명명하였다.
또한, 상기와 동일한 방법으로, 제조된 TNLV2를 다시 주형으로 사용하고 서열번호 16과 서열번호 17의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR하였다. 생성된 단편 (표 2의 14번 PCR 산물)을 메가프라이머 (Megaprimer)로 서열번호 30의 프라이머와 함께 PCR하여 인간화 항체 경쇄 가변영역 유전자를 얻어 TNLV2d (서열번호 35)로 명명하였고, TNLV2d 유전자가 삽입된 TOPO 벡터를 pCR-TNLV2d Lv라고 명명하였다.
상기 PCR 반응에서 사용된 프라이머 및 PCR 조건을 하기 표 2에 기술하였다. 각각의 PCR 반응은 95℃에서 7분 동안 전처리한 후, 하기 표 2의 각 조건에 따라 30회 반복 수행한 다음, 72 ℃에서 10분 동안 반응을 종결시켰다.
Figure 112005077752726-pat00002
실시예 4: 인간화 항체의 경쇄 전체 유전자 및 발현벡터의 제조
실시예 3에서 제조된 pCR-TNLV2 Lv 벡터의 인간화 항체의 가변영역 유전자를 인간화 항체의 전체 유전자로 제조하기 위하여, 인간 항체의 경쇄 불변영역 유전자가 삽입된 pHAB-KC (KCTC 10230BP, 대한민국 특허공개 제2004-0012268호) 발현벡터를 사용하였다.
먼저, 상기 인간화 항체의 경쇄 가변영역 유전자 TNLV2를 발현벡터 pHAB-KC에 삽입하기 위하여, pCR-TNLV2 Lv를 제한효소 HindIII/BsiWI (바이오랩사, 미국)과 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 절단한 다음 1.5 % 아가로스 젤 전기영동과 에티디움 브로마이드 염색을 통하여 약 400 bp의 유전자 조각을 확인하였다.
마찬가지로 경쇄 발현벡터 pHAB-KC도 제한효소 HindIII/BsiWI로 절단하여 약 5.6 Kb의 절단된 발현벡터를 확인하였다. 그 후, 각각의 유전자 조각을 퀴아젤 추출키트 (Qiagen사. 미국)를 이용하여 회수한 다음, T4 DNA 연결효소 (DNA ligase, 바이오랩사, 미국)를 이용하여 16℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 후, 대장균 TOP10F'를 형질전환시켜 형질전환체를 얻었다. 얻어진 형질전환체를 100 ㎍/㎖의 암피실린이 함유된 LB 배지에서 하룻밤 배양한 뒤 플라스미드를 회수한 다음, 제한효소 HindIII/NotI (바이오랩사, 미국)로 절단하여 인간화 항체의 경쇄 가변영역 유전자 TNLV2와 인간 항체의 경쇄 불변영역 유전자가 연결된 약 0.7 Kb의 인간화 항체의 경쇄 전체 유전자를 전기영동을 통하여 확인하였다.
상기와 같은 방법에 따라 제조된 인간화 항체의 경쇄 전체 유전자를 TNLV2 LF로 명명하였다. 또한, 상기 유전자 TNLV2 LF가 삽입된 인간화 항체의 경쇄 발현벡터를 pHAB-TNLV2 LF로 명명하였으며 (도 6), 이를 이용하여 대장균 TOP10F'를 형질전환시킨 세포주를 2004년 9월 1일자로 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC)에 기탁하였다 (기탁번호: KCTC 10690BP).
마찬가지로, 실시예 3에서 제조된 인간화 항체의 경쇄 가변영역 유전자 TNLV2d에 대하여도 상기와 동일한 방법에 따라 인간 항체의 경쇄 불변영역 유전자가 연결된 인간화 항체의 경쇄 전체 유전자를 제조하였으며, 이를 TNLV2d LF로 명명하였다. 또한, 상기 유전자 TNLV2d LF가 삽입된 인간화 항체의 경쇄 발현벡터를 pHAB-TNLV2d LF로 명명하였으며 (도 7), 이를 이용하여 대장균 TOP10F'를 형질전환시킨 세포주를 2005년 6월 13일자로 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC)에 기탁하였다 (기탁번호: KCTC 10817BP).
실시예 5: 인간화 항체의 CHO 세포에서의 형질전환
동물세포에서의 인간화 항체의 활성을 측정하기 위하여, 상기 실시예 2 및 실시예 4에서 각각 제조된 중쇄 발현벡터 pHAB-TNHV2 HF 및 경쇄 발현벡터 pHAB-TNLV2 LF 를 이용하여 CHO 세포 (ATCC CRL-9096, 미국)를 형질전환시켰다.
먼저 CHO 세포를 배양하기 위하여, DMEM/F12 배지 (JRH사, 미국)에 2.0 g/L의 소듐 바이카보네이트 (Sodium Bicarbonate, 시그마사, 미국) 및 10 % 송아지 혈청 (Heat inactivated FBS, Gibo BRL, 미국)을 첨가한 배양 배지를 이용하였다. 5 % 이산화탄소가 공급되는 37℃ 배양기 (humidified CO2 incubator)에서 2일 내지 3일 동안 상기 세포를 배양한 후, 상온 (25℃)에서 1,200 rpm으로 5분간 원심 분리하여 세포를 회수하였다. 다음으로 회수된 CHO 세포를 0.4 % 트리판블루 (trypan blue, Gibo BRL, 미국) 용액으로 염색하고 헤마토사이토미터 (hematocytometer)를 이용하여 세포의 수를 측정하였으며, 약 3 x 105개의 세포를 T-75 플라스크에 옮겨 다시 계대 배양하였다.
상기 계대 배양된 CHO 세포를 플라스크 표면의 약 60 내지 90 % 정도로 충분히 증식시킨 다음, 형질전환할 경쇄 및 중쇄 유전자 각각 10 ㎍씩과 형질전환 용액인 진포터 (GenePoter, GTS 사, 미국) 용액 80 ㎕를 DMEM/F12 (serum-free medium, 무혈청) 배지 5 ㎖에 섞어 혼합하였다. 상기 혼합액을 상온에서 10 내지 45분간 방치 후, 배양액을 제거한 세포와 함께 37℃ 배양기 (humidified CO2 incubator)에서 약 3 내지 5시간 동안 배양하여 형질전환체를 얻었으며, 이를 CHO-YHB1406이라고 명명하였다.
마찬가지로, 상기 실시예 2 및 실시예 4에서 각각 제조된 중쇄 발현벡터 pHAB-TNHV2k HF 및 경쇄 발현벡터 pHAB-TNLV2 LF, 중쇄 발현벡터 pHAB-TNHV2k HF 및 경쇄 발현벡터 pHAB-TNLV2d LF, 그리고 중쇄 발현벡터 pHAB-TNHV1k HF 및 경쇄 발현벡터 pHAB-TNLV2d LF를 상기와 동일한 방법에 따라 각각 CHO 세포로 형질전환시켜 형질전환체를 얻었으며, 이를 각각 CHO-YHB1411, CHO-YHB1411-2 및 CHO-YHB1406-2라고 명명하였다.
실시예 6: 인간화 항체의 정제
상기 실시예 5에서 얻은 형질전환체 CHO-YHB1406을 배양하여 인간화 항체 유전자를 발현시켰다. 구체적으로, T-75 플라스크에 2 x 105개의 세포를 접종하고, 10 % 소 태아 혈청 (fetal bovine serum, FBS)이 함유된 DMEM/F12 배지에서 5% CO2, 37℃ 습윤 배양기에서 7일 동안 배양하였다. 상기 세포 배양액을 회수하고 원심분리한 후, 이를 여과하여 항체가 포함된 배양액만을 얻었다.
또한, 배양액에서 항체만을 정제하기 위하여 단백질-A (protein A, 아머샴 바이오 사이언스, 스웨덴)와 산양 항 인간 면역글로불린 G (goat anti-human Immuno globulin G, 자이매드사, 미국)가 결합되어 있는 세파로스 4 패스트 플로우 (sepharose 4 Fast flow)를 사용하였다. 항체를 단백질-A와 결합시키기 위하여 항체가 발현된 상기 세포 배양액을 단백질-A가 결합된 세파로스 4 패스트 플로우 컬럼 (column)에 통과시킨 다음, pH 2.5의 글리신 (glycine) 완충액을 통과시켜 단백질-A와 결합된 인간화 항체를 용출시켰다. 그 후, 1M Tris-Cl (pH 8.0) 완충액을 상기 항체 회수액의 1/10 부피로 첨가하여 항체 용출액의 pH를 중화시켰다. 상기에서 용출된 인간화 항체를 산양 항 인간 면역글로불린 G가 결합되어 있는 세파로스 4 패스트 플로우가 충진된 컬럼에 다시 통과시켜 항체 단백질만 특이적으로 결합되도록 하였다.
항체의 용출은 상기 단백질-A에서의 용출 방법과 동일한 방법을 사용하여 인간화 항체만을 순수 정제하였으며, 상기와 같이 정제된 인간화 항체를 YHB1406이라고 명명하였다.
마찬가지로, 실시예 5에서 얻은 형질전환체 CHO-YHB1411, CHO-YHB1411-2 및 YHB1406-2를 각각 상기와 동일한 방법에 따라 배양한 후 항체를 정제하여 인간화 항체 YHB1411, YHB1411-2 및 YHB1406-2를 얻었다.
정제된 인간화 항체의 단백질들을 10 % SDS-PAGE을 통하여 확인한 결과, 5만 달톤(Dalton) 분자량 위치의 인간화 항체의 중쇄 단백질 밴드와 2만 5천 달톤 분자량 위치의 인간화 항체의 경쇄 단백질 밴드를 각각 확인하였다 (도 8).
실시예 7: 인간화 항체의 hTNF-α에 대한 친화력 측정
실시예 6에서 정제된 인간화 항체를 경쟁적 효소면역측정법 (competitive ELISA) 방법을 이용하여 정량하고, 재조합 hTNF-α (바이오소스사, 미국)를 이용하여 그 활성을 분석하였다. 항체를 정량하기 위하여 마이크로플레이트 (다이나텍크사, 미국)의 각 웰에 산양 항-인간 면역글로불린 (goat anti-human immunoglobulin G.A.M, 자이매드사, 미국)을 100 ng씩 넣고 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켜 코팅한 다음 농도를 알고 있는 마우스 단일클론 항체 (TSK114)를 대조군으로 사용하여 항체의 양을 측정하였다.
다음으로, 재조합 hTNF-α 항원에 대한 항체의 친화력을 측정하기 위하여 여러 농도 (10-11 내지 10-7 M)의 항원 용액 (각 100 ㎕)에 5 ng의 마우스 단일클론 항체 (TSK114) 또는 인간화 항체 YHB1406, YHB1411, YHB1406-2 또는 YHB1411-2를 각각 섞은 뒤 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 다음, 0.4 ㎍의 항원이 코팅되어 있는 플레이트의 각 웰에 첨가하여 37℃에서 약 1.5시간 동안 방치하였다. 다음으로, 각 웰에 서양 고추냉이 과산화분해효소 (horseradish peroxidase)가 결합된 산양 항-인간 폴리클론 항체 (goat anti-human polyclonal antibody, 바이오래드사, 미국)를 1,000배 희석하여 100 ㎕씩 가하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 서양 고추냉이 과산화분해효소 기질 키트 (horseradish peroxidase substrate kit, 바이오래드사, 미국)로 발색시켜 흡광도를 측정하였다.
상기에서 측정된 흡광도로부터 항원에 결합한 항체와 결합하지 않은 항체의 농도를 환산하여 항체의 항원에 대한 친화도를 측정하였으며 (Friguet B. et al., J. Immunol . Meth ., 77; 305-319, 1985), 그 결과를 표 3 및 도 9에 나타내었다.
Figure 112005077752726-pat00003
상기 표 3 및 도 9에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 실시예의 인간화 항체 YHB1406, YHB1411, YHB1411-2 및 YHB1406-2의 항원 결합 친화도는 마우스 단일클론 항체 TSK114의 항원 결합 친화도와 거의 동등한 수준으로 확인되었다.
실시예 8: 인간화 항체의 생체 외 ( in vitro) 항원 중화능력 시험
인간화 항체의 hTNF-α에 대한 생체 외 중화능력을 결정하기 위하여 웨이 164 세포주 (WHEI 164 cell line, ATCC CRL-1751, 미국)를 이용한 TNF-α 생체 외 항원 중화능력 시험법을 사용하였다 (Khabar KSA et al., Immunol. Lett. 46; 107-110, 1995).
마우스 단일클론 항체 TSK114, 인간화 항체 YHB1406, YHB1411, YHB1411-2 또는 YHB1406-2를 각각 다양한 농도 (0.024 ng/㎖ 내지 1.0 ug/㎖)로 PBS 완충용액에 희석하고, 상기 희석액 100 ul씩을 96 웰 세포배양 플레이트의 각 웰에 가하였다. 50 ul의 hTNF-α 용액 (100 pg/㎖)을 각 웰에 첨가한 후, 1시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 2 ㎍/ml의 악티노마이신 디(Actinomycin D, 시그마사, 미국)로 처리된 웨이 164 세포주 (1 x 106 세포/ml)를 상기 각 웰에 50 ul씩 첨가하였다.
37℃에서 24시간 동안 세포를 배양한 뒤, 각 웰에서 반응액 100 ul를 제거하고 PBS 완충용액에 5 mg/㎖로 희석된 메틸 티아졸 테트라졸리움 (methyl thiazole tetrazolium, MTT, 시그마사, 미국) 용액(20 ul)을 세포 배양 플레이트의 각 웰에 첨가하여 4시간 동안 37℃에서 발색시켰다. 발색 후 각 웰에 에스디에스 용액 (0.1 N 염산, 10 % SDS (시그마사, 미국))을 100 ul씩 넣고 발색 침전물을 완전히 용해시킨 뒤, 595 nm에서 흡광도를 측정하였다.
상기에서 측정된 흡광도로부터 항체 농도에 따른 웨이 164 세포주의 생존률 곡선을 작성하였고, 이로부터 웨이 164 세포주의 사멸을 50 % 억제하는 항체의 농도 (IC50)를 산출하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.
Figure 112005077752726-pat00004
표 4에 나타낸 것과 같이, 마우스 단일클론 항체 (TSK114)의 항원을 중화하는 항체양은 4.7 ng/㎖이고, 본 실시예의 인간화 항체 YHB1406, YHB1411, YHB1411-2 와 YHB1406-2의 항원을 중화하는 항체양은 각각 9.2 ng/㎖, 6.7 ng/㎖, 5.5 ng/㎖와 6.5 ng/㎖로서, 마우스 단일클론 항체와 인간화 항체의 생체 외 항원 중화능력이 유사한 것으로 확인되었다.
실시예 9: SPR을 이용한 인간화 항체의 hTNF-α에 대한 친화력 측정
표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance) 방법을 이용하여, 마우스 단일클론 항체와 인간화 항체의 hTNF-α에 대한 친화력을 분석하였다. 구체적으로, hTNF-α(바이오소스사, 미국)를 센서 칩 CM5 (Biacore사, 스웨덴)에 200 ug/㎖의 농도로 고정화시키고, 마우스 단일클론 항체(TSK114)와 인간화 항체(YHB1411-2)를 각각 25, 50, 100, 200 및 400 nM의 농도로 반응시켜 결합(association) 상수 및 해리(dissociation) 상수를 Biacore2000 (Biacore사, 스웨덴)을 이용하여 측정하였다.
상기에서 측정된 결합 상수 및 해리 상수로부터 항체의 항원 결합 친화도를 산출하였으며, 그 결과를 표 5에 나타내었다.
Figure 112005077752726-pat00005
상기 표 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 인간화 항체 YHB1411-2는 피코몰(10-12 M) 수준의 높은 항원 결합 친화도와 낮은 해리상수를 나타내었다. 또한, 인간화 항체 YHB1411-2의 항원 결합 친화도는 마우스 단일클론 항체 TSK114의 항원 결합 친화도보다 약 3배 높은 것으로 확인되었다.
본 발명의 hTNF-α에 특이적으로 결합하는 인간화 항체는 마우스 단일클론 항체와 유사한 항원 결합능력을 나타내면서도 면역반응유발능이 현저히 감소된 인간화 항체로서, 류마티스 관절염, 크론병, 건선성 관절염, 건선, 패혈증, 천식, 베게너 육아종증, 염증 및 강직성 척수염 환자의 치료에 사용될 수 있다.
<110> YUHAN CORPORATION <120> Humanized antibody specific for human tumor necrosis factor-alpha <130> 200512-0032 <150> KR 10-2004-0115709 <151> 2004-12-29 <160> 50 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 aaagcttatg gattgggtgt ggaacttgct attcctgatg 40 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cctggagcgt cagtcaaggt ctcctgcaag gct 33 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cttgcaggag accttgactg acgctccagg cttctt 36 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gtgaggcagg ctccaggaca gggtttagag tggatgggc 39 <210> 5 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gcccatccac tctaaaccct gtcctggagc ctgcctcacc cagtt 45 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ggacgggtta ccatgactag ggacacctct gccagcact 39 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggcagaggtg tccctagtca tggtaacccg tccctt 36 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gcctatatgg agctcagcag cctcagaagt gaggacacg 39 <210> 9 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cgtgtcctca cttctgaggc tgctgagctc catataggca gt 42 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gacacggctg tatattactg tgcaagatat gattcc 36 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 atcatatctt gcacagtaat atacagccgt gtcctc 36 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gtgaggcagg ctccaggaaa gggttta 27 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gcccatccac tctaaaccct ttcctgg 27 <210> 14 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 tgggcccttg gtggaggctg aggagactgt gacagtgg 38 <210> 15 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 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23 gagtttgggg gcggatcctg gcttctgctg ata 33 <210> 24 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 tctgggaccg atttcacttt cacaatcagc agc 33 <210> 25 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 gctgctgatt gtgaaagtga aatcggtccc aga 33 <210> 26 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 agcagcctgc agcctgaaga tattgccact tat 33 <210> 27 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 agtggcaata tcttcaggct gcaggctgct gat 33 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 ggagtcccat ctcgcttcag tggcagt 27 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 cccactgcca ctgaagcgag atgggactcc 30 <210> 30 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 gccaccgtac gtttgatttc caccttggt 29 <210> 31 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable region of humanized heavy chain, TNHV2 <400> 31 caggtccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagcgtc agtcaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata taccttcaca cactatggaa tgaactgggt gaggcaggct 120 ccaggacagg gtttagagtg gatgggctgg ataaacacca acactggaga gccaagatat 180 gatgaagagt tcaagggacg ggttaccatg actagggaca cctctgccag cactgcctat 240 atggagctca gcagcctcag aagtgaggac acggctgtat attactgtgc aagatatgat 300 tccaggggat ttgactgctg gggccaaggc accactgtca cagtctcctc a 351 <210> 32 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable region of humanized heavy chain, TNHV2k <400> 32 caggtccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagcgtc agtcaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata taccttcaca cactatggaa tgaactgggt gaggcaggct 120 ccaggaaagg gtttagagtg gatgggctgg ataaacacca acactggaga gccaagatat 180 gatgaagagt tcaagggacg ggttaccatg actagggaca cctctgccag cactgcctat 240 atggagctca gcagcctcag aagtgaggac acggctgtat attactgtgc aagatatgat 300 tccaggggat ttgactgctg gggccaaggc accactgtca cagtctcctc a 351 <210> 33 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable region of humanized heavy chain, TNHV1k <400> 33 caggtccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagcgtc agtcaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata taccttcaca cactatggaa tgaactgggt gaggcaggct 120 ccaggaaagg gtttagagtg gatgggctgg ataaacacca acactggaga gccaagatat 180 gatgaagagt tcaagggacg ggttaccatg actagggaca cctctgccag cactgcctat 240 atggagctca gcagcctcag aagtgaggac acggctgtat attactgtgc aagatatgat 300 tccaggggat ttgactgctg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a 351 <210> 34 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable region of humanized light chain, TNLV2 <400> 34 caaattgtta tgacccagtc tccatcaagc ctgtctgcat ctgtagggga acgggtcacc 60 atcacctgca ctgccagctc aagtataagt tacaattact ttcactggta tcagcagaag 120 ccaggatccg cccccaaact ctggatttat agctcatcca atctggcttc tggagtccca 180 tctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc gatttcactt tcacaatcag cagcctgcag 240 cctgaagata ttgccactta ttactgccac cagtatgagc gttccccgtg gacgttcggt 300 ggaggcacca aggtggaaat caaacgt 327 <210> 35 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable region of humanized light chain, TNLV2d <400> 35 gatattgtta tgacccagtc tccatcaagc ctgtctgcat ctgtagggga acgggtcacc 60 atcacctgca ctgccagctc aagtataagt tacaattact ttcactggta tcagcagaag 120 ccaggatccg cccccaaact ctggatttat agctcatcca atctggcttc tggagtccca 180 tctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc gatttcactt tcacaatcag cagcctgcag 240 cctgaagata ttgccactta ttactgccac cagtatgagc gttccccgtg gacgttcggt 300 ggaggcacca aggtggaaat caaacgt 327 <210> 36 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable region of humanized heavy chain, TNHV2 <400> 36 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Asp Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Asp Ser Arg Gly Phe Asp Cys Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 37 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable region of humanized heavy chain, TNHV2k <400> 37 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Asp Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Asp Ser Arg Gly Phe Asp Cys Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 38 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable region of humanized heavy chain, TNHV1k <400> 38 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Asp Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Asp Ser Arg Gly Phe Asp Cys Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 39 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable region of humanized light chain, TNLV2 <400> 39 Gln Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Asn 20 25 30 Tyr Phe His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ala Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Ser Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Glu Arg Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 40 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable region of humanized light chain, TNLV2d <400> 40 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Asn 20 25 30 Tyr Phe His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ala Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Ser Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Glu Arg Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 41 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 41 His Tyr Gly Met Asn 1 5 <210> 42 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 42 Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Asp Glu Glu Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 43 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 43 Tyr Asp Ser Arg Gly Phe Asp Cys 1 5 <210> 44 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 44 Thr Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Asn Tyr Phe His 1 5 10 <210> 45 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 45 Ser Ser Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 46 His Gln Tyr Glu Arg Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 47 <211> 117 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 47 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Asp Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Arg Arg Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Asp Ser Arg Gly Phe Asp Cys Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 48 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 49 <211> 109 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 49 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Asn 20 25 30 Tyr Phe His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Ser Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Pro Arg Ile Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Glu Arg Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 50 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Gln Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro 85 90 95

Claims (15)

  1. a) 상보성 결정 부위에 각각 하기 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역;
    HYGMN WINTNTGEPRYDEEFKG YDSRGFDC
    (서열번호 41 내지 43)
    b) 상보성 결정 부위에 각각 하기 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역;
    TASSSISYNYFH SSSNLAS HQYERSPWT
    (서열번호 44 내지 46)
    c) 인간 항체의 중쇄 불변영역과 동일한 중쇄 불변영역; 및
    d) 인간 항체의 경쇄 불변영역과 동일한 경쇄 불변영역
    을 갖는, 인간 종양괴사인자 알파 (human tumor necrosis factor-α, hTNF-α)에 특이적인 인간화 항체.
  2. 제 1 항에 있어서, 중쇄 또는 경쇄 가변영역에서 CDR을 제외한 골격 영역이 인간 항체 유래의 중쇄 또는 경쇄 서열인 인간화 항체.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 인간화 항체의 결합 친화도 (Kd)가 1 × 10-9 M 내지 1 × 10-13 M 인 것을 특징으로 하는 인간화 항체.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 인간화 항체의 SPR 방법에 의해 결정된 해리상수(Koff)가 1 × 10-6 s-1 내지 1 × 10-9 s- 1 인 것을 특징으로 하는 인간화 항체.
  5. 제 1 항에 있어서, 중쇄 가변영역이 서열번호 36, 서열번호 37 또는 서열번호 38의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 인간화 항체.
  6. 제 5 항에 있어서, 중쇄 가변영역이 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 33의 염기서열을 갖는 DNA에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 인간화 항체.
  7. 제 1 항에 있어서, 경쇄 가변영역이 서열번호 39 또는 서열번호 40의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 인간화 항체.
  8. 제 7 항에 있어서, 경쇄 가변영역이 서열번호 34 또는 서열번호 35의 염기서열을 갖는 DNA에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 인간화 항체.
  9. 서열번호 36, 서열번호 37 또는 서열번호 38의 중쇄 가변영역을 코딩하는 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 hTNF-α 항원에 특이적인 인간화 항체의 중쇄 발현벡터.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 발현벡터가 도 3에 표시된 개열지도를 갖고 세포주 TOP10F/pHAB-TNHV2 HF (기탁번호: KCTC 10691BP)로부터 수득되는 발현벡터 pHAB-TNHV2 HF, 도 4에 표시된 개열지도를 갖고 세포주 TOP10F/pHAB-TNHV2k HF (기탁번호: KCTC 10692BP)로부터 수득되는 발현벡터 pHAB-TNHV2k HF 또는 도 5에 표시된 개열지도를 갖고 세포주 TOP10F/pHAB-TNHV1k HF (기탁번호: KCTC 10818BP)로부터 수득되는 발현벡터 pHAB-TNHV1k HF 임을 특징으로 하는 중쇄 발현벡터.
  11. 서열번호 39 또는 서열번호 40의 경쇄 가변영역을 코딩하는 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는, hTNF-α 항원에 특이적인 인간화 항체의 경쇄 발현벡터.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 발현벡터가 도 6에 표시된 개열지도를 갖고 세포주 TOP10F/pHAB-TNLV2 LF (기탁번호: KCTC 10690BP)로부터 수득되는 발현벡터 pHAB-TNLV2 LF 또는 도 7에 표시된 개열지도를 갖고 세포주 TOP10F/pHAB-TNLV2d LF (기탁번호: KCTC 10817BP)로부터 수득되는 발현벡터 pHAB-TNLV2d LF임을 특징으로 하는 경쇄 발현벡터.
  13. 제 9 항 또는 제 11 항의 발현벡터로 형질전환된 대장균 세포주.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 세포주가 TOP10F/pHAB-TNHV2 HF (기탁번호: KCTC 10691 BP), TOP10F/pHAB-TNHV2k HF (기탁번호: KCTC 10692 BP), TOP10F/pHAB-TNHV1k HF (기탁번호: KCTC 10818BP), TOP10F/pHAB-TNLV2 LF (기탁번호: KCTC 10690 BP), 또는 TOP10F/pHAB-TNLV2d LF (기탁번호: KCTC 10817BP) 임을 특징으로 하는 대장균 세포주.
  15. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 인간화 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 류마티스 관절염, 크론병, 건선성 관절염, 건선, 패혈증, 천식, 베게너 육아종증, 염증 및 강직성 척수염으로 이루어진 군에서 선택되는 hTNF-α 관련 질환의 치 료용 약학 조성물.
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