CN114195887B - 乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂及其应用。该乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂由抗HBsAg人源化单克隆抗体通过共价偶联的方法连接到吸附剂载体上构建而成；所述抗HBsAg人源化单克隆抗体是将鼠源性抗HBsAg单克隆抗体的V区基因通过CDR替换技术进行人源化改造获得。该乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂综合了抗HBsAg鼠源单克隆抗体高特异性和人源化改造抗体高安全性的优点，由此在保证高抗原特异性和亲和力的前提下，能够显著降低异源性，提高该乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂在乙型肝炎病毒净化吸附领域应用的安全性，具有极大的应用潜力和价值。

Description

乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂及其应用
技术领域
本发明涉及吸附剂技术领域，尤其涉及一种乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂及其应用。
背景技术
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是嗜肝病毒家族的成员之一，属嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)。HBV感染会引发严重肝脏疾病，包括急性和慢性肝炎，并且与肝硬化，肝衰竭和原发性肝癌息息相关。目前市面上尽管有有效的保护性乙肝疫苗，但根据世界卫生组织2017年统计的数据，全世界仍有超过2.5亿人存在慢性感染，HBV感染导致全球每年约100万人死亡。2020年7月28日“世界肝炎日”的数据显示，目前我国现存乙肝病毒感染者约有7000万例，其中近九成未得到治疗。因为肝内共价闭合环状HBV DNA和整合的HBV基因组在感染的肝细胞核中稳定存在，所以感染者很难实现完全治愈。迄今为止，尚无能完全消除该病毒并为慢性HBV感染提供治疗的特异性方法和特异性药物。
乙型肝炎病毒表面抗原(Hepatitis B surface Antigen,HBsAg)是乙肝病毒外壳成分之一，是曾经感染过或正在感染乙肝病毒的标志物之一。乙肝病毒入侵人体后会在肝脏定植、繁殖，大量的表面抗原会积累在血液系统内，形成表面抗原血症。目前，乙型肝炎的治疗手段主要是药物治疗，包括核苷类似物和干扰素等，但未能达到完全治愈，暂且只能追求临床治愈，即功能性治愈。血液中存在大量的HBsAg和病毒粒子，以及高于病毒粒子1000-10000倍的亚病毒颗粒，清除这些物质有助于恢复患者针对HBV的特异性免疫应答反应，阻断这些物质对肝脏的循环感染具有重要意义。功能性治愈的主要特征表现为血清HBsAg清除，以及治愈后6个月内无法检测到HBV DNA。2019年，欧洲肝脏研究协会和美国肝病研究协会共同举办的关于临床试验设计和治疗终点会议上对慢性乙肝治疗的最终目标达成共识：追求以HBsAg清除为主要特征的功能性治愈。
乙型肝炎病毒免疫吸附是基于血液净化技术的思路，根据抗原抗体特异性结合的机理，偶联在吸附剂载体上的乙型肝炎病毒表面抗体(Hepatitis B surface Antibody,HBsAb)可以高选择性、特异性地清除人体内HBsAg的全新一代技术。
本公司一直致力于清除人体血液中肝炎病毒表面抗原吸附剂的研发。例如，申请号为CN201310059551.0的发明专利中公开了一种乙型肝炎抗原蛋白的吸附材料及其制备方法。其公开了琼脂糖凝胶与基因改造钠离子牛磺胆酸共转运多肽偶联的高分子材料，该材料以琼脂糖凝胶为载体基质，与双缩水甘油醚类偶联试剂反应后得到活性载体，然后再与融合了多肽标签的钠离子牛磺胆酸共转运多肽偶联反应而得到。申请号为CN201510140673.1的发明专利中公开了一种丙型肝炎病毒吸附剂的制备方法。该方法利用氨基酸处理连接了配基的吸附微球，使其上的配基结合更牢固，降低了丙型肝炎病毒吸附剂脱落的几率和速率。申请号为CN202010578582.7的发明专利公开了一种烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂及其制备方法。该烷基化修饰的乙肝病毒免疫吸附剂包括活化的吸附载体以及与活化的吸附载体偶联结合的烷基化修饰的乙肝病毒抗体，所述烷基化修饰是在所述乙肝病毒抗体与所述活化的吸附载体偶联后进行，用于修饰所述乙肝病毒抗体中的巯基。
1998年，我国研究者将抗HBsAg单抗偶联至壳聚糖微球，吸附剂对含HBsAg阳性血清的吸附率达44％，配基为鼠源单克隆抗体。高庆伟等制备的吸附剂在体外血浆吸附实验中对HBsAg清除率达59％，配基为血液制品来源的乙型肝炎人免疫球蛋白。韩振伟等将抗HBsAg单抗偶联至琼脂糖凝胶微球，对HBsAg的吸附率达90％，配基为鼠源单克隆抗体。上述研究所用配基为鼠源抗体或血源抗体，存在免疫原性高、来源受限、产量低等一系列问题，成为走向产业化及临床应用的一大难题。
虽然不同于常规抗体药物通过静脉注射或皮下注射的方式给药，但是，上述吸附材料存在偶联在吸附剂载体上的抗HBsAg抗体发生脱落的可能。现有技术中，虽然人源抗体(即，血源抗体)对乙型肝炎病毒表面抗原的特异性和亲和度较高，但是其存在制备成本高，制备原料和来源严重受限的技术问题，不能实现大规模量产。而目前常用的抗HBsAg单克隆抗体一般为鼠源(即，非人源)单克隆抗体，由于鼠源单克隆抗体在人体内免疫原性较强，一旦脱落的鼠抗HBsAg单克隆抗体随血液循环进入人体，将会引发严重的机体排异反应，进而影响该抗体偶联的吸附剂材料在临床应用时的安全性。
有鉴于此，有必要设计一种改进的乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂及其应用，以解决上述问题。
发明内容
针对吸附剂上的抗HBsAg单克隆抗体发生脱落导致人体引发严重的机体排异反应的技术弊端，本发明的目的在于提供一种能够降低抗体的异源性，并且使其特异性和亲和力保持不变的人源化单克隆抗体及其在制备乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂中的应用。
为实现上述发明目的，本发明提供了一种乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂，由抗HBsAg人源化单克隆抗体通过共价偶联的方法连接到吸附剂载体上构建而成；
所述抗HBsAg人源化单克隆抗体为通过CDR移植的方法对抗HBsAg鼠源单克隆抗体进行人源化改造而来。
本发明首先涉及针对乙型肝炎病毒表面抗原的鼠源单克隆抗体，该抗HBsAg鼠源单克隆抗体的六个CDR区为：
(1)重链CDR1(VHCDR1)包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
(2)重链CDR2(VHCDR2)包含如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
(3)重链CDR3(VHCDR3)包含如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；
(4)轻链CDR1(VLCDR1)包含如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；
(5)轻链CDR2(VLCDR2)包含如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；
(6)轻链CDR3(VLCDR3)包含如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
作为本发明的进一步改进，所述抗HBsAg鼠源单克隆抗体重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示序列；所述抗HBsAg鼠源单克隆抗体轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示序列。
作为本发明的进一步改进，所述抗HBsAg人源化单克隆抗体重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示序列；所述抗HBsAg人源化单克隆抗体轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示序列。
作为本发明的进一步改进，所述抗HBsAg人源化单克隆抗体的重链并不限于上述SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列，还可以为：
(1)SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸后，形成的具有同等功能的序列；
或(2)与SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列；
所述抗HBsAg人源化单克隆抗体的轻链并不限于上述SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列，还可以为：
(1)SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸后，形成的具有同等功能的序列；
或(2)与SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。
作为本发明的进一步改进，所述抗HBsAg人源化单克隆抗体与所述吸附剂载体的比例为(0.1-10)mg：1g。
作为本发明的进一步改进，所述吸附剂载体为琼脂糖、纤维素、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇中的一种。
作为本发明的进一步改进，所述乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂，对HBsAg阳性血浆中的HBsAg吸附率达到95％以上。
为实现上述发明目的，本发明还提供了一种核酸片段，其用于编码抗HBsAg人源化单克隆抗体，或者，用于编码抗HBsAg鼠源单克隆抗体；
所述抗HBsAg人源化单克隆抗体的重链可变区全长包含SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列；轻链可变区全长包含SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列；
所述抗HBsAg鼠源单克隆抗体的重链可变区全长包含SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列；轻链可变区全长包含SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。
为实现上述发明目的，本发明还提供了一种单克隆抗体，采用上述核酸片段编码得到，所述单克隆抗体为抗HBsAg人源化单克隆抗体或者用于编码抗HBsAg鼠源单克隆抗体；
所述抗HBsAg人源化单克隆抗体的重链可变区全长包含SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列；轻链可变区全长包含SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列；
所述抗HBsAg鼠源单克隆抗体的重链可变区全长包含SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列；轻链可变区全长包含SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。
作为本发明的进一步改进，所述单克隆抗体在制备检测乙型肝炎病毒诊断试剂中的应用。
作为本发明的进一步改进，所述单克隆抗体在制备抑制乙型肝炎病毒的试剂中的应用。
作为本发明的进一步改进，所述单克隆抗体在制备预防和/或治疗因乙型肝炎病毒感染引起的疾病的药物中的应用。
作为本发明的进一步改进，所述单克隆抗体在制备乙型肝炎病毒净化吸附材料中的应用。
本发明的有益效果是：
1、本发明提供的乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂中，抗HBsAg人源化单克隆抗体保留了抗HBsAg鼠源单克隆抗体的抗原亲和力和特异性，但其免疫原性低于抗HBsAg鼠源单克隆抗体，即降低了抗体的免疫原性，使得该吸附剂具备优异的吸附效率和使用安全性，有效避免现有技术中的吸附剂免疫原性过大导致引起较强人体免疫反应，进而影响其使用安全性能的技术弊端；提高该乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂在乙型肝炎病毒净化吸附领域应用的安全性，其具有极大的应用潜力和价值。
2、本发明提供的乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂，对HBsAg具备优异的吸附效率，并且其还具备优异的使用安全性。在37℃、120r/min的摇床条件下，对HBsAg阳性血浆中的HBsAg达到97.05％。本发明提供的抗HBsAg人源化单克隆抗体，相比于人血源乙型肝炎表面抗体，具备制备工艺可控，可实现大规模量产的优势，具有巨大的商业价值和临床应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例提供的抗HBsAg鼠源单克隆抗体亚型测定结果。
图2为本发明实施例提供的抗HBsAg人源化单克隆抗体的SDS-PAGE电泳检测结果。
图3为本发明实施例提供的抗HBsAg人源化单克隆抗体的相对表达量比较。
图4为本发明实施例提供的抗HBsAg人源化单克隆抗体结合活性检测结果。
图5为本发明实施例提供的抗HBsAg人源化单克隆抗体亲和力检测结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述。
在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，在附图中仅仅示出了与本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了与本发明关系不大的其他细节。
另外，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
本发明提供了一种乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂，其由抗HBsAg人源化单克隆抗体通过共价偶联的方法连接到吸附剂载体上构建而成；
所述抗HBsAg人源化单克隆抗体为通过CDR移植方法改造抗HBsAg鼠源单克隆抗体而成；
所述抗HBsAg人源化单克隆抗体的重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示序列；
所述抗HBsAg人源化单克隆抗体的轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示序列。
进一步的，所述抗HBsAg鼠源单克隆抗体的可变区结构域包含的6个CDR区为：
(1)重链CDR1(VHCDR1)包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
(2)重链CDR2(VHCDR2)包含如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
(3)重链CDR3(VHCDR3)包含如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；
(4)轻链CDR1(VLCDR1)包含如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；
(5)轻链CDR2(VLCDR2)包含如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；
(6)轻链CDR3(VLCDR3)包含如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
进一步的，所述抗HBsAg鼠源单克隆抗体的可变区结构域包括重链可变区VH和轻链可变区VL；
所述抗HBsAg鼠源单克隆抗体的重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示序列；
所述抗HBsAg鼠源单克隆抗体的轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示序列。
进一步的，所述抗HBsAg人源化单克隆抗体与所述吸附剂载体的比例为(0.1-10)mg：1g。
进一步的，所述吸附剂载体为琼脂糖、纤维素、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇中的一种。
下面就本发明提供的乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂进行进一步详细阐述。
实施例1、抗HBsAg鼠源单克隆抗体的制备
1、小鼠免疫
选择8周龄的Balb/c小鼠进行免疫，首次免疫乙型肝炎病毒表面抗原剂量为100μg/0.2mL/只。第15天按同样方式加强免疫一针，第30天采尾静脉血进行ELISA测定，抗体效价达到1:32000以上进行细胞融合。
2、脾细胞融合
颈脱位致死小鼠，在无菌条件下分离脾脏，制备脾细胞悬液，并用基础培养基洗涤2次，进行细胞计数。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按照2:1比例混合，补加DMEM基础培养基至30mL重悬。离心后弃上清，滴入1mL预热至37℃的50％PEG，1min左右加完。静置30s，再缓慢加入30mL预热至37℃的DMEM不完全培养基终止反应，加完后静置1min。离心收集细胞，加入5mL重悬饲养细胞的含2％HAT的DMEM完全培养基。将重悬起来的细胞液加入120mL的HAT完全培养基中，轻轻晃动混匀。将融合细胞铺至提前一天准备含有饲养层的96孔板上，置于二氧化碳培养箱内培养。在细胞集落长到适当大小时，吸取培养液上清进行ELISA检测。
3、杂交瘤细胞的克隆化
杂交瘤细胞的克隆化培养按有限稀释法进行，选择抗体检测阳性的杂交瘤孔细胞作适当增殖后，准确计数细胞。用完全DMEM培养液稀释成10个/mL的细胞悬液接种到已有饲养细胞的96孔培养板中，每孔0.1mL，7-10天后观察细胞生长情况，并检测上清液中抗体水平，选择5个抗体效价最高的，呈单个克隆细胞生长的培养孔，作再次克隆化培养，直至杂交瘤细胞的阳性孔率为100％。
4、腹水制备
在接种杂交瘤细胞前3-7天，Balb/c小鼠腹腔注入弗氏不完全佐剂0.5mL/只。无菌PBS溶液洗涤杂交瘤细胞，以1×106/0.5mL/只的细胞量腹腔注射到Balb/c小鼠体内。5-10天后收集腹水，离心收集上清。
5、间接ELISA测定腹水效价。
包被乙型肝炎病毒表面抗原0.5μg/mL，100μL/孔。2％BSA作为封闭液，TMB作为显色液，HRP酶标抗体作为二抗1:5000稀释后使用，A450nm读值，同时设定不包被组进行对照。将腹水从1:100开始进行倍比稀释，共稀释7个梯度，腹水稀释106倍时的OD值大于阴性对照的2.1倍，表明腹水效价已达1:1000000。结果见表1，制备的腹水与乙型肝炎病毒表面抗原反应效价高达106。
表1小鼠腹水效价
6、鼠源单克隆抗体亚类测定
将杂交瘤细胞培养上清用1×PBST以1:100稀释。然后采用proteintech公司的小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(货号PK20003)说明书进行实验，具体步骤如下：①将待测样本加入样品孔中，50μL/孔。②无需孵育，将1×羊抗鼠IgA+IgM+IgG-HRP加入样品孔中，50μL/孔，用手轻轻敲击板架两侧1min。③盖上封板膜，室温孵育1h。④弃去孔内液体，1×PBST洗板3次，吸水纸上拍干。⑤将现配的显色液加入孔中，100μL/孔。⑥室温避光显色10-20min。⑦每孔加入终止液，100μL/孔。⑧通过酶标仪读取A450nm。
抗HBsAg鼠源单克隆抗体亚型测定结果如图1所示，表明抗HBsAg鼠源单克隆抗体亚型为鼠源IgG1亚型，轻链为κ链。
实施例2、抗HBsAg人源化单克隆抗体的制备
1、抗HBsAg鼠源单克隆抗体序列测定
提取杂交瘤细胞株的总RNA，反转录成cDNA。用简并引物扩增抗体轻链和重链的可变区，采用胶回收试剂盒获得目标DNA片段，随后进行TA克隆构建重组质粒。用热激法将重组质粒转化至感受态细胞DH5α，单菌落PCR鉴定轻链和重链。挑选5个轻链和重链可变区长度正确的单菌落进行测序，5个克隆测序结果一致，则认为是抗体可变区的真实序列。
杂交瘤细胞株得到的基因序列结果：抗HBsAg单克隆抗体重链可变区编码基因序列长348bp，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的重链可变区由116个氨基酸组成，氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。抗乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体轻链可变区编码基因序列长321bp，根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的轻链可变区由107个氨基酸组成，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
2、抗体人源化改造
抗体人源化借助Chemical Computing Group(CCG)公司的分子操作环境系统(Molecular Operating Environment，MOE)完成。MOE通过分析抗体结构数据库中的抗体可变区结构，根据序列一致性和结构质量打分选用合适的FR(Framework)，根据序列相似度和构象聚类分析选用合适的loop，实现抗体建模。分析轻重链结合界面、loop支撑、与loop有直接相互作用的经典残基(canonical residues)，然后通过与人源抗体germline序列数据库进行同源比对，综合考虑一致性、相似度、经典残基、结构等因素，选择合适的germline序列进行CDR移植(CDR grafting)。
选择IGHV库中的IGHV1-46*01和IGHV1-03*01共2条V基因和1条J基因与重链CDR进行移植拼接，同时对V基因框架区中一些可能影响抗体结构的氨基酸位点设置回复突变和非回复突变两种序列版本，共得到4条不同的人源化重链可变区。
同样地，选择IGKV库中IGKV1-33*01和IGKV1-39*01共2条V基因和1条J基因与轻链CDR进行移植拼接，同时对V基因框架区中一些可能影响抗体结构的氨基酸位点设置回复突变和非回复突变两种序列版本，共得到3条人源化轻链可变区。将人源化重链和轻链可变区分别与人IgG1κ的重链和轻链恒定区融合形成完整的重链和轻链，并将4条重链和3条轻链组合，构建12种不同的人源化抗体，命名为1-12。
这12种人源化抗体的重链互补决定区的VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3的氨基酸序列分别依次为GYTFSTYW(SEQ ID NO.1)、IHPGGGNT(SEQ ID NO.2)、ARHGHYFDY(SEQ ID NO.3)，轻链互补决定区的VLCDR1、VLCDR2、VLCDR3的氨基酸序列分别依次为QDISNY(SEQ ID NO.4)、YTS(SEQ ID NO.5)、QQGDTLPFT(SEQ ID NO.6)。
3、人源化抗体表达量比较
构建含有人源化抗体基因的pTT5重组质粒，采用PEI法将重组质粒转染至HEK-293E细胞，进行无血清悬浮培养，瞬时表达人源化抗体。收集7天的细胞培养上清，经0.22μm滤膜过滤后，采用proteinA亲和层析纯化抗体。抗体超滤置换至PBS溶液，分别通过SDS-PAGE、NanoDrop 2000测定抗体的表达情况和含量。SDS-PAGE结果显示，构建的12株人源化抗体中有9株表达成功，3组未表达(见图2)，其中编号为3号、2号和12号的抗体表达量相对高于其它几组人源化抗体(见图3)。
4、人源化抗体与HBsAg的结合活性检测
采用ELISA间接法测定半数有效浓度(EC50)评价人源化抗HBsAg单克隆抗体与HBsAg结合能力。步骤简述为：①以0.5μg/mL乙型肝炎病毒表面抗原蛋白溶液为包被抗原，4℃过夜。②加入2％BSA封闭液封闭，37℃孵育2h。③加入梯度稀释抗体，37℃孵育1.5h。④加入用封闭液稀释的HRP-抗体，37℃孵育1h。⑤加显色液显色后，加入终止液终止反应，于酶标仪测定A450nm吸收值。
ELISA测定结果显示9株表达成功的人源化抗体表现出良好的结合活性，编号为8号和12号抗体结合活性优于其它7组(见图4)。该结果说明，鼠源抗体CDR与众多不同人germline抗体FR拼接后，仍可以保持较好的亲和力，表明本发明抗HBsAg抗体的CDR区具有良好的可移植性。结合表达量和结合活性等因素，优选12号抗体进行稳定转染细胞系的构建。
12号抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
12号抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
5、人源化抗体的亲和力检测
利用GE公司的Biacore 8K仪器进行表面等离子共振实验，检测抗体亲和力。人源化单克隆抗体亲和力检测结果见图5，可知抗体结合常数ka值为1.30E+071/Ms，解离常数kd值为4.68E-031/s，亲和力常数KD值为3.59E-10M。
本发明提供的上述单克隆抗体在制备检测乙型肝炎病毒诊断试剂、在制备抑制乙型肝炎病毒的试剂、在制备预防和/或治疗因乙型肝炎病毒感染引起的疾病的药物中具备巨大的应用前景。
实施例3、乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂的吸附性能检测
准备抗HBsAg鼠源单克隆抗体、抗HBsAg人源化单克隆抗体和作为吸附剂载体的琼脂糖微球，将载体分别和两种不同的配基通过化学方法偶联，制备得到乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂。
用1L生理盐水冲洗吸附剂，再称取一定质量的吸附剂于10mL离心管中，加入一定比例HBsAg阳性血浆，置于恒温37℃摇床上、120r/min振荡2h。吸附剂自然沉降30min后，吸取上清液待测。用全自动生化分析仪测定吸附前、吸附后血浆中的HBsAg含量，确定吸附效率。结果如表2所示。
表2乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂对HBsAg的吸附效率
表2表明，本发明提供的乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂在摇床条件下，对HBsAg具备优异的吸附性能。抗HBsAg人源化单克隆抗体制备的吸附剂对HBsAg吸附率达97.05％，抗HBsAg鼠源单克隆抗体制备的吸附剂对HBsAg吸附率达98.49％。
综上所述，本发明提供了一种乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂及其应用。该乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂由抗HBsAg人源化单克隆抗体通过共价偶联的方法连接到载体上构建而成；所述抗HBsAg人源化单克隆抗体基于杂交瘤细胞技术，采用CDR移植的方法对鼠源单克隆抗体进行人源化改造。该乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂综合了抗HBsAg鼠源单克隆抗体高特异性和人源化改造抗体高安全性的优点，由此在保证高抗原特异性和亲和力的前提下，能显著降低异源性，提高该乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂在乙型肝炎病毒净化吸附领域应用的安全性，具有极大的应用潜力和价值。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
SEQ ID NO.1
GYTFSTYW
SEQ ID NO.2
IHPGGGNT
SEQ ID NO.3
ARHGHYFDY
SEQ ID NO.4
QDISNY
SEQ ID NO.5
YTS
SEQ ID NO.6
QQGDTLPFT
SEQ ID NO.7
QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFSTYWMHWVKQRPGQGLEWIGDIHPGGGNTYYNERFKRKASLTVDTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARHGHYFDYWGQGTTITVSS
SEQ ID NO:.8
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGSVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTIANLEQEDIATYFCQQGDTLPFTFGSGTKLEIK
SEQ ID NO.9
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSTYWMHWVRQAPGQGLEWMGDIHPGGGNTKYNQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARHGHYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO.10
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGGAVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGDTLPFTFGPGTKVDIK
序列表
<110> 武汉瑞法医疗器械有限公司
<120> 乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂及其应用
<141> 2021-11-23
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Tyr Thr Phe Ser Thr Tyr Trp
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ile His Pro Gly Gly Gly Asn Thr
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Arg His Gly His Tyr Phe Asp Tyr
1 5
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
1 5
<210> 5
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Tyr Thr Ser
1
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Gln Gly Asp Thr Leu Pro Phe Thr
1 5
<210> 7
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile His Pro Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Arg Phe
50 55 60
Lys Arg Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Gly His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Ile
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Ser Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ala Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asp Thr Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile His Pro Gly Gly Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Gly His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Ala Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asp Thr Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105

Claims (10)

1.一种乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂，其特征在于：所述乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂由抗HBsAg人源化单克隆抗体通过共价偶联的方法连接到吸附剂载体上构建而成；
所述抗HBsAg人源化单克隆抗体为通过CDR移植的方法对抗HBsAg鼠源单克隆抗体进行人源化改造而来；
所述抗HBsAg鼠源单克隆抗体的可变区结构域包含的6个CDR区为：
（1）重链CDR1（VHCDR1）为如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
（2）重链CDR2（VHCDR2）为如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
（3）重链CDR3（VHCDR3）为如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；
（4）轻链CDR1（VLCDR1）为如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；
（5）轻链CDR2（VLCDR2）为如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列；
（6）轻链CDR3（VLCDR3）为如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂，其特征在于，
（1）所述抗HBsAg鼠源单克隆抗体的重链可变区全长序列为SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列；
（2）所述抗HBsAg鼠源单克隆抗体的轻链可变区全长序列为SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂，其特征在于，
（1）所述抗HBsAg人源化单克隆抗体的重链可变区全长序列为SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列；
（2）所述抗HBsAg人源化单克隆抗体的轻链可变区全长序列为SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂，其特征在于：所述乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂中，所述抗HBsAg人源化单克隆抗体与所述吸附剂载体的比例为（0.1-10）mg：1 g。
5.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂，其特征在于：所述吸附剂载体为琼脂糖、纤维素、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇中的一种。
6.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂，其特征在于：所述乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂，对HBsAg阳性血浆中的HBsAg吸附效率达到95%以上。
7.一种权利要求1至6中任一项权利要求所述的乙型肝炎病毒表面抗原吸附剂在乙型肝炎病毒净化吸附领域的应用。
8.一种核酸片段，其特征在于：用于编码抗HBsAg人源化单克隆抗体，或者，用于编码抗HBsAg鼠源单克隆抗体；
所述抗HBsAg人源化单克隆抗体的重链可变区全长序列为SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列；轻链可变区全长序列为SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列；
所述抗HBsAg鼠源单克隆抗体的重链可变区全长序列为SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列；轻链可变区全长序列为SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。
9.一种单克隆抗体，采用权利要求8的核酸片段编码得到，其特征在于：所述单克隆抗体为抗HBsAg人源化单克隆抗体或者抗HBsAg鼠源单克隆抗体；
所述抗HBsAg人源化单克隆抗体的重链可变区全长序列为SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列；轻链可变区全长序列为SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列；
所述抗HBsAg鼠源单克隆抗体的重链可变区全长序列为SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列；轻链可变区全长序列为SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。
10.权利要求9所述的单克隆抗体在制备检测乙型肝炎病毒诊断试剂、在制备乙型肝炎病毒净化吸附材料中的应用。
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