KR20050100414A

KR20050100414A - Ｂ형 간염바이러스의 ｓ-표면항원을 인식하는 인간화 항체및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20050100414A
Application number: KR1020040025573A
Authority: KR
Inventors: 강희일; 이병규; 박세철; 송무영; 유태형; 이재선; 김창석; 박상구; 나강인
Original assignee: 주식회사유한양행
Priority date: 2004-04-14
Filing date: 2004-04-14
Publication date: 2005-10-19
Also published as: JP2008501312A; US7435414B2; WO2005100400A1; JP4563451B2; US20060014937A1; CN1980956B; CN1980956A; KR100789645B1

Abstract

본 발명은 B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus, 이하 "HBV"라 한다)의 S-표면항원을 인식하는 인간화 항체(humanized antibody)에 관한 것으로, 보다 상세하게는 B형 간염바이러스의 S-표면항원에 대한 마우스(mouse) 항체의 가변 유전자를 인간 항체의 가변 유전자로 치환함으로서, 마우스 항체의 면역반응을 최소한으로 감소시키고 본래 마우스 항체의 HBV S-표면항원에 대한 반응성은 유지하여 B형 간염 환자의 치료에 효율적으로 사용할 수 있는 인간화 항체 유전자, 이를 포함하는 인간화 항체 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체, 그리고 상기 형질전환체를 배양함으로서 얻어지는 인간화 항체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

Ｂ형 간염바이러스의 Ｓ-표면항원을 인식하는 인간화 항체 및 이의 제조방법 {A HUMANIZED ANTIBODY AGAINST S-SURFACE ANTIGEN OF HEPATITIS B VIRUS AND A METHOD FOR PREPARING THEREOF}

B형 간염 바이러스는 대인 입자(Dane particle)로 알려진 약 42nm의 구형입자로서, 외피(outer envelope)는 다량의 B형 간염 표면항원(Hepatitis B surface antigens)을 포함하고 있고 약 180개의 B형 간염 코어 단백질(Hepatitis B core proteins)로 구성된 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)를 둘러싸고 있다. 이 뉴클레오캡시드는 HBV 유전자, 중합효소 등을 포함하고 있다(Summers et al., Proc. Nat. Acad. Sci, 72, 4579, 1975 ; Pierre Tiollais et al., Science, 213, 406-411, 1981).

HBV 유전자내에서, B형 간염 표면항원을 코딩하는 HBV 유전자 부위는 3개의 프레임상(in-frame) 개시부위를 함유하고 있으며, 이들은 모두 S-도메인(S-domain)말단의 종료코돈을 공유하고 있다. 따라서, HBV 표면항원은 (i) S-도메인만을 포함하는 소 HBV 표면항원(Small Hepatitis B Virus Surface Antigen, 이하 "S-표면항원"이라 한다), (ii) S-도메인 및 Pre-S2로 알려진 55개의 아미노산을 포함하는 중 HBV 표면항원(Middle Hepatitis B Virus Surface Antigen, 이하 "M-표면항원"이라 한다), 및 (iii) S-도메인, Pre-S2 및 Pre-S1을 포함하는 대 HBV 표면항원(Large Hepatitis B Virus Surface Antigen, 이하 "L-표면항원"이라 한다)으로 나누어진다. 이들 표면항원 중 S-표면항원은 발현되는 전체 표면항원의 약 80%이상을 차지한다.

현재 만성간염치료제로서는 인터페론 알파(interferon α)와 라미부딘 (Lamivudin)이 많이 사용되고 있으나(C. L. Lai, P. C. Wu, H.K.M.J, 3, 289-96, 1997), 인터페론 알파는 생체 내 바이러스에 대한 면역반응임에도 불구하고 독성이 강하여 사용에 따른 많은 부작용이 문제점으로 제시되고 있다. 반면 라미부딘의 경우 핵산 유도체로서 바이러스 DNA 합성효소를 억제하는 역할을 통하여 항 바이러스 작용을 하는데, 경구용으로 개발되어 치료효과가 높으나, 장기 복용시 라미부딘에 내성을 지닌 돌연변이가 출현할 가능성이 높다(Daryl T.-Y. Lau et al, Hepatology 32, 828-34, 2000). 또한, 간이식 및 수직감염의 예방용으로 현재 사용되는 인간 혈장에서 분리한 항 HBV 폴리항체의 경우 항원에 대한 특이성이 낮고, 사람의 혈액에서 분리해야 하는 등의 여러가지 단점을 가지고 있다.

상기 문제점을 해결하기 위하여 HBV 표면항원에 대한 마우스 단일클론항체를 사용하는 방법이 개발되었나, 마우스 단일클론항체를 장기간 사용하면 마우스항체에 대한 인간 항체가 형성되는 면역반응이 발생한다는 문제가 있다(Dimaggio J. J., Scheinberg D.A. et al., Cancer Chemother. Biol. Response Modif. 11, 177-203, 1990).

따라서 상기의 문제점을 해결하기 위하여 항체의 항원과 결합하는 부위만을 제외한 나머지 부분을 인간 항체로 치환한 인간화 항체가 개발되었다. 현재 사용되고 있는 마우스 항체의 인간화 항체로의 치환방법으로는 치환할 항체에 대한 가장 유사한 인간 항체 유전자를 선정하고, CDR 이식이라 불리는 방법으로 마우스 항체의 CDR 부위만을 인간 항체 CDR 위치로 치환하는 것이다. 이와 같은 인간화 항체는 유전자의 대부분을 인간화 하였으므로 인체 내에서의 면역반응을 줄일 수 있는 장점이 있다(Riechmann et al., Nature, 332, 323, 1988; Nakatani etal., Protein Engineering, 7, 435, 1994). 그러나, 획기적인 B형 간염 치료제를 개발하기 위하여는 인체내에서 일어나는 면역반응이 더욱 감소된 인간화 항체의 개발이 필요하다.

이에 본 발명자들은 B형 간염 바이러스의 S-표면항원에 대한 마우스 단일클론항체의 항체특이성은 그대로 유지하면서 마우스 항체의 가변지역을 인간 항체 유전자로 치환하여 마우스 항체에 대한 면역반응을 최소한으로 감소시킨 B형 간염 바이러스의 S-표면항원을 인식하는 인간화 항체를 개발하였다.

따라서, 본 발명은 B형 간염 바이러스의 S-표면항원을 인식하는 인간화 항체 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 B형 간염 바이러스의 S-표면항원을 인식하는 인간화 중쇄 가변영역의 아미노산 서열 및 이를 암호화 하는 인간화 중쇄 유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 B형 간염 바이러스의 S-표면항원을 인식하는 인간화 경쇄 가변영역의 아미노산 서열 및 이를 암호화 하는 인간화 경쇄 유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 B형 간염 바이러스의 S-표면항원을 인식하는 인간화 중쇄 유전자 또는 인간화 경쇄 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 본 발명자에 의해 선출원된 B형 간염바이러스의 S-표면항원에 대한 마우스(mouse) 항체 유전자 A9-11-5 (대한민국 특허공개번호 제2001-0107418호)에 대한 인간화 항체 및 이의 제조방법을 제공한다.

따라서, 본 발명은 마우스 항체의 면역반응은 최소한으로 감소시키고 본래 마우스 항체의 HBV S-표면항원에 대한 반응성은 유지하여 B형 간염 환자의 치료에 효율적으로 사용할 수 있는 인간화 항체 및 이의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 서열 35의 아미노산 서열의 가변영역을 포함하는 인간화 중쇄로 된 B형 간염바이러스의 S-표면항원에 대한 인간화 항체를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열 36 또는 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 경쇄로 된 B형 간염바이러스의 S-표면항원에 대한 인간화 항체를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열 35의 아미노산 서열의 가변영역을 암호화하는 서열 32의 염기서열을 포함하는 B형 간염바이러스의 S-표면항원에 대한 인간화 중쇄 유전자 HFW141 를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열 36의 아미노산 서열의 가변영역을 암호화하는 서열 33의 염기서열을 포함하는 B형 간염바이러스의 S-표면항원에 대한 인간화 경쇄 유전자 LFW22-31 를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열 37의 아미노산 서열의 가변영역을 암호화하는 서열 34의 염기서열을 포함하는 B형 간염바이러스의 S-표면항원에 대한 인간화 경쇄 유전자 LFW22-312 를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열 1의 염기서열을 포함하는 인간화 중쇄 리더서열 유전자 및 서열 13의 염기서열을 포함하는 인간화 경쇄 리더서열 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 인간화 중쇄 유전자 HFW141를 포함하는 B형 간염바이러스의 S-표면항원에 대한 인간화 항체의 중쇄 발현벡터 pHAB-HFW141 HF(기탁번호: KCTC 10533 BP)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 인간화 경쇄 유전자 LFW22-31를 포함하는 B형 간염바이러스의 S-표면항원에 대한 인간화 항체의 경쇄 발현벡터 pHAB-LFW22-31 LF (기탁번호: KCTC 10532 BP)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 인간화 경쇄 유전자 LFW22-312를 포함하는 B형 간염바이러스의 S-표면항원에 대한 인간화 항체의 경쇄 발현벡터 pHAB-LFW22-312(기탁번호: KCTC 10553 BP)를 제공한다.

또한, 본 발명에서는 상기 발현벡터 pHAB-HFW141 HF 와 pHAB-LFW22-31 LF를 CHO 세포로 형질전환하여 얻은 형질전환체 CHO-YHB1110-13을 제공한다.

또한, 본 발명에서는 상기 발현벡터 pHAB-HFW141 HF 와 pHAB-LFW22-312 LF를 CHO 세포로 형질전환하여 얻은 형질전환체 CHO-YHB1110-15를 제공한다.

또한, 본 발명에서는 상기 형질전환체 CHO-YHB1110-13 또는 CHO-YHB1110-15를 배양하여 얻어진 인간화 항체 YHB1110-13 또는 YHB1110-15 및 이의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에서는 본 발명의 발명자들에 의해 선출원된 B형 간염 바이러스 S-표면항원에 대한 마우스 항체의 유전자 A9-11-5 (대한민국 특허공개번호 제2001-0107418호)에 대한 인간화 항체를 제조하기 위하여, 마우스 항체 경쇄 및 중쇄 유전자와 가장 유사한 아미노산 서열을 유전자은행 데이터 베이스(Gene bank database)로부터 검색한다. 상기 검색결과, 중쇄의 경우 캐뱃(Kabat)의 정의에 의한 인간 중쇄 가변 서브그룹 2번 (Hh2)이 마우스 항체의 가변영역 유전자와 가장 유사하고, 경쇄의 경우 인간 경쇄 람다 가변 서브그룹 7번 또는 유전자은행 항체 람다 점라인 가변유전자(Gene bank Ig blast의 human Ig lamda germline V genes)의 V3가 마우스 항체의 가변영역 유전자와 가장 유사한 인간 유전자임을 확인하였다(Kawasaki K. et al, 1997).

따라서, 상기에서 선정된 인간 유전자를 주형으로 인간화 중쇄 및 경쇄 유전자가 제조된다. 인간화 중쇄 및 경쇄 유전자의 제조과정에서 아미노산의 치환은 공지된 유전자 분석 자료 및 항체 구조분석 자료를 토대로 항원과의 결합에 영향을 미치거나, 항체구조에 중요한 아미노산은 마우스 항체 본래의 잔기를 이용하는 것이 바람직하다(Kabat E.A. et al., D.H.H.S. 91-3242, 1991 ; Chothia C. et al., Nature 342, 877-883, 1989; Gary M. Studnicka. et al., Protein Engineering 7, 805-814, 1994 ; Linda Harris, and Bajorath, J. Protein Science 4, 306-310, 1995).

인간화 중쇄 가변유전자는 B형 간염 바이러스 S-표면항원에 대한 마우스 단일클론항체 A9-11-5 의 중쇄 가변지역 유전자 중에서 항원과 결합하는 부분을 제외한 나머지를 인간 항체 유전자 서열로 치환함으로써 제조된다. 즉, 인간화 중쇄 가변유전자는 마우스항체 A9-11-5의 중쇄 유전자를 주형으로 인간화시킬 프라이머들을 선정하고, 각각의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 후, 각 PCR 산물을 제한효소 및 DNA 리가아제(ligase)를 이용하여 연결함으로써 제조될 수 있으며, 이렇게 제조된 인간화 중쇄 가변유전자를 HFW141 라고 명명하였다(도 1 참조).

상기에서 제조된 인간화 중쇄 가변유전자 HFW141를 포함하는 인간화 중쇄 전체유전자를 제조하기 위하여, 먼저 상기 인간화 중쇄 가변유전자 HFW141를 PCR 벡터에 삽입시켜 pCR-HFW141를 제조한다. 이때, 상기 인간화 중쇄 가변유전자 HFW141의 고발현을 위하여 인간화 중쇄 리더서열의 앞쪽으로 코작 서열(Kozak, M. Nuc. Acids Res. 15, 8125-8148, 1987)을 삽입하고, 중쇄 리더서열 유전자 중 일부를 동물세포에서의 사용빈도가 높은 코돈으로 치환하여 항체 유전자의 발현효율을 높이는 것이 바람직하다(서열 1).

상기와 같이 제조된 pCR-HFW141 로부터 인간화 중쇄 가변유전자를 분리하고, 분리된 인간화 중쇄 가변유전자를 본 발명자들에 의해 선출원된 인간 항체 중쇄 불변유전자가 삽입된 항체 중쇄 발현벡터 pHAB-HC (KCTC 10229BP, 대한민국 특허공개번호 제2004-12266호)로 삽입시켜 인간화 중쇄 발현벡터를 제조할 수 있으며, 이렇게 제조된 인간화 중쇄 발현벡터를 pHAB-HFW141 HF (기탁번호: KCTC 10533BP)라고 명명하였다. 상기 중쇄 발현벡터 pHAB-HFW141 HF로부터 인간화 중쇄 전체유전자를 분리할 수 있으며, 분리된 인간화 중쇄 전체유전자를 HFW141 HF 라고 명명하였다.

인간화 경쇄 가변유전자는 B형 간염바이러스 S-표면항원에 대한 마우스 단일클론항체 A9-11-5 의 경쇄 가변지역 유전자 중에서 항원과 결합하는 부분을 제외한 나머지를 인간 항체 유전자 서열로 치환함으로써 제조된다. 즉, 인간화 경쇄 가변유전자는 마우스항체 A9-11-5 의 경쇄 유전자를 주형으로 인간화시킬 프라이머들을 선정하고, 각각의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 후, 각 PCR 산물을 제한효소 및 DNA 리가아제(ligase)를 이용하여 연결함으로써 제조될 수 있으며, 이렇게 제조된 인간화 경쇄 가변유전자를 각각 LFW22-31 및 LFW22-312 라고 명명하였다(도 2 참조).

상기에서 제조된 인간화 경쇄 가변유전자 LFW22-31 또는 LFW22-312 포함하는 인간화 경쇄 전체유전자를 제조하기 위하여, 상기 인간화 경쇄 가변유전자 LFW22-31 및 LFW22-312 를 각각 PCR 벡터에 삽입시켜 pCR-LFW22-31 및 pCR-LFW22-312를 제조한다. 이때 인간화 경쇄의 고발현을 위하여 인간화 경쇄 리더서열의 앞쪽으로 코작 서열(Kozak, M. Nuc. Acids Res. 15, 8125-8148, 1987)을 삽입하고, 경쇄 리더서열 유전자 중 일부를 동물세포에서 발현효율이 높은 코돈으로 치환하여 항체 유전자의 발현효율을 높이는 것이 바람직하다(서열 13).

상기에서 제조된 pCR-LFW22-31 또는 pCR-LFW22-312 로부터 경쇄 가변유전자를 분리하고, 분리된 경쇄 가변유전자를 본 발명자들에 의해 선출원된 인간 항체 경쇄 불변유전자가 삽입된 항체 경쇄 발현벡터 pHAB-LC (KCTC 10231BP, 대한민국 특허공개번호 제2004-12267호)로 삽입시켜 인간화 경쇄 발현벡터를 제조할 수 있으며, 이렇게 제조된 인간화 경쇄 발현벡터를 각각 pHAB-LFW22-31 LF(기탁번호: KCTC 10532BP) 및 pHAB-LFW22-312 LF(기탁번호: KCTC 10553BP)라고 명명하였다. 상기 경쇄 발현벡터 pHAB-LFW22-31 LF 또는 pHAB-LFW22-312 LF로부터 인간화 경쇄 전체유전자를 분리할 수 있으며, 분리된 인간화 경쇄 전체유전자를 각각 LFW22-31 LF 및 LFW22-312 LF 라고 명명하였다.

상기에서 제조된 인간화 항체 중쇄 발현벡터 pHAB-HFW141 HF 및 인간화 항체 경쇄 발현벡터 pHAB-LFW22-31 LF 를 진포터(Gene POTER)와 같은 적절한 형질전환 용액을 사용하여 CHO 세포로 형질전환시켜 형질전환체를 제조할 수 있으며, 이를 CHO-YHB1110-13 라고 명명하였다. 또한, 인간화 항체 중쇄 발현벡터 pHAB-HFW141 HF 및 인간화 항체 경쇄 발현벡터 pHAB-LFW22-312 LF 를 상기와 동일한 방법으로 형질전환시켜 형질전환체를 제조할 수 있으며, 이를 CHO-YHB1110-15 라고 명명하였다.

상기에서 얻은 형질전환체 CHO-YHB1110-13 또는 CHO-YHB1110-15를 배양하여 얻어진 배양액을 단백질-A(protein-A)와 산양 항-인간 면역글로부린 G(goat anti-human immunoglobulin G)로 정제함으로서 본 발명의 인간화 항체를 분리할 수 있으며, 이와 같이 분리된 인간화 항체를 각각 YHB1110-13 및 YHB1110-15 라고 명명하였다.

상기와 같이 분리 정제된 인간화 항체 YHB1110-13 및 YHB1110-15는 SDS-PAGE 전기영동을 통하여 단백질 밴드를 확인할 수 있으며, 5만 달톤의 항체 중쇄 밴드와 2만 5천 달톤의 항체 경쇄 밴드로 이루어졌음을 확인하였다.

또한, 본 발명의 인간화 항체 YHB1110-13 및 YHB1110-15의 B형 간염 바이러스 S-표면항원에 대한 친화력은 경쟁적 엘리자(competitive ELISA) 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 그 측정결과 인간화 항체 YHB1110-13의 항원 결합 친화력은 1 x 10⁸M^-1 이고, 인간화 항체 YHB1110-15의 항원 결합 친화력은 7 x 10⁷M^-1 로서 마우스 항체의 항원에 대한 친화력과 별다른 차이가 없음을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 B형 간염 바이러스 S-표면항원에 대한 인간화 항체 YHB1110-13 및 YHB1110-15 는 기존의 마우스 항체와 유사한 항원 결합능력을 유지하며 면역유발능력이 현저히 감소되어 B형 간염 바이러스를 효과적으로 예방할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 그러나, 이것이 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

실시예

실시예 1. 인간화 중쇄 가변유전자의 제조

항 B형 간염 S-표면항원에 대한 마우스 항체 A9-11-5 (대한민국 특허공개번호 제2001-0107418호)의 중쇄 가변지역 유전자를 서열 1과 서열 12를 이용하여 리더서열이 포함된 중쇄 가변유전자 A 를 증폭하였다. PCR을 실행하여 증폭된 유전자조각은 아가로즈 전기영동 및 퀴아젤 추출키트(QIAgel extraction kit, Qiagen사, 미국)를 이용하여 회수하였다. 다음으로 분리 정제된 중쇄 가변유전자 A 를 토대로 서열 1과 서열 3, 서열 2와 서열 12로 증폭하고 각각의 증폭된 유전자를 제한효소 Stu I(바이오렙사, 미국)으로 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 절단한 다음 T4 DNA 연결효소(DNA ligase, 바이오랩사, 미국)를 이용하여 상온에서 1시간 동안 반응시켜 중쇄 가변유전자 B 를 제조하였다. 다음으로 상기 중쇄 가변유전자 B 를 토대로 서열 4와 서열 12, 서열 1과 서열 5로 증폭된 유전자를 제한효소 Pst I(바이오렙사, 미국)으로 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 절단한 다음 T4 DNA 연결효소(DNA ligase, 바이오랩사, 미국)를 이용하여 상온에서 1시간 동안 반응시켜 연결하여 중쇄 가변유전자 C 를 제조하였다. 다음으로 중쇄 가변유전자 D 는 중쇄 가변유전자 C 를 서열 6과 서열 12, 서열 1와 서열 7로 증폭 후, 제한효소 SalI(바이오렙사, 미국)을 사용하여 절단하였고, 중쇄 가변유전자 E 는 중쇄 가변유전자 D 를 서열 8과 서열 12, 서열 1와 서열 9로 증폭 후, 제한효소 DraI(바이오렙사, 미국)을 사용하였으며, 중쇄 가변유전자 A9V7FW42HV는 서열 10과 서열 12, 서열 1과 서열 11로 증폭 후, 제한효소 XbaI(바이오렙사, 미국)을 사용하여 절단 한 후 T4 DNA 연결효소(DNA ligase, 바이오랩사, 미국)를 이용하여 상온에서 1시간 동안 반응시켜 제조하였다. 최종 인간화 중쇄 가변유전자를 제조하기 위하여, 상기 중쇄 가변유전자 A9V7FW42HV를 주형으로 서열 23과 서열 25, 서열 1과 서열 24로 각각 증폭 후 Overlapping 방법으로 PCR 증폭을 수행하였다. 각각의 PCR 증폭은 크게 3단계로 나누어 수행하였으며, 1단계는 분해로 구성되었고 분해조건은 95℃에서 5분 동안 1회로 동일하게 수행하였다. 2단계는 하기 표 1의 각 조건에 따라 수행하였으며, 1회로서 30회 반복 수행하였다. 3단계는 합성단계로 72℃에서 10분 동안 동일하게 수행하였다.

상기와 같은 방법으로 PCR을 진행하여 최종적으로 인간화된 중쇄 가변유전자를 제조하였으며, 이를 HFW141 이라 명명하였다(도 1 참조). 마우스 항체 중쇄 가변유전자를 인간화시키기 위해 제조된 프라이머 및 2단계 PCR 조건은 하기 표 1에 기술하였다.

인간화 항체 중쇄 개발 프라이머의 PCR 조건

순서	프라이머	유전자명	2단계 PCR 조건
순서	프라이머	유전자명	분해(denature)	결합(annealing)	합성(extension)
1	서열1/서열12	A	94℃ 1분30초	55℃ 2분	72℃ 3분
2	서열1/서열3	B	94℃ 1분30초	50℃ 2분	72℃ 2분30초
3	서열2/서열12	B	94℃ 1분30초	50℃ 2분	72℃ 2분30초
4	서열4/서열12	C	94℃ 1분30초	55℃ 2분	72℃ 2분30초
5	서열1/서열5	C	94℃ 1분30초	55℃ 2분	72℃ 2분30초
6	서열6/서열12	D	94℃ 1분30초	55℃ 2분	72℃ 2분30초
7	서열1/서열7	D	94℃ 1분30초	55℃ 2분	72℃ 2분30초
8	서열8/서열12	E	94℃ 1분30초	55℃ 2분	72℃ 2분30초
9	서열1/서열9	E	94℃ 1분30초	55℃ 2분	72℃ 2분30초
10	서열10/서열12	A9V7FW42HV	94℃ 1분30초	55℃ 2분	72℃ 2분30초
11	서열1/서열11	A9V7FW42HV	94℃ 1분30초	55℃ 2분	72℃ 2분30초
12	서열23/서열25	HFW141	95℃ 1분	55℃ 1분 30초	72℃ 1분30초
13	서열1/서열24	HFW141	95℃ 1분	55℃ 1분 30초	72℃ 1분30초

실시예 2. 인간화 중쇄 전체유전자 및 발현벡터의 제조

인간화 중쇄의 고발현을 위하여 인간화 중쇄 리더서열의 앞쪽으로 코작 서열(Kozak, M. Nuc. Acids Res. 15, 8125-8148, 1987)을 삽입하고, 중쇄 리더서열 4번째 아미노산인 루이신(Leucin)의 염기코돈을 기존의 TTA에서 동물세포에서의 사용빈도가 높은 코돈인 CTG로 치환하여 발현효율이 높은 프라이머를 제작하였다. 상기와 같이 치환된 인간화 중쇄 리더서열을 하기 표 2에 기술하였다.

인간화 중쇄 리더서열(서열 1)

프라이머	서열
마우스 중쇄 리더서열	CGAC ATG GCT GTC TTA TTC CTG CTC CTC TGC CTG M A V L F L L L C L
인간화 중쇄 리더서열(서열 1)	C *ACC* ATG GCT GTC CTG TTC CTG CTC CTC TGC CTG M A V L F L L L C L

상기 표 2의 프라이머를 이용하여 실시예 1에서 제조된 인간화 중쇄 가변유전자 HFW141의 PCR 증폭을 수행하였으며, 그 결과로서 증폭된 인간화 중쇄 가변유전자 HFW141를 PCR 벡터에 삽입였으며, 이를 pCR-HFW141 라고 명명하였다.

또한, 인간화 중쇄 전체유전자를 제조하기 위하여 본 발명의 발명자들에 의해 선출원된 인간 항체 중쇄 불변유전자가 삽입된 항체 중쇄 발현벡터 pHAB-HC (KCTC 10229BP, 대한민국 특허공개번호 제2004-12266호)를 사용하였다.

먼저, 인간화 중쇄 가변유전자 HFW141를 항체 중쇄 발현벡터 pHAB-HC 로 삽입하기 위하여, 상기에서 제조된 pCR-HFW141 를 제한효소 HindIII/ApaI(바이오렙사, 미국)으로 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 절단한 다음 1.5% 아가로스젤 전기영동과 에티디움 브로마이드 염색을 통하여 약 450 bp의 유전자 조각을 확인하였다. 마찬가지로 항체 중쇄 발현벡터 pHAB-HC를 제한효소 HindIII/ApaI 으로 절단하여 약 6.5 Kb의 절단된 발현벡터를 확인하였다. 그 후, 각각의 유전자 조각을 퀴아젤 추출키트(QIAgel extraction kit, Qiagen사. 미국)를 이용하여 회수한 다음, T4 DNA 연결효소(DNA ligase, 바이오랩사, 미국)를 이용하여 16℃에서 하룻밤동안 반응시킨 다음 대장균 XL1-Blue를 형질전환시켜 형질전환체를 얻었다. 얻어진 형질전환체를 100㎍/㎖의 암피실린이 함유된 LB 배지에서 하룻밤 배양한 뒤 플라스미드를 회수한 다음, 제한효소 HindIII/ApaI 으로 절단하여 약 1.4Kb의 항체 중쇄 가변 및 불변유전자 전체를 전기영동을 통하여 확인하였다.

상기와 같은 방법에 따라 인간화 중쇄 가변유전자 HFW141 와 인간 중쇄 불변유전자가 연결된 인간화 중쇄 전체유전자를 제조하였으며, 이를 HFW141 HF 라고 명명하였다. 또한, 상기 인간화 중쇄 전체유전자 HFW141 HF 가 삽입된 인간화 중쇄 발현벡터를 pHAB-HFW141 HF 라고 명명하였으며(도 3 참조), 이를 2003년 10월 29일자로 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에 기탁하였다 (기탁번호: KCTC 10533BP).

실시예 3. 인간화 경쇄 가변유전자의 제조

항 B형 간염 S-표면항원에 대한 마우스 항체 A9-11-5(대한민국 특허출원 제2000-28938호)의 경쇄 가변지역 유전자를 서열 13과 서열 22를 이용하여 리더서열이 포함된 경쇄 가변유전자 A 를 증폭하였다. PCR을 실행하여 증폭된 유전자조각은 아가로즈 전기영동 및 에티디움 브로마이드(EtBr) 염색을 통하여 확인하였고, 퀴아젤 추출키트(QIAgel extraction kit)를 이용하여 회수하였다. 다음으로 분리 정제된 경쇄 가변유전자 A 를 토대로 서열 14와 서열 22, 서열 13과 서열 15로 증폭하여 각각 증폭된 유전자를 서로 제한효소 Kpn I(바이오렙사, 미국)으로 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 절단한 다음 T4 DNA 연결효소(DNA ligase, 바이오랩사, 미국)를 이용하여 상온에서 1시간 동안 반응시켜 경쇄 가변유전자(B)를 제조하였다. 다음으로 상기 경쇄 가변유전자 (B)를 토대로 서열 16과 서열 22, 서열 13과 서열 17로 증폭된 유전자를 서로 제한효소 Msc I(바이오렙사, 미국)으로 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 절단한 다음 T4 DNA 연결효소(DNA ligase, 바이오랩사, 미국)를 이용하여 상온에서 1시간 동안 반응시켜 연결하여 경쇄 가변유전자 C 를 제조하였다. 다음으로 경쇄 가변유전자 D 는 경쇄 가변유전자 C 를 서열 18과 서열 22, 서열 13와 서열 19로 증폭한 후, 제한효소 ApaLI(바이오렙사, 미국)을 사용하여 절단하였고, 경쇄 가변유전자 A9V7은 경쇄 가변유전자 D 를 서열 20과 서열 22, 서열 13와 서열 21로 증폭한 후, 제한효소 SmaI(바이오렙사, 미국)을 사용하여 절단한 후 T4 DNA 연결효소(DNA ligase, 바이오랩사, 미국)를 이용하여 상온에서 1시간 동안 반응시켜 제조하였다. 경쇄 가변유전자 LFW22는 상기 A9V7LV를 주형으로 서열 26과 서열 22, 서열 13와 서열 27로 증폭 후, Overlapping 방법으로 PCR 증폭을 수행하였다. LFW22을 주형으로 Overlapping 방법으로 PCR 증폭을 수행하여 하나의 최종 인간화 경쇄 가변유전자를 제조하였으며, 이를 LFW22-31 라고 명명하였다(도 2 참조).

또한, 상기 제조된 LFW22-31 를 다시 주형으로 Overlapping 방법으로 PCR 증폭을 수행하여 또다른 최종 인간화 경쇄 가변유전자를 제조하였으며, 이를 LFW22-312 라고 명명하였다(도 2 참조).

각각의 PCR은 크게 3단계로 나누어 수행하였으며, 1단계는 분해로만 구성되었고, 분해조건은 95℃에서 5분 동안 1회로 동일하게 수행하였다. 2단계는 상기 표 3의 각 조건에 따라 수행하였다. 3단계는 합성으로만 구성되어 72℃에서 10분 동안 동일하게 수행하였다. 마우스 항체 경쇄 가변유전자를 인간화시키기 위해 제조된 프라이머 및 2단계 PCR 조건은 하기 표 3에 기술하였다.

인간화 항체 경쇄 개발 프라이머의 PCR 조건

순서	프라이머	치환 유전자명	2단계 PCR 조건
순서	프라이머	치환 유전자명	분해(denature)	결합(annealing)	합성(extention)
1	서열13/서열22	A	94℃ 1분30초	55℃ 2분	72℃ 3분
2	서열14/서열22	B	94℃ 1분30초	55℃ 2분	72℃ 3분
3	서열13/서열15	B	94℃ 1분30초	55℃ 2분	72℃ 3분
4	서열16/서열22	C	94℃ 1분30초	49℃ 2분	72℃ 3분
5	서열13/서열17	C	94℃ 1분30초	50℃ 2분	72℃ 3분
6	서열18/서열22	D	94℃ 1분30초	55℃ 2분	72℃ 3분
7	서열13/서열19	D	94℃ 1분30초	55℃ 2분	72℃ 3분
8	서열20/서열22	A9V7LV	94℃ 1분30초	55℃ 2분	72℃ 3분
9	서열13/서열21	A9V7LV	94℃ 1분30초	50℃ 2분	72℃ 3분
10	서열26/서열22	LFW22	95℃ 1분	55℃ 1분 30초	72℃ 1분 30초
11	서열13/서열27	LFW22	95℃ 1분	55℃ 1분 30초	72℃ 1분 30초
12	서열28/서열22	LFW22-31	95℃ 1분	55℃ 1분 30초	72℃ 1분 30초
13	서열13/서열29	LFW22-31	95℃ 1분	55℃ 1분 30초	72℃ 1분 30초
14	서열30/서열22	LFW22-312	95℃ 1분	55℃ 1분 30초	72℃ 1분 30초
15	서열13/서열31	LFW22-312	95℃ 1분	55℃ 1분 30초	72℃ 1분 30초

실시예 4. 인간화 경쇄 전체유전자 및 발현벡터의 제조

인간화 경쇄의 고발현을 위하여 인간화 경쇄 리더서열의 앞쪽으로 코작 서열(Kozak, M. Nuc. Acids Res. 15, 8125-8148, 1987)을 삽입하였고, 경쇄 리더서열 유전자 중에서 8번째 아미노산을 기존의 페닐알라닌(Phenylalanine)에서 동물세포에서 발현효율이 높은 루이신으로 치환하였고, 6번째 루이신을 암호화하는 CTT를 CTG로, 7번째 이소루이신을 암호화하는 ATA를 ATC로 치환하여 경쇄의 발현효율이 높은 프라이머를 제작하였다. 상기와 같이 치환된 인간화 경쇄 리더서열을 하기 표 4에 기술하였다.

인간화 경쇄 리더서열(서열 13)

프라이머	서열
마우스 경쇄 리더서열	TTCATG GCC TGG ATT TCA CTT ATA TTC TCT CTC CTG M A W I S L IF S L L
인간화 경쇄 리더서열(서열 13)	C *ACC* ATG GCC TGG ATT TCACTG ATC CTC TCT CTC CTG M A W I S L IL S L L

상기 표 4의 프라이머를 이용하여 실시예 3에서 제조된 인간화 경쇄 가변유전자 LFW22-31 의 PCR 증폭을 수행하였으며, 그 결과로서 증폭된 인간화 항체 경쇄 가변유전자 LFW22-31 를 PCR 벡터에 삽입였으며, 이를 pCR-LFW22-31 라고 명명하였다.

또한, 인간화 경쇄 전체유전자를 제조하기 위하여 본 발명의 발명자들에 의해 선출원된 인간 항체 경쇄 불변유전자가 삽입된 항체 경쇄 발현벡터 pHAB-LC (KCTC 10231BP, 대한민국 특허공개번호 제2004-12267호)를 사용하였다.

먼저, 상기 인간화 경쇄 가변유전자 LFW22-31 를 항체 경쇄 발현벡터 pHAB-LC로 삽입하기 위하여, pCR-LFW22-31 를 제한효소 HindIII/AvrII 로 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 절단한 다음 1.5% 아가로스 젤 전기영동과 에티디움 브로마이드 염색을 통하여 약 400bp의 유전자 조각을 확인하였다. 마찬가지로 경쇄 발현벡터 pHAB-LC 도 제한효소 HindIII/AvrII 로 절단하여 약 5.6Kb의 절단된 발현벡터를 확인하였다. 그 후, 각각의 유전자 조각을 퀴아젤 추출키트(Qiagen사. 미국)를 이용하여 회수한 다음, T4 DNA 연결효소(DNA ligase, 바이오랩사, 미국)를 이용하여 16℃에서 하룻밤동안 반응시킨 다음 대장균 XL1-Blue를 형질전환시켜 형질전환체를 얻었다. 얻어진 형질전환체를 100㎍/㎖의 암피실린이 함유된 LB 배지에서 하룻밤 배양한 뒤 플라스미드를 회수한 다음, 제한효소 HindIII/NotI(바이오렙사, 미국)으로 절단하여 약 0.7Kb의 항체 경쇄 전체 유전자를 전기영동을 통하여 확인하였다.

상기와 같은 방법에 따라 인간화 경쇄 가변유전자 LFW22-31 와 인간 경쇄 불변유전자가 연결된 인간화 경쇄 전체유전자를 제조하였으며, 이를 LFW22-31 LF 로 명명하였다(도 4 참조). 또한, 상기 유전자 LFW22-31 LF가 삽입된 인간화 경쇄 발현벡터 pHAB LFW22-31 LF 를 2003년 10월 29일자로 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에 기탁하였다(기탁번호: KCTC 10532 BP).

마찬가지로, 실시예 3에서 제조된 인간화 경쇄 가변유전자 LFW22-312 에 대하여도 상기와 동일한 방법에 따라 인간화 경쇄 불변유전자가 연결된 인간화 경쇄 전체유전자를 제조하였으며, 이를 LFW22-312 LF 로 명명하였다(도 4 참조). 또한, 상기 유전자 LFW22-312 LF가 삽입된 인간화 경쇄 발현벡터 pHAB LFW22-312 LF 를 2003년 11월 25일자로 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에 기탁하였다(기탁번호: KCTC 10553 BP).

실시예 5. 인간화 항체의 CHO 세포에서의 형질전환

동물세포에서의 인간화 항체의 활성을 측정하기 위하여, 상기 실시예 2 및 실시예 4에서 각각 제조된 중쇄 발현벡터 pHAB-HFW141 HF 및 경쇄 발현벡터 pHAB-LFW22-31 LF를 CHO 세포로 형질전환시켰다. 먼저 CHO 세포를 배양하기 위하여, DMEM/F12 배지(JRH 사, 미국)에 1.5 g/L의 소듐 바이카보네이트(Sodium Bicarbonate), 10% 송아지혈청(dialyzed FBS)을 첨가한 배양 배지를 이용하였다. 5% 이산화탄소가 공급되는 37℃ 배양기(humidified CO2 incubator)에서 2일 내지 3일 동안 상기 세포를 배양한 후 상온(25℃)에서 1,200 rpm으로 5분간 원심 분리하여 세포를 회수하였다. 다음으로 회수된 CHO 세포를 0.4% 트리판블루(trypan blue) 용액으로 염색하고 헤마토시토미터 (hematocytometer)를 이용하여 세포의 수를 측정하였으며, 약 6 x 10⁶ 개의 세포를 T-225 플라스크 (또는 T-75플라스크)에 옮겨 다시 계대 배양하였다. 상기 계대 배양된 CHO 세포를 플라스크 표면의 약 60-90% 정도로 충분히 증식시킨 다음, 형질전환할 유전자 10㎍과 형질전환 용액인 진포터(GenePoter) 용액 40㎕를 DMEM/F12 (serum-free medium) 배지 5ml에 섞어 혼합하였다. 상기 혼합액을 상온에서 10~45분간 방치 후, 배양액을 제거한 세포와 함께 37℃ 배양기(humidified CO2 incubator)에서 약 3~5시간 동안 배양하여 형질전환체를 얻었으며, 이를 CHO-YHB1110-13 라고 명명하였다.

마찬가지로, 상기 실시예 2 및 실시예 4에서 각각 제조된 중쇄 발현벡터 pHAB-HFW141 HF 및 경쇄 발현벡터 pHAB-LFW22-312 LF를 상기와 동일한 방법에 따라 CHO 세포로 형질전환시켜 형질전환체를 얻었으며, 이를 CHO-YHB1110-15 라고 명명하였다.

실시예 6. 인간화 항체의 정제

상기 실시예 5에서 얻은 형질전환체 CHO-YHB1110-13 를 배양하여 인간화 항체 유전자를 발현시켰다. 구체적으로, 세포배양은 T-75 플라스크에 2x10⁶ 개의 세포를 접종하고, 10% 송아지혈청이 함유된 DMEM/F12 배지에서 배양하였다. 상기 세포배양액을 회수하고 원심분리한 후 이를 여과하여 항체가 포함된 배양액만을 정제하였다. 또한, 배양액에서 항체만을 정제하기 위하여 단백질-A(protein A, 파마시아사)와 산양 항인간 면역글로부린지(goat-antihuman Immunoglobulin G)가 결합되어 있는 세파로스 4B(sepharose 4B)를 사용하였다. 항체를 단백질-A와 결합시키기 위하여 항체가 발현된 상기 세포배양액을 단백질-A가 결합된 컬럼(column)에 통과시킨 다음, 단백질-A와 결합된 항체를 pH 2.5의 글리신(glycine) 완충액에 통과시켜 인간화 항체를 용출시켰다. 그후, 1몰 트리스 시엘(1M Tris-Cl, pH 8.0) 완충액을 상기 항체 회수액의 1/10 부피로 첨가하여 항체 용출액의 pH를 중화시켰다. 상기에서 용출된 인간화 항체를 산양 항인간 면역글로부린지가 결합되어 있는 세파로스4B에 다시 통과시켜 항체 단백질만 특이적으로 결합되도록 하였다. 항체의 용출은 상기 단백질-A에서의 용출방법과 동일한 방법을 사용하여 인간화 항체만을 순수 정제하였으며, 상기와 같이 정제된 인간화 항체를 YHB1110-13 라고 명명하였다.

마찬가지로, 실시예 5에서 얻은 형질전환체 CHO-YHB1110-15를 상기와 동일한 방법에 따라 배양하여 인간화 항체 YHB1110-15를 얻었다.

정제된 항체단백질은 SDS-PAGE 전기영동을 통하여 확인하여 5만 달톤(dalton) 분자량 위치의 항체 중쇄와 2만5천 달톤 분자량 위치의 항체 경쇄 단백질 밴드를 확인하였다(도 5 참조).

실시예 7. 인간화 항체의 HBV S-표면항원에 대한 친화력 측정

실시예 6에서 정제된 인간화 항체를 샌드위치 엘리자(sandwich ELISA)방법을 이용하여 정량하고, S-표면항원(인터네셔널 엔자임사, 미국) 에이디알형(adr type)을 이용하여 그 활성을 분석하였다. 항체를 정량하기 위하여 마이크로 플레이트(다이나텍크사, 미국)의 각 웰에 산양 항 인간 면역글로부린 지.에이.엠(goat-antihuman immunoglobulin G.A.M)을 100ng 씩 넣고 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켜 코팅한 다음 농도를 알고 있는 항체를 대조군으로 사용하여 항체의 양을 측정하였다. 다음으로, HBV S-표면항원에 대한 항체의 친화력을 측정하기 위하여 여러 농도(10^-11~ 10^-6 M)의 항원 용액(각 100㎕)에 5ng의 항체를 각각 섞은 뒤 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 0.5㎍의 항원이 코팅되어 있는 플레이트의 각 웰에 첨가하여 37℃에서 약 2시간 동안 방치하였다. 다음으로, 각 웰에 서양 고추냉이 과산화분해효소(horseradish peroxidase)가 결합된 산양 항 인간 폴리클론항체(goat anti-mouse polyclonal antibody, 바이오래드사, 미국)를 1,000배 희석하여 100㎕씩 가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 서양 고추냉이 과산화분해효소 기질 키트(horseradish peroxidase substrate kit, 바이오래드사, 미국)로 발색시켜 흡광도를 측정하였다.

상기에서 측정된 흡광도로부터 항원에 결합한 항체와 결합하지 않은 항체의 농도를 환산하여 항체의 항원에 대한 친화도를 측정하였으며(Friguet, et al. 1985, J. Immunol. Meth. 77, 305-319), 그 결과를 표 5에 나타내었다. 하기 표 5에 기술된 바와 같이, 마우스 항체(mA9-11-5)의 항원 결합 친화도는 1 x 10⁸M^-1 이고, 본 실시예의 인간화 항체 YHB1110-13 의 항원 결합 친화도는 1 x 10⁸M^-1이고, YHB1110-15의 항원 결합 친화도는 7 x 10⁷M^-1 로서 마우스 항체와 비교하여 항원 결합 친화도에서 차이가 없다는 것을 확인하였다(도 6 참조).

마우스항체와 인간화항체의 항원에 대한 겹합 친화도 비교

항원	마우스항체mA9-11-5	인간화 항체YHB1110-13	인간화 항체YHB1110-15
항원에 대한 친화도(M^-1)	1 x 10⁸	1 x 10⁸	7 x 10⁷

본 발명의 인간화 항체는 마우스 항체와 유사한 항원결합능력을 나타내면서도 면역유발능력이 현저히 감소된 인간화 항체로서, 만성 B형 간염환자의 치료, 간이식환자의 감염예방 및 B형 간염바이러스에 감염된 산모에서 태아로의 수직감염 예방 등에 사용될 수 있다.

도 1은 HBV S-표면항원에 대한 마우스 단일클론항체 및 인간화 항체 중쇄의 아미노산 서열과 인간 항체 주형을 비교하여 나타낸 것이고,

도 2는 HBV S-표면항원에 대한 마우스 단일클론항체 및 인간화 항체 경쇄의 아미노산 서열과 인간 항체 주형을 비교하여 나타낸 것이고,

도 3은 인간화 항체 중쇄 발현벡터 pHAB-HFW141 HF를 제조하는 과정을 나타낸 것이고,

도 4는 인간화 항체 경쇄 발현벡터 pHAB-LFW22-31 LF 및 pHAB-LFW22-312 LF를 제조하는 과정을 나타낸 것이고,

도 5는 동물세포에서 생산 및 정제된 인간화 항체의 에스디에스 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE, polyacylamide gel electrophoresis)을 나타낸 것이고,

도 6은 인간화 항체 YH1110-13 및 YHB1110-15의 HBV S-표면항원에 대한 항원 결합 친화도를 경쟁적 엘리자(competitive ELISA) 방법을 통하여 나타낸 것이다.

<110> YUHAN CORPORATION <120> A HUMANIZED ANTIBODY AGAINST S-SURFACE ANTIGEN OF HEPATITIS B VIRUS AND A <160> 37 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 caccatggct gtcctgttcc tgctcctctg cctg 34 <210> 2 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 caggcctagt gaagccctca cagaccctgt ccctcacctg cacag 45 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 taggcctggt ccgctctctt gcagctgcac ctg 33 <210> 4 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gctgcagaca cagccgtgta ttattgtgcc ag 32 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tctgcagcag tcacactgga cagtttcagg aaaacttggc 40 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cgtcgacacc tccaagaacc aattctcact gaaactgtc 39 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tgtcgacgct gatggtcact ctggatatg 29 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ttctctttaa aactgtccag tg 22 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ttttaaagag aattggttct tggaggtgtc cttgctgatg 40 <210> 10 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 atctagagtg accatcagca aggacacctc caagaaccaa gtttcactga aa 52 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ctctagatat gaaagctgca tt 22 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 agagctcacg gtgaccgtgg tcccagcgcc cc 32 <210> 13 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 caccatggcc tggatttcac tgatcctctc tctcctg 37 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ggtggtaccg tcacactcac ttgtc 25 <210> 15 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cggtaccgcc aggtgagacg gtgagtgaag gttcctg <400> 15 cggtaccgcc aggtgagacg gtgagtgaag gttcctg 37 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 ctggccaggc tcctagaact ctaatatatg atacc 35 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 ctggccaggt ttctgttgga accagttggc 30 <210> 18 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 ggtgcacagc ctgaagatgc agaatattat tgtgc 35 <210> 19 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 tgtgcaccga gtagggtgag ggcagccttg tttccgagca ggg 43 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 tcccgggtgt tcctgacaga ttctc 25 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 acccgggact cggttgttgg tatc 24 <210> 22 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 cccaagctta gctcttcagt ggagggtgga aa 32 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 gctgaaacag agcggaccag g 21 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 gcctggtccg ctctgtttca gct 23 <210> 25 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 tgggcccttg gtggaggcag agctcacggt gacc 34 <210> 26 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 caggctttca gaggtctaat aggtgatacc aac 33 <210> 27 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 tggtatcacc tattagacct ctgaaagcct gg 32 <210> 28 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 gttccgggtg ttcctgccag attctcaggc tccctg 36 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 ggagcctgag aatctggcag gaacacc 27 <210> 30 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 tcaggctccc tgattggaga caaggctg 28 <210> 31 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 gagggcagcc ttgtctccaa tcaggga 27 <210> 32 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region of humanized heavy chain HFW141 <400> 32 caggtgcagc tgaaacagag cggaccaggc ctagtgaagc cctcacagac cctgtccctc 60 acctgcacag tctctggttt ctcattaagt acctatggtg tacagtgggt tcgccagcct 120 ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagtg atatggagtg gtggaaacac agactataat 180 gcagctttca tatccagagt gaccatcagc aaggacacct ccaagaacca agtttcactg 240 aaactgtcca gtgtgactgc tgcagacaca gccgtgtatt attgtgccag agcacggtac 300 ttcgatgtct ggggcgctgg gaccacggtc accgtgagct ct 342 <210> 33 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region of humanized light chain LFW22-31 <400> 33 caggctgttg tgactcagga accttcactc accgtctcac ctggtggtac cgtcacactc 60 acttgtcgct caagtactgg ggctattaca actaataact ttgccaactg gttccaacag 120 aaacctggcc aggctttcag aggtctaata ggtgatacca acaaccgagt tccgggtgtt 180 cctgccagat tctcaggctc cctgctcgga aacaaggctg ccctcaccat cacaggtgca 240 cagcctgaag atgaggcaga atattattgt gctctatggt acaacaactg ggtgttcggt 300 ggaggaacca aactgactgt cctaggc 327 <210> 34 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region of humanized light chain LFW22-312 <400> 34 caggctgttg tgactcagga accttcactc accgtctcac ctggtggtac cgtcacactc 60 acttgtcgct caagtactgg ggctattaca actaataact ttgccaactg gttccaacag 120 aaacctggcc aggctttcag aggtctaata ggtgatacca acaaccgagt tccgggtgtt 180 cctgccagat tctcaggctc cctgattgga gacaaggctg ccctcaccat cacaggtgca 240 cagcctgaag atgaggcaga atattattgt gctctatggt acaacaactg ggtgttcggt 300 ggaggaacca aactgactgt cctaggc 327 <210> 35 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> variable region of humanized heavy chain HFW141 <400> 35 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Val Gln Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 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Claims

중쇄 가변영역의 아미노산 서열이 서열번호 35인 것을 특징으로 하는 B형 간염바이러스의 S-표면항원에 대한 인간화 항체.
경쇄 가변영역의 아미노산 서열이 서열번호 36인 것을 특징으로 하는 B형 간염바이러스의 S-표면항원에 대한 인간화 항체.
경쇄 가변영역의 아미노산 서열이 서열번호 37인 것을 특징으로 하는 B형 간염바이러스의 S-표면항원에 대한 인간화 항체.
서열 35의 아미노산 서열의 가변영역을 암호화하는 서열 32의 염기서열을 포함하는 B형 간염바이러스의 S-표면항원에 대한 인간화 중쇄 유전자.
서열 36의 아미노산 서열의 가변영역을 암호화하는 서열 33의 염기서열을 포함하는 B형 간염바이러스의 S-표면항원에 대한 인간화 경쇄 유전자.
서열 37의 아미노산 서열의 가변영역을 암호화하는 서열 34의 염기서열을 포함하는 B형 간염바이러스의 S-표면항원에 대한 인간화 경쇄 유전자.
서열 1의 염기서열을 포함하는 인간화 중쇄 리더서열 유전자.
서열 13의 염기서열을 포함하는 인간화 경쇄 리더서열 유전자.
제4항의 유전자를 포함하는 B형 간염바이러스의 S-표면항원에 대한 인간화 항체의 중쇄 발현벡터 pHAB-HFW141 HF (기탁번호: KCTC 10533 BP).
제5항의 유전자를 포함하는 B형 간염바이러스의 S-표면항원에 대한 인간화 항체의 경쇄 발현벡터 pHAB-LFW22-31 LF (기탁번호: KCTC 10532 BP).
제6항의 유전자를 포함하는 B형 간염바이러스의 S-표면항원에 대한 인간화 항체의 경쇄 발현벡터 pHAB-LFW22-312 LF (기탁번호: KCTC 10553 BP).
인간화 항체의 중쇄 발현벡터 pHAB-HFW141 HF와 인간화 항체의 경쇄 발현벡터 pHAB-LFW22-31 LF를 CHO 세포로 형질전환하여 얻은 형질전환체.
인간화 항체의 중쇄 발현벡터 pHAB-HFW141 HF와 인간화 항체의 경쇄 발현벡터 pHAB-LFW22-312 LF를 CHO 세포로 형질전환하여 얻은 형질전환체.
제12항의 형질전환체를 배양하여 인간화 항체를 제조하는 B형 간염바이러스의 S-표면항원에 대한 인간화 항체 제조방법.
제13항의 형질전환체를 배양하여 인간화 항체를 제조하는 B형 간염바이러스의 S-표면항원에 대한 인간화 항체 제조방법.