JP4554810B2 - 粒子分析装置および粒子分析方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液や尿等に含まれる血球その他の各種細胞といった粒子の分析に用いる粒子分析装置および粒子分析方法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
血液中の血球や尿中に含まれる細胞・細菌等の粒子を分析するために、各種粒子分析装置が用いられている。このような粒子分析装置としてはフローサイトメータが公知である。一般的なフローサイトメータでは、分析対象となる粒子を含有する試料液をシース液で包んでシースフローセル内で細く絞り込み、粒子を整列させて通過させ、そこにレーザ光を照射して各粒子から散乱光や蛍光等の光学的情報を得る。得られた光学的情報は光電変換素子によって光検出信号に変換され、その信号波形を処理することによって粒子の特徴を表すパラメータが算出され、それに基づいて分析対象の粒子が分類・計数される。
【0003】
光検出信号からは、信号波形の高さ(ピークレベル)や信号波形の幅(パルス幅)等のパラメータが算出される。例えば、前方散乱光検出信号のピークレベルは粒子の大きさを表すものである。また前方散乱光検出信号のパルス幅は粒子長を表す。一方、予め粒子、例えば有核細胞に蛍光染色を施した場合などには、蛍光検出信号のピークレベルは核等の染色度合いを表し、パルス幅は蛍光染色部分長を表す。このような各粒子の特徴を表すパラメータをもとにヒストグラムを作成したり、複数のパラメータを組合わせて粒子の分布を示すスキャッタグラムを作成したりして、試料に含まれる粒子の種類・数などを統計的に解析することが行われている。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、フローサイトメータにおいて形態・構造の単純な粒子から検出される光検出信号波形は、図7のような単純なものとなる。一方、形態・構造が複雑な粒子は信号波形も複雑になり、一つあるいは二以上の谷を有するものとなる。
また、形態・構造が単純な粒子の場合でも、複数の粒子が近接した状態でフローサイトメータの検出領域を通過(近接通過)した場合には、前記形態・構造が複雑な粒子と同様に、信号波形に谷が生じる。そのような信号波形の例を図8に示す。
【0005】
しかしピークレベルやパルス幅といったパラメータには、信号波形の谷の状態が反映されないため、ピークレベルやパルス幅の値を比較しただけでは形態・構造が単純な粒子と複雑な粒子とを区別できないことがある。また複数の粒子が近接通過した場合は、大型で形態・構造が複雑な粒子と区別できないことがある。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はこれらの問題点に鑑み、従来のピークレベルやパルス幅等に加え、信号波形の谷を反映したパラメータを算出する機能を有する粒子分析装置および粒子分析方法を提供するものである。
【0007】
【課題を解決するための手段】
本発明は、粒子を含む試料液をシースフローセルに流し、前記シースフローセルにレーザ光を照射して前記粒子から光検出信号を検出する検出部と、前記検出部で検出された光検出信号の信号波形を処理して粒子の特徴を表すパラメータとして前記信号波形の差分積分値を算出する信号処理部と、前記信号処理部によって算出されたパラメータをもとに粒子の分析を行う分析部と、を備えた粒子分析装置を提供するものである。また、本発明は、フローサイトメータを用いた粒子分析方法であって、粒子を含む試料液にレーザ光を照射して、前記試料液中の粒子から光検出信号を検出する工程と、検出された前記光検出信号の信号波形を処理して粒子の特徴を表すパラメータとして前記信号波形の差分積分値を算出する工程と、算出されたパラメータをもとに粒子の分析を行う工程と、を備えた粒子分析方法を提供するものである。
【0008】
【発明の実施の形態】
本発明において分析の対象となる粒子には、血液中の血球や尿中の細胞・細菌などといった粒子が含まれる。
【0009】
検出部は、粒子を含む試料液をシース液で包んでシースフローセルに流し、そのシースフローセルにレーザ光を照射し、各粒子からの散乱光や蛍光等を光検出信号として検出するためのものである。この検出部には公知の光学式検出器を用いることができる。具体的には、シースフローセルは、その内部を通過する粒子から光学的情報を得るため、透明で表面が滑らかなものが好適であり、ガラス等の材質が用いられる。また照射するレーザ光としては、半導体レーザやアルゴンレーザ等が用いられる。粒子からの光学的情報を光電変換して光検出信号を検出するための光電変換素子としては、フォトダイオードやフォトトランジスタ、フォトマルチプライヤチューブ等が用いられる。その他、レンズ、ミラー等の各種光学部品が必要に応じて用いられる。
【0010】
信号処理部は、検出部により得られた各粒子毎の光検出信号についての波形を処理し、差分積分値をはじめ各種パラメータを算出する回路からなるものである。また差分積分値の他、ピークレベル、パルス幅等がパラメータとして算出されてもよい。ピークレベル、パルス幅等のパラメータは公知のピークホールド回路やカウンタ回路等によって算出できる。
【0011】
本発明において差分積分値とは、信号波形を微分し、その絶対値を足し合わせた値である。すなわち、図7に示したような波形に谷の無い信号の差分積分値は、その信号のピークレベルHを2倍した値と同じになる。
【0012】
一方、波形に谷の有る信号の差分積分値は、その信号のピークレベルを2倍した値よりも大きくなる。図8を用いてその算出例を示す。すなわち、図8の信号の差分積分値は、H1・H2・H3・H4の和で求められるところ、以下の式が成り立つ。
(H1+H2+H3+H4)=(H1×2+H3×2)>(H1×2)
【0013】
H1は図8の信号のピークレベルであるので、波形に谷の有る信号の差分積分値は、その信号のピークレベルを2倍した値よりも大きくなるということが上記の式からわかる。また、この差分積分値は、波形に谷が多いほど、また谷が深いほど大きい値となり、ピークレベルを2倍した値との差も大きくなる。
【0014】
上記のような差分積分値の性質から、粒子の形態・構造の複雑さ、あるいは粒子の近接通過を反映するパラメータとして信号波形の差分積分値が有用であることがわかる。
【0015】
信号波形の差分積分値は、信号を一定の周期でサンプリングし、隣り合うデータの差の絶対値を累積加算する回路を用いることで算出できる。なお、従来のアナログ信号処理方式では回路が複雑になり、また信号ゲインの温度変化や経年変化が生じやすいため差分積分値の信頼性を確保するのは難しい。そこでアナログ信号をその信号周波数帯域よりも十分高い周波数でサンプリングA/D変換し、その波形データをデジタル信号処理することによって差分積分値を算出することが好ましい。
【0016】
なお検出された信号のS/N比が悪い場合には、高周波のノイズ信号が混じるために形態・構造の単純な粒子の信号であっても波形に微少な谷を多数含むこととなり、形態・構造の複雑な粒子との区別が困難になる。従って、パラメータとして差分積分値を有効に活用するには、検出された信号からノイズ信号を除去する必要がある。その対策としては、信号処理部において差分積分値を算出する処理の前処理として、ハイカットフィルタを設ける等の方法が考えられる。
【0017】
分析部は、信号処理部で算出された各種パラメータに基づき、統計解析することで試料液中に存在する粒子を分析するものであり、マイクロコンピュータやパーソナルコンピュータ等によって構成できる。統計解析の際にはヒストグラムや、複数のパラメータを組合わせてなるスキャッタグラム等が作成されてもよい。
【0018】
また分析部による分析結果を出力するため、本発明はさらに出力部を備えてもよい。出力部にはCRTやLCD等の表示手段、あるいはプリンタ等を用いることができる。
【0019】
【実施例】
以下、図面に基づいて本発明の実施例について説明する。なお本発明が以下の実施例に限定されるわけではない。
【0020】
図1は本実施例の構成を示す図である。検出部1では、レーザ光源11から発せられたレーザ光がコンデンサレンズ12により楕円形に絞られてシースフローセル13内を通過する粒子に照射される。試料液に尿を用いる場合などは、その楕円形のサイズは、試料液の流れの方向には被検粒子径と同程度、例えば10μm前後であり、試料の流れ方向と直交する方向には被検粒子径より十分大きく、例えば150〜400μm程度である。
【0021】
その後、前方散乱光は集光レンズ14を介してフォトダイオード15により検出され、前方散乱光信号として信号処理部2へ送られる。またシースフローセル13から集光レンズ16を介し、ダイクロイックミラー17により反射された側方散乱光はフォトマルチプライヤチューブ18に、ダイクロイックミラー17を通過した側方蛍光はフォトマルチプライヤチューブ19によってそれぞれ側方散乱光信号、側方蛍光信号として検出され、信号処理部2へ送られる。
【0022】
以下、信号処理部2における波形処理において差分積分値を算出する回路について説明する。本実施例の信号処理部2はピークレベル、パルス幅といったパラメータを算出する回路も有するが、これらは公知であるため説明を省略する。
【0023】
図2は信号処理部2の差分積分値算出回路を示す図である。また図3は本回路におけるタイミングチャートの概略である。本実施例の差分積分値算出回路においては、連続した光検出信号波形のうち粒子を検出した部分(粒子信号)の信号波形サンプリングデータの、隣り合うデータの差の絶対値を累積加算することによって差分積分値を求める。
【0024】
まず、検出部1で検出された光検出信号(アナログ信号)がA/Dコンバータ21によってサンプリングA/D変換される。この際に用いられるサンプリングクロックは、アナログ信号の周波数帯域よりも十分に周波数の高いものである。
サンプリング周期毎にA/D変換された波形サンプリングデータD1は、比較器22において、それが粒子信号か否かを検知するために予め設定されたディスクリレベルと比較され、このディスクリレベルより大きくなったらその信号が粒子を検出したものとみなし、比較器出力信号S1がHIGHになる。同時にサンプリングクロックに同期して波形サンプリングデータD1がサンプリングデータレジスタ23にラッチされる。
【0025】
差分器24にはA/Dコンバータ21からの波形サンプリングデータD1及びサンプリングデータレジスタ23にラッチされていた波形サンプリングデータD2が送られる。ここで、サンプリングデータレジスタ23にラッチされていたデータD2はA/Dコンバータ21からのデータD1より1クロック前のデータであるので、これら二つの波形サンプリングデータの差の絶対値が差分器24で算出される。
【0026】
比較器出力信号S1がHIGHになることで制御回路25が働き、加算イネーブル信号S2を発する。これにより、差分器24から次々と出力される差分器出力データD3を足し合わせるための累積加算器26の動作が開始する。波形サンプリングデータD1がディスクリレベルより小さくなり比較器22の比較器出力信号S1がLOWになると、それに呼応して制御回路25の加算イネーブル信号S2がLOWになり、累積加算器26の動作が停止する。
【0027】
累積加算器26の出力データD4は、波形サンプリングデータD1がディスクリレベルより大きい期間での差分積分値である。そこで加算器27により、さらにディスクリレベルの2倍値が加算される。そのデータ(加算器出力データD5)は、前記加算イネーブル信号S2がLOWになったのに呼応して制御回路25から出力されたラッチイネーブル信号S3に同期し、差分積分レジスタ28にラッチされる。
【0028】
一つの粒子信号波形の差分積分値について、差分積分レジスタ28へのラッチが完了したら、次の粒子信号に備えるため累積加算器26をクリアする。このクリア動作は前記ラッチイネーブル信号S3に呼応して制御回路25から出力されたクリア信号S4に基づく。
【0029】
以上のようなステップで算出された各粒子信号波形の差分積分値は、別途算出されたピークレベルやパルス幅等のパラメータとともに時系列に、メモリ(図示せず)に記憶される。
【0030】
一試料に対する測定が終了したら、前記メモリに記憶された差分積分値、その他のパラメータが読み出され、分析部3においてスキャッタグラムの作成、統計解析が行われる。
【0031】
図4は、本実施例を用いた粒子分析装置において分析対象の粒子を含む試料液として尿を用いた際に作成されたスキャッタグラムの一例であり、座標の縦軸には前方散乱光検出信号の波形の差分積分値の1/2の値を、横軸には前方散乱光検出信号の波形のピークレベルをとったものである。
【0032】
波形に谷の無い信号の差分積分値はその信号のピークレベルを2倍した値と同じになり、波形に谷の有る信号の差分積分値はその信号のピークレベルを2倍した値よりも大きくなることは前記の通りである。これらのことを利用した図4のスキャッタグラム上において、形態・構造の単純な粒子は傾きが1である直線上付近に分布し、この直線より上側に分布する粒子は形態・構造の複雑な粒子又は複数の粒子が近接通過したものと判断できる。
【0033】
尿中に含まれる粒子としては、赤血球・白血球・上皮細胞・円柱・連鎖状球菌・細菌等の各種細胞が挙げられる。これらのうち、赤血球・白血球・細菌などは形態・構造が単純な粒子であり領域4aに分布する可能性が高く、円柱・連鎖状球菌など形態・構造が複雑な粒子、あるいは形態・構造が単純な粒子が検出部を近接通過した場合は領域4bに分布する可能性が高い。
【0034】
このように、パラメータとして信号波形の差分積分値を用いることにより、形態・構造が単純な粒子と複雑な粒子、もしくは近接通過した粒子とを分類することが可能となる。また、この分析結果を従来より行われている分析による結果と組合わせて用いることで、粒子の分類精度を向上させることができる。
【0035】
ところで、パラメータにピークレベルと差分積分値のみを用いただけでは、形態・構造が複雑な粒子と、単純な粒子が近接通過した場合とを区別するのが困難であることが考えられる。図5は、円柱の前方散乱光検出信号の波形と、二つの白血球が近接通過した場合の前方散乱光検出信号の波形とを比較したものであるが、これらは前記図4のスキャッタグラム上ではいずれも領域4bに出現することになる。
【0036】
しかし、尿中に含まれる粒子においては、形態・構造の複雑な粒子はそのサイズが大型であってパルス幅も非常に大きいものとなり、形態・構造の単純な粒子が近接通過した場合のパルス幅よりもさらに大きいことが一般的である。例えば、円柱の粒子長は通常100〜300μm程度であり、白血球の粒子長は10〜15μm程度であるため、円柱のパルス幅と、白血球が近接通過した場合のパルス幅は、図5に示したように明らかに異なる大きさとなる。そこで差分積分値・ピークレベルを用いた分析に、更にパルス幅をパラメータとした分析を加味することにより、形態・構造が複雑な粒子と、単純な粒子が近接通過した場合との分類精度を向上することができる。
【0037】
まず分析部3において、図4のスキャッタグラム上で形態・構造が複雑な粒子と、形態・構造が単純な粒子が近接通過した場合とが混在しているとされる領域4bを切り出す。次にその領域内に分布する粒子群につき、パルス幅をパラメータとしたヒストグラム、あるいはパルス幅とピークレベルをパラメータとしたスキャッタグラム等を作成する。
【0038】
図6はこうして作成されたヒストグラムの一例である。座標の縦軸には粒子の度数を、横軸にはパルス幅をとり、前記図4のスキャッタグラムの領域4b内に分布する粒子の度数をパルス幅毎に算出する。ここで粒子の種類に対応した閾値を予め設定しておくことにより、形態・構造が複雑な粒子、近接通過した粒子各々の計数・分類が可能となる。またこの結果を従来より行われている分析による結果と組合わせて用いることで、粒子の分類精度を向上させることができる。
【0039】
【発明の効果】
以上のように、本発明は、粒子の特徴を反映するパラメータとして差分積分値を用いることで、粒子の形態・構造の複雑さ、あるいは複数の粒子の近接通過という観点から粒子の分類を可能にするものである。
【0040】
また本発明の粒子分析装置および粒子分析方法は、差分積分値をピークレベルやパルス幅といった従来のパラメータと組合わせて用いることにより、より分類精度の高い粒子分析を可能にするものである。
【0041】
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の構成の概略を示す図
【図2】差分積分値算出回路を示すブロック図
【図3】差分積分値算出回路におけるタイミングチャートを示す図
【図4】本発明において作成されたスキャッタグラムを示す図
【図5】円柱の信号波形と白血球が近接通過した場合の信号波形とを比較する図
【図6】本実施例におけるヒストグラムを示す図
【図7】波形に谷の無い信号の一例を示す図
【図8】波形に谷の有る信号の一例を示す図
【符号の説明】
1 検出部
11レーザ光源
12コンデンサレンズ
13シースフローセル
14集光レンズ
15フォトダイオード
16集光レンズ
17ダイクロイックミラー
18フォトマルチプライヤチューブ
19フォトマルチプライヤチューブ
2 信号処理部
21A/Dコンバータ
22比較器
23サンプリングデータレジスタ
24差分器
25制御回路
26累積加算器
27加算器
28差分積分レジスタ
D1波形サンプリングデータ
D2波形サンプリングデータ
D3差分器出力データ
D4累積加算器出力データ
D5加算器出力データ
S1比較器出力信号
S2加算イネーブル信号
S3ラッチイネーブル信号
S4クリア信号
2 信号処理部
3 分析部
Claims (6)
- 粒子を含む試料液をシースフローセルに流し、前記シースフローセルにレーザ光を照射して前記粒子から光検出信号を検出する検出部と、
前記検出部で検出された光検出信号の信号波形を処理して粒子の特徴を表すパラメータとして前記信号波形の差分積分値を算出する信号処理部と、
前記信号処理部によって算出されたパラメータをもとに粒子の分析を行う分析部と、を備えた粒子分析装置。 - 前記信号処理部が、前記検出部で検出された光検出信号をその周波数帯域よりも周波数の高い周期でサンプリングA/D変換し、隣り合うデータの差の絶対値を累積加算することによって前記信号波形の差分積分値を算出することを特徴とする請求項1に記載の粒子分析装置。
- 前記信号処理部において、差分積分値を算出する処理の前処理に用いられるハイカットフィルタを設けたことを特徴とする請求項1又は2に記載の粒子分析装置。
- 前記信号処理部はパラメータとしてさらに信号波形のピークレベルを算出し、
前記分析部は前記信号波形の差分積分値及び前記信号波形のピークレベルに基づきスキャッタグラムを作成することを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の粒子分析装置。 - 前記検出部は、前記光検出信号として、前記粒子からの散乱光または蛍光を検出するように構成されている、請求項1〜4のいずれか1項に記載の粒子分析装置。
- フローサイトメータを用いた粒子分析方法であって、
粒子を含む試料液にレーザ光を照射して、前記試料液中の粒子から光検出信号を検出する工程と、
検出された前記光検出信号の信号波形を処理して粒子の特徴を表すパラメータとして前記信号波形の差分積分値を算出する工程と、
算出されたパラメータをもとに粒子の分析を行う工程と、を備えた粒子分析方法。
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JPS63298029A (ja) * | 1987-05-28 | 1988-12-05 | Toa Medical Electronics Co Ltd | 粒子分析装置の谷波形信号処理装置 |
JPH08136438A (ja) * | 1994-11-14 | 1996-05-31 | Toa Medical Electronics Co Ltd | 粒子分析装置 |
JPH1130580A (ja) * | 1997-05-13 | 1999-02-02 | Toa Medical Electronics Co Ltd | 粒子測定装置 |
-
2000
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JPS5850450A (ja) * | 1981-09-21 | 1983-03-24 | Toa Medical Electronics Co Ltd | 粒子計数装置 |
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