JP4548742B2 - 誘電体微粒子濃縮装置 - Google Patents

Description

本発明は、試料液中の誘電体微粒子を誘電泳動力によって捕集し、捕集された誘電体微粒子の定量測定・分析、回収を容易にするとともに、回収後の装置内洗浄も容易に行うことができる誘電体微粒子濃縮装置に関する。

近年、サルモネラ菌、ブドウ球菌、ボツリヌス菌、病原性大腸菌Ｏ−１５７といった微生物に起因する食中毒の被害が問題になっており、関係企業では、これらの微生物に対する予防・衛生にかかわる講習会や啓蒙活動などを行う一方で、高額な設備投資を通じて事故拡散を未然に防ごうとしている。

微生物の検出は、培養した後に種類の同定や定量をすることが一般的である。すなわち、前培養→増菌培養→分離培養といった培養操作を伴うことから、その培養操作に起因して検査結果が出るまで数日程度の期間を要し、かつ、専門の測定技術者を必要とする。この長期間の測定は、迅速性が要求される生鮮食品など、食料品への微生物検査の必要性が生じた場合に非常に問題となる。

このようなことから、微生物を簡易かつ迅速に検出する様々な試薬や装置が提案されている。例えば、誘電泳動力によって微生物を捕集する電極を有し、かかる電極間のインピーダンスを測定することで微生物数を定量的に算出する装置がある（特許文献１）。また、特許文献１と同様に、誘電泳動力によって捕集した微生物を定量分析した後に、試料液を自動的に排水して、測定チャンバー内を洗浄することができる装置がある（特許文献２）。

特開２００３−２４３５０（請求項１） 特開２００３−２２４（請求項５、請求項６）

上記特許文献１及び２のいずれも、捕集した微生物を定量分析することを目的としたものであり、捕集した微生物を回収することを意図したものとはなっていない。すなわち、定量分析後の微生物は排出洗浄されるだけで、更なる活用方法が示唆されているものではなかった。

これに関連し、近年は、微生物などのタンパク質を含む標的菌を効率良く濃縮して、かかる濃縮液を分析することが求められ、如何にして標的菌を効率良く濃縮するかが課題となっている。かかる濃縮技術の提供は、飲料水、食肉、惣菜、加工食品等の飲料・食品分野において、製薬、製剤、薬品、化粧品等の製薬・化粧品分野において、エイズ、結核菌、鳥インフルエンザ等の臨床・医療分野において、ＤＮＡ・ＲＮＡ、たんぱく質、核酸等のバイオ産業分野において、温泉、水処理、下水処理等の環境測定分野において、船舶バラスト、湾岸管理、海洋汚染等の海洋測定分野において、など様々な分野で活躍することが期待される。

本発明は以上の点に鑑みてなされたものであり、その目的は、試料液中の誘電体微粒子（例えば、微生物）を誘電泳動力によって捕集し、捕集された誘電体微粒子の定量測定・分析後に、誘電体微粒子を濃縮して回収することができる誘電体微粒子濃縮装置を提供することにある。

以上のような課題を解決するために、本発明は、誘電体微粒子を含む試料液を誘電泳動電極に捕集し、誘電泳動電極にリリース液を貫流して、誘電泳動電極によって捕集された誘電体微粒子を濃縮して回収することを特徴とする。

より具体的には、本発明は、以下のものを提供する。

（１） 検査対象となる誘電体微粒子を含む試料液を保持する試料液保持部と、前記誘電体微粒子を誘電泳動力によって捕集する誘電泳動電極を備えるセルと、前記誘電泳動電極に貫流するリリース液を保持するリリース液保持部と、前記リリース液保持部から供給されるリリース液を前記誘電泳動電極に貫流して、当該誘電泳動電極によって捕集された誘電体微粒子を回収する回収部と、を有することを特徴とする誘電体微粒子濃縮装置。

上記構成を有する本発明によれば、試料液保持部から供給された誘電体微粒子が印加されたセルを通過する際に、誘電泳動電極上に誘電泳動力によって誘電体微粒子が捕集される。この捕集された誘電体微粒子を、印加を停止して誘電泳動力から開放し、かつ、リリース液保持部から供給されるリリース液を誘電泳動電極に貫流することで、放出させて、回収部に回収することができる。これにより、濃縮された誘電体微粒子を標的菌として回収することが容易にできる。

また、誘電泳動電極上に捕集された誘電体微粒子は、ＣＣＤカメラ、光学顕微鏡等によるリアルタイム観察が可能であり、誘電体微粒子の代謝活性状態をリアルタイムで観察することができる。さらに、捕集された誘電体微粒子が電極間にパールチェーンを形成することで電極間に微弱な電流が流れる現象を利用し、誘電泳動電極間のインピーダンス変化を計測する（ＤＥＰＩＭ）ことによって、誘電体微粒子の定量測定が可能となる。

（２） 前記誘電泳動電極によって捕集された誘電体微粒子に対して標識化物質を作用させるための染色液を保持する染色液保持部を有することを特徴とする誘電体微粒子濃縮装置。

上記構成を有する本発明によれば、染色液保持部から供給された染色液がセルを通過する際に、誘電泳動電極によって捕集された誘電体微粒子に対して標識化物質を作用することができることから、蛍光強度を測定する器具を接続することによって、染色された誘電体微粒子を蛍光分光光度計による蛍光観察や蛍光顕微鏡による観察によって定量測定をリアルタイムで行うことができる。具体的には、標識化物質を含む誘電体微粒子は、光源より発せられた紫外線励起光によって蛍光を発し、集光レンズを備える検出器においてこれを受光することで、電気信号を取り出す。この電気信号を測定・分析することによって、誘電体微粒子を光学的に検出することができる。

（３） 前記リリース液保持部から供給されるリリース液を前記誘電泳動電極に貫流する際に、リリース液内に気泡を混入することを特徴とする誘電体微粒子濃縮装置。

上記構成を有する本発明によれば、気泡が混入されたリリース液を誘電泳動電極に貫流することによって、誘電泳動電極によって捕集されている誘電体微粒子のリリースを容易に行うことができ、回収部への誘電体微粒子の回収が容易になる。

（４） 前記誘導泳動電極は、タンパク質の吸着を防止する被膜で被覆されていることを特徴とする誘電体微粒子濃縮装置。

上記構成を有する本発明によれば、誘導泳動電極に誘電体微粒子が吸着することを防止することができるので、誘電泳動電極によって捕集されている誘電体微粒子のリリースを容易に行うことができ、回収部への誘電体微粒子の回収が容易になる。

（５） 前記試料液は、導電率に影響する電解物質を予め分離したことを特徴とする誘電体微粒子濃縮装置。

上記構成を有する本発明によれば、導電率に影響する電解物質を除去して検査対象となる誘電体微粒子の濃度が高い試料液を誘電体微粒子濃縮装置にかけることができるので、濃縮された誘電体微粒子を標的菌として回収することがさらに容易にできる。

すなわち、誘電泳動電極によって誘電体微粒子を捕集する場合に、あるレベル以上の導電率媒質に誘電体微粒子を懸濁させた試料液を用いると、正のＤＥＰ（電極に向って働く引力）が作用しにくくなることが知られている。従って、海水や食品サンプルから誘電体微粒子を分離回収する場合、高導電率媒質に対して有効に菌濃縮が行える機構を構築する必要がある。これらの処理については、一般的に、遠心分離法及びろ過法が有効であるが、前者は，処理中に発生する対象物（細胞，微生物）の損傷や回収率低下の問題があり、後者は一般的であるが、使用するろ過膜の目詰まりによって、対象物の回収に時間を要するという問題がある。

そこで有効な手段の一つが、クロスフロー方式と呼ばれる膜ろ過法である。原料を分離膜に対して垂直に加圧して分離する通常のろ過方法に対し、原料を分離膜に対し水平に流しながら加圧・ろ過する方式のことをいう。ろ過後の膜上の残渣を回収する場合や、固形物が多く分離膜が目詰まりしやすい原料をろ過する場合に適している。この原理を利用することによって，高効率で導電率に影響する電解物質を媒質から分離することができる。

この手法を、誘電体微粒子濃縮装置の前処理機構として併用することにより、高導電媒質サンプルからの誘電体微粒子の回収を可能とする。

本発明によれば、誘電体微粒子を含む試料液を誘電泳動電極に捕集し、誘電泳動電極にリリース液を貫流して、誘電泳動電極によって捕集された誘電体微粒子を濃縮して回収することができる。また、誘電体微粒子を濃縮して回収する前に、誘電泳動電極によって捕集された誘電体微粒子に対して標識化物質を作用させるための染色液を施して、誘電体微粒子を染色することによって、回収後に誘電体微粒子を測定する際の染色工程が不要となり、染色された誘電体微粒子を標的菌として測定装置に提供することが可能となる。

以下、本発明を実施するための最良の形態について、図面に基づいて説明する。

［概略］
図１は、本発明の実施の形態に係る誘電体微粒子濃縮装置１の概略図である。

図１に示す誘電体微粒子濃縮装置１は、試料液保持部１０と、セル１１と、リリース液保持部１２と、回収部１３と、から主に構成されており、その他、流路系統には、流路系への流量を制御可能な送液ポンプＰ、流路系の方向及び流量を制御可能な電磁弁Ｖ_１，Ｖ_２，Ｖ_３が設けられ、誘電体微粒子濃縮装置１には、送液ポンプＰ及び電磁弁を制御するコントロールユニット１４、セル１１の誘電泳動電極に電圧を印加する精密電圧発生装置１５、電圧測定装置１６が接続されている。

試料液保持部１０は、検査対象となる誘電体微粒子としての微生物を含む試料液を保持するものであり、試料液をセル１１の誘電泳動電極１１ａ〜１１ｃに貫流するために試料液を流入出する。なお、試料液は、予め濾過することによって粗大コンタミを除去することが好ましく、また、イオン交換樹脂等を介した脱イオン処理を施すことによって、高導電率を有する物質を除去することが好ましい。なお、誘電体微粒子としては、微生物の他に、ナノウィルス、カビ、ナノパーティクル等も含まれる。

リリース液保持部１２は、誘電泳動電極に貫流させて、誘電泳動電極によって捕集された微生物をリリースするためのリリース液を保持している。リリース液は、りん酸緩衝液など、誘電泳動電極に捕集されている微生物をそのままの状態で回収することができるものを使用する。

回収部１３は、誘電泳動電極によって捕集された微生物を回収するものであり、回収された微生物をさらに別の分析装置に利用するなど、様々な用途が可能である。試料液保持部に保持された試料液から微生物のみを回収することができるので、例えば試料液１００ｃｃに含まれる微生物を１ｃｃの溶液に濃縮して回収することができる。

［セル］
図２は、セル１１の概略図、図３は、セル１１内の誘電泳動電極のパターン図である。

セル１１は、基板（ａ）に流入口（ｈ）と流出口（ｉ）とが設けられ、流路（ｄ）を図面上右から左に試料液が流れるように構成されている。流路（ｄ）を構成する流路カバー（ｂ）の材質は、ガラス、アクリル、軟性ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等であって、限定されない。また、セル１１には、誘電泳動電極部（ｆ）がその流路（ｄ）中に設けられている。

誘電泳動電極部（ｆ）は、図３に示すように、１０本の電極を等間隔に並列配置しており、同形の電極１０本を対面から交互に組み合わせることによって、櫛形の電極群（捕集部（ｅ））を構成してなる。例えば、１本の電極は幅１００μｍであって、電極の間隔は１０μｍとすることができる。また、電極には、微生物や細胞などの非特異的反応を抑制して、その吸着を防止する界面親和剤（主成分：りん脂質）を被膜として被覆している。

なお、誘電泳動電極部（ｆ）は、石英ガラス基板上にクロム、金、チタン等の誘電泳動力が働く材質を蒸着して作製しているが、基板は絶縁体であれば限定されない。

［流路系］
図４は、本発明の実施の形態に係る誘電体微粒子濃縮装置１の流路系概略図である。

本発明の実施の形態に係る誘電体微粒子濃縮装置１は、試料液保持部１０と、セル１１と、リリース液保持部１２と、回収部１３と、染色液保持部１７と、洗浄液保持部１８と、から主に構成されており、その他、流路系統には、流路系への流量を制御可能な送液ポンプＰ、電磁弁Ｖ_１，Ｖ_２，Ｖ_３，Ｖ_４，Ｖ_５が設けられている。

なお、電磁弁Ｖ_１はセル１１への流入方向を制御可能な流入方向制御手段、電磁弁Ｖ_５はセル１１からの流出方向を制御可能な流出方向制御手段として機能する。また、電磁弁Ｖ_２は流入方向制御手段と接続された第１方向制御手段、電磁弁Ｖ_３及びＶ_４は、それぞれＴ字継手１９を介して第１方向制御手段と接続された第２方向制御手段及び第３方向制御手段として機能する。それぞれの方向制御手段は、流出方向の制御のほかに流量の制御も可能である。

染色液保持部１７は、誘電泳動電極によって捕集された微生物に対して標識化物質を作用させるための染色液を保持するものである。染色液は、６−カルボキシルフルオレセイン・ジアセテートをアセトンで希釈したＣＦＤＡアセトン溶液等を用いることができる。

洗浄液保持部１８は、誘電体微粒子濃縮装置１の流路系を洗浄するための洗浄液を保持するもので、誘電泳動電極によって捕集された微生物をリリースする前に流路系を洗浄したり、使用後の誘電体微粒子濃縮装置１の流路系を洗浄したりする際に用いる。

リリース液保持部１２と接続される電磁弁Ｖ_４の一端は、断続的に開放されることでリリース液内に気泡を断続的に混入することができる。また、気泡を混入するために、図示しない気泡を流入する装置を接続して、電磁弁Ｖ_４の開閉動作によって断続的な気泡の混入も可能である。

試料液保持部１０とセル１１とは流路Ｆ_１，Ｆ_２で接続され、流路Ｆ_１−Ｆ_２間には電磁弁Ｖ_１が設けられている。また、セル１１と試料液保持部１０とは流路Ｆ_３，Ｆ_５で接続され、流路Ｆ_３−Ｆ_５間には電磁弁Ｖ_５が設けられている。なお、流路Ｆ_３には送液ポンプＰが設けられ、ポンプの正転動作によって図面右向き、逆転動作によって図面左向きに流水される。

セル１１と回収部１３とは流路Ｆ_３，Ｆ_４で接続され、流路Ｆ _３ −Ｆ _４ 間には電磁弁Ｖ₅が設けられている。

続いて、流路Ｆ_２を通してセル１１に流入される染色液、リリース液、洗浄液の流路系について説明する。

染色液、リリース液、洗浄液は、いずれかが択一的にセル１１に流入されることから、流路Ｆ_７を主路として、流路Ｆ₇−Ｆ_２間には電磁弁Ｖ_１が設けられている。

染色液は、染色液保持部１７に接続された流路Ｆ_６から供給され、電磁弁Ｖ₂によって流路Ｆ_６−Ｆ_７が開通されることでセル１１に流入することが可能となる。

リリース液は、リリース液保持部１２に接続された流路Ｆ₁₀から供給され、電磁弁Ｖ₄によって流路Ｆ₁₀−Ｆ₉が開通され、さらに、電磁弁Ｖ₂によって流路Ｆ₈−Ｆ_７が開通されることでセル１１に流入することが可能となる。なお、流路Ｆ_８−Ｆ_９間にはＴ字継手１９が設けられているが、流路Ｆ_８−Ｆ_９は常時開通している。

洗浄液は、洗浄液保持部１８に接続された流路Ｆ_１２から供給され、電磁弁Ｖ_３によって流路Ｆ_１２−Ｆ_１１が開通され、電磁弁Ｖ₂によって流路Ｆ₈−Ｆ_７が開通されることでセル１１に流入することが可能となる。なお、流路Ｆ_８−Ｆ₁₁間にはＴ字継手１９が設けられているが、流路Ｆ_８−Ｆ₁₁は常時開通している。

以上の流路系を確保するために使用される電磁弁のうち、Ｖ_１，Ｖ_２，Ｖ_４，Ｖ_５は３方向からの接続を確保するために三方電磁弁を使用するが、３方向からの接続を確保できるものであれば、その種類を問わず、例えば、四方電磁弁のうち１方向を遮断することによって、実質的に三方電磁弁と同じ機能を有するものも含まれる。また、Ｖ_３は二方電磁弁を使用するが、２方向からの接続を確保できるものであれば、その種類を問わず、例えば、三方電磁弁のうち１方向を遮断することによって、実質的に二方電磁弁と同じ機能を有するものも含まれる。

また、電磁弁Ｖ_１は、流路Ｆ_１−Ｆ_２と流路Ｆ_７−Ｆ_２とを形成するように、Ｆ_２が共通ポートに接続される。電磁弁Ｖ_２は、流路Ｆ₆−Ｆ₇と流路Ｆ₈−Ｆ₇とを形成するように、Ｆ₇が共通ポートに接続される。電磁弁Ｖ₃は、流路Ｆ₁₁−Ｆ₁₂を形成するように接続される。電磁弁Ｖ₄は、流路Ｆ₁₀−Ｆ₉を形成し、気泡を流路Ｆ_９に断続的に混入させるために、Ｆ₉が共通ポートに接続される。電磁弁Ｖ₅は、流路Ｆ₃−Ｆ₅と流路Ｆ_３−Ｆ_４とを形成するように、Ｆ_３が共通ポートに接続される。

なお、電磁弁Ｖ_１は、流出側にセル１１が、流入側に試料液保持部１０と電磁弁Ｖ_２乃至Ｖ_４を介した染色液保持部１７，リリース液保持部１２，洗浄液保持部１８が接続され、共通ポートとして接続されたセル１１に、試料液保持部１０からの試料液を流入するか、或いは、染色液保持部１7からの染色液，リリース液保持部１２からのリリース液，洗浄液保持部１８からの洗浄液のいずれかを流入するかを制御するものである。また、電磁弁Ｖ_５は、流入側にセル１１が、流出側に試料液保持部１０又は廃液保持部２０と回収部１３が接続され、共通ポートとして接続されたセル１１から流出される試料液又は廃液を試料液保持部１０又は廃液保持部２０に流入するか、捕集された微生物を濃縮液として回収部１３に流入するか、のいずれかを制御するものである。

［捕集工程］
図５は、本発明の実施の形態に係る誘電体微粒子濃縮装置１を使用して微生物を捕集する捕集工程を説明するための流路系概略図である。

微生物を捕集する捕集工程においては、試料液保持部１０から供給される試料液をセル１１内の誘電泳動電極に貫流して、セル１１から流出する試料液を試料液保持部１０に戻す。これを何度も繰り返すことで、試料液をセル１１内に循環させ、試料液に含まれる微生物の捕集を確実にする。この際、誘電泳動電極には正弦波電圧を印加することで、電極間の電極ギャップ部分に誘電体である微生物を捕集することができる。

流路系は、試料液保持部１０から試料液を流出する流路Ｆ_１と試料液保持部１０に試料液を流入（還流）する流路Ｆ_５とを確保するために、電磁弁Ｖ_１によって流路Ｆ_１−Ｆ_２を開通し、電磁弁Ｖ_５によって流路Ｆ₃−Ｆ₅を開通することで、流路Ｆ_１−Ｆ_２−Ｆ_３−Ｆ_５が形成される。換言すれば、微生物を捕集する捕集工程においては、本発明は微生物の濃縮を主目的としていることから、試料液保持部１０とセル１１との流路系統を確保し、試料液自体が回収部１３に回収されないように回収部１３との流路系統を断ち、また、リリース液保持部１２，染色液保持部１７，洗浄液保持部１８との流路系統を断つように流路が形成される。また、試料液保持部１０とセル１１とを循環する閉ループ流路を形成して、試料液をセル１１内に循環させ、試料液に含まれる微生物の捕集を確実にする。

［染色工程］
図６は、本発明の実施の形態に係る誘電体微粒子濃縮装置１を使用して捕集した微生物を染色する染色工程を説明するための流路系概略図である。

微生物を染色する染色工程においては、染色液保持部１７から供給される染色液をセル１１内の誘電泳動電極に貫流して、セル１１から流出する染色液を廃液保持部２０に戻す。この際、誘電泳動電極には正弦波電圧を印加しておき、捕集された微生物が染色液とともに剥離されて流出しないようにする。なお、廃液保持部２０は、試料液保持部１０と兼用することとしてもよい。

流路系は、染色液保持部１7から染色液を流出する流路Ｆ₆とセル１１に染色液を貫流するための流路Ｆ_２とを確保するために、電磁弁Ｖ₂によって流路Ｆ₆−Ｆ₇を開通し、電磁弁Ｖ₁によって流路Ｆ₇−Ｆ₂を開通する。さらに、セル１１から染色液（染色廃液）を流出して廃液保持部２０に流入するための流路Ｆ_３−Ｆ_５を電磁弁Ｖ_５によって形成する。これにより、流路Ｆ₆−Ｆ₇−Ｆ₂−Ｆ₃−Ｆ_５が形成される。換言すれば、微生物を染色する染色工程においては、染色液保持部１７とセル１１と廃液保持部２０との流路系統を確保し、染色液自体が回収部１３に回収されないように回収部１３との流路系統を断ち、また、リリース液保持部１２，洗浄液保持部１８との流路系統を断つように流路が形成される。また、染色液保持部１７とセル１１と廃液保持部２０との開ループ流路を形成して、染色液保持部１７にセル１１からの染色廃液が流入されることのないようにする。

［リリース前洗浄工程］
図７は、本発明の実施の形態に係る誘電体微粒子濃縮装置１を使用して捕集した微生物をリリースする前のリリース前洗浄工程を説明するための流路系概略図である。

リリース前洗浄工程は、セル１１の誘電泳動電極によって捕集された微生物を回収する前に、染色工程によって染色液が流れた流路Ｆ₆−Ｆ₇−Ｆ₂−Ｆ₃−Ｆ₅と、リリース工程によって微生物を回収する流路Ｆ_１０−Ｆ_９−Ｆ_８−Ｆ_７−Ｆ_２−Ｆ_３−Ｆ_４とのうち、染色工程によって残存する染色液がリリース液と混入して回収部１３に回収されることのないように、両工程に共通する流路のうち、特にリリース液に染色液が混入する可能性が高い流路Ｆ_７，Ｆ_２，Ｆ_３とそれらに接続されるセル１１や送液ポンプＰを洗浄することを目的とするものである。

リリース前洗浄工程においては、洗浄液保持部１８から供給される洗浄液をセル１１内の誘電泳動電極に貫流して、セル１１から流出する洗浄液（洗浄廃液）を廃液保持部２０に戻す。この際、誘電泳動電極には正弦波電圧を印加しておき、捕集された微生物が洗浄液とともに剥離されて流出しないようにする。なお、廃液保持部２０は、試料液保持部１０と兼用することとしてもよい。

流路系は、洗浄液保持部１８から洗浄液を流出する流路Ｆ₁₂とセル１１に洗浄液を貫流するための流路Ｆ_２とを確保するために、電磁弁Ｖ _３ によって流路Ｆ_１２−Ｆ_１１を開通し、電磁弁Ｖ₂によって流路Ｆ₈−Ｆ₇を開通し、電磁弁Ｖ₁によって流路Ｆ₇−Ｆ₂を開通する。さらに、セル１１から洗浄廃液を流出して廃液保持部２０に流入するための流路Ｆ_３−Ｆ_５を電磁弁Ｖ_５によって形成する。なお、流路Ｆ_１１−Ｆ_８は、Ｔ字継手１９によって常時形成されている。これにより、流路Ｆ₁₂−Ｆ₁₁−Ｆ₈−Ｆ₇−Ｆ₂−Ｆ_３−Ｆ_５が形成される。換言すれば、リリース前洗浄工程においては、洗浄液保持部１８とセル１１と廃液保持部２０との流路系統を確保し、洗浄液自体が回収部１３に回収されないように回収部１３との流路系統を断ち、また、染色液保持部１７，リリース液保持部１２との流路系統を断つように流路が形成される。また、洗浄液保持部１８とセル１１と廃液保持部２０との開ループ流路を形成して、洗浄液保持部１８に洗浄廃液が流入されることのないようにする。

なお、Ｔ字継手１９を用いることによって、洗浄液が流路Ｆ_９に残存することとなり、リリース工程の際に残存する洗浄液とリリース液とが混ざる可能性がある。これが許されない場合は、Ｔ字継手を三方弁にする。この場合は、流路Ｆ_９−Ｆ_８と流路Ｆ_１１−Ｆ_８を形成する必要があることから、Ｆ_８を共通ポートに接続する。

［リリース工程］
図８は、本発明の実施の形態に係る誘電体微粒子濃縮装置１を使用して捕集した微生物をリリースするリリース工程を説明するための流路系概略図である。

リリース工程においては、リリース液保持部１２から供給されるリリース液をセル１１内の誘電泳動電極に貫流して、誘電泳動電極に捕集されている微生物を剥離させ、リリース液とともに濃縮液として回収部１３に回収する。この際、誘電泳動電極への電圧印加は停止しておき、捕集された微生物がリリース液とともに剥離されて流出するようにする。リリース液供給の際に、気泡を断続的に混入することで、誘電泳動電極に捕集されている微生物をより容易に剥離させることができる。なお、断続的としたのは、電磁弁Ｖ_４の機能上、流路Ｆ_１０−Ｆ_９を形成するか、気泡混入のために開放された側とＦ_９との流路を形成するかの択一的な選択しかできないために、リリース液か気泡かを択一的に供給することとなるからである。

また、リリース工程において供給するリリース液は試料液よりも少量とすることで、微生物を濃縮して回収することができる。

流路系は、リリース液保持部１２からリリース液を流出する流路Ｆ₁₀とセル１１にリリース液を貫流するための流路Ｆ_２とを確保するために、電磁弁Ｖ₄によって流路Ｆ₁₀−Ｆ₉を開通し、電磁弁Ｖ₂によって流路Ｆ₈−Ｆ₇を開通し、電磁弁Ｖ₁によって流路Ｆ₇−Ｆ₂を開通する。さらに、セル１１からリリース液を含む微生物を流出して回収部１３に流入するための流路Ｆ_３−Ｆ₄を電磁弁Ｖ_５によって形成する。なお、流路Ｆ₉−Ｆ_８は、Ｔ字継手１９によって常時形成されている。これにより、流路Ｆ₁₀−Ｆ₉−Ｆ₈−Ｆ₇−Ｆ₂−Ｆ_３−Ｆ₄が形成される。換言すれば、リリース工程においては、リリース液保持部１２とセル１１と回収部１３との流路系統を確保するように流路が形成される。また、リリース液保持部１２とセル１１と回収部１３との開ループ流路を形成して、微生物を濃縮して回収する。

［洗浄工程］
図９、図１０は、本発明の実施の形態に係る誘電体微粒子濃縮装置１の流路系を洗浄する洗浄工程を説明するための流路系概略図である。

図９においては、濃縮液回収後に回収部１３を廃液保持部２０に替えて、洗浄液保持部１８とセル１１と廃液保持部２０との流路系統を確保する。すなわち、電磁弁Ｖ_３によって流路Ｆ_１２−Ｆ_１１を開通し、電磁弁Ｖ_２によって流路Ｆ_８−Ｆ_７を開通し、電磁弁Ｖ_１によって流路Ｆ_７−Ｆ_３を開通し、電磁弁Ｖ_５によって流路Ｆ_３−Ｆ_４を開通することで、流路Ｆ₁₂−Ｆ₁₁−Ｆ₈−Ｆ₇−Ｆ₂−Ｆ_３−Ｆ₄が形成されるので、かかる流路の洗浄が可能となる。

図１０においては、流路Ｆ_５を洗浄するために、洗浄液保持部１８を流路Ｆ_１に接続し、廃液保持部２０を流路Ｆ_５に接続する。すなわち、電磁弁Ｖ_１によって流路Ｆ_１−Ｆ_２を開通し、電磁弁Ｖ_５によって流路Ｆ_３−Ｆ_５を開通することで、流路Ｆ_１−Ｆ₂−Ｆ_３−Ｆ_５が形成されるので、かかる流路の洗浄が可能となる。

［クロスフロー］
図１１は、本発明の実施の形態に係る誘電体微粒子濃縮装置１の前処理機構であるクロスフロー装置２の流路系概略図である。

クロスフロー装置２は、導入部３０と、濃縮サンプル部３１と、ろ液回収部３２と、クロスフロー部３３と、から主に構成されており、その他流路系統には送液ポンプＰ、適宜にバルブが設けられている。

導入部３０は、クロスフロー前のサンプル液又は洗浄液が保持してクロスフロー装置２内にいずれかの液が導入される。準備工程及び濃縮工程においてはサンプル液が、洗浄工程においては洗浄液が導入される。導入部３０は流路Ｆ_３０によって接続されている。

濃縮サンプル部３１は、クロスフロー部３３で分離された誘電体微粒子（微生物）を含む溶液を回収するもので、流入路Ｆ_３１と流出路Ｆ_３３とによって接続されている。なお、誘電体微粒子濃縮装置１とクロスフロー装置２とを組み合わせて使用する場合は、濃縮サンプル部３１を試料液保持部１０と同一に又は連結して構成することも可能である。

ろ液回収部３２は、クロスフロー部３３で分離された電解物質を含む溶液を回収するもので、流入路Ｆ_３４によって接続されている。

クロスフロー部３３は、電解物質を分離するために、電解物質を透過可能で誘電体微粒子（微生物）を透過し難い中空糸膜を有し、流入路Ｆ_３３と流出路Ｆ_３２及びＦ_３４によって接続されている。

上記構成を有するクロスフロー装置２を使用して電解物質を分離する工程について説明すると、まず、流路Ｆ_３０−Ｆ_３１−Ｆ_３３−Ｆ_３２を形成して、換言すれば、導入部３０と濃縮サンプル部３１とクロスフロー部３３とを連通させて、導入部３０からクロスフロー前のサンプル液が上記形成された流路に充填される（準備工程）。

次に、流路Ｆ_３０−Ｆ_３１−Ｆ_３３−Ｆ_３２，Ｆ_３４を形成して、換言すれば、導入部３０と濃縮サンプル部３１とろ液回収部３２とクロスフロー部３３とを連通させて、クロスフロー部３３によって電解物質を分離する（濃縮工程）。具体的には、送液ポンプＰからの圧力により中空糸膜の孔径より小さい成分である電解物質は透過してろ液回収部３２に回収される。一方、中空糸膜の孔径より大きい成分である誘電体微粒子（微生物）は透過せずに中空糸膜上に残る。また、ろ液としてろ液回収部３２に回収された液量に相当する量のクロスフロー前のサンプル液が導入部３０から導入される。この濃縮工程は、導入部３０のサンプル液がなくなるまで続ける。

導入部３０のサンプル液がなくなると、流路Ｆ_３０−Ｆ_３１−Ｆ_３３−Ｆ_３２，Ｆ_３４を形成したまま、導入部３０を洗浄液（純水）に変えて、洗浄液を導入する（洗浄工程）。中空糸膜上や流路中に残った誘電体微粒子（微生物）を濃縮サンプル部３１に流し込む。

最後に、流路Ｆ_３０とＦ_３４を断ち、流路Ｆ_３３−Ｆ_３２−Ｆ_３１によって、流路中に残留している濃縮サンプルを別に導入する少量の洗浄液で洗い出して濃縮サンプル部３１に流し込む（回収工程）。

このようにして、濃縮サンプル部３１に導電率を低減させた試料液が貯留される。なお、濃縮量は、準備工程で濃縮サンプル部３１に充填したクロスフロー前のサンプル液と洗い出しに用いた洗浄液量とから決定することができる。

図１２は、クロスフローによる媒質の導電率低減を示す図であり、人工海水を使用して実験を行った結果、クロスフロー回数が増えるに従って媒質の導電率が低減していることがわかる。

本発明に係る誘電体微粒子濃縮装置は、微生物を含む多量の試料液から、微生物を濃縮した濃縮液として標的菌を回収することができるので、高迅速・高効率の捕集技術が求められる際に、標的菌を短時間で濃縮し得るものとして有用である。

また、微生物を濃縮して回収する前に染色液を施すことで染色された微生物を標的菌として測定装置に提供することが可能となる。これは、別に提供される測定装置において、染色液が装置各部に付着することによる測定精度の劣化等を防止するとともに、装置各部の劣化を防止するものとして有用である。

本発明の実施の形態に係る誘電体微粒子濃縮装置の概略図。 セルの概略図。 セル内の誘電泳動電極のパターン図。 本発明の実施の形態に係る誘電体微粒子濃縮装置の流路系概略図。 本発明の実施の形態に係る誘電体微粒子濃縮装置を使用して微生物を捕集する捕集工程を説明するための流路系概略図。 本発明の実施の形態に係る誘電体微粒子濃縮装置を使用して捕集した微生物を染色する染色工程を説明するための流路系概略図。 本発明の実施の形態に係る誘電体微粒子濃縮装置を使用して捕集した微生物をリリースする前のリリース前洗浄工程を説明するための流路系概略図。 本発明の実施の形態に係る誘電体微粒子濃縮装置を使用して捕集した微生物をリリースするリリース工程を説明するための流路系概略図。 本発明の実施の形態に係る誘電体微粒子濃縮装置の流路系を洗浄する洗浄工程を説明するための流路系概略図。 本発明の実施の形態に係る誘電体微粒子濃縮装置の流路系を洗浄する洗浄工程を説明するための流路系概略図。 本発明の実施の形態に係る誘電体微粒子濃縮装置の前処理機構であるクロスフロー装置の流路系概略図。 クロスフローによる媒質の導電率低減を示す図。

符号の説明

１ 誘電体微粒子濃縮装置
２ クロスフロー装置
１０ 試料液保持部
１１ セル
１２ リリース液保持部
１３ 回収部
１４ コントロールユニット
１７ 染色液保持部
１８ 洗浄液保持部
１９ Ｔ字継手
２０ 廃液保持部
３０ 導入部
３１ 濃縮サンプル部
３２ ろ液回収部
３３ クロスフロー部
Ｐ 送液ポンプ
Ｖ_ｎ 電磁弁
Ｆ_ｎ 流路

Claims (5)

1. 検査対象となる誘電体微粒子を含む試料液を保持する試料液保持部と、
   前記誘電体微粒子を誘電泳動力によって捕集する誘電泳動電極を備えるセルと、
   前記誘電泳動電極に貫流するリリース液を保持するリリース液保持部と、
   前記誘電泳動電極によって捕集された誘電体微粒子に対して標識化物質を作用させるための染色液を保持する染色液保持部と、
   流路系を洗浄するための洗浄液を保持する洗浄液保持部と、
   前記リリース液保持部から供給されるリリース液を前記誘電泳動電極に貫流して、当該誘電泳動電極によって捕集された誘電体微粒子を回収する回収部と、
   を有し、
   前記試料液保持部、前記染色液保持部、前記リリース液保持部又は前記洗浄液保持部からの各液を前記セルに択一的に貫流させる第１流路と、前記セルから排出された各液を前記回収部に回収させるか否かの分岐を有する第２流路と、前記リリース液保持部又は前記洗浄液保持部からの各液を流す流路を含み前記染色液保持部、前記リリース液保持部又は前記洗浄液保持部からの各液を前記第１流路に流す第３流路と、を形成し、
   誘電体微粒子を捕集する際には、前記試料液保持部と前記セルとで前記第１流路及び前記第２流路を含む閉ループ流路を形成して、試料液を循環させ、
   誘電体微粒子を染色する際には、前記染色液保持部と前記セルとで前記第１流路を含む流路を形成するとともに、前記セルから排出された染色液を前記回収部に回収させない第２流路を含む流路を形成して、染色液を前記セル内に貫流させ、
   誘電体微粒子をリリースして回収する際には、前記リリース液保持部と前記セルと前記回収部とで前記第１流路、前記第２流路及び前記第３流路を含む流路を形成して、リリース液を前記セル内に貫流させるものであって、
   前記セルに捕集された誘電体微粒子に対して標識化物質を作用させた後、標識化物質を作用させた誘電体微粒子を回収する前に、染色液が流れる流路とリリース液が流れる流路とに共通する前記第１流路、前記第２流路及び前記第３流路に前記洗浄液保持部から洗浄液を流すことを特徴とする誘電体微粒子濃縮装置。
2. 前記セルに捕集された誘電体微粒子を回収した後、前記第１流路、前記第２流路及び前記第３流路に前記洗浄液保持部から洗浄液を流すことを特徴とする請求項１記載の誘電体微粒子濃縮装置。
3. 前記リリース液保持部から供給されるリリース液を前記誘電泳動電極に貫流する際に、リリース液内に気泡を混入することを特徴とする請求項１記載の誘電体微粒子濃縮装置。
4. 前記誘導泳動電極は、タンパク質の吸着を防止する被膜で被覆されていることを特徴とする請求項１記載の誘電体微粒子濃縮装置。
5. 前記試料液は、導電率に影響する電解物質を予め分離したことを特徴とする請求項１記載の誘電体微粒子濃縮装置。

Images