JP4531558B2 - 免疫細胞を含む3次元膣組織モデル - Google Patents
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Description
本出願は、2002年6月7日に出願された米国仮出願10/165,267号に係る優先権を主張し、その内容は、本明細書に参照により組み込まれる。
政府の財政支援
本明細書において記載されている仕事は、国立衛生研究所により与えられたSBIR Grant 1R43 AI047792-01のもとに支援された。したがって、米国政府は本発明において一定の権利を有することができる。
膣組織における外在性および内在性の剤の効果を研究するために、数多くのインビトロモデルが用いられてきた。今日までに開発された各モデルは有用ではあるが、重大な欠点に苦しんできた。
単層培養における膣上皮細胞は、基礎の生化学研究のために、そしてホルモン、成長因子および外在性の剤の子宮頚部(cervical)および膣組織における効果を決定するために、用いられてきた。性感染症に関与する感染のメカニズムを調べるために、浮遊培養(suspension culture)における血液由来の樹状細胞およびT細胞と併せて、子宮頚部または膣細胞の単層培養が用いられてきた。しかし、単層培養の細胞は、正常組織に見出される分化能およびバリヤ特性を欠如している。よって、単層または浮遊細胞による結果は正常ヒト子宮頚−膣組織に適用できない場合がある。
co-receptor)を発現している、膣上皮において発見されたランゲルハンス細胞が、HIV-1感染の最初の標的であり、感染したランゲルハンス細胞がHIVをCD4+T細胞に感染させることを示唆してきた(Cohen, M.S., Lancet, 351 (supp III), 5-7 (1998))。またランゲルハンス細胞は、インビボにおけるHIV/SIV複製のための重要な宿主(reservoir)であることも示されている(Hu, J., et al. , Lab. Invest., 78, 435-451 (1998)。しかし、HIVの複製がT細胞の存在下でのみ起こるということを示す研究(Granelli-Piperno, A., Steinman, R.M., et al., Curr. Biol., 14, 21-29 (1999))などの研究、およびCD4-である子宮頚部−膣細胞の直接的なHIV-1の感染の報告は、HIV感染におけるランゲルハンス細胞の役割について論議を持続させている。
1つの側面においては、本発明は、膣上皮細胞および免疫細胞からなる、空気−液体界面(air-liquid interface)で培養された、子宮頚−膣組織相当物(cervico-vaginal tissue equivalent)に関する。子宮頚−膣組織相当物は、任意に無血清培地中で生成されてもよい。膣上皮細胞、免疫細胞、または両方はヒト由来であってもよい。膣上皮細胞、免疫細胞、または両方は、初代細胞、継代された初代細胞、形質転換細胞、または不死化細胞であってもよい。子宮頚−膣組織相当物の初代または継代された初代膣上皮細胞は、正常ヒト子宮頚部組織、正常ヒト子宮頚管組織、病態のヒト子宮頚部組織、または病態のヒト子宮頚管組織由来であってもよい。子宮頚−膣組織相当物の免疫細胞は、ランゲルハンス細胞、ランゲルハンス前駆細胞(CD34+)、単球(CD14+)、未熟樹状細胞(CD1a+、CD4+)、成熟樹状細胞(CD86+、HLA-DR++)、T細胞(CD3+)、マクロファージ、またはこれらのいずれかの組合せであってもよい。子宮頚−膣組織相当物の免疫細胞はHLA-DRを発現している。免疫細胞は、例えばランゲルハンス前駆細胞または単球から、インビトロで産生されてもよい。
または、あるいはさらに、前記の方法は、共培養するステップの後に、共培養された(co-cultured)播種細胞中に、追加の免疫細胞をさらに播種するステップ、および、分化に適切な条件下で、播種された細胞を空気−液体界面にてさらに共培養するステップをさらに含むこともできる。
子宮頚−膣組織相当物を製造するための方法において用いられる免疫細胞は、提供するステップの前に、未熟または成熟樹状細胞として単離されてもよい。
図1は、空気−液体界面で培養される子宮頚−膣組織の概略図である。栄養素および成長因子は、組織培養インサート(tissue culture insert)の底部で膜を介して浸透する、基本コンパートメントに配置された培地から組織に供給されている。頂端側の(apical)組織表面には培養培地が存在しないので、病原体や殺菌剤などの試験物質の局所適用が可能になる。
図2は、市販の殺精子剤ノノキシノール−9(nonoxynol-9)(2%)への暴露時間に対して、インビトロで産生された子宮頚−膣組織の組織生存率をプロットする用量作用曲線である。組織生存率を50%まで減少させるのに必要な暴露時間(ET-50)のグラフによる決定が説明されている。
本発明の側面は、本明細書に記載されている3次元子宮頚−膣組織相当物の開発に関する。子宮頚−膣組織相当物は、インビボの組織に由来する膣および/または子宮頚部上皮細胞を、インビボの組織の形態を強く反映する3次元細胞組織の状態で含む。インビボの組織と同様に、本発明の組織相当物はまた機能的に取り込まれた免疫細胞を含み、免疫応答性である。これらの性質を有する子宮頚−膣組織相当物は、当分野で現在利用できる他の既知のモデルよりも、インビボの膣組織の性質をより正確に反映するインビトロモデルシステムを供給する。そのようなものとして、子宮頚−膣組織相当物は、外来性の剤の膣組織における効果をより正確に決定するために、そして性感染症病原体の感染を研究するために、用いられてもよい。
1つの側面においては、本発明は、インビボの膣および子宮頚部を表す3次元モデルを製造するために、空気−液体界面においてインビトロで培養された、膣上皮細胞および免疫細胞の両方からなる子宮頚−膣組織相当物に関する。子宮頚−膣組織相当物は、インビボの膣組織と同様の細胞組織、形態および組織像を有することを特徴とする。例えば、1つの態様においては、子宮頚−膣組織相当物の頂端側の表面には、微小隆線(microridge)が存在し、組織の頂端側の表面の近くに見出される組織の細胞は、ジッパー様のパターンで高度にかみ合っている。1つの態様においては、組織の下のほうの層に位置する細胞の間にデスモソームが存在する。
1つの態様においては、組織がその上で生育する支持体は、インビボの膣組織において天然に存在する細胞を含む(例えば、膣線維芽細胞または免疫細胞)。かかる支持体が用いられる場合には、支持体中に存在する細胞の一部は、育成している組織に機能的に取り込まれることが期待される。細胞の種類に依存して、ある細胞は基底層に残ってもよく、また、さらに頂端側の層に遊走してもよい。
本発明の他の側面は、本明細書において記載される子宮頚−膣組織相当物を作製する方法に関する。子宮頚−膣組織相当物の製造のために開発された本方法は、かなりの量の実験の結果である。
「膣上皮細胞」の語は、膣および子宮頚部の上皮細胞を含むことが意図される。「免疫細胞」の語は、ランゲルハンス細胞、ランゲルハンス前駆細胞(CD34+)、単球(CD14+)、未熟樹状細胞(CD1a+、CD4+)、成熟樹状細胞(CD86+、HLA-DR++)、T細胞(CD3+)、およびマクロファージを含む、膣および子宮頚部組織において天然に見出される免疫細胞、またはその前駆体の種類をいう。
提供される膣上皮細胞および免疫細胞は、空気−液体界面における培養のために適した条件下で一緒に播種される。これは、空気−液体界面において細胞の増殖を誘導する支持体上に細胞を播種することを伴う。支持体に対する要求の1つは、培地が下から細胞に通り抜けることができるのに充分なほど多孔性であることである。適切な支持体は、下記で詳細に議論される。
播種のための好ましい容器は、細胞培養インサートであり、種々のものが当業者に知られ、入手できる。当業者は、壁があるおよび壁がない両方のさらなる容器を思い描くことができ、それは本方法における使用に充分であり、その全てが本発明により包含されることが意図される。容器が壁を有する場合には、容器の壁は、細胞が接着し、生育するための支持体として働く多孔性の基剤を有する、ポリスチレン、ポリカーボネート、樹脂、ポリプロピレンまたは他の生体適合性プラスチックからなってもよい。多孔性の基剤または支持体は、生育している組織の真下から培地が通過できるようにしなければならない。多孔性基剤は、ポリカーボネートの膜状基剤であってもよく、細胞がその上で培養される、底に付着したコラーゲン、水和性(wettable)フッ素ポリマー、セルロース、グラスファイバーまたはナイロン製の膜などの、他の培養生体適合性多孔性膜であってもよい。
1度支持体上に播種されると、細胞を上記の子宮頚−膣組織相当物への分化に適切な条件下での共培養のために空気−液体界面に上昇させる。便宜上、「共培養」の後およびその変化したものは、空気−液体界面での、互いに直接的または非直接的接触している2種類または3種類以上の細胞の増殖および/または分化を特定するのに用いられる。空気−液体界面での細胞の増殖および分化のための方法は、当分野において既知である。共培養は、例えば標準的組織培養インキュベーター中で、標準的条件下で、インキュベートされてよい。子宮頚−膣組織相当物への分化に適切な条件は、培養がインキュベートされる空気の温度および組成、培地の組成(下記で詳細に議論される)ならびに任意に生育している組織への追加の細胞のさらなる播種を含む。好ましい温度および空気は約5%CO2中で約37℃であるが、軽微な変更は許容されうる。
本発明の子宮頚−膣組織相当物をつくるための方法は、任意に上記に対する追加のステップを含んでもよい。
好ましい態様においては、一度細胞が空気−液体界面における増殖のために、支持体上に播種されると、共培養のために空気−液体界面に上昇させる前に、細胞増殖に適切な条件下で、増殖培地中で共液中培養される(co-cultivated)。「共液中培養(co-cultivation)」およびその変化したものは、培地中で、互いに直接的または非直接的接触している2種類または3種類以上の細胞の増殖および/または分化を特定するのに用いられる。1つの態様においては、液体(submerged)共液中培養は、約1日〜約21日の期間である。好ましい液体共液中培養期間は、2〜6日である。上記のようにフロースルー供給もまた液体増殖するのに用いられてもよい。
本発明の組織相当物への細胞の増殖および分化のために用いられる培地は、最終的な組織相当物の生成物の性質に影響を及ぼす。他に記載がなければ、本明細書において用いられている「培地」の語は、血清を含む培地および無血清培地の両方を含むことを意味する。「無血清培地」は、血清またはその分画された部分を含まない培地をいう。その化学的組成に関しては、無血清培地の全ての成分および量は、定義され、当分野の組織培養標準により相対的に純粋である。
アデニン、α−メラノサイト刺激ホルモン、アラキドン酸、β−線維芽細胞成長因子、ウシ下垂体抽出物、ウシ血清アルブミン、塩化カルシウム、仔牛血清、カルニチン、コレラ毒素、ジブチルサイクリックアデノシンモノホスフェート、エンドセリン−1、EGF(表皮成長因子)、エピネフリン、エストラジオール、エストロゲン、エタノールアミン、ウシ胎児血清、FLT-3(Fms様チロシンキナーゼ3)、グルカゴン、顆粒球/マクロファージ−コロニー刺激因子、肝細胞成長因子、ウマ血清、ヒト血清、ヒドロコルチゾン、インスリン、インスリン様成長因子1、インスリン様成長因子2、インターロイキン−1β、インターロイキン−3、インターロイキン−4、インターロイキン−6、インターロイキン−12、インターロイキン−18、イソブチルメチルキサンチン、イソプロテレノール、ケラチノサイト成長因子、リノール酸、MIP-1α(マクロファージ炎症性タンパク質−1α)、MIP-3α(マクロファージ炎症性タンパク質−3α)、ウシ新生仔血清、ノルエピネフリン、オレイン酸、パルミチン酸、ホスホエタノールアミン、プロゲステロン、幹細胞成長因子、トランスフェリン、形質転換成長因子−β1、トリヨードチロニン、腫瘍壊死因子α、ビタミンA、ビタミンB12、ビタミンC、ビタミンDおよびビタミンE。
本発明の別の側面は、子宮頚−膣組織相当物の使用方法に関する。本発明の子宮頚−膣組織相当物は、当分野における種々の異なる用途を有している。1つの側面においては、インビボの膣および子宮頸部組織のためのモデルシステムとして役に立つ。そのようなものとして、インビボ組織において用いられる物質(例えば殺精子剤、感染に対する医学的処置、および感染に対する予防薬)の起こり得る悪影響を決定するのに用いられてもよい。
例1−子宮頚−膣組織相当物の作製および特徴
樹状細胞、ランゲルハンス細胞、前駆細胞などの免疫細胞と共に、子宮頚部、子宮頚管上皮細胞の両方、または膣上皮細胞の供給源が子宮頚−膣組織相当物をつくるのに必要である。この例においては、初代子宮頚部上皮細胞をヒト子宮頚部組織から得た。ランゲルハンス細胞(CD1a+細胞)は、サイトカインを用いて、ランゲルハンス前駆細胞(CD34+細胞)を分化させることにより得られた。ランゲルハンス前駆細胞は、臍帯血サンプルからハーベストした。
上皮細胞は、子宮摘出(hysterectomy)を受けた女性から得られた子宮頚部組織および膣組織から得た。組織の手術による除去の後、組織をペニシリンストレプトマイシン(1 mg/ml)およびゲンタマイシン(0.5 mg/ml)の10×濃縮物を含むダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM)に入れ、組織を処理できるまで、4℃で保存した(24時間以内)。初代培養を開始するために、下にある結合組織を上皮層から切除した。ある実験においては、下にある結合組織は、膣線維芽細胞をハーベストするために残しておいた。上皮組織は、メスを用いて厚さ約1〜2mmの薄い切片に切った。次いで、切片を縦方向に何度も切り、上皮組織の小さい立方体をつくった。立方体は約2mm×2mm以下であった。その後、組織立方体を0.025% トリプシン/0.025%EDTAに入れて、1時間37℃および5%CO2でインキュベートした。組織およびトリプシン/EDTA混合物はこの間、時々穏やかに撹拌した。1時間後、培地を除き、600 X g で5 分間遠心し、子宮頚部および膣上皮細胞のペレットを得た。培地を遠心チューブから吸引除去し、細胞をLife Technologies (Rockville, MD)から市販されているリン酸緩衝生理食塩水(PBS)/大豆トリプシンインヒビター(STI) に再懸濁した。
精製されたCD34+細胞は、イムノマグネチックビーズ(immuno-magnetic bead)(Dynal Inc., Lake Success, NY)を用いて、臍帯血から単離した。細胞の生存率をトリパンブルー排除法を用いて確認された:生存率は受領した全てのサンプルにおいて>95%であった(n=10)。単離された細胞(2.5×105細胞/ml) は、11日間、幹細胞因子(SCF;25ng/ml)、顆粒球/マクロファージ−コロニー刺激因子(GM-CSF;200 U/ml)および腫瘍壊死因子(TNF-α;(2.5ng/ml)ならびに抗生物質を補充したStemSpan(登録商標)無血清増殖培地(SFEM, Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada)中で培養した。4日後、培地にさらにTGF-β1(0.5 ng/ml)をさらに補充し、11日まで培養を続けた。その後、細胞を計数し、ランゲルハンス細胞の重要なマーカーであるCD1aの存在に対してFACSを用いて特徴づけた。4つの代表的な帯血サンプルから得られたランゲルハンス前駆細胞の数を表1に示す。40mlの帯血が平均して31×106 ランゲルハンス細胞を産生し、そのうち、41%がCD1a+であった(n = 3 の調製物)。この方法で調製されたランゲルハンス前駆細胞は、すぐに上皮細胞と共に播種されるか、またはStemSpan(登録商標)無血清増殖培地(SFEM, Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada)および10%DMSOからなる凍結培地中でmlあたり5×105細胞で低温保存された。
PRGMに懸濁された2.5×105 個の子宮頚部上皮細胞(EEC)および無血清増殖培地に懸濁された2.5×105 個のランゲルハンス細胞を、NalgeneNunc International (Naperville, IL)から市販されている、ポリカーボネートの組織培養処理されている微小孔性膜(microporous membrane)細胞培養インサートに加えた。細胞培養インサートは、3日間37℃かつ5%CO2のインキュベーターで、1.8mlの増殖培地(PRGM)中で維持された。3日に、増殖培地を除き、RA 5×10-9M、ケラチノサイト成長因子(KGF) 0.1nM、ヒドロコルチゾン0.4μg/ml、インスリン5μg/mlを含むDMEM:F12(3:1)からなる分化培地に換えた。増殖培地と比較して、分化培地は、細胞培養インサートの微小孔性膜を通って、培養物の基底側(basolateral)(底)表面のみに対して補充された;すなわち、培養物の先端側(頂端側)表面は乾燥しているようにした。組織を培養するこの方法は、空気−液体界面(ALI)での培養として一般に言及されている。空気−液体界面での組織の培養のための装置の説明図を図1において示す。次の7日にわたって、RAの濃度を5×10-9M〜5×10-13Mに減らした。培地は1日おきに交換した。生成した組織は下記のように特徴づけられた。
インビトロで生成した組織およびインビボの子宮頚部−膣組織内のグリコーゲンの存在を、過ヨウ素酸シッフ(periodic acid Schiff) (PAS)試薬を用いて決定した。インビトロで作製された子宮頚部−膣組織および正常ヒト子宮頚部−膣組織のホルマリン固定断切片をPAS試薬と反応させ、標準的組織学的手法を用いてヘマトキシリンを用いてカウンター染色した(counter stained)(Carson, F. I., Histotechnology: Aself-instructional text, Amer. Soc. Clin. Pathologist Press, Chicago 112-117 (1997))。前記の2つを同様にして得られたものと比較した。
組織のサイトケラチンの解析のために、3〜5μm厚のパラフィン包埋断切片をスライドグラスにマウントし、抗原の探索のためにクエン酸塩緩衝液(pH 6.0)中で20分間95〜99℃で加熱することにより処理した。20分後、標本を水浴から取り出し、さらに20分間室温(RT)にて、クエン酸塩緩衝液中に立たせておいた。全ての抗体は、室温で30分間1:30の濃度で適用した。CK13(Sigmaから購入)、CK14(Research Diagnostics, Inc.から購入)、CK16(Novacastraから購入)およびCK18(DAKO, Carpinteria, CAから購入)、または、樹状細胞マーカーHLA-DR (マウス抗ヒトHLA-DR、PharMingen, San Diego, CA)に特異的な抗体である。2次抗体(ヤギ、抗マウス)は1次抗体を識別するために用い、結合した抗体を陽性の細胞を赤く染める基質としてFast Red (DAKO, Carpinteria, CA)を用いてアルカリホスファターゼ検出システムにより可視化した。
透過型電子顕微鏡の手順は、以前に記載されたものに従った(Cook, J.R., et al.. J. Toxicol. :Cutaneous and Ocular Toxic. 12:109-128 (1993))。簡単には、培養物をカコジル酸ナトリウム緩衝液、pH7.2の5%グルタルアルデヒド溶液を用いて室温で2時間固定した。その後、サンプルを洗い、カコジル酸ナトリウム緩衝液の1%四酸化オスミウム溶液中で後固定し(postfixed)、段階的な一連のエタノール中で脱水し、スパー低粘度エポキシ樹脂(Spurr's low-viscosity epoxy resin )(Polysciences, Inc. , Warrington, PA)中に包埋した。超薄切片を炭素安定化(carbon-stabilized)フォムバー被膜グリッド(Formvar-coated grid)上にマウントし、Hitachi 7000 透過型電子顕微鏡で観察する前に、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色した。Harvard Medical School(Boston, MA)のTEM設備を用いた。インビトロで作製された子宮頚−膣組織相当物についてTEM顕微鏡写真を撮影し、正常ヒト子宮頚部−膣組織を示している。インビトロで作製された子宮頚−膣組織相当物に用いられた固定剤はK4Fe(CN)6を含んでいたが、摘出された正常ヒト子宮頚部−膣組織に用いられた固定剤はこれを含んでいなかったことに注意されたい。
免疫染色の結果を表2に要約する。インビトロで作製された子宮頚−膣組織相当物は、インビボの組織と類似の形態および組織像を呈していた。H&E組織断切片は、インビトロで作製された組織およびインビボの組織が同様に有核基底細胞および多くの有核基底上細胞層を有していることを示した。調べた両方の組織においては、インビボおよびインビトロの組織のPASを反応させた断切片の顕微鏡写真において見られたように、これらの層は核およびオルガネラを喪失して、細胞がグリコーゲンで満たされた層に続いていた。両方の組織において、グリコーゲン染色の強度は、頂端側の表面に近づくにつれて増加した。
単球から単離されたランゲルハンス細胞は、インビトロの子宮頚−膣組織の作製において同様に良好に行った。単球から産生されたランゲルハンス細胞を含む、インビトロで作製された子宮頚−膣組織相当物において、例1で行われたのと同じ実験を行った。
精製されたマクロファージは、製造者の推奨にしたがってイムノマグネチックビーズ (Dynal Inc., Lake Success, NY)を用いて、またはプラスチックへの接着により、帯血/成人血液由来の単核細胞(MNC)から消極的に単離された。MNC(1×107)は、0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)、20μlのブロッキング試薬および20μlの抗体混合物(Dynalから提供されている単球キット)を添加した200μlのPBS中に再懸濁し、4℃で10分間インキュベートした。その後細胞を2回洗い、0.1%BSAを含むPBS中に再懸濁した。Depletion Dynalbeads (100μl/1×107細胞) を次いで加えて、細胞を4℃で15分間、穏やかに傾斜および回転させながらインキュベートした。細胞をピペッティングし、その後、Dynal Magnetic Particle Concentrator(MCP)-6を用いて、ビーズ−細胞ロゼット(bead-cell rosette)の磁性分離を2分間行った。消極的に単離されたマクロファージを含む上清を集めて遠心した。単離されたマクロファージを計数し、培養し、または使用するまで液体窒素中で低温保存した。単離された単球(5.0×105細胞/ml)は、GM-CSF (200 U/ml)、IL-4(200 U/ml)、5%ウシ胎児血清(FBS)および抗生物質を補充したOPTI-MEM培地(GIBCO BRL Life Technologies, Rockville, MD)中で8日間培養した。培養8日後、培養物からランゲルハンス細胞が産生された。
この例は、ランゲルハンス細胞の代わりに、ランゲルハンス前駆細胞を用いた以外は、例1と同じである。増殖および分化培地にサイトカインを添加し、組織の育成と同様にそのまま(in situ)ランゲルハンス前駆細胞をランゲルハンス細胞に成熟させた。
これは、例1および2に記載の方法により解析したところ、例1および2においてランゲルハンス細胞により産生されたものと同様の組織相当物を形成していた。
この例は、上皮細胞およびランゲルハンス細胞を添加する前に、ポリカーボネートの組織培養微小孔性膜細胞培養インサートに、コラーゲンゲル/線維芽細胞マトリックスを処理した以外は、例1と同じである。線維芽細胞は、例1の子宮頚部上皮組織から採取された下にある結合組織からハーベストされた。上皮組織と同様に、メスを用いて厚さ約1〜2mmの薄い切片に切った。次いで、切片を縦方向に何度も切り、上皮組織の小さい立方体を得た。好ましくは立方体は約2mm×2mm以下であった。その後、組織立方体を、各立方体において2〜3滴のDMEM+10%FCS+抗生物質(0.25μg/ml ファンギゾン(fungizone)、0.5 mg/ml ゲンタマイシン、および1 mg/ml ペニシリン/ストレプトマイシン)と共に、100mmの組織培養処理されたペトリディッシュ中に入れた。次に、ペトリディッシュを37℃かつ5%CO2で3日間インキュベーターに入れた。
この例において続く手順は、T細胞が豊富な末梢血単核細胞(PBMC)をコラーゲンゲル/線維芽細胞マトリックスに添加する以外は、例4と同じであった。PBMCをHistopaque gradient(Sigma Chemical Company, St. Louis, MO)を用いて帯血細胞から分離した。40mlの帯血から、この方法を用いて平均1×108個のPBMCを得た。約1×107個のPBMCを0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)、10%ウシ胎児血清、20μlの抗体混合物(Dynal Inc., Lake Success, NYから提供されているT細胞の消極的単離キット)を添加した200μlのPBS中に再懸濁し、4℃で10分間インキュベートした。その後細胞を2回洗い、0.1%BSAを含むPBS中に再懸濁した。Depletion Dynal beads (100μl/1×107PBMC) を次いで加えて、細胞を4℃で15分間、穏やかに傾斜および回転させながらインキュベートした。
例1において記載されているように、子宮頚部組織からハーベストされた初代上皮細胞を、0.5mlの低温バイアルにおいてPRGM/FBS/ジメチルスルホキシド(DMSO)中、1×106細胞/mlで低温保存した。低温バイアルの内容物を、37℃の水浴中で融解し、30mlのPRGMを含む直径150mmの組織培養処理されたペトリディッシュ2つに加えた。上皮細胞は、70〜75%コンフルエントになる時点である7日まで、1日おきに上皮細胞に供給された。5mlの0.025% トリプシン/0.025%EDTAで約1分間処理することにより、ペトリディッシュから細胞をはがした(続いて低倍率4倍対物の顕微鏡観察により、ペトリディッシュからの細胞の剥離が行われた)。1度細胞が剥がれたら、過剰のトリプシンを大豆トリプシンインヒビター(STI)を用いて中和し、PRGM培地中で懸濁し、ばらばらにした。これらの2次継代(second passaged)細胞は、例1において用いられた初代上皮細胞と同じ方法で、細胞培養インサートに添加された。
低温保存された、皮膚由来の、正常ヒト表皮ケラチノサイト(NHEK)をCascade Biologics (Portland, OR)から購入し、Human Keratinocyte Growth Supplement (Cascade Biologics)が補充された154培地(Medium 154)中で、Cascade Biologicsにより提供されている説明書の通りに単層培養で増殖させた。子宮頚部上皮細胞(EEC)は、例1に記載の通りに子宮頚部組織から単離した。さらに、ランゲルハンス細胞を例1に記載の通りに調製した。その後、Nuncの細胞培養インサートに、125000個のランゲルハンス細胞および250000個のa)正常ヒト表皮ケラチノサイトもしくはb)子宮頚部上皮細胞のいずれかを播種した。これらの組織は、4日間、1日おきに培地交換をしつつ、PRGM 2.0ml中で維持された。4日に、組織は空気−液体界面に上昇させ、さらに125000個のランゲルハンス細胞をインサートに播種した。空気−液体界面において、5.0mlの下記培地を用いた:DMEM:F12 (3:1)+ 5×10-10M RA、0.3 ng/ml KGF、5 ng/ml EGF、0.4μg/mlヒドロコルチゾンおよび 5μg/ml インスリン。
この例は、組織を分化させるために用いた培地が、3:1 の比のDMEM:ハムF12、10%ウシ胎児血清、10 ng/ml表皮成長因子、0.4μg/ml ヒドロコルチゾン、1×10-6Mイソプロテレノール、5 ug/mlトランスフェリン、2×10-9 M トリヨードチロニン、1.8×10-4 Mアデニン、5μg/mlインスリンおよび1×10-6 Mレチノイン酸である以外は、例1と同じである。培養物は、1日おきに培地交換をしながら、2.0mlのこの培地を用いて、5日間液中で培養中で維持された。その後培養物を、イソプロテレノール、トランスフェリン、トリヨードチロニンおよびアデニンを除いた以外は同じ培地5.0mlを用いて、空気−液体界面に置いた。組織像が上記例において作製された組織のものと(これらの種類の培養物において観察される通常の多少のばらつきの範囲内で)等価な組織が得られた。上記の組織の特徴と等価な組織の特徴もまた観察された。
上記例1において作製された子宮頚−膣組織培養物を、MTTアッセイを用いてインビボの刺激の結果と相関させるために用いた。
MTT組織アッセイは、全体的な生存率(Mosmann, T., J. Immunol. Meth., 65, 55(1983)) および増殖性(Klausner, M., Kubilus, J., et al., in Advances in Animal Alternatives, eds. Salem, H. , Katz, S. A., Taylor & Francis, Washington, DC, 347-357 (1997))を定量する、容易かつ正確な手段を提供する。MTT (3-(4,5-ジメチルチアゾール-2イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド)は、生存細胞に取り込まれ、紫のホルマザンを形成するミトコンドリアのデヒドロゲナーゼにより、減少する色素である。機能しているミトコンドリアを有する生存細胞のみがこの反応を行うので、産生された有色のホルマザンの量が生存細胞数に比例する(Mosmann, T., J. Immunol. Meth., 65, 55(1983))。
例1の通りにつくられたインビトロで作製された子宮頚−膣組織相当物およびEpiOcular(登録商標)眼組織(Stern, M., et al, Toxicology In vitro, 12, 455-461,(1998))を、100mgの3つの試験物質に暴露した:1)KY Brand Jelly personal lubricant(KYブランドゼリー個人用潤滑剤)(Personal Products Company, Division of McNeil-PPC, Inc., Skillman, NJ, 08558);2)KY Plus 2% Nonoxynol-9 Lubricant Spermicide (KYプラス2%ノノキシノール−9潤滑殺精子剤)(Personal Products, Company);および3)10%ノノキシノール−9(Nonoxynol-9)(JEECHEN NP-9, JEEN International Corporation, Fairfield, NJ)を、市販されているKY Plus Nonoxynol-9 (2%)Lubricant Spermicideに加えて調製された、KY と12%ノノキシノール−9の実験用組成物。これらの各製品を1〜24時間、重複組織に暴露した。高い粘性、すなわちKY Jellyのゲル様性質のために、100mgの組成物を、0.50cm2の円形領域を有する塗布ピンの平面末端に均一に拡げた。
例1においてつくられたインビトロで作製された子宮頚−膣組織相当物、および非角化上皮組織モデルであるEpiOcular(登録商標)を用いて、KY jellyおよび種々の濃度のN-9を含むKY jelleyについて、MTTアッセイを行った。種々の試験物質について決定されたET-50を表4に示す。
本発明のインビトロで作製された子宮頚−膣組織相当物は、HIV感染および透過のメカニズムを研究するために用いられてもよく、抗生剤を試験するインビボ様手段または他のウイルスの透過を防止する予防手段を提供する。HIV感染および透過に関する1つの答えが出ていない疑問は、HIVは子宮頚部組織または膣組織を透過しうるかどうかということである。この例では、子宮頚−膣組織相当物を、HIVビリオン(virion)が子宮頚部−膣組織を通過する能力を決定するために用いた。
HIV-1ウイスルのストックは、293T細胞にpNL4-3(T細胞トロピック(tropic)ウイルスであるNL4-3のプラスミド)またはpAD8 (マクロファージトロピックウイルスであるADAのプラスミド)プラスミドDNAのいずれか15μgをトランスフェクトすることにより、作製された。トランスフェクションから12時間後、細胞を洗い、10%ウシ胎児血清 (FCS)および抗生物質を補充したRPMI中で培養した。24時間後、全長ウイルスを含む培養上清をハーベストし、孔サイズ0.45μmのフィルターを用いてろ過し、逆転写酵素(RT)アッセイを用いて解析した。
逆転写酵素(RT)アッセイは、HIV透過および感染実験後の上清に存在するHIVの相対的な量を決定するために用いられた。1mlの上清を集めて12000rpmで30分間遠心した。上清を捨て、ウイルスのペレットを50 mM Trisバッファー−HCl pH 7.5、1 mMジチオスレイトール(DTT)、20%グリセロール、0.25 M KCl、および0.25% triton X-100を含むRT懸濁バッファー10μlに再懸濁した。3回の凍結/融解サイクル(37℃/-78℃)を用いて上清中のウイルスを溶解させた。
ウイルスは、子宮頚−膣組織相当物に局所的に適用されるかまたは直接(その上で組織が培養されている)下にある0.4μmの微小孔性膜に直接適用された。子宮頚−膣組織相当物を有するかまたは有さない組織培養インサートを2.0mlの培養培地と一緒に6ウェルプレートに入れ、108μlのADAウイルス(RTアッセイで測定したところでは50000CPM)を局所的に適用した。インサートの真下にある培地を、ウイルス適用後2、5および24時間でアッセイした。24時間後、インサートの頂端側表面を洗浄し、空の(bare)インサートおよび組織含有インサートをさらに48時間インキュベーターにもどした(全部で72時間)。培地サンプルは、RTアッセイを用いてHIVについてアッセイした。結果を表5に示す。
結果
解析結果を表5に要約する。
HIV感染および透過をモニターする能力を、例10で記載された逆転写酵素およびポリメーラーゼ連鎖反応(PCR)を利用して、インビトロで作製された子宮頚−膣組織相当物においてモニターし、子宮頚−膣組織相当物のDNAの中にHIV転写物を検出した。
PCR解析のためのDNA溶解物の調製において、組織サンプルは遠心によりPBSを用いて2回洗った。次いで、Qiagen DNeasy(登録商標)Tissue Kit (Qiagen Inc., Valencia Inc, CA)を使用して製造者のプロトコールを用い、細胞のDNA抽出を行った。このアッセイにおいては、組織サンプルをプロテアーゼK(15μl/組織)の添加および55℃1時間のインキュベーションにより溶解し、その後70℃で10分間インキュベートした。その後、溶解物をDNeasy(登録商標)ミニメンブレンカラム上にロードした。DNAが選択的にこの膜に結合するので、混入物は2回の洗浄により除かれる。次いで、DNAを50μlの溶出バッファーを(2回)加えることにより溶出した。DNAは分光光度計により定量した(260/280の吸光度比が1.81〜1.97の範囲にある)。全DNA(0.6μg)を、HIVのDNAについてポリメーラーゼ連鎖反応(PCR)により調べた。
インビトロで作製された子宮頚−膣組織相当物におけるHIVの感染/透過を評価するために、図1で概略的に描いたように、組織を空気−液体界面条件下、24時間37℃でADA(マクロファージトロピック)もしくはNL4-3(T細胞トロピック)HIV-1単離物に局所的に暴露した(50000CPM/組織)。
a)空気−液体界面(ALI):ウイルスが暴露された組織は、基底側のEC組織表面の下の細胞培養インサートの膜を介して供給された。培地中には、T細胞は存在しなかった。
b)空気−液体界面+ジャーカット(Jurkat)細胞(ALI+J):1×106個のジャーカット細胞を細胞培養インサートの下の培地に加え、a)と同様にした。細胞培養インサートの膜は、組織とジャーカット細胞の間のいかなる直接的接触をも防止していた。
c)液中(submerged)(SUB):ウイルスが暴露された組織は細胞培養インサートを剥がして、1×106個のジャーカット細胞を含む培地中に浸した。
培養培地サンプルは、ウイルスを除去するための局所的な洗浄の後、3、7および10日に回収し、ウイルスの存在を決定するために逆転写酵素アッセイに用いた。
結果
結果を表6に示す。
当業者は、本明細書において記載された本発明の具体的態様に対する多くの均等物を認識し、または、日常的実験を超えないものを用いて、確認することができるであろう。かかる均等物は、請求項により包含されることが意図される。
Claims (31)
- 空気−液体界面で共培養された膣上皮細胞および免疫細胞からなる子宮頚−膣組織相当物を含む、子宮頚−膣組織の免疫応答性についてのインビトロモデルシステム。
- その上で子宮頚−膣組織相当物が培養される支持体をさらに含む、請求項1に記載のインビトロモデルシステム。
- ウイルス、バクテリア、寄生虫、および真菌からなる群から選択される性感染病原体に感染することができる、請求項1に記載のインビトロモデルシステム。
- 性感染病原体がHIVである、請求項3に記載のインビトロモデルシステム。
- アレルギー型反応または刺激型反応を惹起することができる、請求項1に記載のインビトロモデルシステム。
- 無血清培地で生成する、請求項1に記載のインビトロモデルシステム。
- 膣上皮細胞、免疫細胞、または両方がヒト由来である、請求項1に記載のインビトロモデルシステム。
- 膣上皮細胞、免疫細胞、または両方が、初代細胞、継代された初代細胞、形質転換細胞、および不死化細胞からなる群から選択される、請求項1に記載のインビトロモデルシステム。
- 初代または継代された初代膣上皮細胞が、正常ヒト子宮頚部組織、正常ヒト子宮頚管組織、病態のヒト子宮頚部組織、および 病態のヒト子宮頚管組織からなる群から選択される組織由来である、請求項8に記載のインビトロモデルシステム。
- 免疫細胞が、ランゲルハンス細胞、ランゲルハンス前駆細胞(CD34+)、単球(CD14+)、未熟樹状細胞(CD1a+、CD4+)、成熟樹状細胞(CD86+、HLA-DR++)、T細胞(CD3+)、マクロファージ、またはこれらのいずれかの組合せを含む、請求項1に記載のインビトロモデルシステム。
- 免疫細胞がランゲルハンス前駆細胞または単球からインビトロで産生される、請求項1に記載のインビトロモデルシステム。
- 支持体が、人工膜、細胞外マトリックス成分、コラーゲン混合物、インビボ由来の結合組織、混合コラーゲン−線維芽細胞格子、混合細胞外マトリックス−線維芽細胞格子、およびプラスチックからなる群から選択される、請求項2に記載のインビトロモデルシステム。
- 混合コラーゲン−線維芽細胞格子が、膣線維芽細胞を含む、請求項12に記載のインビトロモデルシステム。
- 混合コラーゲン−線維芽細胞格子が、さらにT細胞(CD3+)を含む、請求項13に記載のインビトロモデルシステム。
- 免疫細胞がHLA-DRを発現している、請求項1に記載のインビトロモデルシステム。
- 有核基底層細胞および有核基底上層細胞を有することを特徴とする、請求項1に記載のインビトロモデルシステム。
- 漸次的にグリコーゲンの含有量を増加させ、かつ核の含量を減少させる基底上層の外側に、細胞層を有することを特徴とする、請求項16に記載のインビトロモデルシステム。
- 主に基底層および基底上層に存在する免疫細胞を有することを特徴とする、請求項16に記載のインビトロモデルシステム。
- ステップ:
膣上皮細胞および免疫細胞を提供すること;
細胞を播種すること;そして
分化に適切な条件下で、播種された細胞を空気−液体界面で共培養すること(co-culturing)、
を含む、膣上皮細胞および免疫細胞からなる子宮頚−膣組織相当物を含む、子宮頚−膣組織の免疫応答性についてのインビトロモデルシステムを製造する方法。 - 共培養するステップの前に、細胞の増殖に適切な条件下で、増殖培地中で、播種された細胞を共液中培養するステップをさらに含む、請求項19に記載の方法。
- 共液中培養するステップの増殖培地が、無血清増殖培地である、請求項20に記載の方法。
- 播種するステップにおいて、各細胞種が、1×103〜1×107細胞/cm2で播種される、請求項19に記載の方法。
- 播種するステップが、免疫細胞に対して膣上皮細胞が1:1の比で行われる、請求項19に記載の方法。
- 播種するステップが、免疫細胞に対して膣上皮細胞が1:1〜10000:1の比で行われ、そして、共培養するステップが、免疫細胞の生存を増加するかまたは増殖を惹起する添加剤が補充された無血清培地中で行われる、請求項19に記載の方法。
- 比が、免疫細胞に対して膣上皮細胞が20:1〜50:1である、請求項24に記載の方法。
- 免疫細胞が、ランゲルハンス細胞、ランゲルハンス前駆細胞(CD34+)、単球(CD14+)、未熟樹状細胞(CD1a+、CD4+)、成熟樹状細胞(CD86+、HLA-DR++)、T細胞(CD3+)、マクロファージ、またはこれらのいずれかの組合せを含む、請求項19に記載の方法。
- 播種された細胞が、人工膜、細胞外マトリックス成分、コラーゲン混合物、インビボ由来の結合組織、混合コラーゲン−線維芽細胞格子、混合細胞外マトリックス−線維芽細胞格子、およびプラスチックからなる群から選択される支持体上で共培養される、請求項19に記載の方法。
- 膣上皮細胞および免疫細胞を空気−液体界面で分化に適切な条件下で共培養することを含む方法により調製された子宮頚−膣組織相当物を含む、子宮頚−膣組織の免疫応答性についてのインビトロモデルシステムであって、前記子宮頚−膣組織相当物が、各々が膣上皮細胞および免疫細胞からなる有核基底層および有核基底上層、ならびに、漸次的にグリコーゲンの含有量を増加させ、かつ核の含量を減少させる基底上層の外側の細胞層を有する、前記インビトロモデルシステム。
- 膣上皮細胞および免疫細胞を空気−液体界面で分化に適切な条件下で共培養することをにより調製された、膣上皮細胞および免疫細胞からなる子宮頚−膣組織相当物を含む、子宮頚−膣組織の免疫応答性についてのインビトロモデルシステム。
- ステップ:
膣上皮細胞および免疫細胞を提供すること;
細胞を播種すること;
細胞増殖に適切な条件下で、播種された細胞を増殖培地中で液体共液中培養すること;そして
分化に適切な条件下で、播種された細胞を空気−液体界面で共培養すること、
を含む方法により製造された子宮頚−膣組織相当物を含む、子宮頚−膣組織の免疫応答性についてのインビトロモデルシステム。 - 細胞増殖に適切な条件下で、播種された細胞を増殖培地中で液体共液中培養するステップを、共培養するステップの前に行う、請求項30に記載のインビトロモデルシステム。
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