ITMI20120104A1 - L'utilizzo di tessuto umano proveniente da piccole labbra dei genitali femminili - Google Patents
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Description
Campo dell’invenzione
La presente invenzione si riferisce allo sviluppo e caratterizzazione di un modello di tessuto cutaneo dei genitali esterni femminili (vulva) ottenuto mediante coltura exvivo di campioni di piccole labbra umane. In particolare, questo modello biologico viene proposto per lo studio degli effetti dovuti a composti o preparati terapeutici, cosmetici e nutraceutici destinati al trattamento delle parti intime, con particolare riferimento all’organo genitale femminile (i.e. vulva). Il modello in oggetto viene proposto anche per lo studio di effetti desiderati o indesiderati derivanti da sostanze o materiali impiegati per la realizzazione di tessuti o prodotti destinati a restare intimamente a contatto con gli organi genitali, tra i quali possono venire citati a titolo di esempio non esaustivo, biancheria intima, assorbenti, pannolini.
Inquadramento dell’invenzione
La creazione di prodotti per l’igiene intima à ̈ un settore molto importante sia per il mercato cosmetico che farmaceutico nonché nella produzione di tamponi ed assorbenti o loro componenti. Attualmente i test di prodotti per l’igiene intima vengono fondamentalmente effettuati su cellule, su modelli tridimensionali di tessuti ricostruiti in coltura, su animali o tramite test clinici su pazienti in vivo.
Il modello tridimensionale più sofisticato attualmente disponibile sul mercato à ̈ il modello EpiVaginal<TM>(MatTek, Ashland, USA) che però si compone solamente di due tipi cellulari (i.e. cellule epiteliali vagino-ectocervicali e cellule dendritiche), mentre manca completamente di annessi cutanei complessi.
Un secondo modello tridimensionale disponibile à ̈ rappresentato da HVE<TM>, (SkinEthic, Nice, France) ed include un solo tipo cellulare derivante da carcinoma vulvare epidermoide (i.e. cellule A431).
Entrambi questi modelli, sebbene possano essere utili per saggiare diverse sostanze, risultano comunque poco indicativi della reale complessità del tessuto cutaneo genitale e quindi poco utili nella conduzione di saggi preclinici. Vi à ̈ inoltre da notare che questi due modelli tridimensionali utilizzano fondamentalmente cellule provenienti da parte interne alla vagina, che nelle circostanze reali rappresentano la componente genitale meno esposta al diretto contatto con i prodotti che si intende studiare.
Il test di prodotti cosmetici su animali à ̈ sconsigliabile per motivi etici e in aperto contrasto con le direttive europee che regolamentano il settore.
Infine il test diretto su esseri umani può essere potenzialmente molto pericoloso.
In seguito a queste considerazioni risulta quindi evidente la forte esigenza del mercato di acquisire un modello di screening rappresentativo del tessuto cutaneo genitale, con particolare riferimento ai genitali esterni femminili (ad esempio vulva), idoneo a testare l’attività e l’efficacia di principi attivi e di prodotti finiti cosmetici, cosmeceutici e farmacologici ad utilizzo ginecologico, nonché di tessuti o prodotti destinati a restare intimamente a contatto con gli organi genitali, tra i quali possono venire citati a titolo di esempio non esaustivo, biancheria intima, assorbenti o pannoloni per incontinenti. Tra le richieste del mercato va considerata anche la necessità di testare sostanze o prodotti destinati all’igiene della regione genitale dei lattanti e per la realizzazione di pannolini o altri prodotti destinati al contatto con l’area ano-genitale dei bambini.
In risposta a tali esigenze, Cutech à ̈ riuscita a sviluppare e a mettere a punto una metodica innovativa per tenere viva e metabolicamente attiva pelle umana proveniente da piccole labbra, per un periodo che si protrae fino a 8 giorni dal momento dell’espianto.
In base a questa invenzione, biopsie di pelle proveniente da piccole labbra umane vengono utilizzate come modello di genitali femminili, preferenzialmente esterni.
Descrizione dettagliata del modello
I campioni di pelle utilizzati per questo modello provengono preferenzialmente da operazioni di chirurgia plastica delle vulva. I campioni presentano tutti gli strati di pelle presenti in vivo (i.e. strato corneo, epidermide, derma) nonché i vasi (non irrorati), gli annessi cutanei (e.g. ghiandole sebacee) e tutti i tipi cellulari ad essi associati, come cellule epiteliali, cheratinociti, fibroblasti, cellule dendritiche, melanociti, sebociti, etc.
I campioni di piccole labbra umane che vengono utilizzate sono formate da una plica cutanea che presenta un lato epidermico interno meno cheratinizzato, rivolto verso l’orifizio vaginale, ed una parte epidermica esterna, con cheratinizzazione leggermente più sviluppata ma comunque non paragonabile a quella della restante cute umana. In effetti à ̈ da considerare che le mucose vaginali esterne e la vulva sono zone del corpo umano femminile estremamente sensibili ad agenti esogeni ed a patogeni di varia natura (e.g. virus, batteri, funghi) e pertanto si comportano in modo sensibilmente differente dalla cute del resto del corpo.
Una volta escissi, i campioni di piccole labbra sono posti all’interno di provette da 50 ml contenenti 40 ml di medium di trasporto e vengono mantenuti a 4°C per tutto il tempo del trasporto fino a che i campioni giungono al laboratorio per essere processati. Si à ̈ visto che il medium di trasporto provvede sia ad un’effettiva protezione dei campioni di pelle da possibili contaminazioni batteriche durante il trasporto sia ad un mantenimento ottimale delle caratteristiche del tessuto cutaneo. Un medium di trasporto idoneo à ̈ composto da Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) con aggiunta di penicillina (100U/ml) e streptomicina (100µg/ml). E’ preferibile e raccomandabile che il trasporto dei campioni dalla clinica, dove sono stati prelevati, al laboratorio, dove verranno processati, avvenga nel più breve tempo possibile, preferenzialmente in meno di 4 ore.
Una volta che i campioni di pelle sono giunti in laboratorio, prima di eseguire la preparazione delle biopsie da mettere in coltura, le porzioni di piccole labbra preferenzialmente possono essere disinfettate con una soluzione di etanolo al 95% e poi ripetutamente lavate con una soluzione di PBS contente antibiotici e antimicotici.
I tessuti destinati alla coltura vengono preparati dissezionando campioni cilindrici, aventi 6mm di diametro, mediante l’impiego di un puncher elettronico. L’intervento di dissezionamento viene eseguito attraversando l’intero spessore della plica cutanea, ottenendo pertanto campioni di tessuto che conservano entrambe le facce, interna ed esterna, del piccolo labbro di origine. Il campione cutaneo così ottenuto viene preferenzialmente tagliato trasversalmente a metà in modo da avere due biopsie, ciascuna formata da epidermide e derma, una della faccia esterna ed una della faccia interna delle piccole labbra. Queste biopsie hanno una dimensione di circa 6mm di diametro per 3-5mm di spessore. Le dimensioni delle biopsie sono state definite in modo da massimizzare le performance di vitalità ed attività metabolica del modello biologico.
Le 2 biopsie così ottenute vengono poste in coltura preferenzialmente insieme, con la porzione epidermica esposta all’aria e la parte dermica immersa nel medium di coltura. E’ preferibile porre le biopsie su supporti sterilizzati, costituiti ad esempio da cotone imbevuto di medium di coltura. Il supporto di cotone à ̈ preferenzialmente messo all’interno di un pozzetto di una piastra a sei pozzetti.
Il medium di coltura à ̈ preferenzialmente privo di siero fetale di vitello (FCS) e ancor più preferenzialmente à ̈ composto da un medium di coltura complesso quale il William’s E. Il medium di coltura viene comunque selezionato da una persona esperta in base al tipo di saggio a cui si vuole sottoporre il modello. Infatti il medium di coltura, in alcune circostanze, può essere addizionato con composti che aumentano la proliferazione delle cellule della pelle come vitamine o sali di zinco.
Nell’eseguire i test, le sostanze o i prodotti da saggiare possono essere applicati topicamente sull’epidermide, oppure venire disciolti nel medium in modo da mimare una potenziale azione sistemica (cioà ̈ attraverso il derma). Le sostanze possono essere applicate in qualsiasi forma, allo stato puro o miscelate con uno o più composti secondari o additivi (a loro volta potenzialmente responsabili dell’attività biologica osservata sul modello ex vivo). La sostanza o le sostanze possono essere applicate in qualsiasi forma fisica, come ad esempio solida, gel, crema o composizione multifasica, sotto forma di liquido, schiuma o gas. Tessuti e altri materiali destinati a coadiuvare l’igiene intima, come ad esempio gli assorbenti igienici, possono venire testati ponendo campioni degli stessi a diretto contatto con l’epidermide.
Sostanze e formulazioni da testare (da ora in poi definite semplicemente “formulazioni†) sul modello di cute genitale femminile possono essere sotto forma di saponi, syndet, lavaggi, preparazioni per bagno e doccia, lavaggi vaginali, emulsioni.
I test da eseguire possono essere condotti sia direttamente sul modello di genitali femminili sia sul medium di coltura.
Esempi
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Esempio da 1 a 6
Test sulla vitalità delle biopsie di piccole labbra umane
Le biopsie sono state messe in coltura come spiegato in precedenza. In breve dai campioni di tessuto umano sono state fatte delle biopsie che sono state messe in coltura a coppie all’interno di pozzetti su piastre da 6 pozzetti. Le biopsie sono state poste sopra pezzi di cotone imbevuti di medium di coltura in modo da lasciare esposta all’aria la parte epidermica.
I campioni di pelle così coltivati, sono stati raccolti ai giorni 0 (inizio della coltura tissutale), 1-2-3-5-6-8 di coltura.
L’analisi della vitalità à ̈ stata eseguita tramite test con Methylthiazolyldiphenyltetrazolium bromide (MTT). In breve ogni biopsia, subito dopo essere stata tolta dalla coltura, à ̈ stata lavata in PBS, gentilmente e superficialmente asciugata, pesata e posta in eppendorf contenente una soluzione di MTT per 3 ore. In questo periodo di tempo l’MTT viene convertito in cristalli non idrosolubili di colore blu/viola dalle cellule metabolicamente attive presenti nel modello. I cristalli così formati vengono solubilizzati ponendo ogni biopsia in una eppendorf contente una soluzione di DMSO:Isopropanolo (1:10) per 2 ore. In questo modo per ogni biopsia si ottiene una soluzione liquida colorata di blu-viola. Una quantità precisa di soluzione blu-viola identica per tutte le biopsie, viene letta allo spettrofotometro ad una lunghezza d’onda pari a 570 nm. Il valore di assorbanza ottenuto per ogni biopsia viene normalizzato dividendolo per il peso della biopsia (in mg) precedentemente misurato. Il valore finale per ogni giorno di raccolta deriva dal valore medio ottenuto dall’analisi di 3 biopsie. Per riuscire a confrontare i dati ottenuti a diversi giorni, il valore ottenuto al giorno 0 viene posto pari a 100 ed i valori ottenuti nei giorni seguenti vengono calcolati in percentuale in relazione al giorno 0.
Tabella 1
Analisi della vitalità cellulare espressa in valore percentuale rispetto al giorno 0 – percentuale ± errore standard
Ex. Giorno di coltura Percentuale di vitalitÃ
0 0 100 ± 3
1 1 73 ± 0,4
2 2 77 ± 3
3 3 74 ± 1
4 5 63 ± 0,8
5 6 60 ± 1,3
6 8 58 ± 3,5
I risultati indicano che il modello à ̈ metabolicamente attivo almeno fino al giorno 8 di coltura tissutale quantunque sia consigliabile eseguire i test entro il giorno 3 di coltura.
Esempio da 7 a 9
Test di un agente pro-infiammatorio (i.e. Sodio Dodecil Solfato (SDS))
Le biopsie sono state messe in coltura come spiegato in precedenza. In breve dai campioni di tessuto umano sono state fatte delle biopsie che sono state messe in coltura a coppie all’interno di pozzetti su piastre da 6 pozzetti. Le biopsie sono state poste sopra pezzi di cotone imbevuti di medium di coltura in modo da lasciare esposta all’aria la parte epidermica.
Una volta messe in coltura le biopsie sono state trattate topicamente con soluzioni di DMEM contente concentrazioni crescenti di SDS (i.e. 0,5%-2%-10%). Il trattamento topico à ̈ durato 2 giorni e rinnovato quotidianamente. Al giorno 2 di coltura tissutale e trattamento topico si à ̈ prelevato il medium di coltura dai pozzetti e si †̃ eseguita l’analisi di IL-1alfa tramite ELISA kit (Bender MedSystems, Vienna, Austria, # BMS243/2MST).
Tabella 2
Analisi del rilascio di intereluchina-1alfa nel medium di coltura al giorno 2 – valore in pg/ml ± errore standard
Ex. Campione Quantità di IL-1alpha nel medium (pg/ml)
0 Controllo (DMEM) 3,1 ± 0,3
7 SDS 0,5% 4,5 ± 0,3
8 SDS 2% 9,9 ± 0,5
9 SDS 10% 13,2 ± 0,7
I risultati indicano che il modello à ̈ suscettibile in modo dose-dipendente ad agenti pro-infiammatori (nello specifico SDS).
Esempio 10
Test di un agente anti-infiammatorio (i.e. Dexamethasone)
Le biopsie sono state messe in coltura come spiegato in precedenza. In breve dai campioni di tessuto umano sono state fatte delle biopsie che sono state messe in coltura a coppie all’interno di pozzetti su piastre da 6 pozzetti. Le biopsie sono state poste sopra pezzi di cotone imbevuti di medium di coltura in modo da lasciare esposta all’aria la parte epidermica.
Le biopsie sono state trattate topicamente con una soluzione di DMEM contente dexametasone 10µM. Il trattamento topico à ̈ durato 2 giorni e rinnovato quotidianamente. Al giorno 2 di coltura tissutale e trattamento topico si à ̈ prelevato il medium di coltura dai pozzetti e si †̃ eseguita l’analisi di IL-1alfa tramite ELISA kit (Bender MedSystems, Vienna, Austria, # BMS243/2MST).
Tabella 3
Analisi del rilascio di intereluchina-1alfa nel medium di coltura al giorno 2 – valore in pg/ml ± errore standard
Ex. Campione Quantità di IL-1alpha nel medium (pg/ml) 0 Controllo (DMEM) 1,2 ± 0,4
10 Dexametasone 10µM 0,6 ± 0,2
I risultati indicano che il modello à ̈ suscettibile all’azione di anti-infiammatori (nello specifico dexametasone).
Claims (8)
- Rivendicazioni ___________________________________________________________________ 1. L’utilizzo di tessuto umano proveniente da piccole labbra dei genitali femminili per la creazione di un modello ex-vivo destinato allo studio del metabolismo del tessuto cutaneo genitale e in particolare degli organi genitali esterni femminili.
- 2. Utilizzo di un modello ex vivo di cui alla rivendicazione precedente, in cui epidermide, derma e tutti gli annessi cutanei tipici della cute genitale sono rappresentati.
- 3. Utilizzo del modello di cui alla rivendicazione 1 per lo studio degli effetti derivanti dall’applicazione di sostanze, applicate sia per via topica che sistemica, destinate ai seguenti usi come farmacologico, cosmetico o cosmeceutico.
- 4. Utilizzo del modello di cui alla rivendicazione 1 per lo studio degli effetti derivanti da sostanze o prodotti formulati destinati a modulare il piacere sessuale oppure a prevenire o favorire il concepimento durante l’atto sessuale.
- 5. Utilizzo del modello di cui alla rivendicazione 1 per lo studio di sostanze o formulazioni destinate alla cura del corpo ed all’igiene intima, sia nell’adulto che nella prima infanzia;
- 6. Utilizzo del modello di cui alla rivendicazione 1 per studiare gli effetti di materiali utilizzati per la realizzazione di prodotti tessili o dispositivi igienici e sanitari come api di biancheria intima, pannolini per l’infanzia o pannoloni per incontinenti, preservativi, assorbenti igienici, carta igienica o salviette igieniche.
- 7. Utilizzo del modello di cui alla rivendicazione 1 per lo studio dei seguenti processi metabolici e relativa modulazione mediante trattamenti con principi attivi o formulazioni come vitalità e/o proliferazione, reazioni immunitarie ed allergiche, abrasione cutanea, protezione dai processi ossidativi, secrezione delle ghiandole sebacee e del muco, melanogenesi, permeabilità cutanea o idratazione cutanea.
- 8. Utilizzo del modello di cui alla rivendicazione 1 per lo studio dell’attività di sostanze o formulazioni aventi attività biologica come pro-infiammatori, antiinfiammatori, antibatterici, antimicotici, antiprotozoari, antivirali, antitumorali, agenti corrosivi.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT000104A ITMI20120104A1 (it) | 2012-01-30 | 2012-01-30 | L'utilizzo di tessuto umano proveniente da piccole labbra dei genitali femminili |
| PCT/EP2013/051330 WO2013113613A1 (en) | 2012-01-30 | 2013-01-24 | The use of human tissue originating from the inner labia of female genitalia |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| IT000104A ITMI20120104A1 (it) | 2012-01-30 | 2012-01-30 | L'utilizzo di tessuto umano proveniente da piccole labbra dei genitali femminili |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ITMI20120104A1 true ITMI20120104A1 (it) | 2013-07-31 |
Family
ID=45998483
Family Applications (1)
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| IT000104A ITMI20120104A1 (it) | 2012-01-30 | 2012-01-30 | L'utilizzo di tessuto umano proveniente da piccole labbra dei genitali femminili |
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|---|---|
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| WO (1) | WO2013113613A1 (it) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990015862A1 (en) * | 1989-06-12 | 1990-12-27 | Cornell Research Foundation, Inc. | In vitro cultivation of epithelial cells |
| US6943021B2 (en) * | 2002-06-07 | 2005-09-13 | Mattek Corporation | Three dimensional vaginal tissue model containing immune cells |
-
2012
- 2012-01-30 IT IT000104A patent/ITMI20120104A1/it unknown
-
2013
- 2013-01-24 WO PCT/EP2013/051330 patent/WO2013113613A1/en active Application Filing
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990015862A1 (en) * | 1989-06-12 | 1990-12-27 | Cornell Research Foundation, Inc. | In vitro cultivation of epithelial cells |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
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| AYEHUNIE S ET AL: "Development of an in vitro alternative assay method for vaginal irritation", TOXICOLOGY, vol. 279, no. 1-3, 11 January 2011 (2011-01-11), pages 130 - 138, XP027558095, ISSN: 0300-483X, [retrieved on 20101213] * |
| J D SOBEL ET AL: "Human vaginal epithelial multilayer tissue culture", IN VITRO, vol. 15, no. 12, December 1979 (1979-12-01), pages 993 - 1000, XP055041910, ISSN: 0073-5655, DOI: 10.1007/BF02619158 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2013113613A1 (en) | 2013-08-08 |
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